Олигоспоровые актиномицеты в почвах разных типов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Михайлова, Наталия Викторовна

• Михайлова, Наталия Викторовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Михайлова, Наталия Викторовна

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экология олигоспоровых актиномицетов

1.2. Прикладное значение олигоспоровых актиномицетов

1.3. Место представителей олигоспоровых актиномицетов

в системах классификаций

1.4. Методы выделения актиномицетов из природных субстратов

1.4.1. Этапы выделения микроорганизмов

1.4.2. Методы, основанные на подавлении роста сопутствующих организмов

1.4.3. Методы, основанные на особенностях спор

1.4.4. Методы, основанные на особенностях

вегетативных клеток

1.4.5. Применение метода PCR для выявления

и идентификации актиномицетов в почвах и других субстратах

1.4.6. Другие методы выявления, изоляции

и идентификации актиномицетов в почвах

1.4.7. Селективное выделение олигоспоровых

актиномицетов из природных источников

1.4.8. Методы выявления комплекса актиномицетов

в ходе инициированных сукцессий

Глава II. ОБЪКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод фаготипирования для выявления

актиномицетов в почве

Стр.

2.2.2. Метод посева из разведений почвенных

суспензий для учета и выделения олигоспоровых актиномицетов

2.2.3. Методы идентификации актиномицетов

2.2.4. Сукцессионный анализ

Глава III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Численность и доля олигоспоровых актиномицетов

в комплексе почвенных мицелиальных прокариот

3.2. Частота встречаемости олигоспоровых

актиномицетов в почвах

3.3. Вертикально-ярусное распределение

олигоспоровых актиномицетов в биогеоценозах

3.4. Динамика численности популяций

олигоспоровых актиномицетов в ходе сукцессии

3.5. Выявление олигоспоровых актиномицетов

в различных типах почв методом фаготипирования

3.6. Сравнительная характеристика методов, использованных для выявления олигоспоровых актиномицетов

в различных типах почв

3.7. Выявление некоторых родов олигоспоровых актиномицетов с применением предобработки

почвенных образцов растворами хлорамина Б

Глава IV ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР

АКТИНОМИЦЕТОВ

Глава V ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Описание исследованных почв

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Олигоспоровые актиномицеты в почвах разных типов»

ВВЕДЕНИЕ

• Актуальность темы. В настоящее время группа актиномицетов и родственных им организмов насчитывает более 100 родов. Однако, до последнего десятилетия считалось, что наиболее распространенными в почве являются актиномицеты родов Streptomyces и Micromonospora. Использование селективных методов выявления позволяет обнаружить и другие, считавшиеся редкими роды актиномицетов.

Олигоспоровые актиномицеты — понятие не таксономическое. Под олигоспоровыми актиномицетами подразумевают группу родов, представители которых характеризуются наличием коротких цепочек спор (не более десяти) на воздушном (реже на воздушном и субстратном) мицелии, причем диаметр спор превышает диаметр гиф.

Имеются сведения об обнаружении олигоспоровых актиномицетов родов Thermomonospora, Saccharopolyspora, Saccharomonospora в саморазогревающихся субстратах и в почвах южных зон (чернозем, каштановая почва). Однако закономерности распределения этих мицелиальных прокариот в наземных экосистемах не исследованы и неизвестна их доля в актиномицетном комплексе различных почв. Среди олигоспоровых актиномицетов много продуцентов ценных биологически активных веществ: антибиотиков, витаминов, ферментов и др. Они образуют внеклеточные ферменты гидролазы и участвуют в разложении целлюлозы, хитина, гумусовых веществ в почве (The Prokaryotes, 1991).

• Целью работы было выявление закономерностей распределения олигоспоровых актиномицетов в различных типах почв и по вертикальной структуре основных типов биогеоценозов для установления экологического статуса этих мицелиальных прокариот.

• Задачи исследования:

1. Разработка и подбор методических приемов селективного выделения олигоспоровых актиномицетов из почв и растительных субстратов.

2. Определение численности, пространственной и временной локализации олигоспоровых актиномицетов в почвах основных природных зон России и стран СНГ, а также в некоторых почвах Мексики, Монголии и Аргентины.

3. Выявление закономерностей вертикально-ярусного распределения олигоспоровых актиномицетов в биогеоценозах разных типов.

4. Определение наиболее благоприятных временных промежутков и условий в микробной сукцессии для выделения олигоспоровых актиномицетов из почв основных биоклиматических зон.

5. Составление коллекции культур — представителей олигоспоровой группы актиномицетов.

• Научная новизна.

Предложен комплексный метод для селективного выделения из почвы и растительных субстратов олигоспоровых актиномицетов (тепловая предобработка воздушно-сухих образцов почвы (120°С, 1 час); посев почвенных и растительных суспензий на селективные среды с пропионатом натрия и с гороховой мукой; добавление комплекса антибиотиков в питательные среды; длительные сроки инкубирования посевов (3—4 недели)).

Впервые показано, что олигоспоровые формы являются минорным, но постоянно присутствующим компонентом почвенных актиномицетных комплексов. Количество олигоспоровых актиномицетов увеличивается от почв северных районов к южным. В лесной зоне наиболее благоприятным местообитанием для олигоспоровых актиномицетов являются нижние слои подстилки и верхние горизонты почвы. В степном биогеоценозе олигоспоровые актиномицеты сосредоточены в почвенном ярусе. В полупустынном биогеоценозе олигоспоровые актиномицеты преобладают в карбонатно-иллювиальном горизонте серозема, где их доля в комплексе превышает долю стрептомицетов.

Использование сукцессионного подхода к исследованию актиномицетов позволило выявить временные промежутки и условия, определяющие максимальный показатель их популяционной плотности в почве. Исследование динамики численности актиномицетов показало, что максимумы популяционной плотности родов, объединяемых в группу олигоспоровых, отмечены на разных этапах сукцессии, что свидетельствует об их экологическом разнообразии и последовательном участии в разложении органического вещества.

• Практическая значимость.

Установление экологической ниши олигоспоровых актиномицетов важно для пополнения наших знаний о биоразнообразии микробного мира и способах его сохранения.

Сведения, полученные при изучении динамики численности и таксономического состава актиномицетного комплекса в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почвы, дает возможность оптимизировать процедуру выделения нужного объекта из природных субстратов, а также управлять объектом непосредственно в почве, что имеет важное значение с точки зрения поиска природных штаммов микроорганизмов для нужд биотехнологии.

• Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной конференции «Ломоносов-96» (Москва, 1996), Международной конференции «Ломоносов-97» (Москва, 1997), Н-ой Открытой городской научной конференции молодых ученых города Пущино (Пущино, 1997), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), 16th Word Congress of Soil Science (Montpellier, France, 1998), Международной конференции «Ломоносов-98» (Москва, 1998), Международной конференции «Ломоносов-99» (Москва, 1999), IX International Congress of Bacteriology @ Applied Microbiology (IX ICBAM) (Sydney, Australia, 1999) и на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

• Публикации. Материалы диссертации изложены в 12 печатных работах.

Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой биологии почв академику РАЕН Звягинцеву Д. Г. за постоянное внимание к работе.

Автор благодарит профессора Владыченского А. С. за помощь в идентификации почв и профессора Судницына И. И. за консультации и ценные советы.

Автор выражает признательность к. б. н. Лихачевой А. А. и всему коллективу кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М. В. Ломоносова за сотрудничество и поддержку.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экология олигоспоровых актиномицетов

Представители рода Saccharomonospora были выделены из естественных источников, таких как лиственная подстилка, навоз, компост и верховой торф (The Prokaryotes, 1991), а также из озерных илов (Агре, 1986; Bergey's Manual, 1989). Большое число спор S. viridis было обнаружено в зернохранилищах с повышенной влажностью и начавших саморазогреваться (Lakey, 1988), а также в грибных компостах (Fergus, 1964). Было высказано предположение, что споры культур S. viridis, S. rectivirgula и других термофильных актиномицетов вызывают загрязнение субстратов, попадая в них из почвы и воздуха. Условия для их пролиферации в хранящемся сене с содержанием воды 35-46 % обсуждались Lacey (Lacey, 1988). Показано, что благоприятные условия для роста S. viridis складываются в ареалах с повышенными температурами и высокими значениями pH (Lacey, 1988). Также было высказано предположение (Bergey's Manual, 1989), что штаммы сахаромоноспор, участвуют в разложении исключительно гемицеллзолозы (McCarthy et al., 1985), но не целлюлозы, лигнина или пектина (McCarthy and Broda, 1984; McCarthy and Cross, 1984). С понижением содержания в субстрате воды, понижается и его температура. Однако, поскольку число обнаруживаемых актиномицетных спор в субстрате остается высоким, то это может представлять значительную угрозу для здоровья работников сельского хозяйства, так как споры S. viridis могут вызвать появление аллфшческих альвеолигов (пневмония у гиперчувствительных индивидов) или так называемые «фермерское легкое» (Barrowcliff and Arblaster, 1968; Greene et al., 1981), «легкое работников грибных хозяйств», и вентиляционную пневмонию (Kurup, 1984). Эти заболевания связаны с Т-лимфоцит-зависимыми гранулематозными воспалительными реакциями (Newman Taylor, 1985; Lacey, 1988).

Жизнеспособные споры S. viridis были также обнаружены в озерных илах (Johnston and Cross, 1976), а вид S. glauca выделялся из почвы (GreinerMai et al., 1988). Мезофильные виды S. azurea и S. суапеа были изолированы из почвенных образцов (Runmao, 1987; Runmao et al., 1988).

По данным Широких И. Г. специфическим признаком таксономического состава актиномицетного комплекса торфяников является доминирование сахаромоноспор, редко встречающихся в почвах зональных типов (Звягинцев и др., 1995). В выработанном торфянике при широком родовом спектре представители рода Saccharomonospora характеризуются незначительной численностью (до нескольких сотен КОЕ/г) и невысокой частотой встречаемости (в основном на талломах лишайников). При освоении целинной торфяной почвы структура комплексов актиномицетов изменяется незначительно. Так, представители рода Saccharomonospora из разряда типичных доминирующих в целинной почве переходят в ряд случайных при пастбищном использовании и не встречаются совсем в почве севооборота. Проведение лесной рекультивации торфяников ведет к выпадению из актиномицетного комплекса представителей рода Saccharomonospora. При исследовании вертикально-ярусной структуры лесного биогеоценоза на выработанном торфянике представители рода Saccharomonospora были обнаружены в травяном ярусе.

Представители рода Saccharopolyspora выделялись из различных разлагающихся растительных материалов (Lacey, 1988). Saccharopolyspora hirsuta была впервые выделена из выжимок сахарного тростника (Lacey, 1971, 1974; Lacey and Goodfellow, 1975). Штаммы S. gregorii иногда выделялись из сена, соломы и, временами, из ячменя (Goodfellow et al., 1989). S. hordei является частым загрязнителем хранящегося ячменя и сена, и несколько реже, сахарного тростника (Lacey, 1988). rectivirgula особенно часто встречается во многих хранящихся растительных субстратах содержащих достаточно воды для начала спонтанного разогрева. Условия для ее пролиферации являются сходными с описанными для сахаромоноспор (Lacey, 1988). Однако существуют факты, свидетельствующие о том, что S. rectivirgula способна разрушать протеины и увеличивать высвобождение газообразного азота из

субстратов (Festenstein, 1966). Очевидно с этим связана способность S. rectivirgula заселять свежескошенное сено, которое имеет низкие значения pH (5,5-6,5) без предобработки парами аммония для повышения pH (Lacey, 1988).

Присутствие большого количества спор Saccharopolyspora в парниках и на производствах, связанных с переработкой растительных материалов, может стать причиной серьезных заболеваний сходных с заболеваниями, вызываемыми представителями рода Saccharomonospora (Lacey, 1988; Lacey and Crook, 1988). S. rectivirgula (синоним Faenia rectivirgula, Micropolyspora faeni, M. rectivirgula, Thermopolyspora polyspora или Т. rectivirgula) является частой проблемой и главной причиной пневмонии у гиперчувствительных индивидов известной как фермерское легкое (Campbell, 1932; Pepys et al., 1963). Споры Saccharopolyspora hordei также в большом количестве присутствуют в хранящемся зерне, и этот организм может вызывать заболевания у гиперчувствительных субъектов (Lacey and Crook, 1988). Заболевание фермерским легким протекает обычно в хронической форме, однако, были зарегистрированы фатальные случаи (Lacey, 1988). Респираторные заболевания, сходные с фермерским легким, были зарегистрированы у лошадей, поедавших влажное сено (Pirie et al., 1971; Lacey, 1988). Острые вспышки этого заболевания, приведшие к нескольким смертельным случаям, были зарегистрированы в Канаде у крупного рогатого скота (Wilkie, 1978). Критерии, используемые для диагностики нетипичных аллергических альвеолитов, включая фермерское легкое, были предложены Lacey (1988). Антигены, недавно выделенные в чистом виде, из S. rectivirgula, могут быть использованы для определения циркулирующих антител в крови пациентов (Brummond et al., 1988; Mantujarvi and Kump, 1988). Также для диагностики перечисленных выше заболеваний Ramasamy с соавторами (Ramasamy et al., 1987) была разработана фермент-связывающая иммуноадсорбционная система (ELISA).

Некоторые штаммы сахарополиспор {S. erythraea (Labeda, 1987), «S. hirsuta subsp. kobensis» (Iwasaki et al., 1979), S. hirsuta subsp. taberi (Gerber et al., 1983; Labeda, 1987), «S. aurantiaca», «S. aurantiaca subsp. kunmingensis»

(Jiang et al., 1986), «Faenia interjecta» (Okazaki et al., 1987)) были выделены из почвы.

Согласно результатам исследований, проведенным Широких И. Г., представители рода Saccharopolyspora являются доминантами в торфяных почвах (Широких, 1993). В выработанном торфянике при широком родовом спектре актиномицеты рода Saccharopolyspora характеризуются незначительной численностью и невысокой частотой встречаемости. Сахарополиспоры, часто встречающиеся в целинной торфяной почве, лишь случайно выделяются из почвы, длительно используемой в севообороте. При исследовании вертикально-ярусной структуры лесного биогеоценоза на выработанном торфянике представители рода Saccharopolyspora были обнаружены в моховом и почвенном ярусах (Широких, 1993). В пастбищном биогеоценозе сахарополиспоры обнаруживались в войлоке и торфяном ярусе в качестве минорного компонента.

В целях получения информации о взимоотношениях популяций актиномицетов внутри комплекса, в диссертационной работе Широких И. Г. (1993) были проведены модельные опыты по наблюдению за динамикой численности актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением воздушно-сухих образцов торфяной почвы и выработанных торфяников различной степени окультуренности. В результате эксперимента установлен динамический характер численности различных родов актинмицетов, в том числе и представителей родов Saccharomonospora и Saccharopolyspora, что может свидетельствовать об активно протекающих в почве процессах размножения, гибели и перестройки популяционной структуры актиномицетов. Также было обнаружено, что наиболее благоприятные условия для выделения представителей родов Saccharomonospora и Saccharopolyspora складываются на промежуточных стадиях сукцессии. Сукцессионные исследования были использованы для определения степени разобщенности постоянно выделяемых из торфяных почв родов актиномицетов. Микромоноспоровые актиномицеты, принадлежащие родам Saccharomonospora, Micromonospora, а также термотолерантные актиномицеты группы «Micropolyspora» (Saccharopolyspora) и рода Saccharomonospora имеют в комплексе выраженное экологическое

сходство: степень перекрывания их экологических ниш более 90%. Наиболее разобщены экониши представителей родов Streptosporangium и Saccharomonospora: степень перекрывания их экониш менее 10 %.

Представители рода Nocardia широко распространены в природе; они были выделены из насекомых и растений (Bergey's Manual, 1989), клинических образцов (Bassam and Hasso, 1997; Knox et al., 1997; Nampoory et al., 1997; Ogg et al., 1997), воды, воздуха, сточных вод, почвы.

Нокардии, как правило, не являются доминирующими формами актиномицетов в биогеоценозах (БГЦ) и по данным Звягинцева Д. Г. с соавторами (Звягинцев, 1993) в лесных БГЦ по численности уступают стрептомицетам на 1-3 порядка. В БГЦ на дерново-подзолистой почве представители рода Nocardia выделялись как в органогенном, так и в органо-минеральных горизонтах. Наибольшая численность нокардий была отмечена для нижнего горизонта лесной подстилки, где интенсивно идут процессы деструкции органического вещества опада и осуществляется разложение сложных полимеров. Представители рода Nocardia также принимают активное участие в разложении гумуса (Теппер, 1976).

Актиномицеты, если они патогенны, являются обычно оппортунистами, и нокардии не являются исключением из этого правила. Основными типами вызываемых заболеваний человека являются:

a) легочные, нервные расстройства, и/или системные нокардиозы, вызываемые N. asteroides и иногда N. brasilensis и N. otididiscaviarum;

b) акганомикозные мицегомы, которые являются опухолеподобными разрастаниями организмов в пределах тканей и обычно обусловливаются N. brasilensis, но иногда N. asteroides vi N. otididiscaviarum;

c) кожные заболевания, причиной которых, как правило, являются первичные инфекции, вызываемые N. asteroides или N. brasilensis (Bergey's Manual, 1989).

Обычным местообитанием представителей рода Microbispora является почва. При использовании стандартных способов выделения их численность колеблется от 104 до 106 КОЕ/г сухой почвы. Наибольшая популяционная плотность обнаруживалась в слабокислых (рН 5-6)

богатых гумусом садовых почвах (Bergey's Manual, 1989). Также микробиспоры были выделены со свежих листьев (Kizuka et al., 1994). Среди представителей этого рода есть и патогенные формы — Microbispora rosea вызывает перикардит и плеврит у человека (Bergey's Manual, 1989).

Представители рода Microtetraspora широко распространены в почве, но численность их довольно невелика — менее 103 КОЕ/г сухой почвы (The Prokaryotes, 1991).

Актиномицеты рода Actinomadura часто выделяются с поверхностей таких культурных растений, как овес, ячмень, а также из хранящихся сена и овощей, компостов и других саморазогревающихся субстратов.

В последнее время интенсивно исследуется распространение актиномицетов рода Actinomadura в почвах. В некоторых работах (Галатенко, 1983; Чормонова и Преображенская, 1990) было показано, что актиномадуры выделялись из серозема светлого, светло-каштановой почвы, чернозема типичного, дерново-подзолистой почвы и почв арктической и южной тундры. Наблюдалось закономерное увеличение их численности при переходе от дерново-подзолистых почв к черноземам, светло-каштановым и окультуренным светлым сероземам, что соответствует нарастанию общей численности актиномицетов в том же порядке. На основании этих данных можно сказать, что закономерности распространения актиномадур в почве близки к закономерностям распространения стрептомицетов. Доля актиномадур в комплексе почвенных актиномицетов при переходе от почвы к почве практически не изменялась и не превышала 5 %.

Показатели видового и общего разнообразия увеличиваются при переходе от почв северных территорий к почвам южных, в то время, как значения показателя концентрации доминирования понижаются.

Это свидетельствует о том, что видовое разнообразие актиномадур более отчетливо выражено в типичном черноземе, светло-каштановой почве и сероземе светлом по сравнению с дерново-подзолисгой почвой. Видовое разнообразие изменяется также при переходе от целинной к окультуренной почве: оно увеличивается в окультуренных дерново-

подзолистой и светло-каштановой почвах по сравнению с целинными, а в типичном черноземе и сероземе светлом — уменьшается (Галатенко и др., 1990).

В каждом типе почвы имеется специфический спектр наиболее распространенных видов актиномадур, особенно это касается целинных почв. В окультуренных почвах по сравнению с целинными изменяется соотношение различных видов актиномадур, повышается удельный вес таких видов, которые редко встречаются целинной почве данного типа, но играют не последнюю роль в микробном ценозе других типов почв.

Впервые Actinomadura madurae и Actinomadura pelletieri были выделены из клинического материала. Они известны как возбудители актиномицетомы человека в тропических и субтропических областях, в основном на Африканском и Американском континентах. Предполагается, что естественная среда обитания этих актиномицетов — верхние горизонты почв, откуда они попадают с зараженной почвой или частицами грязи на человеческое тело, внедряются в раны (преимущественно на ступнях). Это наиболее вероятное объяснение этиологии «мадуровой ступни», так как наиболее часто этой болезнью поражаются как раз нижние конечности, хотя нередко инфицируются и другие части тела.

Информация о патогенности актиномадур временами довольно противоречива. Большинство случаев актиномицетом, вызванных Actm. madurae и Actm. pelletieri, зарегистрированы в теплых гумидных областях (Африка, Мексика и Индия); такая локализация инфекции может быть объяснена тенденцией ходить без обуви в этих регионах. В Венесуэле вспышки актиномицетом были отмечены в полупустынных ландшафтах, засаженных такими деревьями и кустарниками, как Acacia tortuosa, Amaratus epsinosis и Prosepis fuliflora, а также кактусами Opuntia caribea и Opuntia wentiana. Иглы и шипы этих растений являются частой причиной повреджений кожи работников плантаций.

Модели поражения актиномадурами животных еще не исследованы. Однако, Риппон (Rippon, 1968) показал, что вирулентные штаммы Actm. madurae продуцируют коллагеназу, которой в незначительной степени обладают патогенные организмы (The Prokaryotes, 1991).

Способность представителей рода Thermomonospora секретировать различные внеклеточные ферменты дает им возможность становиться доминантами в компостах растительного происхождения и других отходах (Fergus, 1964; Stutzenberger, 1971; Bernier et al., 1988). Термофильные виды рода Thermomonospora являются частыми обитателями саморазогревающихся субстратов таких как выжимки, компост, фураж и навоз. Они особенно обильны в грибных компостах (Fergus, 1964; McCarthey and Cross, 1981, 1984a, 1984b). Термомоноспоры проявляют высокую целлюлозолитическую (McCarthey, 1987; Ball and McCarthey, 1988) и/или гемицеллюлозолитическую активность (McCarthey et al., 1985) активность. Thermomonospora curvata и Т. fusca продуцируют эндоглюконазу и способствуют разложению целлюлозы. Некоторые виды термомоноспор также растут на семенах рапса, что вызывает разогрев последних и наносит вред при хранении (Mills and Bollen, 1976).

Термомоноспоры способны широко участвовать в разрушении целлюлозы и остатков лигноцеллюлозы, которые составляют основную массу сельскохозяйственных и городских отходов (McCarthey, 1987). Участие термомоноспор в разложении целлюлозы грибных компостов, очевидно, включает их взаимодействие с определенными бактериями (Stanek, 1972). Thermomonospora curvata играет важную роль в очистке сточных вод (Stutzenberger, 1971), где, как показано, тяжелые металлы ингибируют продукцию целлюлазы (Bergey's Manual, 1989) у других организмов. Штаммы Т. fusca проявляют активность при деструкции полисахарида арабиноксилана, а также способны продуцировать ферменты с термостабильными свойствами (McCarthey et al., 1985).

Споры термофильных актиномицегов могут вызывать различные аллергические альвеолиты. Существуют мнения, что споры представителей рода Thermomonospora также являются причиной респираторных заболеваний (Lacey, 1988). Мезофильные и термофильные штаммы термомоноспор были выделены из почвы (Krassil'nikov and Agre, 1965; Nonomura and Ohara, 1974).

Nocardiopsis dassonvillei, типовой вид рода, изначально был выделен из зерна. Около одной трети штаммов Nocardiopsis dassonvillei распространенных во всех лабораториях мира были первоначально выделены из почвы. N. dassonvillei часто встречается в хлопковых отходах, сене (Bergey's Manual, 1989). Описан вид этих актиномицетов, выделенных из пласта льда центрального антарктического глетчера (Bergey's Manual, 1989).

Согласно Гордону и Скаалу (Bergey's Manual, 1989) актиномицеты рода Nocardiopsis могут вызывать кожные и респираторные заболевания человека. Но не смотря на то, что многие штаммы N. dassonvillei были выделены из клинического материала человека и животных, эти актиномицеты являются скорее факультативными, чем облигатными патогенами.

1.2. Прикладное значение олигоспоровых актиномицетов

Представители рода Saccharomonospora редко используются в биотехнологии, поскольку практически не синтезируют веществ представляющих коммерческую ценность. Saccharomonospora viridis является продуцентом термовиридина — антимикробного вещества, ингибирующего рост грамположительных бактерий (Schuurmans et al., 1956), а также гликопептидного антибиотика родственного ванкомицину (Tamura and Takeda, 1975). Имеются сообщения, что некоторые штаммы Saccharomonospora viridis продуцируют слабый стимулятор роста водорослей (Mishra et al., 1987). Saccharomonospora viridis способна разлагать гемицеллюлозу, что обусловлено наличием индуцибельной внеклеточной ксиланазы (McCarthey et al., 1985). Максимальная активность этого фермента наблюдается при pH 5-8 и температуре 60-70°С.

Из культуральной жидкости Saccharomonospora canescens sp. nov. штамм 5 была выделена новая термостабильная протеиназа, (NSP) с молекулярной массой 35 kDa и четким оптимумом протеолитической активности при pH 6,7. Было показано, что NSP обладает ариламидазной и эстеразной активностью. Ее ценность значительно выше, чем у

большинства микробных протеиназ, что объясняется ее термостабильной стуктурой (Dolashka et al., 1998).

Представители рода Saccharopolyspora продуцируют разнообразные биологически активные вещества, такие как эритромицин, синтезируемый Saccharopolyspora erythraea— один из наиболее ценных химиотерапевтических препаратов. Ценным свойством этого антибиотика является его высокая биологическая активность в отношении внутриклеточных инфекций. Эритромицин находит широкое применение в клинической практике при лечении многих инфекций, вызываемых стафилококками, стрептококками и пневмококками, Mycoplasma pneumoniae, а также скарлатины, тонзиллитов, сепсиса, раневых инфекций, дифтерии, ожогов и других заболеваний. Впервые эритромицин А (илотицин) был получен из культуральной жидкости Streptomyces erythreus, выделенного из образца почв Филиппин Мак Гуире с соавторами в 1952 году. Эритромицин В как кристаллический антибиотик был описан в 1954 году, также как продукт жизнедеятельности S. erythreus. В настоящее время продуцент эритромицина решено отнести к новому роду актиномицетов Saccharopolyspora, поэтому продуцент этого антибиотика называется Saccharopolyspora erythraea. Эритромицин образуется только биологическим путем в результате биосинтеза. Методом селекции активных штаммов Saccharopolyspora erythraea получены продуценты, образующие не менее 2000 мкг/мл антибиотика (Егоров, 1994). Saccharopolyspora erythraea также продуцирует родственный макролидный антибиотик — эритронолид В (Martin et al., 1967), N-ацетилмурамидазу (Morita et al., 1976), трипсиноподобную серинопротеазу (Yoshida et al., 1971) и ренниноподобный фермент (Sternberg, 1976).

В ходе изучения возможных источников изофлавоноидов, в особенности генистеина, было обнаружено, что продуцент эритромицина — Saccharopolyspora erythraea, также производит многообещающее новое предотвращающее рак вещество. Процесс ферментации при производстве эритромицина для коммерческих целей во всем мире осуществляется с использованием соевых бобов. Результаты проведенного исследования

показали, что генистин (глюкозид генистеина), добавляемый в ферментационную среду на основе соевых бобов, превращается в генистеин в результате воздействия бета-глюкозидазы, продуцируемой микроорганизмом. Генистеин был соэкстрагирован вместе с эритромицином из культуральной жидкости и отделен от эритромицина на второй стадии очистки процесса производства эритромицина (Hessler et al., 1997).

Штаммы Saccharopolyspora hirsuta способны продуцировать различные антимикробные вещества: макролиды, наргенисин A (Ikeda et al., 1985), аминогликозидный комплекс, апрамицин и его производные (Kamiya et al., 1983), циклические поликетиды, нодусмицин (Whaley et al., 1980). Saccharopolyspora sp. штамм АС 3440 образует 4-диамино-4-гидроксиапрамицин (Awaka et al., 1983), тогда как «S. hirsuta subsp. kobensis» продуцирует спорарицин и родственные аминогликозидные антибиотики (Umezava et al., 1987). S. sannanensis является продуцентом саннамицинов (Егоров, 1994). «Faenia interjecta» {Saccharopolyspora) является продуцентом серии гликопептидных антибиотиков (Takatsu et al., 1987). Они являются активными в отношении метициллин-устойчивых стафилококков и анаэробных грамотрицательных возбудителей инфекций. Как большинство гликопептидов, эти антибиотики могут быть использованы в качестве пищевых добавок (например, при нарушении микрофлоры кишечника).

Из культуры Nocardia mediterranei п. sp. в 1959 г. П. Сенси с соавторами выделен противобактериальный антибиотик рифамицин. По современной номенклатуре продуцент рифамицинов относится к Amycolatopsis (Nocardia) mediterranei.

При развитии актиномицета в среде, содержащей кукурузный экстракт, соевую муку и другие компоненты, одновременно образуется не менее пяти антибиотиков — рифамицины А, В, С, D и Е. Эта смесь антибиотических веществ, которая весьма нестабильна, получила название рифамицинового комплекса. В комплексе наиболее стабильный компонент — рифамицин В (кислота).

Мутант, полученный из исходной культуры N. mediterranei, способен синтезировать преимущественно рифамицины С и D. При

добавлении к питательной среде, где развивается мутант, барбитала (диэтилбарбитурат натрия) в концентрации 0,2 %, образуется почти чистый рифамицин В.

Водный раствор рифамицина В в условиях аэрации превращается в новое производное — рифамицин S; последний обладает значительно большей активностью in vivo и in vitro, чем рифамицин В. Промежуточным продуктом «активации» рифамицина В будет рифамицин О, который под влиянием ряда восстанавливающих веществ (аскорбиновая кислота и др.) может превращаться в рифамицин В.

Рифамицин S — высокоактивный препарат по отношению к грамположительным бактериям и Mycobacterium tuberculosis. Он может использоваться для профилактики менингококковых заболеваний и менингитов, вызываемых Haemophillus influenzae. Рифамицин S легко восстанавливается с образованием рифамицина SV.

Наиболее биологически активный и ценный вариант — рифамицин SV; он весьма активен в отношении грамположительных бактерий (минимальная концентрация, подавляющая развитие Staphylococcus aureus, S. haemolyticus и др., 0,005-0,0025 мкг/мл), Mycobacterium tuberculosis (минимальная концентрация, угнетающая его развитие — 0,05 мкг/мл). Рифамицин SV подавляет развитие и грамотрицательных форм бактерий, но в значительно более высоких концентрациях (25-250 мкг/мл). Рифамицин SV имеет низкую токсичность (Егоров, 1994). Nocardia sulphurea является продуцентом некоторых тетрациклиновых антибиотиков и родственных им соединений. На основе тетрациклиновых продуктов жизнедеятельности получен ряд полу синтетических препаратов, нашедших применение в медицинской практике. Nocardia sulphurea sp. nov. является продуцентом антибиотика хелокардина.

«Nocardia lurida» АТСС 14930 (Bergey's Manual, 1989), имеющая сходные свойства с N. orientalis продуцирует антибиотик ристоцитин. Типовой штамм N. orientalis является продуцентом ванкомицина.

Также было найдено, что Nocardia pseudobrasiliensis IFM 0624 (JCM 9894) является продуцентом нокардициклинов А(1) и В(2) — новых антрациклиновых антибиотиков (Tanaka et al., 1997). Нокардиоциклин

А(1) проявляет цитотоксичную активность против L1210 и Р388 лейкемий. Нокардиоциклины А(1) и В(2) активны против грамположительных бактерий включая Mycobacterium spp. и Nocardia spp., но неактивны против грамотрицательных бактерий. Еще один новый антибиотик — нотрамицин, относящийся также к ряду антрациклиновых антибиотиков, был выделен из культуральной жидкости Nocardia sp. MJ896-43F17, которая близкородственна Nocardia brasiliensis. Этот антибиотик ингибирует рост микобактерий в концентрациях от 1,56 до 25 мкг/мл (Momose et al., 1998).

Nocardia brasiliensis IFM 0089 является продуцентом новых бенз[альфа]антрахиноновых антибиотиков — бразилихинонов А, В и С, (Tsuda, et al., 1996) проявляющих активность в отношении грамположительных бактерий, включая Mycobacterium sp., но неактивных против грамотрицательных бактерий и грибов. Эти антибиотики также активны в отношении многочисленных устойчивых к другим лекарственным препаратам P388/ADR опухолевым клеткам (Nemoto et al., 1997). Также из Nocardia brasiliensis IFM 0089 был выделен новый цитотоксичный индольный алкалоид содержащий изонитрильную группу — бразилидин А(1); его структура была определена на основании данных спектрометрии (Kobayashi et al., 1997). В результате проведения смешанной лимфоцитарной реакции на мышах (1С50=0,057 мкг/мл) было показано, что Nocardia brasiliensis IFM 0406 синтезирует новый трицикличный дитерпеноидный антибиотик бразиликардин А, который проявляет иммуносупрессивную активность (Komaki et al., 1999).

Из ферментационного бульона Nocardia sp. IFM 0406 был выделен новый 32-членный макролидный антибиотик — бразилинолид А. Продуцент был идентифицирован как Nocardia brasiliensis. Антибиотик был активен только в отношении Aspergillus niger, но неактивен в отношении бактерий и других грибов, включая дрожжи. Бразилинолид А проявляет иммунодепрессивную активность при проведении смешанной лимфоцитарной реакции (MLR; англ. Mixed Lymphocyte Reaction) (Tanaka et al., 1997).

Из культуральной жидкости Nocardia sp. A32030 были выделены противоопухолевые вещества названные ВЕ-32030 А, В, С, D и Е.

Действующие вещества были экстрагированы из мицелия с помощью метанола и очищены с использованием Сефадекса LH-20, обратнофазной колоночной хроматографии, а также обратнофазной HPLC. Противоопухолевые вещества ВЕ-32030 А, В, С, D и Е ингибируют рост клеток Р388 лейкемии, DLD-1 рака толстого кишечника человека, РС-13 рака легких человека и MKN-45 рака желудка человека (Tsukamoto et al., 1997).

Microbispora viridis синтезирует антибиотик SF-2240 (The Prokaryotes, 1991). Из культуральной жидкости Microbispora sp. ТР-А0184 был выделен гликозилкестиомицин — новый N-гликопиранозид кестиомицина А. Этот новый антибиотик обладает антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжей; и цитотоксической активностью против U937 клеток (Igarashi et al., 1998).

Штамму ТР-А0121, продуцирующему комплекс новых ингибиторов тирозинкиназ названных гибаримицинами А, В, С, D и G — новому подвиду Microbispora rosea предложено дать название — Microbispora rosea subsp. hibaria. Гибаримицины А, В, С и D специфически ингибируют тирозинкиназную активность без воздействия на протеинкиназу А или протеинкиназу С. Они также проявляли активность in vitro в отношении грамположительных бактерий и противоопухолевую активность (Kajiura et al., 1998; Hon et al., 1998).

Штамм (АТСС 55076) Microtetraspora parvosata subsp. kistnae subsp. nov. продуцирует новые антивирусные антибиотики названные кистамицины А и В. Эти антибиотики проявляют активность в отношении вируса гриппа типа А и умеренную активность в отношении грамположительных бактерий (Naruse et al., 1993).

Новый вторичный метаболит SCH 42282 (1) — макролактамный трисахарид, обладающий антибиотической активностью в отношении грибов, был выделен из ферментационного бульона почвенного актиномицета, идентифицированного как Microtetraspora sp. Активный компонент был экстрагирован из бульона бутанолом и очищен в

колонках с силикагелем и путем многократной хроматографии. Компонент был активен в отношении Candida spp. (Hegde et al., 1998).

Из культуральной жидкости Microtetraspora spiralis был выделен новый антибиотик — пираломицин (Kawamura et al., 1996). Также был синтезирован пираломицин 2с путем N-гликозилирования агликона 16, который был получен из соответственно замещенных пиррола и бензол хлорида (5 и 9) (Tatsuta et al., 1999).

Некоторые штаммы рода Actinomadura стали источниками новых антибиотиков, ферментов и других фармакологически активных веществ: Actm. carminata продуцирует карминомицин, Actm. citrea — рифамицин, Actm. kijianata — каяномицин, Actm. macra — полицикличные этеровые антибиотики, a Actm. oligospora и Actm. yumaensis — полиэтеровые антибиотики. Из культуральной жидкости Actm. verrucosospora был выделен антибиотик эсперамицин Р (BMY-41339,2) (немного сходный с эсперамицином А(1)), проявляющий противоопухолевую и антибактериальную активности (Beutler et al., 1994). В дополнение, из штаммов Actinomadura spp. были выделены противоопухолевые агенты и гликолипид-, нуклеозид-, тетрациклин- и хлоринсодержащие полиэтеровые антибиотики. Актиномадуры способны к синтезу таких экзоферментов, как DD-карбоксипептидазы, эндонуклеазы и внутриклеточные лактомазы, широко используемые в биотехнологической промышленности.

Термофильные представители рода Thermomonospora являются источником новых нафтахиноновых антибиотиков (Hedge et al., 1986). Мезофильные штаммы термомоноспор с фосфолипидами типа II продуцируют новый изохромин-хинон, который ингибирует тромбообразование (Patel et al., 1989). Протеазы, получаемые из Т. fusca используются в индустриальных масштабах (Desai and Dhala, 1969). Термофильные термомоноспоры ценны для процессов биоконверсии предназначенных для получения single-cell белков или сахарного сиропа для ферментации в этанол. Thermomonospora fusca выращивается при 55°С для превращения высокоцеллюлозных, низколигниновых отходов

бумажных и деревообрабатывающих фабрик в single-cell белок. Протеиновый продукт имеет высокую питательную ценность как пищевая добавка к рациону цыплят. Термостабильные целлюлазы также привлекательны в качестве катализаторов перерабатываемой биомассы, поскольку повышенная оптимальная температура их активности отчасти решает проблему заражения субстрата в нестерильных условиях.

Богатый целлюлазой мутант термомоноспоры выращивали на химически предобработанной древесине тополя и было показано, что за 62 часа при 55°С он перерабатывал до 70 % древесной биомассы. При использовании древесины без химической предобработки рост актиномицета практически отсутствовал (Bergy's Manual, 1989). Bellamy (1977) использовал родительский штамм этого организма, известный как Thermoactinomyces cellulosae, для биоконверсии химически предобработанных лигноцеллюлозных отходов в микробную биомассу. Культура разлагала 85 % целлюлозной и 90 % гемицеллюлозной фракций субстрата. Процесс приводил к выработке высокобелкового продукта, но был экономически невыгоден из-за дороговизны химической предобработки и необходимости использования определенного субстрата.

Некоторый успех был достигнут в использовании термофильных актиномицетов для осахаривания очищенной целлюлозы. Целлюлазный комплекс организма, с которым работал Белломи, Т. fusca YX, хорошо осахаривал очищенную путем химической предобработки целлюлозу. Для проведения процесса осахаривания в промышленных масштабах отбирали штаммы термомоноспор, способные к сверхпродукции целлюлазы. Липолитические штаммы термомоноспор могут быть использованы для биологического отбеливания или для процесса биологического получения бумажной массы, дающего возможность растворить лигнин и отделить его от целлюлозных компонентов лигноцеллюлозы (McCarthey et al., 1986). Также можно предположить, что способность некоторых штаммов термомоноспор к одновременной атаке всех главных компонентов, таких как целлюлоза, лигнин и гемицеллюлоза, может быть использована для биоконверсии отходов лигноцеллюлозы в ценные химикалии или в single-cell белок. Создание эффективного индустриального биореактора для ферментации твердых

субстратов является важным для коммерчески выгодного производства с применением актиномицетов.

1.3. Место представителей олигоспоровых актиномицетов в

системах классификаций

В группу олигоспоровых актиномицетов объединяются представители родов: Sacchctromonospora, Saccharopolyspora, Actinomadura, Microbispora, Microtetraspora, Nocardia и Nocardiopsis.

Таксономический статус всех перечисленных родов неоднократно пересматривался, роды дополнялись новыми видами и, с другой стороны, виды одних родов переносились в другие роды (Bergey's Manual, 1974,1989, 1994). Рассмотрим некоторые из этих родов.

Род Actinomadura выделен из рода Nocardia (Lechevalier and Lechevalier, 1970). Несмотря на то, что в семидесятые годы неоднократно было подтверждено разделение родов Actinomadura и Nocardia на основании методов нумерической фенетики, ДНК-ДНК гомологии, фаготипирования, ряда химических и серологических методов (Goodfellow et al., 1979), — в восьмом издании Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) род Actinomadura был описан как genus incetae sedus, что еще раз подтверждало неустоявшуюся историю видов, составлявших его. В девятом издании (Bergey's Manual, 1989) род был включен в группу мадуромицетов, объединявшую представителей таких родов как, Exellospora, Microbispora, Microtetraspora, Planobispora, Planomonospora, Spirillospora и Streptosporangium. Термин «мадуромицеты» был введен для того, чтобы объединить те спороактиномицеты, которые имеют III тип клеточной стенки и содержат сахар мадурозу (З-О-метил-D-галактозу). Исследования ДНК-ДНК и ДНК-РНК гомологии показали, что представители родов Planobispora, Planomonospora и Streptosporangium составляют одну ДНК-гомологичную группу, в то время как представители родов Actinomadura, Microbispora, Microtetraspora и Exellospora оказались мало схожи с этой группой. Неестественность подобной группировки также подтверждается присутствием мадурозы у

актиномицетов с I типом клеточной стенки и стрептомицетной морфологией. Однако в исследованиях нумерической фенетики (Goodfellow and Pirouz, 1982) можно обнаружить некоторые свидетельства того, что Actinomadura и представители родов Microbispora и Microtetraspora обладают многими сходными свойствами.

Как уже упоминалось, первоначально в состав рода Actinomadura входили три группы мезофильных видов Actinomadura madurae, Actinomadura pelletiert и Actinomadura dassonvilei. Последняя группа видов позднее была трансформирована в новый род Nocardiopsis, так как ее представители не содержали мадурозы в клеточной стенке и отличались от других видов морфологией спор, составом жирных кислот, пигментов, полярных липидов и менахинонов (Goodfellow et al., 1979; Goodfellow and Pirouz, 1982). Таким образом, представители рода Nocardiopsis тесно взаимосвязаны с представителями родов Actinomadura, Thermomonospora, Microbispora, Microtetraspora и Streptosporangium. На основании анализа внутригенной структуры было показано, что род Nocardiopsis состоит из группы близкородственных видов: N. dassonvillei, N. alborubida и N. antarctica и второй группы менее близкородственных видов охватывающей N. alba subsp. alba, N. alba subsp. prasina и N. listeri. Nocardiopsis lucentensis занимает промежуточную позицию между видами двух групп. Результаты анализа последовательностей 168рДНК в общем согласуются с имеющимися хемотаксономическими, фенотипическими и данными ДНК-ДНК гибридизации. Филогенетическая позиция, а также морфологические и хемотаксономические свойства видов рода Nocardiopsis подтверждают необходимость создания отдельного семейства для рода Nocardiopsis, Nocardiopsaceae fam., nov. (Rainey et al., 1996).

Новый вид Nocardiopsis synnematoformans (Kawamura et al., 1996), выделенный из мокроты пациента с пересаженной почкой на основании данных хемотаксономии и анализа 168рДНК, идентифицировали как род Nocardiopsis. ДНК-ДНК гибридизация, как и физиологические данные показали, что изолят является новым видом рода Nocardiopsis, названным, типовой штамм IMMIB D-1215 (=DSM 44143). В добавление, данные ДНК-ДНК гибридизации и результаты биохимических тестов,

показали, что Nocardiopsis alborubida DSM 40465(T), Nocardiopsis antarctica DSM 43884(T) и Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111(T) представлены единственным видом, названным Nocardiopsis dassonvillei. Также найдено, что N. alba subsp. alba DSM 43377(T) и N. alba subsp. prasina DSM 43845(T) являются генетически разными и, следовательно, предлагается N. alba subsp. prasina повысить до статуса вида и назвать как Nocardiopsis prasina comb. nov. с типовым штаммом DSM 43845(Т).

В состав рода Actinomadura входила группа видов Actinomadura pusilla. Многие новые виды были выделены во время поиска новых антибиотиков (Nonomura and Ohara, 1971; Meyer, 1979; Терехова и др., 1982; Mertz and Yao, 1986, 1990; Miyadoh et al., 1987). К 1990 году группа видов Actinomadura pusilla была перенесена в род Microtetraspora, несмотря на то, что в 1988 году Гудфеллоу неофициально было предложено выделить эту группу в отдельный род Nonomuria (Goodfellow et al., 1988), в исследованиях 1998 года это предложение поддерживается. В то же время из рода Microbispora в род Actimonadura был перенесен вид Actimonadura echinospora, из рода Exellospora — вид Actimonadura rubrobrunea, а из рода Microtetraspora — вид Actimonadura rugatobispora.

В результате в опредеритель Берги (Bergey's Manual, 1994) в род Actimonadura вошли 25 видов.

К 1998 году род Actimonadura все еще представляет собой гетерогенную группу видов: здесь можно выделить две группировки — штаммы Actinomadura madurae и Actinomadura pelletieri. Объединение их в один род вызывает сомнения у систематиков, так как в нумерических исследованиях эти штаммы попадают в разные кластеры. Отмечается высокая схожесть видов Actinomadura pelletieri и Streptomyces somaliensis, несмотря на ясную дифференциацию по типу клеточной стенки, составу жирных кислот, пигментов и полярных липидов. С другой стороны, виды Actm. citrea, Actm. viridis, Actm. spandix, Actm. luteofluorescens, Actm. libanotica, Actm. rugatobispora, Actm. echinospora и Actm. verrucosospora близки к виду Actm. madurae, но значительно разнятся между собой (Goodfellow and Pirouz, 1982; Bergey's Manual, 1994). Позднее был проведен анализ 21 штамма, предположительно принадлежащих к Actinomadura madurae и Actinomadura pelletieri, которые были отнесены к 4

фенетическим группам. Вторая и четвертая группы оказались Actinomadura madurae и Actinomadura pelletieri соответственно. Результаты пиролиз-масс-спектрометрии и анализа амплифицированной ДНК подтверждают таксономический статус 2, 3, и 4 групп. Поэтому был сделан вывод, что название Actinomadura madurae используется с относительно широким разбросом. Предполагается, штаммам третьей группы дать статус вида внутри рода Actinomadura на основании совпадения химических, молекулярных и данных нумерической таксономии. Новому таксону предлагается дать название Actinomadura latina, типовой штамм DSM 43352 (Trujillo and Goodfellow, 1997).

Предлагается также перенести все организмы группы Microtetraspora pusilla, которые были вынесены из рода Actinomadura, в новый род Nonomuria gen. nov., как Nonomuria africana comb, nov., Nonomuria angiospora comb, nov., N. fastidiosa comb, nov., N. ferruginea comb, nov., N.flexuosa comb, nov., N. helvata comb, nov., N. polychroma comb, nov., N. pusilla comb, nov., N. recticatena comb, nov., N. roseola comb, nov., N. roseoviolacea comb, nov., N. rubra comb, nov., N. salmonea comb, nov., N. spiralis comb. nov. и N. turcmeniaca comb. nov. Nonomuria pusilla. Перечисленные выше названия являются названиями типовых видов рода (Goodfellow et al., 1988).

Аналогичная ситуация наблюдается и среди представителей родов Microbispora и Microtetraspora. Род Microbispora был описан в 1957 году Нономурой и Охарой, и в этом же году Лешевалье был предложен род Waksmania. Позднее было найдено, что эти роды идентичны и были перенесены в род Microbispora (Bergey's Manual, 1994). Принимая во внимание, что Thermopolyspora является синонимом Microbispora (Bergey's Manual, 1994), вид, описанный как Thermopolyspora bispora Хенссеном в 1957 году, был перенесен в род Microbispora как Microbispora bispora (Bergey's Manual, 1994).

Виды рода Microbispora первоначально различали по их способности к образованию парных спор на воздушном мицелии, а также присутствию мезо-ДАПк и отсутствию дифференцирующих Сахаров в пептидогликане клеточной стенки (хемотип клеточной стенки III). Однако, в результате предварительного фенетического рассмотрения

найдено, что род является гетерогенным — M. echinospora (морфологически атипичный вид), М. rosea (мезофильный вид), М. thermodiastatica (термофильный вид) имеют незначительное сходство друг с другом (Goodfellow and Pirouz, 1982). В результате этого исследования получил распространение взгляд, о том, что определения нескольких физиологических свойств для выделения видов в роде Microbispora не достаточно (Bergey's Manual, 1994).

В ходе проведенного исследования 16SpPHK последовательностей у 7 штаммов рода Microbispora, 14 штаммов рода Microtetraspora, 9 штаммов рода Streptosporangium, и 12 штаммов рода Actinomadura было установлено, что Microtetraspora fusca, Microtetraspora glauca и Microtetraspora niveoalba образуют группу непосредственно связанную с представителями рода Microbispora. Эта группа родственна двум другим группам, в одну из которых входят некоторые виды рода Microtetraspora, перенесенные из группы Actinomadura pusilla, а другая — из представителей рода Streptosporangium. Таким образом, эти данные служат еще одним доказательством в пользу необходимости пересмотра членов родов Microbispora и Microtetraspora, выделенных только по морфологическим признакам (Wang et al., 1996).

На основании анализа 16SpPHK двух штаммов Microbispora bispora (Bergey's Manual, 1994) — АТСС 19993(T) и JSM 3082 было показано, что две последовательности не только далеки от других штаммов рода Microbispora, но и вообще не входят в семейство Streprosporangiaceae. Это исследование свидетельствует о гетерогенности рода Microbispora. Существует неформальное предложение о переносе Microbispora bispora в новый род — Thermobispora gen. nov., как Thermobispora bispora comb. nov. (Wang et al., 1996). Оно основано на результатах филогенетического анализа и детального обзора рода Microbispora Miyadoh с соавторами, в котором отдавалось предпочтение хемотаксономии и анализу ДНК-ДНК гибридизации (Bergey's Manual, 1994).

На основании проведенного почти полного анализа 16SpPHK было предложено (Zhang et al., 1998) реклассифицировать некоторых представителей родов Thermomonospora и Microtetraspora. 16SpPHK последовательности семи штаммов термомоноспор — T. curvata, Т.

formosensis, Т. fusca, Т. mesophila, Т. chromogena, Т. alba и Т. mesouviformis (синоним Т. alba) были определены и подвергнуты филогенетическому анализу вместе с последовательностями из всех репрезентативных членов подпорядка Streptosporangineae. На основании филогенетических, хемотаксономических и фенотипических признаков было предложено перенести Thermomonospora formosensis в род Actinomadura как Actinomadura formosensis comb, nov.; Т. mesophila в род Microbispora как Microbispora mesophila comb, nov.; T. fusca и Т. alba в новый род Thermobifida alba comb, nov., который принадлежит семейству Nocardiopsaceae как Thermobifida fusca comb. nov. и Thermobifida alba comb, nov. Thermobifida alba является названием типовых видов рода.

На основании проведенного анализа взаимосвязей родов, принадлежащих семейству Pseudonocardiaceae, с помощью нового метода секвенирования аминокислот рибосомальных AT-L30 протеинов было показано, что семейство Pseudonocardiaceae делится на четыре кластера: первый кластер содержит род Actinopolyspora; второй — род Saccharopolyspora; третий — род Amycolatopsis и четвертому кластеру принадлежат роды Ату colata, Pseudonocardia, Saccharomonospora и Kibdelosporangium, что также показывает тесную филогенетическую связь между родами Amycolata и Pseudonocardia. Род Actinokineospora приходится близкородственным роду Saccharotrix, и эти два рода формируют отдельный кластер от кластеров, включающих роды семейства Pseudonocardiaceae. Эти результаты (Т. М. Embley, J. Smida, and E. Stackebrandt, Syst. Appl. Microbiol. 11:44-52, 1988; Warwick et al., 1994) согласуются почти со всеми аспектами предыдущих исследований 16SpPHK секвенирования. Таким образом было поддержано предложение Warwick и соавторов, об объединении родов Amycolata и Pseudonocardia в исправленный род Pseudonocardia. В ходе дальнейших исследований было найдено несоответствие между результатами, полученными Ochi (Ochi, 1995) и Warwick с соавторами. В исследовании Ochi группы Nocardia-Rhodococcus и Saccharotrix-Actinokineospora были возвращены в пределы семейства Pseudonocardiaceae. Также было проведено почти полное секвенирование lóSpPHK характерных штаммов рода Saccharomonospora с последующим выделением и клонированием

амплифицированных генов. Род Saccharomonospora формирует различимую облать внутри эволюционной ветви, входящей в семейство Pseudonocardiaceae. Оценка среднего нуклеотидного сходства, проведенная среди типовых штаммов четырех наиболее полно описанных видов сахаромоноспор составила 97,5 +/- 1,0%. Наиболее далекое родство было показано между Saccharomonospora azurea и Saccharomonospora viridis К73 (96,3 % сходства). Напротив, Saccharomonospora azurea Kl 61 и «Saccharomonospora caesia» Kl 63 имеют идентичные 16SpPHK последовательности. Данные секвенирования нуклеотидных последовательностей наводят на мысль, что род Saccharomonospora содержит несколько новых центров разнообразия (Kim et al., 1995).

В последнее время обсуждается возможность создания филогенетического древа в пределах рода Saccharomonospora и определение его положения по отношению к другим грамположительным бактериям на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена рибонуклеазы-Р РНК. Наряду со сказанным выше обсуждается возможность применения этого гена в качестве молекулярного филетического маркера (Cho et al., 1998).

На основаниии проведенного анализа последовательности 16SpPHK с помощью амплификации методом PCR и сопоставления результатов с определенными последовательностями репрезентативных штаммов семейства Pseudonocardiaceae было определено положение аэробного грамположительного актиномицета. Отнесение организма к роду Saccharopolyspora строго подверждено хемотаксономическими и морфологическими данными. Предлагается отнести организм штамм AS4.198(T) к роду Saccharopolyspora как Saccharopolyspora spinosporotrichia sp. nov. (Zhou et al, 1998).

По данным хемотаксономии и анализа 168рДНК предлагается реклассифицировать Nocardia piensis Blachall et al. 1989. Результаты секвенирования нуклеотида сравнивались с нуютеотидньми пошедовательносгями представителей родов Corynebacterium, Dietzia, Gordona, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus и Tsukamurella. Генеалогические доказательства вместе с хемотаксономическими и фенотипическими данными этого и

предыдущих исследований показывают, что N. piensis заслуживает помещения в семейство Nocardiaceae. Поэтому предлагается N. piensis Blachall et al. 1989 реклассифицировать как Skermania piriformis gen. nov., comb. nov. (Chun et al., 1997).

Данные анализа 168рДНК последовательности свидетельствуют в пользу перенесения штамма «Nocardia flavorosea» JCM 3332 в род Nocardia. Организмы формировали различимую область с типовым штаммом Nocardia carnea. Однако, эксперименты по определению генетического родства показали, что штамм N. carnea DSM 43397(Т) и изучаемый организм принадлежат к двум различным видам генома. Было также установлено на основании фенотипических свойств, что организм отличен от всех описанных видов нокардий. Анализ фенотипических признаков и генотипа показал, что штамм заслуживает определения как новый вид рода Nocardia. Предлагается название Nocardia flavorosea sp. nov. Типовой штамм JCM 3332(Т) (Chun et al., 1998).

1.4. Методы выделения актиномицетов из природных

субстратов

Впервые элективный метод изоляции микроорганизмов был предложен выдающимся русским ученым С.Н. Виноградским в конце прошлого столетия. Этот метод был основан на физиологической селекции микроорганизмов. Среди большого разнообразия методов, применяемых для выделения микроорганизмов из природных источников, важная роль принадлежит методам селективной изоляции, основанных на различных физиологических особенностях организмов.

В настоящее время селективные методы исключительно широко применяются в самых различных областях микробиологии и при поиске продуцентов новых биологически активных соединений, в том числе и антибиотиков.

В основе селективной изоляции микроорганизмов из естественных мест обитания лежат их физиологические различия — в потребностях в источниках энергии и питания. В чувствительности к воздействию химических и физических факторов: высыханию, pH, температуре, солям, антибиотикам и т.д.

Поскольку организмы различаются по очень многим характеристикам, то может существовать множество селективных методов, т. к. не существует такой среды или таких условий, в которых могли бы расти все многообразные типы микроорганизмов, встречающихся в природе.

1.4.1, Этапы выделения микроорганизмов

Процесс выделения микроорганизмов из природных субстратов можно условно разделить на несколько стадий:

1) отбор образцов природных материалов, содержащих микроорганизмы;

2) обработка образцов (химическими, физическими или другими агентами);

3) инокуляция питательных сред соответствующим природным субстратом.

В отборе образцов природных субстратов возможны два подхода к характеру мест обитания из которых берутся образцы.

В одном случае это могут быть образцы, отобранные из мест обитания, в которых распространена искомая группа микроорганизмов (для актиномицетов таким местом обитания является почва). Этот подход основан на допущении, что чем большее количество штаммов микроорганизмов выделено и исследовано, тем выше вероятность выделения новых микроорганизмов.

В качестве альтернативы образцы могут быть отобраны в местах обитания с экстремальными условиями, к которым адаптировались микробные популяции (например, морская вода, термальные воды, ледники и т. д.).

На следующем этапе селективность выделения микроорганизмов может быть достигнута использованием физических и химических методов предобработки образцов перед анализом.

Такая обработка может применяться как для элиминирования сопутствующих микроорганизмов, так и для стимулирования роста искомых микроорганизмов.

Большое значение имеет состав питательной среды, на которую производится высев образцов природного материала. Селективность среды может быть обусловлена входящими в нее питательными компонентами, рН, и добавлением к ней различных селективных агентов. В настоящее время для выделения из природных субстратов определенных таксонов актиномицетов предложено применять компьютерный анализ данных нумерической таксономии и составление на его основании питательных сред (The Prokaryotes, 1991).

Заключительным этапом выделения микроорганизмов является инкубация инокулированных природным материалом питательных сред. На этом этапе можно обеспечить преимущетвенное развитие искомой группы микроорганизмов, варьируя температуру и время инкубации культур. Большинство актиномицетов являются мезофилами, т. е. оптимальная температура их развития находится в пределах 25-30°С, однако, среди них встречаются термофильные и, реже, психрофильные организмы.

Время инкубации различно для разных групп микроорганизмов. Самого длительного периода развития требуют актиномицеты. Наиболее часто выделяющиеся мезофильные актиномицеты, например, представители родов Streptomyces и Micromonospora, могут быть выделены на 7 - 14 сутки инкубации. Однако для некоторых представителей редких (редковстречающихся) родов необходимо продлить период инкубации до 3-6 недель (The Prokaryotes, 1991).

1.4.2. Методы, основанные на подавлении роста сопутствующих организмов

С целью селективного выделения актиномицетов применяют добавление различных ингибиторов роста — антибиотиков, солей тяжелых металлов и другие химические вещества, в среды для посева из образцов природных субстратов.

Первыми антибиотиками для создания селективных сред были фунгициды. Для подавления роста сопутствующих грибов сначала применяли циклогексимид. Впоследствии антигрибные антибиотики стали использоваться очень широко (Lacey, 1978). Часто применяется

комбинация двух или более антигрибных антибиотиков. Например, циклогексимид с нистатином. Столь широкое использование антигрибных антибиотиков связано с их высокой избирательностью в отношении почвенных грибов и отсутствием ингибирующего действия на актиномицеты. Более того, некоторые авторы, применявшие для селективных сред нистатин с пимарицином, считают, что эти антибиотики не только подавляют почвенные микромицеты, но и оказывают стимулирующее влияние на актиномицеты (Алферова, 1992).

В селективных питательных средах при посеве из почвы используются также антибактериальные и противоопухолевые антибиотики (ОоосИеИош е1 а1., 1988).

Следует отметить, что применение антибактериальных и противоопухолевых антибиотиков имеет значительные ограничения, поскольку ингибирующее действие этих антибиотиков непременно затрагивает и часть актиномицетной флоры.

Перспективным представляется одновременное использование нескольких (6 - 8) антибиотиков в одной среде, а также комбинирование нескольких селективных методов выделения, включающих как предобработку почвы, так и использование селективных сред (Терехова Л. П., 1992). О некоторых новых комплексных методах было сообщено в докладах на 9-ом симпозиуме по биологии актиномицетов в 1994 году. Один из этих методов, предложенный японскими исследователями, включает предобработку почвы агентами, активирующими споры, а также антибактериальными агентами с последующим высевом на селективные агаризованные среды. В качестве селективных агентов были предложены: дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты, валин, гумин и другие. Использовали также предварительную обработку почвы фенолом и температурный шок (40°С). В качестве ингибитора роста бактерий применяли туникамицин и налидиксовую кислоту.

1.4.3. Методы, основанные на особенностях спор

Результаты исследований, полученные учеными, работающими в области экологии актиномицетов, показали, что в почве мицелиальные прокариоты находятся преимущественно в виде спор (около 60 %

актиномицетов) (Cross, 1982). Активно растущий вегетативный мицелий стрептомицетов обнаруживается преимущественно в микрозонах с повышенным содержанием органических веществ.

Таким образом, при разработке приемов селективного выделения актиномицетов из почвы необходимо в числе других факторов учитывать и особенности их спор.

Споры микроорганизмов отличаются высокой устойчивостью к различным физическим воздействиям, особенно по сравнению с их вегетативными клетками. Наиболее распространенным способом является тепловая обработка образцов при различных режимах. Например, при выделении актиномицетов из образцов почвы использовалось прогревание при 90 - 100°С в течение периода времени от 5-45 минут (Терехова и др., 1982) до двух часов (Алферова, 1992). Такое прогревание, как отмечают авторы, способствовало выделению олигоспоровых актиномицетов (в том числе и термофильных) — Actinomadura, Microtetraspora и Thermomonospora.

Для выделения представителей родов Microbispora и Streptosporangium японские исследователи применяли прогревание почвы до 120°С в течение часа. Обработка образцов воздействием высоких температур используется не только для выделения термофильных актиномицетов, но и, в сочетании с другими приемами, для выделения актиномицетов родов Nocardia, Micromonospora, Streptomyces, Streptosporangium (Bergeys's Manual, 1989). Высушивание образцов почвы и их длительное хранение приводят к относительному повышению количества актиномицетов (особенно стрептомицетов) в образце (Алферова, 1992).

Для выделения актиномицетов из почв также использовалось замораживание с последующим оттаиванием (Стрешинская и др., 1989).

Кроме устойчивости спор к воздействию температуры учитываются и другие их особенности.

Один из селективных методов предварительной обработки основан на разнице в удельном весе спор и других зачатков микроорганизмов — это дифференциальное центрифугирование образцов воды, илов и почвенных суспензий. Центрифугирование производится на скоростях, которые позволяют отделить споры актиномицетов от всех прочих

зачатков (1,6 g в течение 20 минут). В супернатанте остаются споры актиномицетов, в осадке — споры и вегетативные клетки грибов и немицелиальных прокариот. Метод дифференциального центрифугирования применяли для выделения представителей родов Streptomyces, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Micromonospora, Saccharopolyspora и Frankia (Чормонова, 1978). Для выделения представителей рода Micromonospora почву подвергали центрифугированию в градиенте плотности хлорида цезия (Hirsch et al., 1982).

Учитывая гидрофобность спорулирующего воздушного мицелия актиномицетов, Маккар и Кросс предложили выделять представителей рода Actinoplanes методом флотации (Калакуцкий, Зенова, 1984).

Среди описываемой группы методов можно назвать также обработку почвенных суспензий ультразвуком при частоте 22 кГц и силе тока 0,4 А в течение 2 минут (Гаузе и др., 1976) с целью десорбции спор и мицелия актиномицетов с поверхности почвенных частиц.

Споры актиномицетов оказываются устойчивыми не только к воздействию названных выше физических факторов, но и проявляют повышенную по сравнению с вегетативными клетками устойчивость к воздействию химических реагентов. Учитывая это свойство, суспензии почв перед высевом на питательные среды обрабатывали 1 % раствором фенола или этанолом 25 % — 45 минут или 50 % в течение одного часа. Вегетативные формы при этом разрушались. Применялась также предварительная обработка щелочью — 0,01 н NaOH, 5-10 минут при 15°С.

Японскими исследователями (Hayakawa et al., 1997) был предложен метод селективного выделения актиномицетов, принадлежащих семейству Streptosporangiaceae (Microbispora, Microtetraspora, Streptosporangium и Herbidospora). Он заключался в приготовлении суспензии из воздушно-сухой почвы на основе 1% раствора хлорамина Т с последующим посевом на HV-arap. Предобработка раствором хлорамина Т позволяла подавить рост немицелиальных прокариот и нежелательных актиномицетов на чашках.

К этой же группе методов можно отнести предварительную обработку почвы СаС03 во влажных условиях, поскольку ионы Са2+ способствуют прорастанию актиномицетных спор (Алферова И. В., 1992). По некоторым данным этот метод имеет преимущество по сравнению с методами центрифугирования и предварительной обработки почвы фенолом и позволяет выделить большее количество актиномицетов.

Споры отдельных представителей порядка Actinomycetales, в частности семейства Actinoplanaceae, подвижны. На основании этого был разработан метод «приманок» (пыльца высших растений, змеиная кожа, а также капилляры с аттрактантами, ионами СГ и Вг"), через 1-2 суток «приманки» удаляют и исследуют под микроскопом для обнаружения роста актиномицетов.

Был предложен новый метод выявления актиномицетов с помощью их спор, в основе которого лежат реакции между семью флуорогенными субстратами и различными группами ферментов (эстераз, липаз, фосфатаз и дегидрогеназ). Измерение флуоресценции было выбрано в качестве быстрого и чувствительного метода для микробного анализа. Центральным предметом исследования были споры важных загрязнителей воздуха: Streptomyces albus и Thermoactinomyces vulgaris. Для измерения энзиматической активности было выбрано добавление флуорогенного субстрата к смеси спор и питательной среде; полученную флуоресценцию измеряли с помощью спектрофлуорометра. Было найдено, что флуорогенные субстраты проявляют энзиматическую активность даже при доминировании спор. Сравнение энзиматических активностей доминирующих спор с активностью вегетативных клеток показывало сходство энзиматических профилей, но более высокую активность для вегетативных клеток. Повышение энзиматической активности спор по сравнению с активностью вегетативных клеток носило нелинейный характер и было флуктуирующим. Наибольшие флуктуации были найдены после 4-5 часов инкубации. Streptomyces albus проявляли в 10-50 раз более низкую энзиматическую активность по сравнению Thermoactinomyces vulgaris. Эти результаты показали, что анализ с использованием флуорогенных субстратов может претендовать

на использование для учета и идентификации актиномицетных спор в качестве быстрого и чувствительного метода (Gazenko et al., 1998).

1.4.4. Методы, основанные на особенностях вегетативных клеток

Некоторые особенности вегетативных клеток актиномицетов — мицелиальный план строения актиномицетной клетки и малый диаметр гиф — легли в основу метода с использованием мембранных фильтров (Алферова, 1992). Метод основан на способности гиф актиномицетов прорастать через поры мелкого диаметра, сквозь которые не проникают немицелиальные бактерии, а гифы грибов не могут прорасти из-за большего диаметра. Однако, диаметр пор мембранных фильтров должен быть не менее 0,2 мкм, иначе гифы актиномицетов при прорастании через такие поры деформируются.

При разработке методов, учитывающих потребности питания актиномицетов, применяется внесение питательных веществ в почву; кроме того применяется введение сопутствующих веществ в состав питательных сред для выделения актиномицетов.

Еще в 1930 году Йенсен впервые использовал добавление источников питания (кератин) в почву для той же цели, чем дал начало многим методам селективного выделения актиномицетов.

Учитывая то обстоятельство, что основным местом обитания актиномицетов является почва, широко применяется добавление почвенных вытяжек в среду для выделения представителей родов Microbispora, Microtetraspora, Actinomadura, Micromonospora, Streptosporangium.

Большинство актиномицетов проявляют себя как нейтрофилы и растут в интервале рН 5-9 при оптимальном рН 7 (Cross, 1982), однако существуют две довольно значительные физиологические группы актиномицетов, предпочитающих для своего развития соответственно кислые или щелочные условия среды. Как правило, ацидофильность (или алкалофильность) актиномицетов связана с кислотностью среды обитания (Калакуцкий и Агре, 1977).

По данным японских исследователей 10 % актиномицетов выделенных из почвы были способны расти при рН 8,5. Для выделения алкалофилов предполагается добавление к питательным средам буферного раствора с рН 8,0 - 8,2 или рН 10,5 и даже рН 10-11 (Lechevalier et аЦ 1970).

Актиномицеты часто доминируют в микробных популяциях засушливых и засоленных почв. Для выделения актиномицетов из солончаков были предложены среды с высоким содержанием NaCl — от 4 до 13 %.

1.4.5. Применение метода PCR для выявления и идентификации актиномицетов в почвах и других субстратах

Несколько лет назад был предложен метод амплификации заранее выбранного участка ДНК в пробирке, по существу являющийся методом клонирования in vitro. Метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР; от англ. Polymerase Chain Reaction, PCR). PCR позволяет избирательно амплифицировать интересующий участок ДНК в миллионы раз за несколько часов, используя в качестве стартового материала сложные смеси ДНК. Если принять во внимание, что при амплификации ДНК в ее нуклеотидную последовательность можно вносить желаемые изменения, то становится ясно, что этот новый метод открывает необычайно широкие перспективы.

PCR основана на амплификациии ДНК с помощью ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3"-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Очевидно, что для амплификации интересующего района ДНК необходимо иметь хотя бы минимальную информацию о его концевых участках (например, об N- и С- концевых последовательностях белка, если речь идет об амплификации структурной области его гена) с тем, чтобы синтезировать соответствующие праймеры. При синтезе ДНК праймеры физически

встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Таким образом, каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо лишь денатурировать образовавшиеся в результате первой стадии реакции двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию. Эти три операции составляют цикл PCR и приводят к удвоению количества ДНК в образце. Следует обратить особое внимание на то, что любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации (такие молекулы образуются уже после второго цикла PCR). Поэтому PCR будет приводить к экспоненциальному росту количества именно таких, ограниченных с двух сторон праймерами молекул ДНК. Следовательно, теоретически за 20 циклов PCR можно получить амплификацию заданного участка ДНК в 220, т. е. примерно в миллион раз. Вследствие этого метод и получил название полимеразной цепной реакции. В то же время длинные неограниченные копии ДНК могут синтезироваться только с исходных «родительских» цепей ДНК и за 20 циклов PCR может образоваться лишь 20 таких копий каждой их родительских цепей, что пренебрежимо мало по сравнению с количеством основного продукта.

В качестве матрицы вовсе не обязательно брать индивидуальную ДНК. Специфичность амплификации заданного участка ДНК обеспечивается за счет специфичности гибридизации праймеров. Выше уже отмечалось, что необходимость наличия информации о последовательности ДНК, к которой синтезируются праймеры, является недостатком, присущим PCR. В то же время именно использование двух различных праймеров резко повышает специфичность реакции.

Эффективность метода PCR такова, что по прошествии 25-30 циклов для того, чтобы увидеть окрашенный бромистым этидием ДНК-продукт после электрофореза в агарозе, достаточно взять для анализа десятую часть реакционной смеси, даже в том случае, если исходное количество нужной ДНК в пробе содержалось в следовых количествах (Вартапетян, 1991).

Для селективного получения (около 1100 пар нуклеотидов) последовательностей 16S рибосомальных ДНК актиномицетов были созданы PCR-праймеры. Также были созданы библиотеки генов и использовались колонии PCR для идентификации клонов, содержащих инсерции. Были идентифицированы уникальные клоны и также были определены, частично или полностью, инсерционные последовательности для 53 клонов. Филогенетический анализ показал, что 46 (87 %) собранных клонов содержали последовательности 16БрДНК, входящих в актиномицетную вегвь. Обширная группа из 34 последовательностей сформировала две близкородственные монофилетические группы в филогенетическом древе 16SpPHK, которое, наоборот, слабо поддерживает сестринскую группу с последовательностью из Actinomadura madurae. Четыре новых родственных 168рДНК были обнаружены в микобактерии, одной из пропионобактерий и одной из коринебактерий. Три новых последовательности слабо группировались со Sporichthya polymorpha. Две выделенные последовательности не были близкородственны к какому-либо из упомянутых актиномицетов. Полученные результаты подтверждают гипотезу, что культивируемые (и секвенированные) актиномицеты неадекватно описывают разнообразие групп в окружающей среде (McVeight et al., 1996).

На основании сопоставления последовательности генов кодирующих 16SpPHK (168рДНК) для обнаружения актиномицетов в природных субстратах с помощью PCR и температурного или денатурационного градиента в гель-электрофорезе (TGGE или DGGE, соответственно) был создан группоспецифичный праймер F243 (от 226 до 243 н., E.coli). Большинство актиномицетов представляется возможным исследовать с помощью TGGE и DGGE, т. к. оба приема дают сходные результаты. Две стратегии были применены к изучению актиномицетных сообществ. Первая — с использованием селективной амплификации актиномицетных последовательностей (E.coli, от 226 до 528 н.) для прямого анализа продуктов в градиенте денатурации. Вторая — с применением PCR и актиномицет-специфичными фрагментами (Е. coli, от 226 до 1401 н.), которые служили для PCR в качестве матрицы при

использовании консервативных праймеров. Продукты (.Е. coli, от 968 до 1401 н.) этого непрямого подхода затем были разделены по градиенту в геле. Оба подхода позволяют обнаруживать актиномицетные сообщества в почве. Вторая стратегия позволяла оценивать относительное обилие актиномицетов в пределах бактериального сообщества. Смеси 168рДНК-фрагментов, полученные с помощью метода PCR, были использованы в качестве модели сообщества состоящего из 5 актиномицетов и 5 других бактериальных видов. Актиномицетные продукты были получены путем 100-кратного разведения ДНК актиномицетов в модельном сообществе путем специфичной PCR (*С помощью PCR можно получать ДНК-продукт не только в двухцепочечной, но и в одноцепочечной форме. Для этого используется прием, называемый ассиметричной PCR. Его суть заключается в том, что один из праймеров для PCR берется в 100-кратном недостатке по сравнению с другим праймером. На ранних циклах реакции происходит образование двухцепочечной ДНК и экспоненциальный рост ее количества. Но как только пул лимитирующего праймера исчерпывается (примерно к 20-му циклу), начинается образование одноцепочечной ДНК. Понятно, что ее накопление носит линейный характер, но и этого оказывается достаточно для получения одноцепочечной ДНК в количествах, необходимых для ее секвенирования и использования в качестве зонда (Вартапетян, 1991)); определение разведенной актиномицетной ДНК было невозможно в случае использования консервативных праймеров. Испытуемый метод был применен для мониторинга изменений актиномицетного сообщества в ризосфере картофеля и исследования актиномицетного разнообразия в различных почвах (Heuer et al., 1997).

Описана предварительная схема идентификации PCR- фрагментов полиморфизма ограниченной длины (RFLP, англ. Restriction Fragment Lenght Polymorphism) для нокардий. Для этого брали сегмент (ампликон) представителя рода Nocardia из 65-Ша белкового гена (439 п. н.), признанный ценным для потенциального использования с изолятами всех клинически значимых аэробных актиномицетов. Изучение включало 28 референтных (American Type Culture Collection) штаммов и 198 клинических изолятов принадлежащих 20 таксономическим группам. Из 198 изолятов 188 дифференцировались PCR-RFLP методом. Ампликоны

всех аэробных актиномицетных изолятов не содержали BstEII сайты распознавания, посредством которых их отделяли от микобактерий, содержащих один или более таких сайтов. Из 29 эндогенных рестриктаз, Mspl плюс Hinfl продуцировали RFLP-образцы, с помощью которых отдифференцировали 16 из 20 таксонов. Один RFLP-образец использовали для 15 из 20 образцов, которые включали 65 % фенотипически сгруппированных изолятов. Многочисленные образцы были просмотрены с Gordona bronchialis, Nocardia transvalensis и Streptomyces spp. Стрептомицетные RFLP-образцы были наиболее гетерогенными (5 образцов среди 19 изолятов). Эти исследования расширили возможность использования PCR-RFLP анализа как быстрого метода для идентификации всех клинически значимых видов и таксонов аэробных актиномицетов (Steingrube et al., 1997). В ходе дальнейших исследований был создан еще один быстрый метод идентификации клинически значимых нокардий на родовом уровне с использованием 16SpPHK микроорганизмов этого рода в качестве праймеров для PCR. Для этого были отобраны два участка генов, кодирующих 16SpPHK в нокардиях как родоспецифичные праймеры. Методом PCR были протестированы 60 штаммов изолятов клинически важных нокардий и типовые штаммы. Были получены положительные результаты для всех штаммов. Напротив, метод PCR в этом случае показал отрицательный результат для всех тестируемых организмов, к большинству близкородственных родов включая Dietzia, Gordona, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces и Tsukamurella. Кроме того, в отличие от вышеперечисленной группы изолятов, для всех штаммов нокардий был показан один сайт распознавания — МЫ. Этот метод в данном случае является специфичным и быстрым по сравнению с хемотаксономическими методами идентификации для Nocardia spp., выделяемых из патогенных образцов (Laurent et al., 1999).

Также был разработан быстрый метод идентификации штаммов рода Saccharomonospora с использованием PCR. Для этого были созданы путем построения предварительно известных 16SpPHK последовательностей праймеры четырех достоверно описанных видов сахаромоноспор. Затем в отдельный реакционный эпиндорф с универсальным противоположно

направленным праймером соответствующим 3 "-концу 16SpPHK добавляли четыре специфичных праймера. Представленные штаммы 4-х видов дифференцировали по продуктам PCR, характерным для каждого штамма. Пять штаммов «Saccharomonospora caesia» проявили сходный PCR профиль к Saccharomonospora azurea К 161 (Т), имевшим ту же самую 16SpPHK, что и S. azurea К 161 (Т) и штаммы «S. caesia». Пять штаммов Saccharomonospora glauca и пять штаммов Saccharomonospora viridis показали идентичные результаты к соответствующим репрезентативным штаммам. Таким образом, теперь стала возможной быстрая идентификация штаммов рода Saccharomonospora за счет использования метода PCR. Было найдено, что этот метод является простым, воспроизводимым и специфичным (Yoon, et al, 1996). Этими же авторами (Yoon, et al., 1997) был исследован 21 штамм Saccharomonospora azurea, Saccharomonospora cyanea, Saccharomonospora glauca, Saccharomonospora viridis и «Saccharomonospora caesia» на предмет целесообразности использования 168рДНК для дифференциации. 168рДНК амплифицировали методом PCR с использованием олигонуклеотидных праймеров комплементарных 16SpPHK. Затем был проведен анализ (RFLP) 168рДНК. Четыре достоверно описанных вида сахаромоноспор дифференцировали на основании их характерных 168рДНК образцов. Штаммы «S. caesia» дали рестрикционный образец идентичный S. azurea К 161 (Т) (Т= типовой штамм). Также было найдено, что для RFLP-анализа необходима очистка амплифицированных в ходе PCR 168рДНК.

В результате дальнейших исследований была изыскана возможность применения метода PCR с использованием родоспецифичных праймеров для идентификации членов родов Pseudonocardia и Saccharopolyspora. Идентификация членов семейства Pseudonocardiaceae представляется трудной только на основании их морфологии. Биохимическая характеристика каждого нового изолята является трудоемкой, требует много времени и не всегда дает гарантию при обработке большого количества штаммов. В результате этого исследования были созданы два набора родоспецифичных олигонуклеотидов, с помощью которых можно было воспроизводимо и быстро идентифицировать членов родов Pseudonocardia и

Saccharopolyspora методом PCR-специфичной амплификации. Родоспецифичность этих праймеров была подтверждена на примере широкого ряда коллекционных штаммов и в дальнейшем праймеры были использованы для изучения группы из 106 изолятов дикого типа, которые обладали морфологическими характеристиками семейства. Пятьдесят один штамм из этой группы можно было бы идентифицировать как членов рода Pseudonocardia и только девять могли бы быть отнесены к роду Saccharopolyspora. Разнообразие, выявленное методом анализа жирных кислот в гидролизатах целых клеток обоих диких типов и референтных штаммов, сравнивали с результатами идентификации, полученными с использованием олигонуклеотидных праймеров. Частичное секвенирование 168рДНК представленных штаммов дикого типа было использовано для подтверждения их распределения по родам методом PCR-специфичной амплификации. Это исследование показало как пользу применения в промышленном масштабе этого метода, так и возможность его использования в качестве дополнительного для оценки разнообразия микробной популяции (Moron etal., 1999).

1,4.6. Другие методы выявления, изоляции и идентификации

актиномицетов в почвах

Несмотря на то, что актиномицеты хорошо известны как продуценты вторичных метаболитов, используемых человеком, поле деятельности для расширения наших знаний об их распространении и экологии все еще велико.

В настоящее время в распоряжении ученых имеются новые технические приемы, основанные на анализе ДНК и актинофагов в почвенных образцах. Для сравнения эффективности различных методов использовали таксономически определенные группы актиномицетов и ряд различных почв (Williams et al., 1994). Для этой цели были выбраны различные роды семейства Pseudonocardiaceae, которые были четко определены с помощью анализа 16S рРНК. Присутствие родов актиномицетов семейства Pseudonocardiaceae в различных типах почв было определено несколькими методами: методом экстракции ДНК из

почв и обнаружения фага к выбранному роду. Выделенные микроорганизмы идентифицировали по типу клеточной стенки, пробам специфичной ДНК и типу фага.

Фаготипаж наиболее широко используется в эпидемиологии для идентификации различных штаммов или групп штаммов одного вида. Считается, что фаготипаж может быть использован для дифференциации видов, т. к. границы действия фагов чаще всего узки, большинство фагов обладает штаммовой специфичностью (Агре, 1986).

Однако, многие актиномицеты являются исключением из этого правила. Фаготипаж у актиномицетов в большинстве имеющихся работ использовали для дифференциации родов (Williams et al., 1980). Работы проводятся в основном на фагах, выделенных из почвы. Помимо родоспецифичных фагов выделены видоспецифичные. Некоторые фаги лизировали большинство представителей семейства Streptomycetaceae. Группировка актиномицетов по чувствительности к фагам, в основном, соответствует их группировке по типам клеточной стенки. Причины такого соответствия остаются неясными. Не определены также причины интересного явления, заключающиеся в том, что в большинстве случаев один из штаммов вида (один из видов рода) оказывается резистентным к фагу, лизирующему остальных представителей таксона. Термофильные штаммы рода Streptomyces не чувствительны к фагам, лизирующим мезофильные штаммы рода.

Отношение к специфическим фагам было положено в основу выделения некоторых родов актиномицетов, в частности рода Oerskovia (The Prokaryotes, 1991).

Трудности интерпретации результатов фаготипажа заключаются в невозможности установить таксономический уровень, на котором работает фаг. Особенно легко допустить ошибку тогда, когда в род входит всего один вид, как это было в случае с Oerskovia turbata. Фаготипаж, однако, прекрасный и быстрый метод идентификации, позволяющий установить принадлежность организма к какому-либо определенному таксону.

В методику выделения актиномицетов с помощью метода посева также вносятся изменения. Один из новых приемов в методе посева для селективного выделения актиномицетов включает предобработку

почвенных суспензий микроволнами Ви1та е! а1., 1994; Ви1та е1 а1., 1997). Лучший эффект был достигнут при экспозиции в течение 30 - 120 секунд и мощности микроволн 80 Вт. В этом случае для выделения актиномицетов использовали плотную питательную среду с добавлением 10 мг/мл налидиксовой кислоты и 20 мг/мл леворина.

Метод наиболее эффективен для выделения представителей редковстречающихся родов актиномицетов. Число редковстречающихся родов актиномицетов и «редких» видов стрептомицетов, выделенных с использованием этого метода составляло 28,6 % вместо 8 %, полученных рутинным методом. Наиболее часто выделялись представители следующих родов: АсНпотайига, ЬИсгоЫярога, Мгсго1еШ8рога, 1чосагс1юр81$, АтусоШор818, Мгсготопоярога, АсИпорШпеБ и БасскатШх.

В настоящее время для обнаружения актиномицетов, равно как и для других бактерий, используются методы анализа жирнокислотного состава микроорганизмов.

Например, для выявления в почве микромоноспоровых актиномицетов были использованы методы газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии (Зенова, 1998).

Для этого полученную из почвенного образца биомассу микроорганизмов подвергали кислому метанолизу, который позволяет выделять жирные кислоты и альдегиды из сложных липидов мембраны и клеточной стенки, в которых они связаны сложноэфирными или амидными связями. В результате реакции жирные кислоты получают в виде метиловых эфиров, а альдегиды — в виде диметилацеталей. Полученный экстракт анализировали в виде метиловых эфиров на хромато-масс-спектрофотометре.

По спектрам или времени и индексам удерживания идентифицировали компоненты пробы — жирные кислоты, альдегиды, оксикислоты и пр. Количественное содержание компонентов определяли при помощи интегратора по площадям хроматографических пиков.

С помощью банка данных и полученного полного профиля химических компонентов биомассы исследуемого объекта проводили идентификацию таксонов. Для этого разработанным математическим методом из состава суммарной биомассы выделяли профильные и маркерные признаки отдельных таксонов и проводили идентификацию.

Метод хромато-масс-спектрометрического анализа использовали также для определения каждого отдельного таксона (рода или вида) в сообществе по полученным ранее калибровочным данным о количественном составе химических компонентов в микробной клетке.

Для диагностики нетипичного аллергического альвеолита т. н. фермерского легкого использовали специфическую серологическую реакцию связывания антител (иммуноглобулина IgG(2) пациента) и антигенов из Saccharopoluspora rectivirgula — возбудителя заболевания (Mundt et al., 1996).

Для выявления клинически значимой Nocardict asteroides и в частности ее антигенов, использовали метод иммуноблоттинга. Концентрированные свободные от клеток фильтраты (нокардины) получали из культур Nocardia asteroides выращенных на синтетическом бульоне Саутона. Нокардины были получены из 10 штаммов, от 6 серотипов Nocardia asteroides. Белки отделяли путем изоэлектрического разделения. Антигены, полученные из белков N. asteroides, были проверены на специфичность к N. asteroides и Mycobacterium tuberculosis с помощью кроличьих антисывороток и моноклональных антител (Mabs: англ. — Monoclonal Antibodies) методом фермент-связанного иммуноэлжгропфшошмого блага. В результате проведенного эксперимента были идентифицированы 15 белковых антигенов из каждых 10 нокардинов. Иммунодоминантные антигены были представлены одним серотипспецифичным белком из N. asteroides с изоэлектрической точкой (pi) = 4 (фактор 1) и двумя группами антигенов с pis 4,43 (фактор 6) и 4,68 (фактор 8) соответственно. Приготовленные нитроцеллюлозные полоски с этими антигенами не дали реакции ни с Mycobacterium tuberculosis, ни с нормальными сыворотками человека, кролика или мыши, но дали специфическую реакцию антигены N. asteroides — Mabs или поликлональные антитела. Проведенный тест на предмет выявления перекрестной реакции четырых очищенных протеиновых производных туберкулина с тремя анти- N. asteroides моноклональными антителами дал отрицательный ответ. Эти реакции подтверждают, что идентифицированные антигены как факторы 1, 6 и 7 являются специфичными к N. asteroides, и что фактор 1 является специфичным к

серотипу 2, в то время как факторы 6 и 8 являются специфичными на видовом уровне (Osoagbaka et al., 1999).

Для селективной идентификации штаммов рода Saccharomonospora использовали анализ франментов ДНК и рРНК. Ограниченные фрагменты ДНК, экстрагированные из 14 репрезентативных штаммов Saccharomonospora azitrea, «Saccharomonospora caesia», Saccharomonospora cyanea, Saccharomonospora glauca, Saccharomonospora viridis и шести сахаромоноспороподобных изолятов были отделены с помощью электрофореза с последующим проведением Саузерн-блоттинга на нейлоновых мембранах и гибридизацией с использованием двух рРНК-образцов, клонированных из Streptomyces griseus subsp. griseus КСТС 9080. Далее для рестрикции использовали 4 эндонуклеазы: BamHI, Sali, PvuII и Xhol. В результате было получено пять видоспецифичных риботипов образцов. Разнообразие геномов, выявленное на основании риботипов, показывает, что этот метод может быть использован как для характеристики, так и для идентификации сахаромоноспор. Все протестированные штаммы содержали ДНК с тремя рРНК кластерами (Yoon et al., 1996).

1.4.7. Селективное выделение олигоспоровых актиномицетов из

природных источников

В последнее время внимание исследователей, работающих в области изыскания антибиотиков, все больше привлекают редковстречающиеся роды актиномицетов, к которым также относятся представители олигоспоровой группы (Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Nocardia, Microbispora, Microtetraspora, Actinomadura, Thermomonospora и Nocardiopsis).

Выделение олигоспоровых актиномицетов сопряжено с некоторыми трудностями. В частности, эти организмы характеризуются меньшей скоростью роста, чем представители рода Streptomyces. Поэтому, как уже ранее отмечалось, увеличение периода инкубации чашек Петри со средами, инокулированными природным материалом, до 4-6 недель является необходимым условием их выделения.

Селективные среды с различными антибиотиками ограничивают не только рост грибов и немицелиальных прокариот, но и банальных форм стрептомицетов, что и позволяет создать условия для преимущественного выделения определенных групп актиномицетов. Поэтому среды с антибиотиками широко применяются при поиске среди актиномицетов продуцентов новых антибиотиков.

Анализ литературы, посвященной выделению актиномицетов различных родов, позволяет выделить комплекс методов, наиболее часто применяющихся для изоляции определенных родов и включающих, помимо сред с антибиотиками, и некоторые другие методические приемы.

Актиномицеты, относящиеся к роду Saccharomonospora, были выделены из компостов и гниющего сена. Для их выделения применяли седиментационную камеру, позволяющую отделить с током воздуха споры актиномицетов. В среды для посева образцов добавляли пенициллин G или полимиксин В (сульфат) (5 мкг/мл) и один из антигрибных антибиотиков — нистатин или циклогексимид (50 мкг/мл) (The Prokaryotes, 1991).

Для выделения из почвы представителей рода Saccharopolyspora применяли следующие антибиотики: канамицин (50 мкг/мл); рубомицин (5 мкг/мл); ристомицин (25 мкг/мл); циклогексимид (50 мкг/мл); стрептомицин (25 мкг/мл). В качестве предобработки образцов применяли предварительное прогревание воздушно-сухих образцов при 100°С в течение часа. Для получения спор использовали седиментационную камеру и пробоотборник Андерсена (как и в случае сахаромоноспоры) (The Prokaryotes, 1991).

Для выделения представителей рода Nocardia используется метод посева на селективные питательные среды с добавлением антибиотиков (диметилхлортетрациклина 5 мкг/мл или метациклина 10 мкг/мл и антигрибных антибиотиков). Чашки инкубируют 21 день при 25°С (Bergey's Manual., 1989).

Представителей рода Microbispora выделяли из образцов почвы, предварительно прогретых в воздушно-сухом состоянии при 120°С в течение 1 часа или обработанных фенолом (1,5 %, 30 минут) (The

Prokaryotes, 1991). Применялись также селективные среды с полимиксином (5 мкг/мл) и пенициллином (1 мкг/мл) (Makkar et al., 1982).

Для выделения представителей рода Microtetraspora японские исследователи (Makkar et al., 1982) применяли среды с полимиксином (1 мкг/мл) и пенициллином (1 мкг/мл) (Алферова, 1992), а также прогревание воздушно-сухих образцов почвы при 100-120°С в течение 1 часа перед посевом (Bergey's Manual., 1989). Также был предложен новый комплексный метод для селективного выделения четырехспоровых актиномицетов (в том числе и для представителей рода Microtetraspora). Он заключался в следующем: водную суспензию, приготовленную из предварительно прогретых при 110°С в течение часа воздушно-сухих почвенных образцов, подвергали предобработке 0,5 % хлоридом бензетониума (ВС) и делали посев на новую среду LSV-SE агар с добавлением канамицина, норфлоксацина и налидиксовой кислоты. Основой LSV-SE агара яляется коммерческий лигнин (в качестве основного источника углерода, специфически поддерживающего удовлетворительный рост и хорошую споруляцию организмов группы Microtetraspora glauca, и таким образом облегчающего выявление и учет этой редкой актиномицетной группы в почвенном образце). Добавление антибактериальных агентов в LSV-SE агар, также как прогревание и предобработка хлоридом бензетониума, обеспечивает селективный эффект и уменьшение количества немицелиальных бактерий и нежелательных актиномицетов. В общем случае было проанализировано 26 различных природных образцов. Из 18 образцов (16 — полевые и лесные почвы, и два — речные и озерные осадки) новым методом четко достигалась селективное выделение микроорганизмов группы Microtetraspora glauca, доля которых составляла 2-27 % от общей численности актиномицетов (Hayakawa et al., 1996).

При выделении актиномицетов рода Actinomadura в качестве селективных агентов в среду добавлялись различные антибиотики: оливомицин (25 мкг/мл); канамицин (50 мкг/мл); рифамицин (25 мкг/мл); брунеомицин (0,5; 1,0 или 2,0 мкг/мл); ристомицин (25 мкг/мл); стрептомицин (0,5; 1,0 или 2,0 мкг/мл); циклогексимид (50 мкг/мл); рубомицин (5,0; 10,0 или 20,0 мкг/мл). Также применяли прогревание воздушно-сухих образцов при 100°С в течение часа перед посевом

(Bergey's Manual., 1989). Например, для выделения Actinomadura viridis из почвы японскими исследователями был предложен комплексный подход, заключающийся в следующем: из воздушно-сухих почвенных образцов (предварительно прогретых в течение часа при 110°С) приготавливали суспензию с 1 % раствором фенола и затем делали посев на чашки с HV-агаром (гуматным агаром), в который добавляли канамицин, йозамицин, лизозим и налидиксовую кислоту. Этот метод позволял избавляться от нежелательных актиномицетов и одноклеточных бактерий и создавал высокоселективные условия для выделения Actinomadura viridis (Hayakawa et al„ 1995).

Представители рода Thermomonospora наиболее эффективно выделялись с применением седиментационной камеры и воздушного пробоотборника Андерсена (The Prokaryotes, 1991). После получения споровой суспензии делался посев на селективные среды с добавлением циклогесимида (50 мкг/мл) для подавления роста грибов. Thermomonospora chromogena хорошо выделялась на селективные среды с добавлением канамицина (25 мкг/мл) или рифампицина (5 мкг/мл). Т. formosensis хорошо росла на крахмало-казеиновом агаре с добавлением кабицидина (6,25 мкг/мл) или рифампицина 12,5 мкг/мл). Другие мезофильные виды термомоноспор выделяли из воздушно-сухих почвенных образцов с предварительным прогреванием последних при 100°С. Для обогащения термофильными актиномицетами (в том числе и термомоноспорами) образцы почвы и растительного материала инкубировали в неплотно закрытых полиэтиленовых пакетах при 50°С в течение 7 дней (The Prokaryotes, 1991).

Для селективного выделения представителей рода Nocardiopsis пока нет каких-либо определенных методов. Организм хорошо растет на различных средах специально рекомендованных Интернациональной Программой по Стрептомицетам (ISP) при 28-30°С. По некоторым данным Miyashita et al. (1984) группа штаммов рода Nocardiopsis требует для роста щелочного pH. Для этих организмов оптимальными значениями pH являются 9-10. При рН=7 рост был очень скудным.

1.4.8. Методы выявления комплекса актиномицетов в ходе инициированных сукцессии,

В целях получения информации о взимоотношениях популяций актиномицетов внутри комплекса проводят модельные опыты по наблюдению за динамикой численности актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением воздушно-сухих образцов почвы. На основании данных сукцессионного анализа осуществляют направленное выделение актиномицетов, принадлежащих к определенным родам.

Наблюдение за динамикой родовых популяций актиномицетов проводят традиционно используемым методом поверхностного посева из разведений почвенной суспензии на плотную питательную среду с применением селективных приемов для выделения актиномицетов (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Посевы из почвенных образцов производят в момент инициации сукцессии (0-момент — почва непосредственно после увлажнения), на 4, 7, 18 и 32 сутки после начала опыта (Бабич Т. Д., 1997).

В качестве селективного приема для направленного выделения актиномицетов навеску почвы (1 г) перед посевом прогревают в течение одного часа при 100° С, что ограничивает рост немицелиальных бактерий. Затем почву переносят в фарфоровую ступку, увлажняют стерильной водой и растирают в ступке пестиком с резиновым наконечником в течение 3-5 минут до пастообразной консистенции (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Далее готовят серию разведений и осуществляют посев на селективную питательную среду.

Исследования Широких И. Г. (1993) и Бабич Т. JI. (1997) показали, что наиболее высокая численность актиномицетов (КОЕ/г почвы) зарегистрирована на среде с пропионатом натрия (Rowbotham, Cross, 1977).

Помимо наблюдения за динамикой численности актиномицетов еукцессионные исследования дают возможность для определения степени разобщенности постоянно выделяемых из почв родов актиномицетов. Таким образом, сосредоточив внимание на характере популяционной динамики, можно в конечном счете получить ответ на вопрос о том, что определяет судьбу объекта, а также решать прикладную задачу по управлению желательными и нежелательными популяциями (Кожевин, 1992).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Михайлова, Наталия Викторовна

ВЫВОДЫ

1) Предложен комплексный метод для селективного выделения из почвы и растительных субстратов актиномицетов родов: А сшотайига, 5асскагоро1у^рога, ЗассНаготопоБрога, МкгоЫБрога, Мшо1е1гаБрога, ИосагсНа и Ткегтотопоьрога, объединенных в группу олигоспоровых (тепловая предобработка воздушно-сухих образцов почвы (120°С, 1 час); посев почвенных и растительных суспензий на селективные среды с пропионатом натрия и с гороховой мукой; добавление комплекса антибиотиков в питательные среды; длительные сроки инкубирования посевов (3—4 недели)).

2) Численность олигоспоровых актиномицетов колеблется в разных типах почв от десятков до десятков тысяч КОЕ/г и на 1 — 2 порядка уступает численности стрептомицетов. Наибольшая численность олигоспоровых форм обнаружена в черноземе обыкновенном, наименьшая — в аллювиальной болотной перегнойно-глеевой (Мексика) и аллювиальной дерновой кислой почвах (Россия).

3) Впервые установлено, что олигоспоровые формы являются минорным, но постоянно присутствующим компонентом почвенного актиномицетного комплекса. Доля их, как правило, не превышает 15 % от всех выявленных актиномицетов в комплексе. При этом частота встречаемости олигоспоровых форм в почве может быть высока.

4) Наиболее благоприятными местообитаниями для олигоспоровых актиномицетов в хвойных лесных биогеоценозах являются листья растений и слой Р лесной подстилки.

5) В степном и полупустынном биогеоценозах олигоспоровые актиномицеты сосредоточены в почвенном ярусе; в полупустынном биогеоценозе эти актиномицеты преобладают в карбонатном горизонте серозема светлого, где их доля в комплексе превышает долю стрептомицетов.

6) Применение сукцессионного подхода к исследованию актиномицетов впервые позволило выявить условия и временные промежутки наиболее благоприятные для выделения из почвы актиномицетов олигоспоровой группы. Ранние этапы сукцессии благоприятны для выделения представителей родов Microtetraspora и Thermomonospora, поздние этапы сукцессии — для выделения актиномицетов родов Actinomadura, Saccharomonospora, Saccharopolyspora и Microbispora. Уровень влажности почвы соответствующий наименьшей влагоемкости благоприятен для выделения родов Saccharomonospora, Actinomadura и Thermomonospora; представители родов Microbispora и Microtetraspora характеризуются наиболее высокими показателями популяционной плотности при увлажнении почвы до уровня влаги завядания и максимальной гигроскопической влажности соответственно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Михайлова, Наталия Викторовна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1.Агре Н. С. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино. АН СССР. 1986. 132 с.

2.Алферова И. В. Разработка методов селективного выделения из почвы актиномицетов редких родов — потенциальных продуцентов антибиотиков. Дисс... к. б. н. М. 1992.

3.Бабич Т. Л. Экологическая характеристика почвенных актиномицетов на основе сукцессионного анализа. Дисс... к. б. н. М. 1997.

4.Вартапетян А. Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. Т. 25. Вып. 4. С. 926-936.

5.Галатенко О. А. Изучение особенностей географического распространения актиномицетов рода Ас1тотас1ига и их антибиотических свойств. Дисс... к. б. н. М. 1983.

6.Галатенко О. А., Преображенская Т. П., Терехова Л. П. Направленное выделение актиномадур из различных почв // Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Алма-Ата: Гылым. 1990. С. 13-20.

7.Гаузе Г. Ф., Чугасова В. А., Терехова Л. П. Новый продуцент цефамицина С — ЗиерХотусез /Шрретгя уаг. серкатусШ // Антибиотики. 1976. Вып. 21. № 12. С. 1059-1062.

8.Доржготов Д. Почвы Монголии (генезис, систематика, география, ресурсы и использование). Дисс... д. б. н. М. 1992.

9.Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Изд-во МГУ, 1994.512 с.

Ю.Звягинцев Д. Г., Бабьева И. П., Добровольская Т. Г., Зенова Г. М., Лысак Л. В., Мирчинк Т. Г. Вертикально-ярусная организация микробных сообществ лесных биогеоценозов // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 1.С. 5-36.

П.Звягинцев Д. Г., Кожевин П. А., Кочкина Г. А., Полянская Л. М. Микробная сукцессия в почве и определение экологических стратегий конкретных популяций // Микробиология. 1981. Т. 53. Вып. 2. С. 353-359.

12.3вягинцев Д. Г., Кочкина Г. А., Кожевин П. А. Новые подходы к изучению сукцессий микроорганизмов в почве // Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза. М.: «Наука», 1984. С. 81-103.

1 З.Звягинцев Д. Г., Широких И. Г., Лихачева А. А., Грачева Т. А. Экологическая оценка состояния актиномицетных комплексов биогеоценозов на осушенных низинных торфяниках // Микробиология. 1995. Т. 64. Вып. 1.С. 88-96.

14.3енова Г. М. Актиномицеты в наземных экосистемах. Автореф. дисс... д. б. н. М. 1998. 56 с.

15.Калакуций Л. В., Агре Н. С. Развитие актиномицетов. М.: «Наука», 1977. 283 с.

16.Калакуций Л. В., Зенова Г. М. Экология актиномицетов // Успехи микробиологии. 1984. Т. 19. С. 203-220.

17.Калакуцкий Л. В., Шарая Л. С. Актиномицеты и высшие растения // Успехи микробиологии. М.: «Наука», 1990. Т. 24. С. 26-64.

18.Классификация и диагностика почв СССР. М.: «Колос», 1977.

224 с.

19.Кожевин П. А., Полянская Л. М., Звягинцев Д. Г. Динамика популяций различных почвенных микроорганизмов // Микробиология. 1979. Т. 48. Вып. 3. С. 490-494.

20.Кожевин П. А. Динамика микробных популяций в почве // Вестн. Моск. Ун-та. Серия 17 почвоведение. 1992. № 2. С. 39-56.

21.Красильников А.П. Справочник по антисептике. Минск: «Высшая школа», 1995. 368 с.

22.Красильников Н. А. Лучистые грибки. М.: «Наука», 1970. 536 с.

23.Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1991.340 с.

24.0дум Ю. Экология. М.: «Мир», 1986. Т. 2. 376 с.

25.Почвоведение. Типы почв, их география и использование. М.: «Высшая школа», 1988. Ч. 2. 368 с.

26.Применение растровой электронной микроскопии в почвоведении, мелиорации и сельском хозяйстве (методические указания). Москва — Новочеркасск, 1979. 64 с.

27.Стрешинская М. Г., Тульская Е. М., Терехова JI. П. Некоторые химиотаксономические критерии рода Nocardiopsis II Доклады АН СССР. 1989. Вып. 309. № 2. С. 477-481.

28.Теппер Е. 3. Микроорганизмы рода Nocardia и разложение гумуса. М.: Наука, 1976. 197 с.

29.Терехова JI. П. Таксономия актиномицетов и поиск продуцентов антибиотиков. Автореф. дисс... д. б. н. М. 1992. 45с.

30.Терехова Л. П., Галатенко О. А., Преображенская Т. П. Новые виды Actinomadura fluorescens sp. nov. и Actinomadura turcmeniaca sp. nov. и их антогонистические свойства // антибиотики. 1982. Т. 27. № 2. С. 87-92.

31.Уиттекер Р. Сообщества и экосистемы. М.: «Прогресс», 1980.

327 с.

32.Чернова Н. М. Экологические сукцессии при разложении растительных остатков. М.: «Наука», 1977. 199 с.

ЗЗ.Чормонова Н. Т. Выделение актиномадур из почв на селективных средах с канамицином и рифампицином // Антибиотики. 1978. Т. 23. № 1.С. 22-26.

34.Чормонова Н. Т., Преображенская Т. П. Распространение актиномицетов рода Actinomadura в почвах Казахстана // Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Алма-Ата: Гылым. 1990. С. 47-54.

35.Широких И. Г. Структура комплексов актиномицетов в биогеоценозах на осушенных торфяниках. Дисс... к. б. н. М. 1993.

36.Awaka М., Satoi S., Muto N., Hayashi M., Sagai H., Sakakibara H. Saccharocin, a new aminoglycoside antibiotic, fermentation, isolation, characterisation and structural study // J. Antibiot. 1983. Vol. 36. P. 651-655.

37.Ball A. S. and McCarthey A. J. Saccharification of straw by actinomycete enzymes //J. Gen. Microbiol. 1988. Vol. 134. P. 2139-2147.

38.Barrowcliff D. E., Arblaster P. G. Farmer's lung: A study of an early acute fatal case // Thorax. 1968. Vol. 23. P. 490-500.

39.Bassam L.S., Hasso S. A. Mastitis in goats caused by Nocardia asteroides // Small Ruminant Research. Vol. 26. № 3. Dec. 15. 1997. P. 287290.

40 .Bellamy W. D. Cellulose and lignocellulose digestion by thermophylic actinomycetes for single cell protein // Dev. Ind. Microb. 1977. Vol. 18. P. 249-254.

41 .Bergey's Manual of Determinative Bacteriology / Eds. R. E. Buchanan, N. E. Gibbons. 8th Edition. Baltimore: Williams & Wilkins Co., 1974.

42.Bergey's Manual of Determinative Bacteriology / Eds. J. A. Holt, N. R. Krieg, Peter H. A. Smath, J. T. Stanley, S. T. Williams. Baltimore: Williams & Wilkins Co., 1994.

43.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. S. T. Williams, M. Sharpe, J. A. Holt. 9th Edition. Baltimore: Williams & Wilkins Co., 1989. Vol. 4.

44.Bernier R., Kopp M., Trakas B. and Stutzenberger F. Production of extracellular enzymes by Thermomonospora curvata during growth on protein-extracted lucerne fibers // J. Appl. Bacterid. 1988. Vol. 65. P. 411-418.

45.Beutler J. A., Clark P., Alvarado A. B., Golik J. Esperamicin-P, the Tetrasulfide Analog of Esperamicin-A(l) // J. of Natural Products - Lloydia. 1994. Vol. 57. Iss. 5. P. 629-633.

46.Brummond W. V., Kurup V. P., Resnick A., Milson T. J., Fink J. N. Immunologic response to Faenia rectivirgula in a dairy farm family // J. Allerg. Clin. Immun. 1988. Vol. 82. P. 190-195.

47.Bulina T. I., Alferova I. V., Terekhova L. P. A new methods for isolation of actinomycetes using microwave treatment of soil samples // 9th Intern. Symp. Biology of Actinomycetes (ISBA). Moscow, Russia. 1994. P. 233.

48.Bulina T. I., Alferova I. V., Terekhova L. P. A novel approach to isolation of actinomycetes involving irradiation of soil samples with microwaves // Microbiol. Vol. 66. № 2. Mar-Apr. 1997.P. 231-234.

49.Campbell J. M. Acute symptoms following work with hay // Brit. Med. J. 1932. Vol. 2. P. 1143-1144.

50.Cho M., Yoon J. H., Kim S. B., Park Y.H. Application of the Ribonuclease-P (RNase-P) RNA Gene Sequence for Phylogenetic Analysis of

the Genus Saccharomonospora II Int. J. Syst. Bacterid. 1998. Vol. 48. Iss. Oct. P. 1223-1230.

51.Chun J., Blackall L. L., Kang S. O., Hah Y. C Goodfellow M. A Proposal to Reclassify Nocardia piensis Blackall et al. as Skermania piniformis Gen. Nov, Comb. Nov. // Int. J. Syst. Bacterid. 1997. Vol. 47. Iss. 1. P. 127-131.

52.Chun J., Seong C. N., Bae K. S., Lee K. J., Kang S. O., Goodfellow M., Hah Y. C. Nocardia flavorosea sp. nov. // Int. J. Syst. Bacterid. 1998. Vol. 48. Iss. Jul. P. 901-905.

53.Cross T. Actinomycetes: a continuing sourse of new metabolits // Developments in Ind. Microbiol. 1982. Vol. 23. P. 1-18.

54.Cross T. and Goodfellow M. Taxonomy and classification of actinomycetes // Actinomycetales: characteristics and practical importance. London: Academic Press. 1973. P. 11-112.

55.Desai A. J., Dhala S. A. Purification and properties of proteolytic enzymes from thermophilic actinomycetes // J. Bacterid. 1969. Vol. 100. P. 149-155.

56.Dolashka P., Georgieva D. N., Stoeva S., Genov N., Rachev R., Gusterova A., Voelter W. A novel thermostable neutral proteinase from Saccharomonospora canescens // Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology. Vol. 1382. № 2. Feb. 17. 1998. P. 207-216.

57.Fergus C. L. Thermophilic and thermotolerant moulds and actinomycetes of mushroom compost during peak heating // Mycologia. Vol. 56. P. 267-284.

58.Festenstein G. N. Biochemical changes during moulding of self-heated hay in Dewar flasks // J. Sci. Food. Agric. 1966. Vol. 17. P. 130-133.

59.Gazenko S. V., Reponen T. A., Grinshpun S. A., Willeke K. Analysis of Airborne Actinomycete Spores with Fluorogenic Substrates // Applied and Enviromental Microbiol. 1998. Vol. 64. Iss. 11. P. 4410-4415.

60.Gerber N. N., Hale H. L., Taber W. A., Kurobane I., Vining L. C. Structure and synthesis of texazone, 2-(N-methylamino)-3H phenoxazin-3-one-8-carboxylic acid, an actinomycete metabolite // J. Antibiot. 1983. Vol. 36. P. 688694.

ôl.Goodfellow M., Alderson G., Lacey J. Numerical taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes // 1979. Vol. 112. P. 95-111.

62.Goodfellow M., O'Donnel A. G. Search and discovery of industrially significant actinomycetes // Microbial products: new approaches. Cambridge: Cambridge University Press, 1989. P. 342-383.

63.Goodfellow M., Pirouz T. Numerical classification of actinomycetes containing w^vo-diaminopimelic acid in the cell wall // J. Gen. Microbiol. 1982. Vol. 128. P. 503-507.

64.Goodfellow M., Stackebrandt E., Kroppenstedt M. Chemotaxonomy and actinomycete systematics // Biology of actinomycetes '88. Tokyo: Japan Scientific Societies Press, 1988.

65.Greene J. G., Treuhaft M. W., Arnsell R. M. Hypersensitivity pneumonitis due to Saccharomonospora viridis diagnosed by inhalation challenge // Ann. Aller. 1981. Vol. 47. P. 449-452.

66.Greiner-Mai E., Korn-Wendisch F., Kutzner H. J. Taxonomic revision of the genus Saccharomonospora and description of Saccharomonospora glauca sp. nov. // J. System. Bacterid. 1988. Vol. 38. P. 398-405.

67.Hayakawa M., lino H., Takeuchi S., Yamazaki T. Application of a method incorporating treatment with Chloramine-T for the selective isolation of Streptosporangiaceae from soil // J. of Fermentation and bioengineering. 1997. Vol. 84. Iss. 6. P. 599-602.

68.Hayakawa M., Momose Y., Yamazaki T., Nonomura H. A Method for the Selective Isolation of Microtetraspora glauca and Related 4-Spored Actinomycetes from Soil I I J. of Applied Bacteriol. 1996. Vol. 80. Iss. 4. P. 375-386.

69.Hayakawa M., Momose Y., Kajiura T., Yamazaki T., Tamura T., Hatano K., Nonomura H. A Selective Isolation Method for Actinomadura viridis in Soil // J. of Fermentation and bioengineering. 1995. Vol. 79. Iss. 3. P. 287-289.

70.Hegde V. R., Barrett T., Gullo V., Horan A. C., McPhail A. T., Marques J., Patel M., Puar M. A novel naphthaquinone antibiotic Sch 3819 produced by

Thermomonospora II Abstract 908, 28th Interscience Congress on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1986.

71.Hegde V. R., Patel M. G., Horan A. C., King A. H., Gentile F., Puar M. S., Loebenberg D. A novel macrolactam-trisaccharide antifungal antibiotic taxonomy, fermentation, isolation, physicochemical properties, structure elucidation and biological activity // J. of Antibiotics. 1998. Vol. 51. Iss. 5.P. 464-470.

72.Hessler P. E., Larsen P. E., Constantinou A. I., Schram K. H., Weber J. M. Isolation of isoflavones from soy-based fermentations of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea // Applied Microbiology and Biothechnology. Vol. 47. № 4. Apr. 1997. P. 398-404.

73.Heuer H., Krsek M., Baker P., Smalla K., Wellington E. M. H. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients // Applied And Enviromental Microbiology. Vol. 63. № 8. Aug. 1997. P. 32333241.

74.Hirsch C. F., Christensen D. L. A novel method for the selective isolation of actinomycetes // Annual meeting ASM: Abstr. 1982. P. 112-113.

75.Hori H., Igarashi Y., Kajiura T., Furumai T., Higashi K., Ishiyama T., Uramoto M., Uehara Y., Oka T. Signal-Transduction Inhibitors, Hibarimicin-A, Hibarimicin-B, Hibarimicin-C, Hibarimicin-D and Hibarimicin-G Produced by Microbispora - II. Structural Studies I I J. of Antibiotics. 1998. Vol. 51. Iss. 4. P. 402-417.

76.Igarashi Y., Takagi K., Kajiura T., Furumai T., Oki T. Glucosylquestiomycin, a novel antibiotic from Microbispora sp. Tp-A0184 — fermentation, isolation, structure determination, synthesis and biological activities // J. of Antibiotics. 1998. Vol. 51. Iss. 10. P. 915-920.

77.1keda Y., Kondo S., Kanai F., Sawa T., Hamada M., Takeuchi T., Umezawa H. A new destomycin-family antibiotic produced by Saccharopolyspora hirsuta I I J. Antibiot. 1985. Vol. 38. P. 436-437.

78.1wasaki A., Itoh H., Mori T. A new broad spectrum amino glycoside antibiotic complex sporaricin. Part 2. Taxonomic studies on the sporaricin producing strain Saccharopolyspora hirsuta subsp. kobensis new subspecies // J. Antibiot. 1979. Vol. 32. P. 180-186.

79.Jiang C., Xu L. Identification of a new species in the genus Saccharopolyspora II Acta. Microbiol. Sin. 1986. Vol. 26. P. 17-20.

80.Johnston D. V., Cross T. The occurrence and distribution of actinomycetes in lakes of the English Lake District // Freshwater Biol. 1976. Vol. 6. P. 457-563.

81.Kajiura T., Furumai T., Igarashi Y., Hon H., Higashi K., Ishiyama T., Uramoto M., Uehara Y., Oki T. Signal-Transduction inhibitors, Hibarimicin-A, Hibarimicin-B, Hibarimicin-C, Hibarimicin-D and Hibarimicin-G produced by Microbispora - I. Taxonomy, fermentation, isolation and physicochemical and biological properties // J. of Antibiotics. 1998. Vol. 51. Iss 4. P. 394-401.

82.Kamiya K., Deushi T., Iwasaki A., Watanabe I., Itoh H., Mori T. A new aminoglycoside antibiotic, KA-5685 // J. Antibiot. 1983. Vol. 36. P. 738-741.

83.Kim S. B., YoonJ. H., Kim H. G., Lee S. T., Park Y. H., Goodfellow M. A Phylogenetic Analysis of the Genus Saccharomonospora Conducted with 16S Ribosomal-RNA Gene-Sequences // Int. J. Syst. Bacterid. 1995. Vol. 45. Iss. 2. P. 351-356.

84.Kizuka M., Enokita R., Tanahashi K., Okazaki T. Studies on actinomycetes in plant leaves // 9th Intern. Symp. Biology of Actinomycetes (ISBA 94). Moscow. Russia. 1994. P. 232.

85.Knox C. M., Whitcher J. P., Cevellos V., Margolis T. P., Irvine A. R. Nocardia scleritis I I American J. Ophthalmology Vol. 123. № 5. May. 1997. P. 713-714.

86.Kobayashi J., Tsuda M., Nemoto A., Tanaka Y., Yazawa K., Mikami Y. Brasilidine A, a new cytotoxic isonitrile-containing indole alkaloid from the actinomycete Nocardia brasiliensis 11 J. of Natural Products. Vol. 60. № 7. Jul. 1997. P. 719-720.

87.Komaki H., Nemoto A., Tanaka Y., Takagi H., Yazawa K., Mikami Y., Shigemori H., Kobayashi J., Ando A., Nagata Y. Brasilicardin-A, a new terpenoid antibiotic from pathogenic Nocardia brasiliensis. Fermentation, isolation and biological activity // J. of Antibiotics. 1999. Yol. 52. Iss. l.P. 13-19.

88.Krassirnikov N. A. and Agre N. S. The brown group of Actinobifida chromogena n. sp. //Microbiologia. 1965. Vol. 34. P. 284-291.

89.Kurup V. P. Thermophilic actinomycetes, their role in hypersensitivity pneumonitis // Biological, biochemical and biomedical aspects of actinomycetes. Orlando: Academic Press, 1984. P. 145-159.

90.Labeda D. P. Transfer of the type strain of Streptomyces erythraeus (Waksman, 1923) Waksman and Henrici 1948 to the genus Saccharopolyspora Lacey and Goodfellow 1975 as Saccharopolyspora erythraea sp. nov., and designation of the neotype strain for Streptomyces erythraeus II Int. J. System. Bacterid. 1987. Vol. 37. P. 19-22.

91.Lacey J. The microbiology of moist barley stored in unsealed silos //Ann. Appl. Biol. 1971. Vol. 69. P. 187-212.

92.Lacey J. Moulding of sugar cane bagasse and its prevention // Ann. Appl. Biol. 1974. Vol. 76. P.63-67.

93 .Lacey J. Actinomycetes biodeteriogens and pollutants of the enviroment // Actinomycetes in biotechnology. London: Academic Press, 1988. P. 359-432.

94.Lacey J. Ecology of actinomycetes in fodders and related substrates // Nocardia and Streptomyces. Eds: Mordarski M. at al., 1978. P. 161-170.

95.Lacey J., Crook B. Fungal and actinomycete spores as pollutants of the workplace and occupational allergens // Ann. Occup. Hyg. 1988. Vol. 32. P. 515533.

96.Lacey J., Goodfellow M. A novel actinomycete from sugar cane bagasse: Saccharopolyspora hirsuta gen. et sp. nov. // J. Gen. Microbiol. 1975. Vol. 88. P. 75-85.

97.Lam K. S., Veitch J. A., Golik J., Krishnan B., Klohr S. E., Volk K. J., Forenza S., Doyle T. W. Biosynthesis of Esperamicin-(l), an Enediyne

Antitumor Antibiotic I I J. of the American Chemical Society. 1993. Vol. 115. Iss. 26. P. 12340-12345.

98.Laurent F. J., Provost F., Boiron P. Rapid identification of clinically relevant Nocardia species to genus level by 16S ribosomal-RNA gene PCR I I J. of clinical microbiology. 1999. Vol. 37. Iss. 1. P. 99-102.

99.Lechevalier M. P. and Lechevalier H. A. Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1970. Vol. 20. P. 435-443.

100.Makkar N. S., Cross T. Actinoplanetes in soil and on plant litter from freshwater habitants // J. Appl. Bacteriol. 1982. Vol. 52. P. 209-218.

101.Mantyjarvi R. M., Kurup V. P. Dot-immunobinding assay in the detection of IgG antibodies against Farmer's lung antigens // Mycopathologia. 1988. Vol. 103. P. 49-54.

102.Martin J. R. and Rosenbrook W. Studies on the biosynthesis of the eiythtomycins. II. Isolation and structure of a biosynthetic intermediate 6-Dioxyerythronolide B. // Biochemistry. 1967. Vol. 6. P. 435-440.

103.McCarthey A. J. Lignocellulose-degrading actinomycetes // FEMS Microbiol. Rev. 1987. Vol. 43. P. 145-163.

104.McCarthey A. J., Paterson A., Broda P. Lignin solubilisation by Thermomonospora mesophila // Appl. Microbiol. 1986. Vol. 24. P. 347-352.

105.McCarthey A. J., Broda P. Screening for lignin degrading actinomycetes and characterisation of their activity against [14C] lignin labelled wheat lignocellulose // J. Gen. Microbiol. 1984. Vol. 130. P. 2905-2913.

106.McCarthey A. J. and Cross T. A note on a selective isolation medium for the thermophilic actinomycete Thermomonospora chromogena I I J. Appl. Bacteriol. 1981. Vol. 51. P. 299-302.

107.McCarthey A. J. and Cross T. A taxonomic study of Thermomonospora and other monosporic actinomycetes // J. Microbiol. 1984a. Vol. 130. P. 5-25.

108.McCarthey A. J. and Cross T. Taxonomy of Thermomonospora and related oligosporic actinomycetes // Biological, Biochemical and biomedical aspects of actinomycetes. San Diego: Academic Press, 1984b. P. 521-536.

109.McCarthey A. J., Peace E., Broda P. Studies on the extracellular xylanase activity of some thermophilic aclinomycetes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. Vol. 21. P. 238-244.

110.McVeigh H. P., Munro J., Embley T. M. Molecular evidence for the presence of novel actinomycete lineages in a temperate forest soil // J. Industrial Microbiol. Vol. 17. № 3-4. Sep.-Oct. 1996. P. 197-204.

111.Mertz F. P. and Yao R. C. Actinomadura oligospora sp. nov., the producer of a new polyether antibiotic // Int. J. Syst. Bacterid. 1986. Vol. 36. P. 179-182.

112.Mertz F. P. and Yao R. C. Actinomadura fibrosa sp. nov. isolated from soil // Int. J. Syst. Bacterid. 1990. Vol. 40. P. 28-33.

113.Meyer J. New species of the genus Actinomadura 11 Z. Allg. Microbiol. 1979. Vol. 19. P. 37-44.

114.Mills and Bollen. Microflora of heat damaged rapeseed I I Can. J. Bot. 1976. Vol. 54. P. 2893-2902.

115.Mishra S. K., Tail W. H., Putnam A. R., Ries S. K. Plant growth regulatory metabolites from novel actonomycetes // J. Plant Growth Reg. 1987. Vol. 6. P. 75-84.

116.Miyadoh S., Amano S., Tohyama H., Shomura T. Actinomadura atramentaria, a new species of the Actinomycetales II Int. J. Syst. Bacterid. 1987. Vol. 37. P. 342-346.

117.Miyashita K., Mikami Y., Arai T. Alkalophilic actinomycete, Nocardiopsis dassonvillei subsp. prasina subsp. nov., isolated from soil // Int. J. Syst. Bacterid. 1984. Vol. 34. P. 405-409.

118.Morita T., Hara S., Matsushima Y. Purification and characterisation of lysozyme produced by Streptomyces erythaeus II J. Biochem. 1976. Vol. 83. P. 893-903.

119.Momose I., Kinoshita N., Sawa R., Naganawa H., Iinuma H., Hamada M., Takeuchi T. Nothramicin, a new anthracycline antibiotic from Nocardia sp. MJ896-43F17 // J. of Antibiotics. Vol. 51. № 2. Feb. 1998. P. 130135.

120.Moron R., Gonzalez I., Genilloud O. New genus-specific primers for the PCR identification of members of the genera Pseudonocardia and Saccharopolyspora //Int. J. Syst. Bacterid. 1999. Vol. 49. Iss. Jan. P. 149-162.

121.Mundt C., Becker W. M., Schlaak M. Farmer's lung: Patients' IgG(2), antibodies specifically recognize Saccharopolyspora rectivirgula proteins and carbohydrate structures // J. of Allergy and Clinical Immunology. Vol. 98. № 2. Aug. 1996. P. 441-450.

122.Nampoory M. R. N., Khan Z. U. Pulmonary Nocardia transvalensis infection: A case report and review I I Saudi Medical Jornal. Vol. 18. № 5. Sep-Oct. 1997. P. 516-518.

123.Naruse N.., Tenmyo O., Kobaru S., Hatori M., Tomita K., Hamagishi Y., Oki T., Careofokumura J. New Antiviral Antibiotics, Kistamicin-A and Kistamicin-B. 1. Taxonomy, Production, Isolation, Physicochemical Properties and Biological-Activities // J. of Antibiotics. 1993. Vol. 46. Iss. 12. P. 1804-1811.

124.Nemoto A., Tanaka Y., Karasaki Y., Komaki H., Yazawa K., Mikami Y., Tojo T., Kadowaki K., Tsuda M., Kobayashi J. Brasiliquinones A, B and C, new benz[alpha]anthraquinone antibioticsfromNocardia brasiliensis .1. Producing strain, isolation andbiologicalactivities of the antibiotics // J. of Antibiotics. Vol. 50. № 1. Jan. 1997. P. 18-21.

125.Newman Taylor A. G. The lung and the work enviroment // Current perspectives in the immunology of respiratory disease. Edinburgh: Chuchill Livingstone, 1985. P. 56-67.

126.Nonomura H. and Ohara Y. Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura Lechevalier et al. I I J. Ferment. Tech. 1971. Vol. 49. P. 904-912.

127.Nonomura H. and Ohara Y. A new species of actinomycetes, Thermomonospora mesouviformis sp. nov. // J. Ferment. Techn. 1974. Vol. 53. P. 10-13.

128,Ochi K. Amino-Acid-Sequence Analysis of Ribosomal-Protein at-L30 from Members of the Family Pseudonocardiaceae // Int. J. Syst. Bacterid. 1995. Vol. 45. Iss. l.P. 110-115.

129.0gg G., Lynn W. A., Peters M., Curati W., McLaughlin J. E., Shaunak S. Cerebral nocardia abscesses in a patient with AIDS: Correlation of magnetic resonance and white cell scanning images with neuropathological findings // J. of Infection. Vol. 35. № 3. Nov. 1997. P. 311-313.

130.0kazaki T., Enokita R., Miyaoka H., Takatsu T., Torikata A. Chloropolysporins A, B and C, novel glycopeptide antibiotics from Faenia interjecta sp. nov. // J. Antibiot. 1987. Vol. 40. P. 917-923.

131.0soagbaka O. U., Reiss E., Kaufman L. Immunodominant Nocardia asteroides Antigens - Isolation and Characterization by Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blotting, and the Value of Immunoblot Strips // British J. of Biomedical Science. 1998. Vol. 55. Iss. 4. P. 258-263.

132.Patel M., Hegde V., Horan A. C., Barrett T., Bishop R., King A., Marques J., Hare R., Gullo V. Sch 38519, a novel platelet aggregation inhibitor produced by a Thermomonospora sp. Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical properties, structure and biological properties // J/ Antibiot. 1989. Vol. 42. P. 1063-1069.

133.Pepys J., Jenkins P. A., Festenstein G. M., Gregory P. H., Lacey M. E., Skinner F. A. Farmers lung: Thermophilic actinomycetes as sources of «farmers lung hay» antigen //Lancet. 1963. Vol. 1. P. 607-611.

134.Pipie H. M., Dawson C. O., Breeze R. G., Wiseman A., Hamilton J. A bovine disease similar to Farmer's lung: extrinic allergic alveolitis // Vet. Rec. 1971. Vol. 88. P. 346-351.

135.Rainey F. A., WardRainey N., Kroppenstedt R. M., Stackebrandt E. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 46. № 4. Oct. 1996. P. 1088-1092.

136.Ramasamy M., Khan Z. U., Kurup V. P. A partially purified antigen from Faenia rectivirgula in the diagnosis of Farmer's lung disease // Microbios. 1987. Vol. 49. P. 171-182.

137.Rippon T. W. Extracellular collagenase produced by Streptomyces madurae //Biochim. Biophys. Acta. 1968. Vol. 159. P. 147-152.

138.Rowbotham T. J., Cross T. Ecology of Rhodococcus coprophilus and associated actinomyces in fresh water and agricultural habitats. 11 J. Gen. Microbiol. 1977. V. 100. P. 231-240.

139.Runmao H. Saccharomonospora azurea sp. nov., a new species of the genus Saccharomonospora /1 Int. J. System. Bacteriol. 1987. Vol. 37. P. 60-61.

HO.Runmao H., Lin C., Guizhen W. Saccharomonospora cyanea sp. nov. // Int. J. System. Bacteriol. 1988. Vol. 38. P. 444-446.

141.Schuurmans D. M., Olson B. N., Clemente C. L. S. Production and isolation of thermoviridin, an antibiotic produced by Thermoactinomyces viridis n. sp. //Appl. Microbiol. 1956. Vol. 4. P. 61-66.

142.Stanek M. Microorganisms inhabiting mushroom compost during fermentation//Mushroom Sc. 1972. Vol. 8. P. 797-811.

143.Steingrube V. A., Wilson R. W., Brown B. A., Jost K. C., Blacklock Z., Gibson J. L., Wallace R. J. Rapid identification of clinically significant species and taxa of aerobic actinomycetes, including Actinomadura, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, and Tsukamurella isolates, by DNA amplification and restriction endonuclease analysis // J. Clinical Microbiol. Vol. 35. № 4. Apr. 1997. P. 817-822.

144.Sternberg M. Microbial rennets // Adv. Appl. Microbiol. 1976. Vol. 20 P. 135-157.

145.Stutzenberger F. J. Cellulase production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost // Appl. Microbiol. 1971. Vol. 22. P. 147-152.

146.Takatsu T., Nakajima M., Oyajima S.; Itoh Y., Haneishi T., Nakamura T., Sakaid Y., Takahashi S., Haneishi T. Chloropolysporins A, B and C: novel

glycopeptides from Faenia interjecta II. Fermentation, isolation and physico-chemical characterisation// J. Antibiot. 1987. Vol. 40. P. 924-932.

147.Tamura A. and Takeda I. Antibiotic AB-65, a new antibiotic from Saccharomonospora vinde II J. Antibiot. 1975. Vol. 28. P. 395-397.

148.Tanaka, Y., Grafe U., Yazawa K., Mikami Y., Ritzau M. Nocardicyclins A and B: New anthracycline antibiotics produced by Nocardia pseudobrasiliensis //J. of Antibiotics. Vol. 50. № 10. Oct. 1997. P. 822-827.

149.Tanaka Y., Komaki H., Yazawa K., Mikami Y., Nemoto A., Tojyo T., Kadowaki K., Shigemori H., Kobayashi J. Brasilinolide A, a new macrolide antibiotic produced by Nocardia brasiliensis: Producing strain, isolation and biological activity // J. of Antibiotics. Vol. 50. № 12. Dec. 1997. P. 1036-1041.

150.Tatsuta K., Takahashi M., Tanaka N. The first total synthesis of pyralomicin 2C//Tetrahedron Letters. 1999. Vol. 40. Iss. 10. P. 1929-1932.

151.The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria. Eds. Starr M. P. et al. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1991. V. 2. P. 1913-2125.

152.Trujillo M. E., Goodfellow M. Polyphasic taxonomic study of clinically significant actinomadurae including the description of Actinomadura latina sp. nov. // Zentralblatt Fur Bakteriologie —International J. of Medical Microbiology, Virology, Parasitology and Infections Diseases. Vol. 285. № 2. Jan. 1997. P. 212-233.

153.Tsuda M., Sato H., Tanaka Y., Yazawa G., Mikami Y., Sasaki T., Kobayashi J. Brasiliquinones A-C, new cytotoxic benz[a]anthraquinones with an ethyl group at C-3 from actinomycete Nocardia brasiliensis II J. of the Chemical Society-Percin Transactions 1. № 15. Aug. 7. 1996. P. 1773-1775.

154.Tsukamoto M., Murooka K., Nakajima S., Abe S., Suzuki H., Hirano K., Kondo H., Kojiri K., Suda H. BE-32030 A, B, C, D and E, new antitumor substances produced by Nocardia sp. A32030 // J. of Antibiotics. Vol. 50. № 10. Oct. 1997. P. 815-821.

155.Umezawa H., Gomi S., Yamagishi Y., Obata T., Ikeda T., Hamada M., Kondo S. -N-Fonnirnidoylsporaricin A produced by Saccharopolyspora hirsuta subsp. kobensis II J. Antibiot. 1987. Vol. 40. P. 91-93.

156.Wang Y., Zhang Z. S., Ruan J. S. Phylogenetic Analysis Reveals New Relationships Among Members of the Genera Microtetraspora and MicrobisporaU Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol.46. Iss. 3. P. 658-663.

157.Wang Y., Zhang Z. S., Ruan J. S. A proposal to transfer Microbispora bispora (Lechevalier 1965) to a new genus, Thermobispora gen. no v., as Thermobispora bispora comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 46. № 4. Oct. 1996. P. 933-938.

158.Warwick S., Bowen T., Mcveigh H., Embley T. M. A Phylogenetic Analysis of the Family Pseudonocardiaceae and the Genera Actinokineospora and Saccharothrix with 16S Ribosomal-RNA Sequences and a Proposal to Combine the Genera Amycolata and Pseudonocardia in an Emended Genus Pseudonocardia II Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. Vol. 44. Iss. 2. P. 293-299.

159.Whaley H. A., Chidester C. G., Mizsak S. A., Wnuk R. J. Nodusmicin, The structure of a antibiotic // Tetrad. Lett. 1980. Vol. 21. P. 3659-3662.

160.Wilkie B. N. Bovine allergic pneumonitis. An acute outbreak associated with mouldy hay // Can. J. Comp. Med. 1978. Vol. 42. P. 10-15.

161.Williams S. T. Streptomycetes in the soil ecosystem // Zentr. Bl. Bakteriol., Parasiten. Infect. UndHyg. I. Abt. 1978. Bd. 6. Suppl. P. 137-144.

162.Williams S. T., Beswick A., Embley T. M., McVeigh H., West M. Evaluation of methods for the detection, isolation and identification of actinomycetes in soils // 9th Intern. Symp. Biology of Actinomycetes (ISBA), Moscow, Russia. 1994. P. 57.

163.Williams S. T., Wellington E. M. N, Tipler L. S. The taxonomic implications of representative Nocardia strains to actinophage // J. Gen. Microbiol. 1980. Vol. 119. P. 173-178.

164.Yassin A. F., Rainey F. A., Burghardt J., Gierth D., Ungerechts J., Lux I., Seifert P., Bal C., Schaal K. P. Description of Nocardiopsis synnemataformans sp. nov., elevation of Nocardiopsis alba subsp. prasina to

Nocardiopsis prasina comb, nov., and designation of Nocardiopsis antarctica and Nocardiopsis alborubida as later subjective synonyms of Nocardiopsis dassonvillei II Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 47. № 4. Oct. 1997. P. 983-988.

165.. Yoon J. H., Kim H„ Kim S. B., Kim H. J., Kim W. Y., Lee S. T., Goodfellow M., Park Y. H. Identification of Saccharomonospora Strains by the Use of Genomic DNA Fragments and Ribosomal-RNA Gene Probes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol. 46. Iss. 2. P. 502-505.

166Yoon J. H., Lee S. T., Kim S. B., Kim W. Y., Goodfellow M., Park Y. H. Restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified 16S ribosomal DNA for rapid identification of Saccharomonospora strains I I Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 47. № 1. Jan. 1997. P. 111-114.

167.Yoon J. H., Lee S. T., Shin Y. K., Kim S. B., Kim H. J., Goodfellow M., Park Y. H. Rapid identification of Saccharomonospora strains by multiplex PCR using species-specific primers within the 16S rRNA gene // J. of Microbiological Methods. Vol. 27. № 1. Sep. 1996. P. 89-95.

168.Yoshida K., Sasaki A. and Inoue H. An anionic trypsin-like enzyme from Streptomyces erythraeus //FEBS Lett. 1971. Vol. 15. P. 129-132.

169.Zhang Z. S., Wang Y., Ruan J. S. Reclassification of Thermomonospora and Microtetraspora II Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. Vol. 48. Iss. Apr. P. 411-422.

170.Zhou Z. H., Liu Z. H., Qian Y. D., Kim S. B., Goodfellow M. Saccharopolyspora spinosporotrichia sp. nov., a novel actinomycete from soil // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. Vol. 48. Iss. Jan. P. 53-58.