Роль протеализина в бактериальной инвазии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Цаплина, Ольга Анатольевна

• Цаплина, Ольга Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Цаплина, Ольга Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СОДЕРЖАНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль цитоскелета во взаимодействие бактерий с клетками эукариот.

1.1. Бактерии, использующие актин для формирования пьедесталов на поверхности клетки-хозяина.

1.2. Бактерии, использующие актин для проникновения в клетку-хозяина и внутриклеткочного движения.

1.2.1. Бактериальные протеазы могут способствовать инвазии, активируя матриксные металлопротеазы (ММП).

1.2.2. Механизм входа типа «застежка - молния».

1.2.3. Триггерный механизм входа.

1.2.4. Стратегии выживания бактерий в клетке-хозяине.

1.2.5. Движение бактерий в цитоплазме клетки-хозяина.

2. Инвазивная активность бактерий рода Serratia.

2.1. Факторы вирулентности бактерий Serratia marcescens.

2.2. Корреляция инвазивной активности бактерий с синтезом протеазы ЕСР32/гримелизин.

2.3. Расщеплеиие актина протеазой ЕСР32/гримелизин.

3. Металлопротеаза S. proteamaculans протеализин.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Бактериальные штаммы и условия культивирования.

2. Кривые роста бактерий.

3. Клеточные линии и условия культивирования.

4. Выделение актина.

5. Модификации актина.

6. Определение степени полимеризации и динамики актина.

7. Получение бактериальных экстрактов.

8. Выявление актиназной активности.

9. Электрофорез в полиакриламидном геле.

10. Зимография.

11. Окраска бактерий реактивом FITC.

12. Проточная цитофлуорометрия.

13. Заражение эукариотических клеток бактериями.

14. Окраска препаратов для конфокальной микроскопии.

15. Электронная микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Расщепление G-актина протеализином.

2. Корреляция между актиназной и инвазивной активностью бактерий.

2.1. Бактерии дикого штамма Serratia proteamaculans 94.

2.2. Бактерии рекомбинантных штаммов Е. coli, синтезирующих протеализин

2.2.1. Бактерий Е. coli, синтезирующие протеализин под управлением собственного промотора.

2.2.2. Бактерии Е. coli, синтезирующие протеализин под управлением промотора фага Т7.

2.2.3. Бактерии Е. coli, синтезирующие мутантный протеализин с точечной заменой глутаминовой кислоты на аланин в активном сайте.

2.3. Бактерии S. proteamaculans после инактивации гена протеализина.

3. Возможные механизмы инвазии бактерий-продуцентов протеализина.

3.1. Локализация протеализина во время инвазии бактерий-продуцентов.

3.2. Чувствительность матриксных металлопротеаз к протеализину.

3.3. Проверка инвазивной активности неинвазивных бактерий E.coli при добавлении протеализина во внеклеточную среду клеток эукариот.

3.4. Расщепление фибриллярного актина протеализином.

3.4. 1. Сравнение протеолиза актина протеализином и экстрактом бактерий, синтезирующих протеализин.

3.4.2. Скорость обмена субъединиц в F-актине, расщепленном экстрактом бактерий-продуцентов протеализина.

3.5. Стабилизация расщепленного актина фторидами.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль протеализина в бактериальной инвазии»

Актуальность проблемы. Актин вовлечен в большинство клеточных процессов, от перестроек хроматина и регуляции транскрипции до внутриклеточного транспорта, различных типов движения клеток и сокращения мышц. Поэтому не удивительно, что актиновый цитоскелет является мишенью для токсинов вирусов и болезнетворных бактерий, взаимодействующих с клетками эукариот. Проникновение бактерий в клетку-хозяина (инвазия) - это процесс, в котором взаимодействие бактериальных и клеточных факторов приводит к интернализации бактерий в клетки эукариот, которые в норме не фагоцитируют. Хотя бактерии разработали различные способы инфицирования клетки-хозяина, общими для всех видов инвазии являются активация сигнальной системы клетки и реорганизация ее цитоскелета. Патогенные бактерии попадают в клетку-хозяина с помощью одного из двух сигнальных путей. Один путь - это прямая интернализация бактерий, индуцированная взаимодействием бактериального белка с поверхностным рецептором, вовлеченным в распластывание или подвижность клетки. Другой процесс напоминает макропиноцитоз, при котором образование выростов клеточной поверхности, захватывающих бактерию, индуцируется секрецией комплекса специфических бактериальных белков, встраивающихся в мембрану клеток эукариот и образующих пору, через которую бактериальные белки попадают в цитоплазму. Оба процесса связаны с реорганизацией цитоскелета, последовательной деполимеризацией и полимеризацией актина (СоБзаг!, БашопеШ, 2004). Поэтому факторами вирулентности могут становиться бактериальные белки, влияющие на равновесие между в- и Р-формами актина.

При исследовании свойств бактериальной металлопротеазы ЕСР32, ограниченно расщепляющей актин в единственном сайте, интенсивно вовлеченном в контакт между мономерами актина в полимере (ЮшШпа е1 а1., 1991), было показано, что непатогенные бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 способны проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Е&ешоуа е1 а!., 2001). Позднее было установлено, что бактериипродуценты протеазы ЕСР32 - это Serratia grimesii (Bozhokina et al., 2008). Способность к инвазии после синтеза актин-специфической металлопротеазы была подтверждена на бактериях референтного штамма Serratia grimesii, а соответствующий белок был назван гримелизином (Bozhokina et al., 2008).

В другом виде сераций, Serratia proteamaculans, была обнаружена новая металлопротеаза протеализин, сходная по свойствам активной формы с ЕСР32/гримелизином и отличающаяся от гримелизина на 8 аминокислотных замен, расположенных на поверхности активного фермента (Demidyuk et al., 2006; Bozhokina et al., 2008). В настоящее время протеализин является одной из наиболее полно охарактеризованных термолизинподобных протеаз. Кроме того, геном S. proteamaculans полностью секвенирован (GenBank Ю СР000826). Поэтому использование этих бактерий и протеализина является перспективным для исследования механизмов инвазии, связанных с перестройками актинового цитоскелета.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитической активности металлопротеазы протеализин из бактерий Serratia proteamaculans в связи с возможным участием этой протеазы в бактериальной инвазии.

Задачи настоящей работы:

1. Определить сайты протеолиза актина протеализином и исследовать свойства G- и F-актина, расщепленного протеализином.

2. Выяснить, способны ли бактерии S. proteamaculans проникать внутрь клеток эукариот.

3. Исследовать актиназную и инвазивную активность неинвазивных бактерии Е. coli после трансформации плазмидой, содержащей ген протеализина.

4. Исследовать актиназную и инвазивную активность бактерии S. proteamaculans после нокаута гена протеализина.

5. Определить локализацию протеализина при инкубации бактерий-продуцентов с клетками эукариот и исследовать возможные мишени действия протеализина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Протеализин расщепляет актин не только в сайте Gly42-Val43, идентичном сайту расщепления актина протеазой ЕСР32, но и в сайтах Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64, расположенных в нуклеотид-содержащей щели молекулы. Свойства актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Кроме того, протеализин частично расщепляет фибриллярный актин, уменьшая степень его полимеризации и усиливая динамику полимера. Действие протеализина ингибируют факторы, стабилизирующие связи между мономерами при образовании полимера.

2. Бактерии S. proteamaculans 94, природные продуценты протеализина, способны к инвазии в клетки эукариот после появления в них активного протеализина, ограниченно расщепляющего актин.

3. Трансформация плазмидой, содержащей ген протеализина, придает неинвазивным бактериям Е. coli способность проникать в клетки эукариот.

4. Во время инвазии бактерий-продуцентов протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетки эукариот. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных бактерии Е. coli в клетки Нер-2.

5. Полученные данные позволяют предположить, что протеализин участвует в инвазии бактерий-продуцентов, будучи транслоцированным в клетки эукариот, и его наиболее вероятной мишенью во время бактериальной инвазии является актин.

Научная новизна. Показано, что протеализин расщепляет актин не только в сайте Gly42-Val43 в ДНКазной петле молекулы, но также и в сайтах Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64, расположенных в нуклеотид-содержащей щели, с образованием фрагмента с молекулярной массой 33 кДа. Свойства G-актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Расщепление G-актина протеализином в растворе обратимо препятствует полимеризации актина. Впервые показана способность условно-патогенных бактерий S. proteamaculans, синтезирующих протеализин, проникать в клетки эукариот. Показано, что неинвазивные бактерии Е. coli после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина, приобретают способность проникать в клетки эукариот. Впервые показано, что в бактериях дикого штамма S. proteamaculans существует механизм инвазии, не зависящий от протеализина. Показано, что во время инвазии бактерий-продуцентов протеализина протеаза появляется во внеклеточной среде и в цитоплазме клеток эукариот. Кроме того показано, что протеализин во внеклеточной среде может быть активатором матриксной металлопротеазы ММР2, которая, по данным литературы, может способствовать инвазии. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных Е. coli внутрь* клеток эукариот. Впервые исследован протеолиз F-актина протеализином и показано, что расщепление протеализином приводит к ускорению обмена субъединиц в полимере, на которое влияют фториды алюминия и натрия. Эти данные являются первым экспериментальным подтверждением транслокации протеализина из бактерий в клетки эукариот и позволяют предполагать, что его мишенью является актин.

Теоретическое и практическое значение работы. Чувствительность клеток к инвазии может быть показателем физиологического состояния клетки при различных воздействиях и степени ее трансформированности. Известно, что инвазия бактерий усиливается пролиферативной активностью и опухолевой трансформацией клеток (Velge et al., 1997). С другой стороны, чувствительность клеток эукариот к инвазии может быть уменьшена в экспериментальных условиях в результате воздействия антиоксидантов (Gamaley et al., 2006). Поэтому взаимодействие культивируемых клеток эукариот с условно-патогенными бактериями-продуцентами протеализина является хорошей моделью для выявления физиологического состояния клетки-хозяина.

В клинических изолятах обнаруживают бактерии S. proteamaculans так же, как и бактерии наиболее патогенного вида серрации Serratia marcescens, вызывающие пневмонию, инфекции мочевыводящих путей и хирургических ран. В свете данных о том, что условно-патогенные бактерии S. proteamaculans проникают в клетки человека, важно изучение механизма инвазии бактерий и факторов, влияющих на их патогенность. Определение ферментов, обеспечивающих инвазию бактерий, их свойств и мишеней будет способствовать разработке способа борьбы с условно-патогенными бактериями вида Serratia.

Обнаруженная в работе способность протеализина расщеплять F-актин, может быть использована для изучения факторов, влияющих на полимеризацию и деполимеризацию актина, внутриклеточных функций актина и структуру полимеров актина. В работе представлены данные о стабилизации полимеров актина фторидом натрия, который в экспериментах на клетках используется как активатор малых ГТФаз и ингибитор фосфатаз (Bogatcheva et al., 2006; Wang et al., 2001; Jaconi et al., 1993). Фосфат натрия ингибирует расщепление F-актина протеализином и ускоряет полимеризацию расщепленного актина, по-видимому, стабилизируя межмономерные контакты и ускоряя нуклеацию. Таким образом, вызываемые им эффекты при воздействии на клетки эукариот могут возникать в результате прямого взаимодействия фторида натрия с актином, что следует учитывать при использовании фторида натрия в качестве активатора сигнальных каскадов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Цаплина, Ольга Анатольевна

выводы

1. Свойства актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Расщепляя G-актин в растворе, протеализин препятствует полимеризации актина. Полимеризацию расщепленного актина ускоряют факторы, стабилизирующие связи между мономерами при образовании полимера.

2. Протеализин частично расщепляет F-актин в растворе, уменьшая степень его полимеризации и усиливая динамику полимера. Протеолиз актина в растворе протеализином ингибируют факторы, стабилизирующие нить актина. Таким образом, протеализин может вызывать перераспределение между G- и F-формами актина в клетках эукариот, необходимое для инвазии бактерий.

3. Бактерии S. proteamaculans 94, природные продуценты протеализина, способны к инвазии в клетки эукариот после появления в них активного протеализина, ограниченно расщепляющего актин.

4. Неинвазивные бактерии Е. coli приобретают способность проникать в клетки эукариот после трансформации плазмидой, содержащей ген протеализина.

5. Нокаут гена протеализина не приводит к потере инвазивной активности бактерий S. proteamaculans, что указывает на существование механизма инвазии S. proteamaculans, в котором не задействован протеолиз актина.

6. Во время инвазии бактерий-продуцентов протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетки эукариот. Во внеклеточной среде протеализин может быть активатором матриксной металлопротеазы ММР2. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных бактерии Е. coli в клетки Нер-2.

7. Полученные данные позволяют предположить, что протеализин транслоцируется в клетки эукариот и его наиболее вероятной мишенью во время бактериальной инвазии является актин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проникновение бактерий в клетки эукариот, которые в норме не фагоцитируют, требует перестроек актинового цитоскелета. На первом этапе проникновения бактерий необходима деполимеризация актиновых филаментов клетки-мишени; затем происходит полимеризация актиновых филаментов, которые служат каркасом для мембранных выростов, захватывающих бактерию; а на конечной стадии необходима разборка актиновых структур, собранных для захвата бактерии. Патогенные бактерии управляют этими перестройками с помощью одного из двух механизмов. Один механизм - взаимодействие бактериального белка с поверхностным рецептором, вовлеченным в распластывание или подвижность клетки, и запуск сигнальных каскадов, приводящих к перестройке цитоскелета. В другом механизме бактериальные белки секретируются в цитоплазму клетки-мишени с помощью специфического аппарата секреции, встраивающегося в мембрану клеток эукариот (Cossart, Sansonetti, 2004). В этом случае бактериальные белки-эффекторы, оказавшись в цитоплазме клетки-хозяина, воздействуют на Rho-ГТФазы, актин-связывающие белки или непосредственно на актин, Поэтому факторами вирулентности могут становиться бактериальные белки, влияющие на равновесие между G- и F-формами актина.

Бактериальная металлопротеаза ЕСР32/гримелизин ограниченно расщепляет актин в единственном сайте между Gly42 и Val43 (Khaitlina et al., 1991), протеолиз актина приводит к обратимому сдвигу равновесия в растворе в сторону образования G-актина. При исследовании свойств этой протеазы было показано, что непатогенные бактерии-продуценты протеазы ЕСР32/гримелизин S. grimesii способны проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Efremova et al., 2001, Bozhokina et al., 2008). Бактерии рода Serratia являются факультативными патогенами, часто вызывающими больничные инфекции, механизм которых неизвестен. Поэтому обнаружение еще в одном виде Serratia, S. proteamaculans 94, металлопротеазы протеализин, отличающейся от ЕСР32/гримелизина на 8 аминокислотных замен (Demidyuk et al., 2006; Bozhokina et al., 2008), поставило вопрос о субстратной специфичности протеализина и его функциях в бактериях-продуцентах.

Оказалось, что бактерии S. proteamaculans способны проникать в клетки эукариот, но только на поздней стационарной стадии роста. При этом появление инвазивной активности совпадает с появлением активного протеализина в бактериальных экстрактах. Более того, неинвазивные бактерии Е. coli приобретали способность проникать в клетки эукариот после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина. Для инвазии рекомбинантных Е. coli, продуцентов протеализина, достаточно даже синтеза мутантного протеализина с точечной мутацией в активном центре, который слабо расщепляет актин.

Однако инактивация гена протеализина в S. proteamaculans 94 pln" не привела к потере бактериями инвазивной активности. Это не отрицает участия протеализина в механизме инвазии S. proteamaculans 94. Известны случаи, когда при смене условий роста бактерий выключается один механизм инвазии и активируется другой механизм (Eitel, Dersch, 2002).

Следующим стал вопрос о локализации мишени действия протеализина во время инвазии бактерий-продуцентов. Оказалось, что за время инкубации клеток Balb ЗТЗ SV40 с бактериями протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетку-хозяина. Во внеклеточной среде протеализин может быть активатором матриксной металлопротеазы, таким образом способствуя инвазии бактерий-продуцентов. Однако добавление фермента в среду во время инкубации неинвазивных Е. coli не приводит к проникновению бактерий в клетки эукариот. По-видимому, мишень действия протеализина расположена в клетке-хозяине, и наиболее вероятной мишенью протеализина в клетках эукариот является актин.

Протеализин, расщепляя актин, может сдвигать равновесие между G- и F-формами актина в сторону образования G-актина в растворе. Это воздействие могут ингибировать факторы, стабилизирующие актин. В растворе, расщепление актина ингибирует предварительная инкубация с фторидами, имитирующими неорганический фосфат, а инкубация расщепленного G-актина с фторидами способствует образованию F-актина. В клетке стабилизирующими факторами могут быть низкомолекулярные эффекторы или актин-связывающие белки. Таким образом, при проникновении в клетку-хозяина, протеализин может обеспечивать обратимые перестройки актинового цитоскелета, необходимые для бактериальной инвазии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Цаплина, Ольга Анатольевна, 2011 год

1. Казанина Г.А., Миргородская O.A., Миргородская Е.А., Хайтлина С. Ю. (1995) Протеиназа ЕСР32. Характеристика фермента, исследование специфичности. Биоорганич. химия, 21(10), 761-766.

2. Мантуленко В.В., Хайтлина С.Ю., Шелудько Н.С. (1983) Большой фрвгмент актина, устойчивый к дальнейшему протеолизу. Биохимия, 48, 69-74

3. Морозова A.B., Сковородкнн И.Н., Хайтлина С.Ю., Малинин А.Ю. (2001) Бактериальная протеаза ЕСР32, специфически расщепляющая актин, и ее воздействие на цитоскелет in vivo. Биохимия, 66 (1), 105-113.

4. Морозова A.B., Хайтлина С.Ю., Малинин А.Ю. (2011) Белок теплового шока Dnak субстрат бактериальной протеазы ЕСР32, специфически расщепляющей актин. Биохимия, 76(4), 558-565.

5. Супотницкий М.В. (2005) Микроорганизмы, токсины и эпидемии. М.: «Вузовская книга»

6. Уикли Б. (1975) Электронная микроскопия для начинающих. М.: «Мир», 324 с.

7. Усманова A.M., Хайтлина С.Ю. (1989) Протеаза из штамма бактерий Е. coli А2, специфически расщепляющая актин. Биохимия, 54 (8), 1308-1314.

8. Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., Комиссарчик Я.Ю. (2003) Динамика актиновых филаментов при инвазии эукариотических клеток бактериями. Биол. мембраны, 20(1), 33-39.

9. Цаплина O.A., Хайтлина С.Ю. (2011) Свойства актина, расщепленного протеализином. Материалы XXIII Международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. Стр. 9.

10. Цаплина О.А., Ефремова Т.Н., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю. (2011) Локализация протеализина при инвазии бактерий-продуцентов в эукариотические клетки. Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск. Стр. 408.

11. Цаплина О.А., Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В., Хайтлина С.Ю. (2009) Выявление актиназной активности протеализина. Биохимия, 74(6), 797-804.

12. Alonso A., Garcia-del Portillo F. (2004) Hijacking of eukaryotic functions by intracellular bacterial pathogens. Int. Microbiol., 7(3), 181-191.

13. Antonny В., Bigay J., Chabre M. (1990) A novel magnesium-dependent mechanism for the activation of transducin by fluoride. FEBSLett., 268(1), 277-280.

14. Antonny В., Sukumar M., Bigay J., Chabre M., Higashijima T. (1993) The mechanism of aluminum-independent G-protein activation by fluoride and magnesium. 31P NMR spectroscopy and fluorescence kinetic studies. J. Biol. Chem., 268(4), 2393-2402.

15. Barth H., Aktories K. (2011) New insights into the mode of action of the actin ADP-ribosylating virulence factors Salmonella enterica SpvB and Clostridium botulinum C2 toxin. Eur. J. Cell Biol., 90(11), 944-950.

16. Barzu S., Benjelloun-Touimi Z., Phalipon A., Sansonetti P., Parsot. C. (1997) Functional analysis of the Shigella flexneri IpaC invasin by insertional mutagenesis. Infect. Immun., 65, 1599-1605.

17. Bierne H., Gouin E., Roux P., Caroni P., Yin H.L., Cossart P. (2001) A role for cofilin and LIM kinase in Listeria-induced phagocytosis. J. Cell Biology, 155, 101-112.

18. Bogatcheva N.V., Wang P., Birukova A.A., Verin A.D., Garcia J.G.N.2006) Mechanism of fluoride-induced MAP kinase activation in pulmonary artery endothelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 290, LI 139-L1145.

19. Bourdet-Sicard R., Rüdiger M., Jockusch B.M., Gounon P., Sansonetti P.J., Nhieu G.T. (1999) Binding of the Shigella protein IpaA to vinculin induces F-actin depolymerization. EMBOJ., 18(21), 5853-5862.

20. Boyle E.C., Finlay B.B. (2003) Bacterial pathogenesis: exploiting cellular adherence. Curr. Opin. Cell Biol., 15(5), 633-639.

21. Bozhokina E.S., Khaitlina S.Yu., Adam T. (2008) Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. Biochem. Biophys: Res. Commun., 367, 888-892.

22. Braun V., Neuss B., Ruan Y., Schiebel E., Schöffler H., Jander G. (1987) Identification of the Serratia marcescens hemolysin determinant by cloning into Escherichia coli. J. Bacteriol, 169(5), 2113-2120.

23. Cain R.J., Hayward R.D., Koronakis V. (2008) Deciphering interplay between Salmonella invasion effectors. PLoSPathog., 4(4), el000037.

24. Campellone K., Leong J. (2005) Nck-independent actin assembly ismediated by two phosphorylated tyrosines within enteropathogenic Escherichia coli Tir. Mol. Microbiol., 56, 416-432.

25. Campellone K.G., Rankin S., Pawson T., Kirschner M.W., Tipper D.J., Leong J.M. (2004) Clustering of Nek by a 12-residue Tir phosphopeptide is sufficient to trigger localized actin assembly. J. Cell Biol., 164(3), 407-416.

26. Chabra E.S., Higgs H.N. (2007) The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Structural Biol, 9, 1110-1121.

27. Coburn B., Sekirov I., Finlay B.B. (2007) Type III secretion systems and disease. Clin. Microbiol Rev., 20(4), 535-549.

28. Combeau C., Carlier M.F. (1988) Probing the mechanism of ATP hydrolysis on F-actin using vanadate and the structural analogs of phosphate BeF-3 and A1F-4. J. Biol. Chem., 263(33), 17429-36.

29. Cossart P., Lecuit M. (1998) Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBOJ., 17(14), 3797-3806.

30. Cossart P., Sansonetti P.J. (2004) Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science, 304, 242-248.

31. Dai S., Sarmiere P.D., Wiggan O., Bamburg J.R., Zhou D. (2004) Efficient Salmonella entry requires activity cycles of host ADF and cofilin: Cell Microbiol., 6, 459-471.

32. Dai S., Sarmiere P.D., Wiggan O., Bamburg J.R., Zhou D. (2004) Efficient Salmonella entry requires activity cycles of host ADF and cofilin. Cell Microbiol., 6(5), 459-71.

33. De Kreij A., Venema G., van den Burg B. (2000) Substrate specificity in the highly heterogeneous M4 peptidase family is determined by a small subset of amino acids. J. Biol. Chem., 275(40), 31115-31120.

34. Demidyuk I.V., Gromova T.Y., Polyakov K.M., Melik-Adamyan W.R., Kuranova I.P., Kostrov S.V. (2010) Crystal structure of the protealysin precursor: insights into propeptide function. J.Biol.Chem., 285(3), 2003-2013.

35. Duelos S., Desjardiris M. (2000) Subversion of a young phagosome: the survival strategies of intracellular pathogens. Cell Microbiol., 2, 365-377.

36. Efremova T.N., Ender N.A., Brudnaja M.S., Komissarchik Y.Y., Khaitlina S.Y. (2001) Specific invasion of transformed cells by Escherichia coli A2 strain. Cell Biol. Int., 25, 557-561.

37. Egelman E.H. (2003) Actin's prokaryotic homologs. Curr. Opin. Struct. Biol., 13, 244-248.

38. Eitel J., Dersch P. (2002) The YadA protein of Yersinia pseudotuberculosis mediates high-efficiency uptake into human cells under environmental conditions in which invasin is repressed. Infect Immun., 70(9), 4880-4891.

39. Fenteany G., Zhu S. (2003) Small-molecule inhibitors of actin dynamics and cell motility, Curr. Top Med. Chem., 3, 593-616.

40. Fu Y., Galán J.E. (1999) A Salmonella protein antagonizes Rac-1 and Cdc42 to mediate host-cell recovery after bacterial invasion. Nature., 401(6750), 293297.

41. Galán J.E., Cossart P. (2005) Host-pathogen interactions: a diversity of themes, a variety of molecular machines. Curr. Opin. Microbiol., 8(1), 1-3.

42. Galán J.E., Wolf-Watz H. (2006) Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature, 444(7119), 567-573.

43. Garmendia J., Frankel G., Crepin V.F. (2005) Enteropathogenic and ■enterohemorrhagic Escherichia coli infections: translocation, translocation,translocation. Infect. Immun., 73(5), 2573-2585.

44. Gouin E., Welch M.D., Cossart P. (2005) Actin-based motility of intracellular pathogens. Curr. Opin. Microbiol., 8(1), 35-45.

45. Gromova T.Y., Demidyuk I.V., Kozlovskiy V.l., Kuranova I.P., Kostrov S.V. (2009) Processing of protealysin precursor. Biochimie, 91, 639-645. .

46. Häse C.C., Finkelstein R.A. (1993) Bacterial extracellular zinc-containing metalloproteases. Microbiol. Rev., 57(4), 823-837.

47. Heckeis J.E., Blackett B., Everson J.S., Ward M.E. (1976) The influence of surface charge on the attachment of Neisseria gonorrhoeae to human cells. J. Gen. Microbiol., 96, 359-364.

48. Hejazi A., Falkiner F.R. (1997) Serratia marcescens. J. Med. Microbiol., 46(11), 903-912.

49. Hertie R. (2005) The family of Serratia type pore forming toxins. Curr. Protein Pept. Sei., 6(4), 313-325.

50. Hertie R., Schwarz H. (2004) Serratia marcescens internalization and replication in human bladder epithelial cells. BMC Infect. Dis., 4, 16.

51. High N., Mounier J., Prevost M.C., Sansonetti P.J. (1992) IpaB of Shigella flexneri causes entry into epithelial cells and escape from the phagocytic vacuole. EMBO J. 11, 1991-1999.

52. Hines D.A., Saurugger P.N., Ihler G.M., Benedik M.J. (1988) Genetic analysis of extracellular proteins of Serratia marcescens. J. Bacteriol., 170(9), 41414146.

53. Holmes K. C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. (1990) Atomic model of the actin filament. Nature, 347, 44-49.

54. Huang Z., Sutton S.E., Wallenfang A.J., Orchard R.C., Wu X., Feng Y., Chai J., Alto N.M. (2009) Structural insights into host GTPase isoform selection by a family of bacterial GEF mimics, Nat. Struct. Mol. Biol, 16, 853-860.

55. Jaconi M.E., Lew D.P., Monod A., Krause K.H. (1993) The regulation of store-dependent Ca2+ influx in HL-60 granulocytes involves GTP-sensitive elements. J. Biol. Chem., 68, 26075-26078.

56. Jonathan J.D., Gerben J.Z. (1998) Plasposons: Modular Self-Cloning Minitransposon Derivatives for Rapid Genetic Analysis of Gram-Negative Bacterial Genomes. Appl. Environ. Microbiol., 64(7), 2710-2715.

57. Khaitlina S. Yu., Hinssen H. (1997) Conformational changes in actin induced by its interaction with gelsolin. Biophys. J., 73, 929-937.

58. Khaitlina S. Yu., Moraczewska J., Strzelecka-Golaszewska H. (1993) The actin-actin interactions involving the N-terminal portion of the DNase I-binding loop are crucial for stabilisation of the actin filament. Eur. J. Biochem., 218, 911-920.

59. Khaitlina S. Yu., Smirnova T. D., Usmanova A. M. (1988) Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease. FEBS Lett., 228, 172-174.

60. Khaitlina S. Yu., Strzelecka-Golaszewska H. (2003) Effects of tropomyosin on dynamics of actin filaments. Biophys. J., 84(Pt 2), 480a.

61. Khaitlina S., Antropova O., Kuznetsova I., Turoverov K., Collins J. H. (1999) Correlation between polymerizability and conformation in scallop P-like actin and rabbit sceletal muscle a-actin. Arch. Biochem. Biophys., 368(1), 105-111.

62. Khaitlina S.Y., Strzelecka-Golaszewska H. (2002) Role of the DNase-I-binding loop in dynamic properties of actin filament. Biophys. J., 82, 321-334.

63. Khaitlina S.Yu., Collins J.H., Kusnetsova I.M., Pershina V.P., Synakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M. (1991) Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E. coli A2 strain. FEBS Lett., 279, 49-51.

64. Khan A.R., James M.N.G. (1998) Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. Prorein Science., 7, 813-836.

65. Kida Y., Inoue H., Shimizu T., Kuwano K. (2007) Serratia marcescensserralysin induces inflammatory responses through protease-activated receptor 2. Infect. Immun., 75(1), 164-174.

66. Kodama T., Fukui K., Kometani K. (1986) The initial phosphate burst in ATP hydrolysis by myosin and subfragment-1 as studied by a modified Malachite Green method for determination of inorganic phosphate. J. Biochem., 99, 1465-1472.

67. König W., Faltin Y., Scheffer J., Schöffler H., Braun V. (1987) Role of cell-bound hemolysin as a pathogenicity factor for Serratia infections. Infect. Immun., 55(11), 2554-2561.

68. Kouyama T., Mihashi K. (1981) Fluorimetry study of N-(1-pyrenyl)iodoacetamide-labelled F-actin. Local structural change of actin protomer both on polymerization and on binding of heavy meromyosin. Eur. J. Biochem.;114(1), 33-38.

69. Kudryashov D.S., Cordero C.L., Reisler E., Satchell K.J. (2008) Characterization of the enzymatic activity of the actin cross-linking domain from the Vibrio cholerae MARTX Vc toxin. J. Biol. Chem., 283, 445-452.

70. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

71. Lafont F., Tran Van Nhieu G., Hanada K., Sansonetti P. and van der Goot F. G. (2002) Initial steps of Shigella infection depend on the cholesterol/sphingolipid raft-mediated CD44-IpaB interaction. EMBO J., 21, 44494457.

72. Lambert M.A., Smith S.G. (2009) The PagN protein mediates invasion via interaction with proteoglycan. FEMS Microbiol. Lett., 297, 209-216.

73. Leranoz S., Orüs P., Berlanga M., Dalet F., Vinas M. (1997) New fimbrial adhesins of Serratia marcescens isolated from urinary tract infections: description and properties. J. Urol., 157(2), 694-698.

74. Lilie M., Galkin V.E., Orlova A., VanLoock M.S., Egelman E.H., Stebbins C.E. (2003) Salmonella SipA polymerizes actin by stapling filaments with nonglobular protein arms. Science, 301, 1918-1921.

75. Margarit S.M., Davidson W., Frego L., Stebbins C.E. (2006) A steric antagonism of actin polymerization by a salmonella virulence protein. Structure, 14, 1219-1229.

76. Marty KB., Williams C.L., Guynn L.J., Benedik M.J., Blanke S.R. (2002) Characterization of a cytotoxic factor in culture filtrates of Serratia marcescens. Infect. Immun., 70(3), 1121-1128.

77. Matthews B.W., (1988) Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. Acc. Chem. Res., 21, 333-340.

78. Matveyev V.V., Usmanova A.M., Morozova A.B., Khaitlina S.Yu. (1996) Purification and characterization of the proteinase ECP32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. biophys. acta., 1296, 55-62.

79. McGhie E.J., Hayward R.D., Koronakis V. (2001) Cooperation between actin-binding proteins of invasive Salmonella-. SipA potentiates SipC nucleation and bundling of actin. EMBOJ., 20(9), 2131-2139.

80. Mornet D, Ue K. (1984) Proteolysis and structure of skeletal muscle actin. Proc Natl Acad Sei USA., 81(12), 3680-3684.

81. Morton W.M., Ayscough K.R., McLaughlin P.J. (2000) Latrunculin alters the actin-monomer subunit interface to prevent polymerization. Nat. Cell Biol., 2, 376378.

82. Mounier J., Laurent V., Hall A., Fort P., Carlier M.F., Sansonetti P.J., Egile C. (1999) Rho family GTPases control entry of Shigella flexneri into epithelial cells but not intracellular motility. J. Cell Sei., 112 (Pt 13), 2069-2080.

83. Mühlrad A., Cheung P., Phan B.C., Miller C., Reisler E. (1994) Dynamic properties of actin. Structural changes induced by beryllium fluoride. J. Biol. Chem., 269(16), 11852-11858.

84. Navarro-Garcia F, Sonnested M, Teter K. (2010) Host-Toxin Interactions Involving EspC and Pet, Two Serine Protease Autotransporters of the Enterobacteriaceae. Toxins (Basel), 2(5), 1134-1147.

85. Navarro-Garcia F., Sears C., Eslava C., Cravioto A., Nataro J.P. (1999) Cytoskeletal effects induced by Pet, the serine protease enterotoxin of enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun., 67, 2184-2192.

86. Ogawa M, Sasakawa C. (2006) Shigella and autophagy. Autophagy., 2(3), 171-174.

87. Okamoto T., Akaike T., Suga M., Tañase S., Horie H., Miyajiina S., Ando M., Ichinose Y., Maeda H. (1997) Activation of human matrix metalloproteinases by various bacterial proteinases. J. Biol. Chem., 212(9), 6059-6066.

88. Pantaloni D., Clainche C. L., Carlier M.-F. (2001) Mechanism of actin-based motility. Science, 292, 1502-1506.

89. Patel J.C., Galán J.E. (2006) Differential activation and function of Rho GTPases during Salmonella-host cell interactions. J. Cell Biol., 175(3), 453-463.

90. Pentecost M., Kumaran J., Ghosh P., Amieva M.R. (2010) Listeria monocytogenes internalin B activates junctional endocytosis to accelerate intestinal invasion. PLoSPathog., 6(5), el000900.

91. Pivovarova A.V., Khaitlina S.Yu., Levitsky D.I. (2010) Specific cleavage of the DNase-I binding loop dramatically decreases the thermal stability of actin. FEBSJ., 277,3812-3822.

92. Poole K., Schiebel E., Braun V. (1988) Molecular characterization of the hemolysin determinant of Serratia marcescens. J. Bacteriol., 170(7), 3177-3188.

93. Rathman M., de Lanerolle P., Ohayon H., Gounon P., Sansonetti P. (2000) Myosin light chain kinase plays an essential role in S. flexneri dissemination. J. Cell Sci., 113,3375-3386.

94. Reisler E., Egelman E.H. (2007) Actin structure and function: what we still do not understand. J. Biol. Chem., 282, 36133-36137.

95. Rosqvist R., Forsberg A., Wolf-Watz H. (1991) Intracellular targeting of the Yersinia YopE cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption. Infect. Immun., 59(12), 4562-4569.

96. Ruan Y., Braun V. (1990) Hemolysin as a marker for Serratia. Arch. Microbiol., 154(3), 221-225.

97. Sansonetti P.J. (2001) Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial-mucosal interactions III. Shigellosis: from symptoms to molecular pathogenesis. Am. J. Physiol .Gastrointest. Liver Physiol., 280(3), G319-323.

98. Sansonetti P.J. (2001) Rupture, invasion and inflammatory destruction of the intestinal barrier by Shigella, making sense of prokaryote-eukaryote cross-talks. FEMS Microbiol. Rev., 25(1), 3-14.

99. Schroeder G.N., Hilbi H. (2008) Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin. Microbiol. Rev., 21(1), 134-156.

100. Schweizer H. (1992) Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColEl-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Mol. Microbiol., 6, 1195-1204.

101. Selbach M., Backert S. (2005) Tyrosine-phosphorylated bacterial effector proteins: the enemies within. Trends Microbiol. 13, 181-189.

102. Shi J., Scita G., Casanova J.E. (2005) WAVE2 signaling mediates invasion of polarized epithelial cells by Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem., 280(33), 29849-29855.

103. Spiering D., Hodgson L. (2011) Dynamics of the Rho-family small GTPases in actin regulation and motility. Cell Adh. Migr., 5(2), 170-180.

104. Stebbins C.E., Galan J.E. (2001) Structural mimicry in bacterial virulence, Nature, 412, 701-705.

105. Sternweis P.C., Gilman A.G. (1982) Aluminum: a requirement for activation of the regulatory component of adenylate cyclasc by fluoride. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79(16), 4888-4891.

106. Stetler-Stevenson W.G., Yu A. E. (2001) Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Cancer Biol, 11, 143-152.

107. Stone C.B., Bulir D.C., Emdin C.A., Pirie R.M., Porfilio E.A., Slootstra J.W., Mahony J.B. (2011) Chlamydia pneumoniae CdsL regulates CdsN ATPase activity, and disruption with a peptide mimetic prevents bacterial invasion. Front. Microbiol., 2, 21.

108. Strzelecka-Golaszewska H. (2001) Divalent cations, nucleotides, and actin structure. In: Molecular interactions of actin. Berlin; Heidelberg: Springer Verlag. 23

109. Theriot J.A. (1995) The cell biology of infection by intracellular bacterial pathogens. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 11, 213-239.

110. Tran Van Nhieu G., Caron E., Hall A., Sansonetti P. J. (1999) IpaC induces actin polymerization and filopodia formation during Shigella entry into epithelial cells. EMBO J., 18, 3249-3262.

111. Vallance B.A., Finlay B.B. (2000) Exploitation of host cells by enteropathogenic Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97(16), 8799-8806.

112. Vavylonis D, Yang Q, O'Shaughnessy B. (2005) Actin polymerization kinetics, cap structure, and fluctuations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(24), 85438548.

113. Velge P., Bottreau E., Van-Langendonck N., Kaeffer B. (1997) Cell proliferation enhances entry of Listeria monocytogenes into intestinal epithelial cells by two proliferation-dependent entry pathways. J. Med. Microbiol., 46(8), 681-92.

114. Watarai M., Funato S., Sasakawa C. (1996) Interaction of Ipa proteins of Shigella flexneri with a5(31 integrin promotes entry of the bacteria into mammalian cells. J. Exp. Med., 183, 991-999.

115. Wawro B., Khaitlina S.Yu., Galinska-Rakoczy A., Strzelecka

116. Golaszewska H. (2005) Role of DNase I-binding loop in myosin subfragment 1-induced actin polymerization. Implications to the polymerization mechanism. Biophys. J., 88, 2883-2896.

117. Zhou D., Mooseker M.S., Galán J.E. (1999) Role of the S. typhimurium actin-binding protein SipA in bacterial internalization. Science, 283, 2092-2095.