Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат наук Смирнова Анна Вячеславна

• Смирнова Анна Вячеславна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Смирнова Анна Вячеславна

Оглавление

Список сокращений

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Разработанность темы

Цели исследования

Задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Внедрение результатов

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности полученных результатов

Личное участие автора в проведенных исследованиях

Апробация работы

Публикации по теме исследования

Объем и структура диссертации

Глава 1. Обзор литературы

1. Рак толстой кишки. Современные представления о патологии

1.1.Формирование первичной опухоли толстой кишки: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности

1.2.Воспаление как фактор развития опухолевого роста

1.2.1. Модели для исследования рака толстой кишки

1.2.2. Диффузная эндокринная система толстой кишки у человека и лабораторных животных (крыс)

1.3. Ацетилхолин

Глава 2. Материалы и методы

2.1.Общий дизайн исследования

2.2.Эксперименты in vitro

2.2.1. Краткое описание клеточной линии рака толстой кишки SW620

2.2.2. Методы работы с культурой клеток

2.3. Эксперименты in vivo

2.3.1. Экспериментальные модели in vivo

2.3.1.1.Моделирование язвы толстой кишки

2.3.1.2.Моделирование опухолей толстой кишки

2.3.1.3.Моделирование язвы толстой кишки в сочетании с введением канцерогена

2.3.2.Биохимические методы и гистологическая техника

2.4. Статистическая обработка результатов

Глава3 Собственные результаты и обсуждение

3.1. Биологические эффекты от воздействия ацетилхолина на опухолевые клетки SW620

3.1.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина для in vitro исследований

3.1.2. Сопоставление полученных данных и определение пролиферативной активности вещества

3.1.3. Микроскопический анализ влияния ацетилхолина на характер роста популяций SW620

3.1.4. Исследование концентрации EGF, ММР-3 и ММР-9

3.1.5. Влияние ацетилхолина на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости человека первого и второго классов

3.1.6. Влияние ацетилхолина на фазы клеточного цикла клеточной линии SW620

3.2. Влияния ацетилхолина на рост и развитие полипов толстой кишки у крыс

3.2.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина для in vitro исследований

3.2.2. Патофизиологические изменения внутренних органов на фоне применения канцерогена АОМ

3.2.3 Патофизиологические изменения внутренних органов при моделировании язвы в сочетании с введением канцерогена АОМ

3.2.4. Сравнительная оценка концентраций EGF и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей в экспериментальных моделях

3.3. Анализ причин летальности и послеоперационных осложнений при работе с животными

Выводы

Практические рекомендации

Перспективы дальнейшей разработки темы

Библиография

Список сокращений

1 АОМ 1,2-азоксиметан

2 Ах Ацетилхолин

3 БСА Бычий сывороточный альбумин V фракция

4 БАВ Биологически-активные вещества

5 ВОК Восходящая ободочная кишка

6 ДМСО Диметилсульфоксид

7 ДЭС Диффузно расположенная эндокринная система

8 ИФА Иммунно-ферментаный метод

9 КФ Культуральный флакон

10 МКА Моноклональные антитела

11 МТТ Соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида

12 МТТ-метод Метод по Mosmann для определения жизнеспособности клеток. Метаболизм тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида в формазан

13 НС Нервная система

14 ОК Опухолевые клетки

15 РТК Рак толстой кишки

16 СК Среда культивирования

17 СО Слизистая оболочка

18 СлК Слепая кишка

19 ТЭС Телячья эмбриональная сыворотка

20 ФСБ Фосфатно-солевой буфер

21 ЦНС Центральная нервная система

22 APUD Amine Precursor Uptake and Decarboxylation, ДЭС

23 CVS От GristallViolet Staining

24 EGF Эпидермальный фактор роста

25 HLA Главный комплекс гистосовмесимости человека

26 ММР-3 Матриксная металлопротеиназа (протеаза) 3-его типа

27 ММР-9 Матриксная металлопротеиназа (протеаза) 9-его типа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo»

Общая характеристика работы Актуальность темы

Рак толстой кишки (РТК) 25 лет занимает первые места в структуре опухолевых заболеваний в экономически-развитых странах (Давыдов М.И., 2011). К этиологическим и факторам риска относят наследственную предрасположенность (Корчагина, 2009), возраст, хронический стресс и длительное воспаление органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), нерациональное питание (Савицкий С.Э., 2009). Биологические особенности развития РТК не позволяют создать полноценную программу скринига (Моисеенко, Волков, 2014, Д.Г. Заридзе, 2009) и/или создать адекватную исследовательскую модель для экспериментальной онкологии (Corpet DE,

2003).

Биологически активные вещества нейроэндокринного происхождения обладают способностью изменять физиологические процессы, происходящие в ЖКТ. Ацетилхолин (Ах) активно участвует в данных процессах. Вопрос его вовлеченности в процесс воспаления достаточно изучен (Трубицына И.Е.,

2004); (Парфенов, 2002); (Трубицына И.Е., Винокурова, 2006); (Коротько, 2009), однако остается много вопросов о его влиянии на начальный этап канцерогенеза при хроническом воспалении. Слизистая оболочка ЖКТ выполняет функции диффузной эндокринной железы, относящейся к APUD-системе. Она имеет как прямую, так и обратную связь с центральной нервной системой (Воробьев А.В., 2010), и известно, что клетки этой системы -апудоциты- обеспечивают метаболизм биогенных аминов, и ацетилхолина (Ах) в частности. Благодаря Ах и его действию на эту систему происходит регуляция секреции пептидных гормонов, которые вовлечены в начальный этап роста опухолевых клонов и способствуют их селекции (Blankenstein,

2005)(Arias, etal, 2009). Исследования в данной области проводятся активно с конца 90х гг ХХ века, когда было показано одновременное нейрональное и гуморальное влияние Ах: прямое (через систему рецепторов клеток слизистой

оболочки кишки), и ненейрональное - через систему биологически активных веществ, выделяемых апудоцитами (Pelisser-Rota, etal, 2013).

В 2000гг. предположили, что Ах может продуцироваться и/или накапливаться опухолевыми клетками, которые стимулируют свой рост благодаря его наличию в окружающих тканях (Delbro, 2012; Novotny, et al., 2011). Установлено, что процессы нарушения гомеостаза Ах в тканях и опухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки (СОТК) связаны, а клетки многих клеточных линий экспрессируют рецепторы к Ах (Belo A., 2011, Pelisser-Rota, etal2013).

Отсутствие полноценной экспериментальной модели, воспроизводящей опухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки у лабораторных животных (Corpet D.E., 2003) является причиной активного исследования генетических причин опухолей. Однако распространенность такого вида опухолей не велика, и учитывая данный факт требуется изучение спонтанного, а также связанного с воспалением опухолевого роста. Таким образом, изучение роли Ах в процессах опухолевого роста как на изолированной системе (in vitro), так и в организме (in vivo) является актуальным направлением для экспериментальной онкологии и патофизиологии.

Разработанность темы

Несмотря на активное изучение молекулярных механизмов возникновения опухолей, в том числе и рака толстой кишки (РТК), остается неразработанной область нейро-иммуно-эндокринной регуляции данного процесса. Вопрос о нейрональной регуляции опухолевого роста в кишечнике до сих пор изучен недостаточно подробно, что ставит задачу изучить роль ацетилхолина в опухолевом росте

Цели исследования

Установить возможные патофизиологические механизмы влияния

ацетилхолина на процесс пролиферации клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки in vivo и in vitro.

Задачи исследования

1. На модели in vitro выявить влияние различных доз ацетилхолина на

опухолевую клеточную линию клеток SW620 (рак толстой кишки человека).

2. Определить in vitro концентрации ацетилхолина, которые способствуют изменению количества митозов в популяции опухолевых клеток.

3. Выявить in vitro влияние ацетилхолина на уровень экспрессии поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов опухолевых клеток.

4. Создать экспериментальные модели для изучения начальных этапов роста опухоли толстой кишки у крыс.

5. Определить изменение концентрации ацетилхолина в слизистой оболочке толстой кишки в динамике заживления язвенного дефекта.

6. Определить влияние ацетилхолина на изменение концентрации эпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в экстрактах слизистой оболочки толстой кишки у крыс.

Научная новизна

1. Впервые для исследования патофизиологического значения ацетилхолина в разных модельных системах применили метод параллельного изучения факторов межклеточного взаимодействия: эпидермального фактора роста и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.

2. Впервые разработана модель опухолевого роста в толстой кишке у крыс путем индукции воспаления в сочетании с введением 1,2-азоксиметана.

3. Определены факторы, влияющие на рост полипов толстой кишки у крыс с разным способом индукции первичной трансформации.

4. Впервые параллельно in vitro и in vivo определено влияние ацетилхолина на концентрацию матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов и эпидермального фактора роста.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показана тесная взаимосвязь между процессом пролиферации клеток толстой кишки крыс, как в нормальной ткани, так и на фоне воспалительного

процесса. Концентрация ацетилхолина в образцах тканей может быть использована в качестве маркера фазы воспаления слизистой оболочки толстой кишки. Разработанные модели могут быть использованы в экспериментальной онкологии.

Методология и методы исследования

1. Методы поиска, анализа и обобщения литературных данных: перевод и создание библиотеки по материалам конференций, лекций и статей; теоретический анализ и обобщение специализированной литературы;

2. Методы моделирования и ветеринарной работы: наблюдение, оперативное вмешательство и послеоперационный уход;

3. Методы работы с клетками эукариот;

4. Биохимические методы исследования: титрование по Хестрину в модификации Трубицыной И.Е.;

5. Методы работы на проточном цитометре: реакция прямой иммунофлюорисценции, детекция и создание шаблонов-оригиналов, работа с витальными красителями для работы с клетками эукариот;

6. Методы аналитической химии: приготовление растворов, измерение оптической плотности растворов, измерение рН среды;

7. Методы математической обработки полученных экспериментальных данных: анализ данных на распределение, проведение исследования внутри экспериментального массива, сравнение между сериями экспериментальных данных.

Внедрение результатов

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского института РУДН

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ацетилхолин оказывает влияние на опухолевые клетки SW620 in vitro. В зависимости от дозы он может как стимулировать рост клеток, так и вызывать их гибель.

2. Ацетилхолин in vitro в низких концентрациях (от 10-4М и ниже) способен влиять на синтез интрацеллюлярных молекул эпидермального фактора роста и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.

3. Разработанные экспериментальные модели позволяют изучать начальные этапы роста опухоли толстой кишки у крыс.

4. Концентрация Ах в первые трое суток от начала воспаления определяет нормальную пролиферативную активность клеток в зоне альтерации. Предложена возможность использования концентрации ацетилхолина как маркера воспаления слизистой оболочки толстой кишки крыс.

Степень достоверности полученных данных

Клетки линии SW620 были использованы согласно договора о безвозмездном научном сотрудничестве между ЦНИИГ и Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. Для работы на клеточной культуре использовали стандартную производственную питательную среду и кондиционирующие добавки, телячью эмбриональную сыворотку, сертифицированную для работы с культурами клеток (все производства ПанЭко, РФ). Пластик и расходные материалы использовали одноразовый. Посуду из стекла использовали только для кратковременного хранения растворов и воды для разведения. Для экспериментов in vivo использовали белых лабораторных крыс Wistar из разведения питомника ФИБХ им. Овчинникова-Шемякина РАН (МО г. Пущино-на-Оке).

Для оценки статистически значимых различий использовали данные полученных в сериях экспериментов. Оценку проводили после определения типа распределения данных, и использовали непараметрические критерии сравнения как парных зависимых (внутри эксперимента), так и парных независимых выборок (серия экспериментов). При оценке динамики изменений исследуемых параметров применяли многопараметрические критерии.

Личное участие автора в проведенных исследованиях

Автором самостоятельно выполнен основной объем экспериментов, проведены обработка и анализ полученных данных, подготовлен иллюстративный материал, описаны и сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены в форме докладов и тезисов на ежегодных сессиях ЦНИИГастроэнтерологии, ГБУЗ МКНЦ ДЗМ 41-я Научная сессия ЦНИИГ XXXIX сессия ЦНИИ гастроэнтерологии "Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» 2012г «Расширяя границы» 5-6 марта 2015 год, «Принципы доказательной медицины в клиническую практику» 2-3 марта 2016 года симпозиум «Фундаментальная наука для практической медицины» конференциях ФГБУ«РОНЦ им. Н. Н. Блохина» МЗ России: Белорусско-Российская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» Минск, 23 - 25 мая 2013 года, XII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» 2015г EPC meeting-2015, Toledo; Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2012 год, материалы 14-ого Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург -Гастро 2012», на расширенном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии РУДН с привлечением сотрудников ГБУЗ МКНЦ ДЗМ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 4 статьи и 13 тезисов в журналах, входящих в перечень, утвержденный ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация построена по традиционному принципу и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Материалы изложены на 146 листах машинописного текста, содержат 25 рисунков и 22 таблицы. Библиографический список включает 197 работ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Рак толстой кишки. Современные представления о патологии

В структуре онкологической заболеваемости в странах Западной и Северной Европы, Северной Америки, Австралии и Японии рак толстой кишки (РТК) составляет 7-14% и 14% для России [6]. Отмечается увеличение заболеваемости в период 2000-2010 годов: среди женщин - 9,2 тысяч, у мужчин - 11,6 тысяч человек в год на сто тысяч населения. В крупных городах отмечают тенденцию к омоложению заболевания, что делает это заболевание социально значимым [6]. Учитывая данные Всемирной Организации Здравоохранения факторами риска для его развития кроме возраста, генетической предрасположенности, наличия хронических очагов воспаления и нерационального питания; является отсутствие полноценной физической активности; чрезмерное употребление алкоголя, курение; воздействие вредных факторов окружающей среды и производственные вредности; длительный стресс [10; 11; 20; 119]. При условии выявления РТК на ранней стадии прогноз лечения положительный, однако в силу особенностей диагностических манипуляций на обследование больные в нашей стране идут не охотно, а получение материала при фиброколоноскопии часто носит субъективный характер [4; 6; 7]. По указанной причине с конца ХХ века разрабатывают методы менее инвазивных процедур, диагностики РТК, которые позволят провести определение молекулярно-биологических показателей, уровень которых изменяется при развитии РТК [5; 11; 45; 66; 81; 160; 131].

Одной из причин отсутствия простого неинвазивного метода диагностики является то, что метаболизм, пролиферация, дифференциация и другие физиологические процессы, происходящие в клетках эпителия слизистой оболочки (СО) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ); регулируются множеством биологически активных веществ (БАВ)

нейроиммуноэндокринного происхождения, которые до настоящее времени

рассматривались преимущественно как нейромедиаторы [59; 81; 130; 131]. Было показано, что они обладают и более широким спектром биологического действия [139].

В обеспечении слаженной деятельности слизистых оболочек ЖКТ, и толстой кишки в частности, ацетилхолину (Ах) отводится центральная роль регулятора физиологических функций [81]. По мнению ряда отечественных патофизиологов (Трубицына И.Е., (1999); Коротько, (2009) органы ЖКТ и центральная нервная система (ЦНС) тесно взаимосвязаны благодаря особой интегрирующей системе (Amine Precursor Uptakeand Decarboxylation, APUD-система) , которая была описана в 1968 году А. Пирсом и до сих пор активно изучается [33]. Клетки данной системы - апудоциты) способны синтезировать, накапливать и декарбоксилировать биогенные амины, вырабатывать пептидные гормоны, оказывая разнообразные регуляторные действия на органы и ткани [89; 90; 113]. БАВ данной системы по принципу «прямой-обратной связи» регулирует деятельность парасимпатической нервной системы, где ацетилхолину отводят центральное положение регулятора сосудистого тонуса, и, таким образом, он может рассматриваться как один из главных регуляторов функций репаративного аппарата клеток слизистых оболочек [81; 86; 185]. Ах может быть как нейронального, так и так называемого «не-нейронального», тканевого синтеза и/или местоположения (тАх) [51; 59; 131; 157] что оказалось характерно для опухолевых клеток [44; 71; 81]. В дальнейшем было показано, что многие стабильные опухолевые клеточные линии имеют рецепторы к Ах [59; 62; 85; 130; 139; 157]. Таким образом, проведение исследований, позволяющих определить степень вовлеченности Ах в процессы опухолевого роста, является актуальным.

Рак - полиэтиологическое заболевание многоклеточного организма. Рак толстой кишки (РТК) является актуальной медико-социальной проблемой в европейских странах и северной Америке [6]. Изучение патогенеза этой нозологии показало тесную взаимосвязь типа питания и течения заболевания [11; 148]. Полученные за 50 лет данные позволили по-новому посмотреть на

моделирование данной патологии в эксперименте [68]. В настоящее время вопросы биомоделирования являются поводом проведения серьезных научных дискуссий [174; 175].

Благодаря исследованиям на животных, было установлено, что общебиологическими закономерностями развития опухолей толстой кишки является наличие синергических воздействий на генетический аппарат клетки [8; 11; 69; 111]. Согласно современной концепции ступенчатого (или многошагового) канцерогенеза, сформулированной норвежским ученым Кнудсоном в 1981 году [124], «формирование опухоли - это не одноразовое событие, а цепь последовательных и взаимосвязанных событий, в ходе которых происходит накопление повреждений генома клеток» - возникает геномная нестабильность. Показано, что важную роль в отборе дефектных клеток играет микроокружение [9; 18; 61; 119]. Особенно выражено это действие в случае развития доброкачественных опухолей - полипов слизистой оболочки [142].

С точки зрения патофизиологии, любой полип слизистой оболочки является опухолью, которая обладает злокачественным потенциалом [8]. Однако его реализация зависит от суммарных стимулирующих факторов, в том числе воспалительного генеза [1; 12; 45; 73; 64; 75; 108]. Этот вывод является частным случаем реализации так называемой «теории раздражения», предложенной Фроловым В. А., (2006). Из этой теории следует, что состояние воспаления тканей ускоряет процессы деления клеток, и, таким образом, качество тканей изменяется [32]. Как было показано ранее, в органах ЖКТ в ответ на воспалительные реакции срабатывает интегральная система -энтериновая система, которая наиболее плотно локализована на СО этих органов и выполняет активную роль в поддержании их физиологической активности. Регуляция этой системы осуществляется через сеть взаимодействий парасимпатической НС и непосредственно самой тканью органа [135]. Таким образом, следуя логике теории, к созданию измененной клетки приведет несколько событий: сверхактивность парасимпатической

системы, активация энтериновой системы и возникновение точки излома при репарации клетки: переход «количество-качество» - т.е. определяется направления эволюции произойдет изменение ДНК - мутация, необходимая для того, чтобы пережить стресс и снять ограничение на рост новой популяции или нет [1; 3; 93; 119;]. При стабильном состоянии окружающих тканей генетические факторы, определяющие активность канцерогенеза, могут длительно «молчать» [76; 96; 128; 188;].

Таким образом, развитие опухолевого клона можно рассматривать двояко. С одной стороны, существует индивидуальная патология генетического материала клетки (наследственные и спонтанные генетические раки), с другой - клон развивается как следствие нарушения системы сигнальных путей в организме в целом (химический канцерогенез и все его варианты) [8]. Оба этих подхода имеют право на существование. Однако, изолированные друг от друга в процессе изучения, они не дают ответа на вопрос - что же происходит в случае возникновения избирательной чувствительности клетки к пролиферативным стимулам в живом организме. На наш взгляд, этот вопрос является краеугольным в процессе изучения этой патологии. В случае сочетанного воздействия на организм, цитокины и нейромедиаторы перестают выполнять свою основную роль и становятся регуляторами роста измененной клетки [116; 128; 130; 131; 141; 143].

Клинически-значимая постепенность изменений в клеточной популяции сформировала определение рака, как хронического, патологического процесса, развивающегося однонаправлено, стадийно и линейно [122], на что делается акцент при изучении клинической онкологии, и, в частности медицинской патофизиологии [1; 8; 141],однако биологически эта микроэволюция проходит более широко. В настоящее время выделены три фазы развития патологии: инициация, промоция и прогрессия опухолевого клона. Они достаточно охарактеризованы, а их изолированной специфике посвящена объемная библиография.

Показано, что на этапе инициации (опухолевой трансформации) происходят изменения на генетическом уровне - микро/макро мутации ДНК, которые можно инициировать введением химических канцерогенов [23]. Отражением возникающих в результате инициации изменений можно считать различного рода дисплазии, разрастания слизистой оболочки, формирования полипов, в том числе слизистой оболочки кишки [1; 47].

Промоция - следующий шаг в развитии опухоли, заключающийся во взаимодействии между трансформированной клеткой и рядом факторов (внешних и/или внутренних); в результате чего образуется обширный клон измененных клеток, т.е. формируется первичный опухолевый узел. Однако сложившаяся на этом этапе опухоль обычно неспособна к инфильтрирующему росту и метастазированию в силу наличия эффекта противоопухолевого иммунного надзора и наличию системы матриксных металлопротеиназ [47; 62; 65]. Этот активный сдерживающий механизм опухолевый клон старательно пытается выключить [3; 41; 53; 65].

Как только данный этап пройден, опухоль способна к неограниченному росту и его самостимуляции. Возникает этап перехода к третей фазе - инфильтрирующему росту и образованию метастазов. Этот процесс имеет выраженную видовую специфичность, что требует уточнения роли нейроактвных веществ в опухолевом росте, так как их действие напрямую изменяет способность опухоли строить собственную систему питания через измененные кровеносные сосуды [67; 68; 69].

1.1. Формирование первичной опухоли толстой кишки: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности

Современная концепция развития злокачественных опухолей ЖКТ, в том числе и из полипов СО ТК, акцентирует внимание на небольшом количестве генов, продукты которых отвечают за адекватную реакцию клетки на митотические сигналы [52]. На сегодняшний день наиболее изучена роль продуктов генов р53, k-ras (BRAF, PTEN и PIK) и apc (ß-катенин, WNT) и

подобных им стимуляторов митоза [34; 73; 77; 141; 142]. Показано, что локальные спорадические изменения в генетическом аппарате (генов опухолевой супрессии и онкогенов) приводят к морфологической перестройке эпителия ТК [126].

Продукты гена k-ras. Официальное название - v-Ki-ras2, (другие названия - kras2, raskl). Этот ген локализован на хромосоме12 (12p12.1); а его продукт - белок р21ras - относится к семейству малых GTPаз (к которым относят и ферменты внутриклеточной деградации нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина) и в норме является медиатором передачи сигналов для рецепторных тирозинкиназ - белков, вовлеченных во внутриклеточный биохимический каскад митотически активной клетки [140].

Наиболее хорошо изучена роль р21ras в сигнальных каскадах Raf/MEK/ERK и RAS/PI3K/PTEN/Akt, которые контролируют пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и выживание клеток как in vivo, так и in vitro. Соматические мутации k-ras при РТК обнаруживают с частотой 20-50%. Мутации уменьшают GTPазную активность р21ras. Снижение активности GTPаз приводит к накоплению в клетке конститутивно активированной GTP-связанной формы белка, который индуцирует пролиферацию и трансформацию клеток [77; 197].

В контексте этих данных при ретроспективном анализе клинических данных было показано [169], что РТК - клинически неоднородное заболевание, которое ассоциировано с нарушениями на молекулярном уровне. Это позволяет выделять две группы нарушений: подтип 1 характеризуется нестабильностью хромосом, подтип 2 - нестабильностью микросателлитов [10; 11; 77; 121; 190; 197] и предположить существование третьего подтипа. Он характеризуюется как имеющий наиболее негативный клинический прогноз. Исследования de Sousa показали наличие такой разновидности опухолей: они были резистентными в отношении препаратов к рецептору эпидермального фактора роста при отсутствии нестабильности

микросателлитов, но выявить специфичные для подтипа мутации исследователям не удалось.

Таким образом, на сегодняшний день, общепринятой является классификация опухолей толстой кишки с двумя типами повреждения генетического аппарата: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности, которые описаны наиболее полно (рисунок 1 и 2).

Рисунок 1 Схема развития опухоли из полипа по пути хромосомной нестабильности

Особенностью развития рака проксимальных отделов толстой кишки является развитие заболевания ассоциированного с накоплением микросателлитных нестабильностей [11]. Что именно является толчком к инициации процесса гиперметилирования и как это приводит энтероциты к неконтролируемой пролиферации СО ТК до сих пор неизвестно [77; 104; 110; 138; 190]. Считается, что активатором этой программы служит хроническое воспаление.

Гиперметилирование 1\/1 СБ 1Ч/1Т АРС Е\/1_

Гиперметилирование Н1_ТР

мьмт

р14АРР

Б1_С5А

Гиперметилирование М1_Н1 МА1 К11_ ИА55Р2А 1ТСЛ4 СПК[М2А/р16

Рисунок 2 Схема развития опухоли из полипа толстой кишки по пути накопления участков гиперметилирования

Учитывая данные молекулярно-генетических исследований периода 80-90х годов, в период 2000-2013гг. исследования РТК как опухолевого процесса с фоном для развития в виде воспаления, были сконцентрированы на роли микроокружения клеток, образующих полипы и метастазирующие опухоли [76; 92; 96; 119; 161; 169; 188; 190]. В частности, достаточно широко освещены в литературе данные об участии макрофагов опухолевой стромы в процессе формирования аденокарциномы из гиперпластических полипов [181]. Установлено, что стромальные опухоль-ассоциированные макрофаги способствуют активации системы мактриксых металлопротеиназ в очаге воспаления и тем самым клетки в зонах репарации, а также и в очагах гиперпластического роста становятся сверхчувствительными к внешним воздействиям: цитокинам [52; 141; 143], нейромедиаторам [131; 136; 157],

индукторам и ингибиторам металлопротеиназам [146] и т.д. По результатам проведенных исследований были сделаны довольно неоднозначные выводы -в зависимости от стадии, степени повреждения генетического аппарата и наличия внешних ко-стимуляторов в условиях in vitro и/или in vivo данные означенные сетеобразно, взаимнорегулирующие синтез друг друга БАВ могут как стимулировать, так и ингибировать рост опухоли, предотвращать трансформацию, подавлять инвазию и/или метастазирование, а их воздействие может носить выраженный локальный характер. Важным наблюдением стало и то, что модель in vivo не всегда воспроизводила результаты in vitro, так как для опухолевого роста в кишке характерно изменение видоспецифичной иммунной реактивности как местного, так и органного уровня [67; 119].

В этот период было установлено, что как в самой ткани полипов, так и в его отдельных участках в разной степени наблюдаются нарушения микроокружения, опосредованные через систему нейромедиаторов и рецепторов к ним, цитокинов и простагландинов, что увеличивает жизнеспособность опухолевых клеток (ОК) [45; 59; 116; 121; 108; 144; 146]. Также было показано, что некоторые металлопротеиназы (ММР-9) является ингибитором нормального апоптоза [93], а их уровень зависит от наличия производных холина в окружающих тканях [65; 136]. В свою очередь они являются стимуляторами синтеза ряда факторов роста, что длительное время оставалось за пределами внимания исследователей [180].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Смирнова Анна Вячеславна, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абелев Г.И., Эрайзер Т.Л. На пути к пониманию природы рака. Обзор // Биохимия. 2008. № 5 (73). С. 605-618.

2. Байсханова Д.М., Омаров Р.Т. Биологически активные продукты на основе пробиотических культур и растительных экстрактов // Биотехнология. Теория и практика. 2012. (2). С. 27-34.

3. Барышников А.Ю. Взаимоотношения опухоли и организма // Практическая онкология. 2003. № 3 (4). С. 127-130.

4. Бурцев Д.В., Кит О.И., Максимов А.Ю. Дифференциальная диагностика воспалительных и онкологических заболеваний кишкчника с помощью молекулярных серологических и копрологических методов // Электронный научный журнал «Современные проблемы науки и образования». 2012. № 37 (4). С. 1-10.

5. Воробьев А.В., Протасова А.Э. Общие вопросы скрининга // Практическая онкология. 2010. № 2 (11). С. 53-59.

6. Давыдов М.И., Аксель А.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 22, №3 (прил. 1), 2011. 2011. № 3 (22). С. 54-93.

7. Емельянов С.И., Урядов С.Е. Колоноскопия при полипах и раке толстой кишки // Эндоскопическая хирургия. 2011. № 49 (2). С. 49-53.

8. Заридзе Д.Г. Канцерогенез / Д.Г. Заридзе, М.: Медицина:, 2004. 576 с.

9. Заридзе Д.Г. Профилактика рака / Д.Г. Заридзе, ИМА-ПРЕСС-е изд., Москва:, 2009. 224 с.

10. Захаржевская Н.Б. [ и др.]. Неинвазивный метод анализа генетических маркеров рака толстой кишки в образцах кала // Колопроктология. 2010. № 31 (1). С. 30-37.

11. Имянитов Е. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака:этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения // Практическая онкология. 2005. № 2 (6). С. 65-70.

12. Имянитов И.Е., Хансон К.П. Фундаментальная онкология: наиболее

примечательные события 2004 года // Практическая онкология. 2005. № 91 (6). C. 1-5.

13. Иншаков А.Н. Фармакодинамическое моделирование чувствительности клеток хронического лимфолейкоза и множественной миеломы к химиопрепаратам in vitro // 2012. 26 с.

14. Костюкевич С.В. Дифференцировка эндокринных клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки у человека и некоторых представителей позвоночных // Цитология. 2004. № 6 (46). C. 506-513.

15. Лазебник Л.Б. [и др.]. Роль молекул адгезии для оценки эффективности стандартной и биологической терапии больных с болезнью Крона // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2013. (3). C. 31-38.

16. Луценко М.Т. Гепатоэнтеральная рециркуляция холестерина // Бюллетень СО РАМН. 2006. № 120 (2). C. 23-28.

17. Молдавская А.А. Фундаментальные исследования 2004. 113 с.

18. Немцова М.В. [и др.]. Молекулярно-генетический анализ клональной внутриопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах // Молекулярная биология. 2008. № 6 (42). C. 1040-1047.

19. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы / А.Д. Ноздрачев, Е.Л. Поляков, СПб: Лань:, 2001. 250 с.

20. Парфенов А.И. На пути к снижению распространенности колоректального рака в Москве:от пилотного исследования к скринингу // Экспериментальная и клиническаягастроэнтерология. 2011. (3). C. 3-5.

21. Петренко В.М. Ободочная кишка у белой крысы // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований «Фундаментальные исслеования» Хорватия, 25июня-1 августа. 2011. (10). C. 41-42.

22. Петренко В.М. Форма и топография слепой кишки у белой крысы // Успехи современного естествознания. 2012. (1). C. 8-11.

23. Попова Н.А. Модели экспериментальной онкологии // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 8 (6). C. 33-38.

24. Прокофьева Д.С., Гончаров Н.В. Действие биогенных и абиогенных

дисульфидов на клетки эндотелия в культуре: сравнение трех методов оценки жизнеспопобности // Цитология. 2014. № 6 (56). С. 410-418.

25. Севумян Д., Амбарцумян Н., Григорян М. Роль хронического воспаления при образовании опухоли и прогресс в понимании механизмов метастазирования // Биологический журнал Армении. 2013. № 65 (1). С. 105109.

26. Смирнова А.В. [и др.]. Изучение влияния аспирина на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на опухолевой линии SW620 // Российсикий биотерапевтический журнал. 2013. № 12 (2).

27. Смирнова А.В. [и др.]. Изучение влияния ацетилхолина на скорость пролиферации клеток SW 620 методом мтт // Российсикий биотерапевтический журнал. 2013. № 2 (12).

28. Смирнова А.В. [и др.]. Количество матриксных металлопротеиназ в слизистой оболочке слепой и ободочной кишки крыс Wistar и морфологическая картина органа на фоне применения 1,2-азоксиметана // Тезисы 42-ой Научной сессии ЦНИИГ 2016год. 2016.

29. Ткаченко Е.В. [и др.]. Состояние тканей легких крыс Wistar, при химической индукци полипов толстой кишки 1,2-азоксиметаном // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2015. № 103 (2).

30. Трубицына И.Е. [и др.]. Повреждающая роль эндогенного оксида азота в развитии экспериментального dss-колита у крыс // Экспериментальная гастроэнтерология. 2010. (3). С. 74-77.

31. Трубицына И.Е., Соколова Г.Н., Губина А.В. Ацетилхолин и серотонин у больных язвенной болезнью и при экспериментальной язве желудка // VI научный форум" Гастро-2004. 2004. С. 178.

32. Чурилов Л.П. О системном подходе в общей патологии: необходимость и принципы патоинформатики // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2009. № 3 (11). С. 5-23.

33. Яглов В.В., Яглова Н.В. Новые концепции биологии диффузной эндокринной системы: итоги и перспективы ее изучения // Вестник

Российской РАМН -. 2012. (4).

34. Amos-Landgraf J.M. [et al.]. A target-selected Apc-mutant rat kindred enhances the modeling of familial human colon cancer 2007. № 1554322.

35. Andelova H., Rudolf E., Cervinka M. Original Article in Vitro Antiproliferative Effects of Sulforaphane on Human Colon Cancer Cell Line Sw620 C. 171-176.

36. Arias H.R. [et al.]. Role of non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors in angiogenesis // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2009. № 7 (41). C. 1441-1451.

37. Ashkenazi, Ramachandran J., Capon D.J. Acetylcholine analogue stimulates DNA synthesis in brain-derived cells via specific muscarinic receptor subtypes. // Nature. 1989. № 6229 (340). C. 146-150.

38. Baez-Pagan C. a., Delgado-Velez M., Lasalde-Dominicci J. a. Activation of the Macrophage a7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of Inflammation // Journal of Neuroimmune Pharmacology. 2015. № 3 (10). C. 468-476.

39. Bajor A., Gillberg P.-G., Abrahamsson H. Bile acids: short and long term effects in the intestine. // Scandinavian journal of gastroenterology. 2010. № 6 (45). C. 645-664.

40. Barnes P.J. New anti-inflammatory targets for chronic obstructive pulmonary disease 2013. № June.

41. Barsoum I.B. [et al.]. Mechanisms of Hypoxia-Mediated Immune Escape in Cancer // Cancer Research. 2014. № 24 (74). C. 7185-7190.

42. Bartoli R. [et al.]. Colonoscopy in rats: An endoscopic , histological and tomographic study 2013. № 5 (5). C. 226-230.

43. Beenken A., Mohammadi M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. // Nature reviews. Drug discovery. 2009. № 3 (8). C. 235-53.

44. Belo A. [et al.]. Muscarinic receptor agonists stimulate human colon cancer cell migration and invasion // AJP: Gastrointestinal and Liver Physiology. 2011. № 5 (300). C. G749-G760.

45. Bettington M. [et al.]. The serrated pathway to colorectal carcinoma: current concepts and challenges // Histopathology. 2013. № 3 (62). C. 367-386.

46. Bissahoyo A. Azoxymethane Is a Genetic Background-Dependent Colorectal Tumor Initiator and Promoter in Mice: Effects of Dose, Route, and Diet // Toxicological Sciences. 2005. № 2 (88). C. 340-345.

47. Blankenstein T. The role of tumor stroma in the interaction between tumor and immune system // Current Opinion in Immunology. 2005. № 2 (17). C. 180-186.

48. Bosani M., Ardizzone S., Porro G.B. Biologic targeting in the treatment of inflammatory bowel diseases. // Biologics: Targets & Therapy. 2009. (3). C. 77-97.

49. Bramanti V. [et al.]. Effect of acetylcholine precursors on proliferation and differentiation of astroglial cells in primary cultures // Neurochemical Research. 2008. № 12 (33). C. 2601-2608.

50. Brown J.R. COX-2: A Molecular Target for Colorectal Cancer Prevention // Journal of Clinical Oncology. 2004. № 12 (23). C. 2840-2855.

51. Bschleipfer T. [et al.]. Expression and distribution of cholinergic receptors in the human urothelium // Life Sciences. 2007. № 24-25 (80). C. 2303-2307.

52. Bujanda L. Malignant colorectal polyps // World Journal of Gastroenterology. 2010. № 25 (16). C. 3103.

53. Burnet F.M. Immunological Aspects of Malignant Disease // The Lancet. 1967. № 7501 (289). C. 1171-1174.

54. Cani P.D. [et al.]. Dietary non-digestible carbohydrates promote L-cell differentiation in the proximal colon of rats // British Journal of Nutrition. 2007. № 1 (98). C. 32.

55. Cani P.D. [et al.]. Involvement of gut microbiota in the development of low-grade inflammation and type 2 diabetes associated with obesity. // Gut microbes. 2012. № 4 (3). C. 279-288.

56. Carmichael J. [et al.]. Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetric Assay: Assessment of Chemosensitivity Testing Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetrie Assay: Assessment // American Association for Cancer Research. 1987. (47). C. 936-942.

57. Cell P.B. [et al.]. Detection and Analysis of a Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase 1979. № 3 (63). C. 635-645.

58. Champaneria M.C. [et al.]. Friedrich Feyrter: A precise intellect in a diffuse system // Neuroendocrinology. 2006. № 5-6 (83). C. 394-404.

59. Cheng K. [et al.]. Acetylcholine release by human colon cancer cells mediates autocrine stimulation of cell proliferation // AJP: Gastrointestinal and Liver Physiology. 2008. № 3 (295). C. G591-G597.

60. Cheng K. [et al.]. Acetylcholine release by human colon cancer cells mediates autocrine stimulation of cell proliferation 2008. (21201). C. 591-597.

61. Cheng K., Raufman J.-P. Bile acid-induced proliferation of a human colon cancer cell line is mediated by transactivation of epidermal growth factor receptors // Biochemical Pharmacology. 2005. № 7 (70). C. 1035-1047.

62. Cheng K., Xie G., Raufman J.-P. Matrix metalloproteinase-7-catalyzed release of HB-EGF mediates deoxycholyltaurine-induced proliferation of a human colon cancer cell line // Biochemical Pharmacology. 2007. № 7 (73). C. 1001-1012.

63. Chiba K., Kawakami K., Tohyama K. Simultaneous evaluation of cell viability by neutral red, MTT and crystal violet staining assays of the same cells // Toxicology in Vitro. 1998. № 3 (12). C. 251-258.

64. Christie M. [et al.]. Different APC genotypes in proximal and distal sporadic colorectal cancers suggest distinct WNT/p-catenin signalling thresholds for tumourigenesis // Oncogene. 2013. № 39 (32). C. 4675-4682.

65. Clark I. [et al.]. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2008. № 6-7 (40). C. 1362-1378.

66. Cooke J.P. Angiogenesis and the role of the endothelial nicotinic acetylcholine receptor // Life Sciences. 2007. № 24-25 (80). C. 2347-2351.

67. Corpet D.E. [et al.]. Most Effective Colon Cancer Chemopreventive Agents in Rats: A Systematic Review of Aberrant Crypt Foci and Tumor Data , 2009. № October 2014. C. 37-41.

68. Corpet D.E., Pierre F. Point: From Animal Models to Prevention of Colon Cancer . Systematic Review of Chemoprevention in Min Mice and Choice of the Model System // Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 2003. № May

(12). C. 391-400.

69. Corpet D.E., Pierre F. How good are rodent models of carcinogenesis in predicting efficacy in humans? A systematic review and meta-analysis of colon chemoprevention in rats , mice and men 2005. (41). C. 1911-1922.

70. Cottrell S. [et al.]. Molecular analysis of APC mutations in familial adenomatous polyposis and sporadic colon carcinomas. // Lancet. 1992. № 8820 (340). C. 626-30.

71. Cucina A. [et al.]. Nicotine stimulates proliferation and inhibits apoptosis in colon cancer cell lines through activation of survival pathways // Journal of Surgical Research. 2012. № 1 (178). C. 233-241.

72. Cusick M.F., Libbey J.E., Fujinami R.S. Molecular Mimicry as a Mechanism of Autoimmune Disease // Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 2012. № 1 (42). C. 102-111.

73. Day F.L. [et al.]. PIK3CA and PTEN Gene and Exon Mutation-Specific Clinicopathologic and Molecular Associations in Colorectal Cancer // Clinical Cancer Research. 2013. № 12 (19). C. 3285-3296.

74. Decock J. [et al.]. Matrix metalloproteinases: protective roles in cancer // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2011. № 6 (15). C. 1254-1265.

75. Delbro D.S. Do neuro-humoral signaling molecules participate in colorectal carcinogenesis/cancer progression? // Neurogastroenterology & Motility. 2012. № 2 (24). C. 96-99.

76. Deloose E. [et al.]. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease // Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 2012. № 5 (9). C. 271-285.

77. Duffy M.J. [et al.]. Tumor markers in colorectal cancer, gastric cancer and gastrointestinal stromal cancers: European group on tumor markers 2014 guidelines update // International Journal of Cancer. 2014. № 11 (134). C. 2513-2522.

78. Dufour A., Overall C.M. Missing the target: matrix metalloproteinase antitargets in inflammation and cancer // Trends in Pharmacological Sciences. 2013. № 4 (34). C. 233-242.

79. Dunn G.P. [et al.]. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. // Nature immunology. 2002. № 11 (3). C. 991-998.

80. Edmondson J.M., Armstrong L.S., Martinez A.O. A rapid and simple MTT-based spectrophotometric assay for determining drug sensitivity in monolayer cultures // Journal of Tissue Culture Methods. 1988. № 1 (11). C. 15-17.

81. Egleton R.D., Brown K.C., Dasgupta P. Nicotinic acetylcholine receptors in cancer: multiple roles in proliferation and inhibition of apoptosis // Trends in Pharmacological Sciences. 2008. № 3 (29). C. 151-158.

82. Español A.J. [et al.]. Role of non-neuronal cholinergic system in breast cancer progression // Life Sciences. 2007. № 24-25 (80). C. 2281-2285.

83. Fiala E.S. Investigation into the metabolism and mode of action of the colon carcinogen 1,2-dimethylhidrazine // Cancer. 1975. (36). C. 2407-2412.

84. Friedman J.M. Leptin at 14 y of age: An ongoing story // American Journal of Clinical Nutrition. 2009. № 3 (89). C. 973-979.

85. Frucht H. [et al.]. Human Colon Cancer Cell Proliferation Mediated by the M 3 Muscarinic Cholinergic Receptor 1 // Clinical Cancer Research. 1999. № September (5). C. 2532-2539.

86. Gahring L.C., Rogers S.W. Neuronal nicotinic acetylcholine receptor expression and function on nonneuronal cells. // The AAPS journal. 2005. № 4 (7). C. E885-E894.

87. Gialeli C., Theocharis a. D., Karamanos N.K. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting // The FEBS Journal. 2011. № 1 (278). C. 16-27.

88. Guizzetti M. [et al.]. Acetylcholine as a mitogen: Muscarinic receptor-mediated proliferation of rat astrocytes and human astrocytoma cells // European Journal of Pharmacology. 1996. № 3 (297). C. 265-273.

89. Gulubova M., Vlaykova T. Chromogranin A-, serotonin-, synaptophysin- and vascular endothelial growth factor-positive endocrine cells and the prognosis of colorectal cancer: An immunohistochemical and ultrastructural study // Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2008. № 10 (23). C. 1574-1585.

90. Gunawardene A.R., Corfe B.M., Staton C. a. Classification and functions of enteroendocrine cells of the lower gastrointestinal tract // International Journal of Experimental Pathology. 2011. № 4 (92). C. 219-231.

91. Guo Y., Lu N., Bai A. Treatment of inflammatory bowel disease with neural stem cells expressing choline acetyltransferase // Medical Hypotheses. 2012. № 5 (79). C. 627-629.

92. Gupta G.P., Massagué J. Cancer Metastasis: Building a Framework // Cell. 2006. № 4 (127). C. 679-695.

93. Halbersztadt A. [et al.]. The role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis // Ginekologia polska. 2006. № 1 (77). C. 63-71.

94. Halpern B., Amache N. Diagnosis of drug allergy in vitro with the lymphocyte transformation test // J Allergy. 1967. № 3 (40). C. 168-181.

95. Holla V.R. [et al.]. Regulation of prostaglandin transporters in colorectal neoplasia // Cancer Prevention Research. 2008. № 2 (1). C. 93-99.

96. Humphries A. [et al.]. OC-016 Human colorectal adenoma growth is characterised by periods of quiescence and rapid clonal expansion // Gut. 2012. № Suppl 2 (61). C. A7-A8.

97. Hylemon P.B. [et al.]. Bile acids as regulatory molecules // The Journal of Lipid Research. 2009. № 8 (50). C. 1509-1520.

98. Improgo M.R. [et al.]. Nicotinic acetylcholine receptors mediate lung cancer growth 2013. № September (4). C. 1-6.

99. Ishiyama M. [et al.]. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highly water-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet. // Biological & pharmaceutical bulletin. 1996. № 11 (19). C. 1518-1520.

100. Itagaki H. [et al.]. An in vitro alternative to the Draize eye-irritation test: Evaluation of the crystal violet staining method. // Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 1991. № 2 (5). C. 139143.

101. Jeffery N. [et al.]. The matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of matrix metalloproteinase profile in colorectal polyp cancers // Histopathology. 2009. № 7

(54). C. 820-828.

102. Jones S. Mini-review: Endocrine actions of fibroblast growth factor 19 // Molecular Pharmaceutics. 2008. № 1 (5). C. 42-48.

103. Keely S., Talley N.J., Hansbro P.M. Pulmonary-intestinal cross-talk in mucosal inflammatory disease // Mucosal Immunology. 2012. № 1 (5). C. 7-18.

104. Kim M.S., Lee J., Sidransky D. DNA methylation markers in colorectal cancer // Cancer and Metastasis Reviews. 2010. № 1 (29). C. 181-206.

105. Klapproth H. [et al.]. Non-neuronal acetylcholine, a signalling molecule synthezised by surface cells of rat and man // Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 1997. № 4 (355). C. 515-523.

106. Koshimizu H. [et al.]. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits // Frontiers in Behavioral Neuroscience. 2011. № December (5). C. 1-10.

107. Kouji H. [et al.]. Molecular and functional characterization of choline transporter in human colon carcinoma HT-29 cells // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2009. № 1 (483). C. 90-98.

108. Lanza G. [et al.]. Colorectal tumors: The histology report // Digestive and Liver Disease. 2011. (43). C. S344-S355.

109. Lappano R., Maggiolini M. GPCRs and cancer // Acta Pharmacologica Sinica. 2012. № 3 (33). C. 351-362.

110. Lee C.-H., Wu C.-H., Ho Y.-S. From Smoking to Cancers: Novel Targets to Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors // Journal of Oncology. 2011. (2011). C. 1-10.

111. Leu R. Le The colonic response to genotoxic carcinogens in the rat: regulation by dietary fibre 2002. № 7 (23). C. 1131-1137.

112. Lindqvist S.M. [et al.]. Acetylcholine-lnduced calcium signaling along the rat colonic crypt axis // Gastroenterology. 1998. № 5 (115). C. 1131-1143.

113. Lloyd R. V [et al.]. Prevalence and Prognostic Significance of Neuroendocrine Differentiation in Colorectal Carcinomas // Endocr Pathol. 1998. № 1 (9). C. 35-42.

114. Lopez-Otin C., Matrisian L.M. Emerging roles of proteases in tumour

suppression. // Nature reviews. Cancer. 2007. № 10 (7). C. 800-808.

115. Marisa L. [et al.]. Gene Expression Classification of Colon Cancer into Molecular Subtypes: Characterization, Validation, and Prognostic Value // PLoS Medicine. 2013. № 5 (10).

116. Martinez-Lopez de Castro A. [et al.]. Cancer-associated differences in acetylcholinesterase activity in bronchial aspirates from patients with lung cancer // Clin Sci (Lond). 2008. № 8 (115). C. 245-253.

117. Mazhar D. COX and cancer // Qjm. 2005. № 10 (98). C. 711-718.

118. Medjber K. [et al.]. Lung Cancer Role of nicotinic acetylcholine receptors in cell proliferation and tumour invasion in broncho-pulmonary carcinomas // Lung Cancer. 2015. № 3 (87). C. 258-264.

119. Medzhitov R. Origin and physiological roles of inflammation. // Nature. 2008. № 7203 (454). C. 428-435.

120. Meregnani J. [et al.]. Anti-inflammatory effect of vagus nerve stimulation in a rat model of inflammatory bowel disease // Autonomic Neuroscience. 2011. № 1-2 (160). C. 82-89.

121. Messick C. a. [et al.]. Serrated polyps: new classifications highlight clinical importance // Colorectal Disease. 2012. № 11 (14). C. 1328-1337.

122. Miller E. Химический канцерогенез 1956.

123. Montuschi P. [et al.]. Pharmacological treatment of chronic obstructive pulmonary disease: from evidence-based medicine to phenotyping // Drug Discovery Today. 2014. № 0 (0). C. 1-8.

124. Moolgavkar S.H., Knudson a G. Mutation and cancer: a model for human carcinogenesis. // Journal of the National Cancer Institute. 1981. № 6 (66). C. 10371052.

125. Morgan D.M. Tetrazolium (MTT) assay for cellular viability and activity. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 1998. № 4 (79). C. 179-183.

126. Morikawa T. [et al.]. Tumor TP53 expression status, body mass index and prognosis in colorectal cancer // International Journal of Cancer. 2012. № 5 (131). C. 1169-1178.

127. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // Journal of immunological methods. 1983. № 1-2 (65). C. 55-63.

128. Noonan D.M. [et al.]. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions // Cancer and Metastasis Reviews. 2008. № 1 (27). C. 3140.

129. Novotny A. Aspects of Non-Neuronal Signalling Functions of Acetylcholine in Colorectal Cancer Aspects of Non-Neuronal Signalling Functions of Acetylcholine in Colorectal Cancer / A. Novotny, 2009.

130. Novotny A. [et al.]. A pharmacological analysis of the cholinergic regulation of urokinase-type plasminogen activator secretion in the human colon cancer cell line, HT-29 // European Journal of Pharmacology. 2010. № 1-3 (646). C. 22-30.

131. Novotny A. [et al.]. Is acetylcholine a signaling molecule for human colon cancer progression? // Scandinavian Journal of Gastroenterology. 2011. № 4 (46). C. 446-455.

132. Okabe S., Roth J.L. a., Pfeiffer C.J. A method for experimental, penetrating gastric and duodenal ulcers in rats // The American Journal of Digestive Diseases. 1971. № 3 (16). C. 277-284.

133. Owczarek D. [et al.]. Biological therapy of inflammatory bowel disease. // Polskie Archiwum Medycyny Wewn^trznej. 2009. № 1-2 (119). C. 84-8.

134. Peddareddigari V.G., Wang D., Dubois R.N. The tumor microenvironment in colorectal carcinogenesis // Cancer Microenvironment. 2010. № 1 (3). C. 149-166.

135. Pelissier-Rota M. [et al.]. Role of Cholinergic Receptors in Colorectal Cancer: Potential Therapeutic Implications of Vagus Nerve Stimulation? 2013. № August (2013). C. 1116-1131.

136. Peng Z. [et al.]. Cholinergic muscarinic receptor activation augments murine intestinal epithelial cell proliferation and tumorigenesis. // BMC cancer. 2013. (13). C. 204.

137. Perse M., Cerar A. Morphological and molecular alterations in 1,2 dimethylhydrazine and azoxymethane induced colon carcinogenesis in rats //

Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011. (2011). C. 1-14.

138. Petko Z. [et al.]. Aberrantly Methylated CDKN2A , MGMT , and MLH1 in Colon Polyps and in Fecal DNA from Patients with Colorectal Polyps // Clinical Cancer Research. 2005. (11). C. 1203-1209.

139. Pettersson A. [et al.]. Is acetylcholine an autocrine/paracrine growth factor via the nicotinic a7-receptor subtype in the human colon cancer cell line HT-29? // European Journal of Pharmacology. 2009. № 1-3 (609). C. 27-33.

140. Phipps I. [et al.]. KRAS-mutation status in relation to colorectal cancer survival: the joint impact of correlated tumour markers. // British journal of cancer. 2013. № 8 (108). C. 1757-64.

141. Pino M.S., Chung D.C. The Chromosomal Instability Pathway in Colon Cancer // Gastroenterology. 2010. № 6 (138). C. 2059-2072.

142. Potaros T. [et al.]. Evidence for the involvement of adenomatous polyposis coli (APC) protein in maintaining cellular distributions of a304 nicotinic receptors // Neuroscience Letters. 2011. № 2 (489). C. 105-109.

143. Putoczki T.L. [et al.]. Interleukin-11 Is the Dominant IL-6 Family Cytokine during Gastrointestinal Tumorigenesis and Can Be Targeted Therapeutically // Cancer Cell. 2013. № 2 (24). C. 257-271.

144. Rad R. [et al.]. A Genetic Progression Model of BrafV600E-Induced Intestinal Tumorigenesis Reveals Targets for Therapeutic Intervention // Cancer Cell. 2013. № 1 (24). C. 15-29.

145. Raju J. Azoxymethane-induced rat aberrant crypt foci: Relevance in studying chemoprevention of colon cancer // World Journal of Gastroenterology. 2008. № 43 (14). C. 6632-6635.

146. Raufman J.-P. [et al.]. Muscarinic receptor agonists stimulate matrix metalloproteinase 1-dependent invasion of human colon cancer cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2011. № 2 (415). C. 319-324.

147. Raufman J.-P., Cheng K., Zimniak P. Activation of muscarinic receptor signaling by bile acids: physiological and medical implications. // Digestive diseases and sciences. 2003. № 8 (48). C. 1431-44.

148. Reddy B.S. [et al.]. Colon carcinogenesis with azoxymethane and dimethylhydrazine in germ-free rats. // Cancer research. 1975. № 2 (35). C. 287-90.

149. Reddy B.S. [et al.]. Prevention of Azoxymethane-Induced Colon Cancer by Combination of Low Doses of Atorvastatin, Aspirin, and Celecoxib in F 344 Rats // Cancer Research. 2006. № 8 (68). C. 4542-4547.

150. Reddy B.S., States U. Dietary Fat and Colon Cancer: Animal Model Studies 1 1992. № 10 (27). C. 807-813.

151. Rizzo A. [et al.]. Intestinal inflammation and colorectal cancer: a double-edged sword? // World journal of gastroenterology: WJG. 2011. № 26 (17). C. 3092-100.

152. Roca F. [et al.]. Prognostic value of E-cadherin, beta-catenin, MMPs (7 and 9), and TIMPs (1 and 2) in patients with colorectal carcinoma // Journal of Surgical Oncology. 2006. № 2 (93). C. 151-160.

153. Rodrigues N.R. [et al.]. P53 Mutations in Colorectal Cancer. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1990. № 19 (87). C. 7555-9.

154. Roeb E. Matrix metalloproteinase-13 is regulated by toll-like receptor-9 in colorectal cancer cells and mediates cellular migration // Oncology Letters. 2011. C. 483-488.

155. Rosenberg D.W. [et al.]. Mouse models for the study of colon carcinogenesis // Carcinogenesis. 2009. № 2 (30). C. 183-196.

156. Rosenvinge E.C. von [et al.]. Bedside to Bench: Role of Muscarinic Receptor Activation in Ultrarapid Growth of Colorectal Cancer in a Patient With Pheochromocytoma // Mayo Clinic Proceedings. 2013. № 11 (88). C. 1340-1346.

157. Rosenvinge E.C. Von, Raufman J.-P. Muscarinic Receptor Signaling in Colon Cancer // Cancers. 2011. № 4 (3). C. 971-981.

158. Sadallah S., Eken C., Schifferli J. a. Ectosomes as modulators of inflammation and immunity // Clinical & Experimental Immunology. 2011. № 1 (163). C. 26-32.

159. Said A., Raufman J.-P., Xie G. The Role of Matrix Metalloproteinases in Colorectal Cancer // Cancers. 2014. № 1 (6). C. 366-375.

160. Saito Y. [et al.]. Epigenetic Alterations and MicroRNA Misexpression in

Cancer and Autoimmune Diseases: a Critical Review // Clinical Reviews in Allergy and Immunology. 2013. C. 1-8.

161. Santos D.C.M. Dos [et al.]. Morphologic characterization and distribution of endocrine cells in the large intestine of the opossum Didelphis aurita (WiedNeuwied, 1826) // Tissue and Cell. 2013. № 5 (45). C. 338-349.

162. Saotome K., Morita H., Umeda M. Cytotoxicity test with simplified crystal violet staining method using microtitre plates and its application to injection drugs. // Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 1989. № 4 (3). C. 317-321.

163. Schuller H.M. [et al.]. Interaction of tobacco-specific toxicants with the neuronal alpha7-nicotinic acetylcholine receptor and its associated mitogenic signal transduction pathway: potential role in lung carcinogenesis and pediatric lung disorders. // European Journal of Pharmacology. 2000. № 1-3 (393). C. 265-77.

164. Schuller H.M. Is cancer triggered by altered signalling of nicotinic acetylcholine receptors? // Nature Reviews Cancer. 2009. № 3 (9). C. 195-205.

165. Singh S., Pillai S., Chellappan S. Nicotinic Acetylcholine Receptor Signaling in Tumor Growth and Metastasis // Journal of Oncology. 2011. (2011). C. 1-11.

166. Smith L.H. The APUD cell concept // Journal of surgical oncology. 1976. № 2 (8). C. 137-142.

167. Song P. [et al.]. Choline transporter-like protein 4 (CTL4) links to nonneuronal acetylcholine synthesis // Journal of Neurochemistry. 2013. № 4 (126). C. 451-461.

168. Song P., Spindel E.R. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: Expression of non-neuronal acetylcholine in Lung cancer provides a new target for cancer therapy // Journal of pharmacological science. 2008. (106). C. 180-185.

169. Sousa E., Melo F. De [et al.]. Poor-prognosis colon cancer is defined by a molecularly distinct subtype and develops from serrated precursor lesions // Nature Medicine. 2013. № 5 (19). C. 614-618.

170. Sun X. [et al.]. Rosiglitazone inhibits 4 nicotinic acetylcholine receptor expression in human lung carcinoma cells through peroxisome proliferator-activated

receptor -independent signals // Molecular Cancer Therapeutics. 2009. № 1 (8). C. 110-118.

171. Suneja M. [et al.]. Hormonal regulation of energy-protein homeostasis in hemodialysis patients: an anorexigenic profile that may predispose to adverse cardiovascular outcomes. // American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 2011. № 1 (300). C. E55-64.

172. Syed M. [et al.]. Acetylcholinesterase supports anchorage independence in colon cancer // Clinical & Experimental Metastasis. 2008. № 7 (25). C. 787-798.

173. Taketo M.M., Edelmann W. Mouse Models of Colon Cancer // YGAST. 2009. № 3 (136). C. 780-798.

174. Tanaka T. [et al.]. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate // Cancer Science. 2003. № 11 (94). C. 965-973.

175. Tanaka T. [et al.]. Melatonin suppresses AOM/DSS-induced large bowel oncogenesis in rats // Chemico-Biological Interactions. 2009. № 2 (177). C. 128136.

176. Thomas G.A., Rhodes J., Ingram J.R. Mechanisms of Disease: nicotine—a review of its actions in the context of gastrointestinal disease // Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology. 2005. № 11 (2). C. 536-544.

177. Tracey K.J. The inflammatory reflex 2002. № December (420). C. 853-859.

178. Uysal M., Sava S. Caecum location in laboratory rats andmice : an anatomical and radiological study 2016. (4). C. 1-10.

179. Vadlamudi H.C. [et al.]. Receptors and ligands role in colon physiology and pathology // J Recept Signal Transduct Res. 2013. № 1 (33). C. 1-9.

180. Wagenaar-Miller R. a, Gorden L., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in colorectal cancer: is it worth talking about? // Cancer metastasis reviews. 2004. № 1-2 (23). C. 119-135.

181. Wang H. [et al.]. Nicotinic acetylcholine receptor a 7 subunit is an essential regulator of inflammation 2003. № January (421). C. 1-5.

182. Wang J. [et al.]. Regulation of acetylcholine receptor clustering by the tumor

suppressor APC // Nature Neuroscience. 2003. № 10 (6). C. 1017-1018.

183. Wang K., Grivennikov S.I., Karin M. Implications of anti-cytokine therapy in colorectal cancer and autoimmune diseases. // Annals of the rheumatic diseases. 2013. (72 Suppl 2). C. ii100-3.

184. Weber R. V. [et al.]. Obesity potentiates AOM-induced colon cancer // Digestive Diseases and Sciences. 2000. № 5 (45). C. 890-895.

185. Wessler I. [et al.]. Release of non-neuronal acetylcholine from the human placenta: difference to neuronal acetylcholine // Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 2001. № 3 (364). C. 205-212.

186. Wessler I. [et al.]. The non-neuronal cholinergic system in humans: Expression, function and pathophysiology // Life Sciences. 2003. № 18-19 (72). C. 2055-2061.

187. Wessler I., Kirkpatrick C.J. Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans // British Journal of Pharmacology. 2009. № 8 (154). C. 1558-1571.

188. Whiteside T.L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth // Oncogene. 2008. № 45 (27). C. 5904-5912.

189. Wieczorek E. [et al.]. Matrix metalloproteinases and genetic mouse models in cancer research: a mini-review // Tumor Biology. 2015. № 1 (36). C. 163-175.

190. Winder T., Lenz H.-J. Molecular predictive and prognostic markers in colon cancer // Cancer Treatment Reviews. 2010. № 7 (36). C. 550-556.

191. Winter B.Y. De Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: Effect on gastrointestinal motility // World Journal of Gastroenterology. 2010. № 44 (16). C. 5523.

192. Witty J.P. [et al.]. Modulation of Matrilysin Levels in Colon-Carcinoma CellLines Affects Tumorigenicity in-Vivo // Cancer Research. 1994. № Iss 17 (Vol 54). C. 4805-4812.

193. Wong H.P.S. [et al.]. Nicotine promotes cell proliferation via a7-nicotinic acetylcholine receptor and catecholamine-synthesizing enzymes-mediated pathway in human colon adenocarcinoma HT-29 cells // Toxicology and Applied

Pharmacology. 2007. № 3 (221). C. 261-267.

194. Wu C.-H., Lee C.-H., Ho Y.-S. Nicotinic Acetylcholine Receptor-Based Blockade: Applications of Molecular Targets for Cancer Therapy // Clinical Cancer Research. 2011. № 11 (17). C. 3533-3541.

195. Xu W. [et al.]. The role of nitric oxide in cancer. // Cell research. 2002. № 5-6 (12). C. 311-320.

196. Yang K. [et al.]. Interaction of Muc2 and Apc on Wnt signaling and in intestinal tumorigenesis: Potential role of chronic inflammation // Cancer Research. 2008. № 18 (68). C. 7313-7322.

197. Zlobec I. [et al.]. Clinicopathological and protein characterization of BRAF -and K-RAS -mutated colorectal cancer and implications for prognosis // International Journal of Cancer. 2010. C. NA-NA.