НОВЫЙ МЕТОД БЫСТРОГО МОЛЕКУЛЯРНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ОСНОВЕ КАРТРИДЖНОЙ ЭКСТРАКЦИИ В ЛИНИИ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.01, кандидат наук Елиферов Василий Алексеевич

• Елиферов Василий Алексеевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Елиферов Василий Алексеевич

Введение

Актуальность работы

Цели и задачи диссертационного исследования

Научная новизна

Практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Глава 1. Обзор литературы

Прямая масс-спектрометрия в контексте анализа тканей и их патологий

Термодесорбция, химическая десорбция, ионизация плазмой

Лазерная абляция

Масс-спектрометрическая визуализация

Предобработка масс-спектрометрических данных

Методы диагностики новообразований, применяемые в медицинской практике

Глава 2. Новый метод картриджной экстракции в линии

Реализация метода картриджной экстракции

Формирование контрольной выборки и постановка исследования

Обработка данных

Оценка информативности масс-спектрометрических профилей картриджной экстракции профилей

Глава 3. Определение возможностей метода картриджной экстракции в

линии при помощи методов статистического анализа

Формирование контрольной выборки образцов

Протоколы исследования

Обработка данных

Влияние заморозки и хранение образца на его масс-спектрометрический профиль

Комплексный анализ масс-спектрометрических профилей

Влияние процессов экстракции

Представление результатов при помощи матриц подобия

Глава 4. Роль липидов при классификации астроцитомы и глиобластомы при помощи масс-спектрометрического профилирования опухолей

Формирование контрольной выборки и постановка исследования

Обработка данных и классификация

Результаты идентификации липидов

Определение роли липидов при классификации астроцитомы и глиобластомы

Заключение

Публикации автора по теме диссертации

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «НОВЫЙ МЕТОД БЫСТРОГО МОЛЕКУЛЯРНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ОСНОВЕ КАРТРИДЖНОЙ ЭКСТРАКЦИИ В ЛИНИИ»

Введение

Актуальность работы Развитие современной медицины в направлении применения персонализированных, автоматизированных и прецизионных подходов к лечению требует внедрения высокопроизводительных методов анализа, позволяющих производить медицинские исследования со все возрастающей частотой и с наибольшей чувствительностью. Методы молекулярного мониторинга биологических процессов, сопровождающих развитие патологий являются перспективными методами как диагностики, так и мониторинга состояния пациента в процессе лечения. Техника проведения автоматизированных манипуляций в медицине и, в частности, хирургии в настоящее время активно развивается, что тоже, в свою очередь, требует разработки новых методов автоматизированного контроля хода данных манипуляций. Молекулярный анализ может быть перспективным методом контроля хирургических операций в том случае, если он позволит предоставить более точную информацию о составе и свойствах удаляемых тканей, чем другие, методы. Масс-спектрометрия, в свою очередь, в настоящее время является лидирующим методом исследования биологических молекул, что обусловлено высокими аналитическими характеристиками метода, такими как разрешающая способность, чувствительность, порог детектирования и динамический диапазон. Кроме этого, современные методы масс-спектрометрических исследований позволяют получать данные за короткое время (десятки спектров в секунду), при этом масс-спектрометрические данные характеризуют представленность в образце большего количества молекул в одном измерении и разбивая их на группы в соответствии с массой молекул. Все это позволяет рассматривать масс-спектрометрические методы как методы высокопроизводительного и высокоинформативного анализа

биологических молекул. Таким образом, методы молекулярного профилирования, в основе которых лежит масс-спектрометрическое исследование молекулярного состава тканей человека по время хирургической операции могут быть положены в основу современных подходов прецизионного сопровождения хирургических операций. Методы объективного контроля патологических изменений, базирующиеся на основе молекулярного профилирования, могут применяться как при анализе биопсийных образцов, так и могут быть интегрированы в состав сложных многофункциональных медицинских комплексов, в том числе систем, использующихся в роботизированной хирургии. Внедрение автоматизированных методов проведения хирургических операций наиболее актуально нейрохирургии опухолей мозга, что обусловлено повышенными требованиями к прецезионности операций, характерных для этой области хирургии. Первичные опухоли головного мозга составляют 1,4% всех случаев раковых заболеваний и 2,4% всех случаев смерти от рака в США. Примерно 20,5 тысяч вновь диагностированных случаев и 12,5 тысяч случаев смертей связаны с первичными злокачественными опухолями головного мозга каждый год[1]. Хирургическое иссечение опухоли является одним из важнейших этапов лечения опухоли головного мозга. Положительный исход операции напрямую связан с точностью определения границ опухоли, что требует точной идентификации тканей. Объем резекции опухоли остается наиболее важным прогностическим фактором для выживаемости пациента и долгосрочного наблюдения, поскольку неполное удаление опухоли может привести к рецидиву, а чрезмерное удаление ткани может резко снизить качество жизни пациента. Несмотря на наличие высоко специфичных методов идентификации опухолевой ткани (включая иммуногистохимические методы, а также визуализацию с помощью МРТ и КТ) создание автоматизированных комплексов сопровождения операций на их основе не возможно, так как все

они требуют достаточно большое время для анализа (не менее 20 минут) и не могут проводиться интраоперационно, без вынужденной приостановки операции.

Методы молекулярного масс-спектрометрического профилирования биологических объектов в настоящее время бурно развиваются благодаря повсеместному внедрению методов прямого масс-спектрометрического анализа - направления масс-спектрометрии, в котором объектом исследования является биологический материал, для которого не проводится сложной подготовки проб на основе экстракции биомолекул. Однако, получаемые при помощи таких методов масс-спектрометрические профили представляют собой трудно интерпретируемые данные, содержащие информацию о нескольких сотнях биомолекул. Интерпретация масс-спектров сложных смесей биологических молекул все еще остаётся трудной задачей из-за огромного разнообразия классов и видов молекул, содержащихся в биологических тканях[2,3]. В качестве инструмента точной идентификации компонентов сложных смесей повсеместное распространение получили методы ЖХ МС/МС, эти методы невозможно использовать для быстрого анализа, ввиду того, что исследование при помощи таких методов занимает значительное время и требует сложной пробоподготовки. Несмотря на большое разнообразие существующих в настоящее время методов прямого масс-спектрометрического анализа биологических объектов, таких как десорбционно-электроспейная ионизация (DESI-MS), быстрая испарительная ионизация (REIMS), лазерно-десорбционная электроспрейной ионизация (ELDI) и других, не все они могут применяться для сопровождения нейрохирургических операций, ввиду специфичности объекта - опухоли головного мозга не имеют выраженной структуры и отличаются малым объемом, а также сложности клинических манипуляций. Таким образом, для развития методов автоматизированного молекулярного профилирования опухолей головного

мозга необходимо разработать новые методы масс-спектрометрического профилирования опухолей головного мозга, новые подходы к анализу данных молекулярного профилирования и методы автоматизации масс-спектрометрического исследования.

Цели и задачи диссертационного исследования Несмотря на высокие аналитические характеристики масс-спектрометрического оборудования и достижения в развитии методов и техники прямого масс-спектрометрического анализа, непосредственное применение уже существующих методов к решению задачи молекулярного профилирования опухолей головного мозга затруднено, так как не дает возможность обеспечить необходимую точность идентификации при сохранении требований к скорости и простоте реализации исследования. Поэтому для решения задачи молекулярного профилирования опухолей головного мозга необходима разработка специализированных методов прямого масс-спектрометрического исследования, включающих протоколы экспериментальных исследований, технику ионных источников и методы обработки экспериментальных результатов.

Таким образом, основной целью диссертационного исследования стала разработка быстрого метода молекулярного масс-спектрометрического профилирования опухолей головного мозга из образцов, получаемых интраоперационно.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка ионного источника, позволяющего осуществлять экспресс-исследование образцов опухолей головного мозга интраоперационно;

2. Исследование аналитических возможностей созданного ионного источника и поиск подходов оптимизации протоколов экспериментальных исследований;

3. Исследование структуры масс-спектрометрических профилей с помощью статистических методов;

4. Определение возможности классификации опухолей головного мозга на основе анализа данных молекулярного профилирования, полученных при помощи разработанного метода.

Научная новизна Научная новизна данной диссертационной работы состоит в следующем:

1. Метод картриджной экстракции, интегрированный непосредственно в электрораспылительный ионный источник, является как новым по своей конструкции, так и его применение для исследования опухолей головного мозга с целью их молекулярного профилирования, предложено впервые. Было продемонстрировано, что предложенный подход позволяет проводить быструю идентификацию опухолей головного мозга на основе молекулярного профилирования образцов тканей, полученных интраоперационно;

2. Исследование информативности молекулярных профилей тканей в режиме исследования положительных или отрицательных ионов и вывод о разной роли таких профилей при решении задачи идентификации типа ткани;

3. Впервые с помощью метода картриджной экстракции в линии на примере дифференциации астроцитом и глиобластом реализован метод классификации опухолей головного мозга на основе молекулярного профилирования.

Практическая значимость Результаты, полученные в диссертационном исследовании, представляют научную и практическую значимость. Практическая значимость, в первую очередь, связана с возможностью реализации аналитического оборудования для применения в практическом здравоохранении.

Разработанный метод картриджной экстракции в линии позволяет проводить быструю идентификацию опухолей головного мозга на основе молекулярного профилирования образцов тканей, проводимого непосредственно во время хирургического вмешательства. Таким образом, созданные методы и подходы могут быть использованы для создания аналитических комплексов, которые могут быть использованы в клинической практике. Полученные результаты могут быть обобщены и использованы при реализации аналогичных методов и подходов не только в нейрохирургии, но и в других областях медицины, в которых требуется быстрое профилирование образов биологических тканей.

Положения, выносимые на защиту

1. Новый метод картриджной экстракции в линии, основанный на интегрированной процедуре экстракции непосредственно в поток растворителя и электроспрейной ионизации, для быстрой идентификации опухолей головного мозга на основе молекулярного профилирования. [4]

2. Возможности метода картриджной экстракции в линии могут быть оценены при помощи методов статистического анализа на основе матриц спектрального подобия, который позволяет получать быстро определять надежность и воспроизводимость получаемого результата. Молекулярные масс-спектрометрические профили,

измеренные в модах положительных и отрицательных ионов, играют разную роль в классификационном анализе опухолей головного мозга - молекулярные профили, измеренные положительной демонстрируют стабильность сигнала и позволяют оценить воспроизводимость данных, молекулярные профили, измеренные в отрицательной моде позволяют оценить тонкие различия между образцами и могут быть использованы для окончательной классификации типа опухоли. [5] 3. Реализация метода классификации опухолей головного мозга при помощи методов молекулярного профилирования на основе картриджной экстракции в линии продемонстрирована на примере исследования различий молекулярного строения астроцитом и глиобластом. Наилучшие результаты дифференциации астроцитом и глиобластом по молекулярному масс-спектрометрическому профилю могут быть достигнуты при помощи комбинации анализа содержания содержания индивидуальных маркерных ионов и выявленных значимых групп ионов. Групповая идентификация ионов значительно дополняет индивидуальную, отражая естественную биологическую функциональность липидных маркеров, напрямую связанных с энергетическим и пластическим метаболизмом тканей. [2][3]

Глава 1. Обзор литературы

Прямая масс-спектрометрия в контексте анализа тканей и их

патологий

Появление методов прямого масс-спектрометрического исследования позволило использовать масс-спектрометрические методы и технологии в совершенно новых практических приложениях и развить новые подходы к созданию масс-спектрометрической техники [6]. Несмотря на то, что часто можно встретить определения, в которых методами прямой ионизации называют подходы, в которых не требуется пробоподготовка[7,8], скорее верно будет сказать, что это методы, в которых пробоподготовка исследуемого образца происходит в реальном времени во время анализа. Прямая ионизация предполагает наличие этапа подготовки проб, но без этапа разделения компонентов, а методы хромато -масс-спектрометрии обычно включают этап пробоподготовки, предварительного разделения и последующую идентификацию компонентов при помощи масс-спектрометра. В контексте решения задач клинической диагностики, ключевым отличием методов прямого масс-спектрометрического исследования и прямой ионизации от классических методов хромато масс-спектрометрии является скорость получения результатов анализа. Если пробоподготовка и хроматографическое разделение с последующим масс-спеткрометричским анализом биологического образца может занимать от десятка минут до нескольких дней, то большая часть методов прямой ионизации нацелена на получение результатов за несколько минут или даже в режиме реального времени. В частности, это позволяет использовать масс-спектрометрию для интраоперационнного анализа и помощи хирургу непосредственно во время операции.

Классифицировать методы прямой ионизации можно исходя из разных критериев, но поскольку данный обзор посвящен методам ионизации, ориентированным на помощь при проведении хирургических операций, я разделю методы по механизму экстракции молекул из образца. Глобально можно выделить три группы методов: использующие жидкостную экстракцию из образца, использующие термодесорбцию для получения молекул и использующие лазерную абляцию. Методы прямой ионизации с жидкостной экстракцией. С точки зрения подхода к инструментальной реализации удобно разделить методы ионизации с жидкостной экстракцией на три группы:

1) распылительная десорбция, в которой заряженные капли растворителя образуют тонкий слой на образце, где молекулы аналита переносятся с поверхности образца в эти капли, примером такого метода является DESI;

2) жидкостная микроэкстракция, при которой молекулы аналита экстрагируются в растворитель и после ионизируются, примерами с таким механизмом являются LESA[9] или NESI[10];

3) ионизация непосредственно из субстрата образца, например Paper Spray[11].

Метод десорбционной электроспрейной ионизации (DESI) и его производные широко применяются в исследованиях, посвященных прямому масс-спектрометрическому анализу образцов тканей человека. Вариативность этих методик позволяет ориентировать метод под конкретную задачу, например, добавив вторичную лазерную ионизацию (LAESI) или же матрично-активированную лазерную ионизацию образца (MALDESI), что позволяет получить хорошие результаты в профилировании разнообразных типов опухолей. Недостатком же подобных методов для клинической интраоперационной диагностики является то, что в условиях хирургической операции поверхность исследуемой ткани может быть покрыта кровью или физраствором, что

может искажать масс-спектрометрические данные вплоть до невозможности их интерпретации. Поэтому большая часть методов ориентирована на диагностику ex vivo.

Методы жидкостной микроэкстракции прежде всего различаются механизмом доставки растворителя на поверхность образца, последующим его забором и ионизацией. Технология MasSpec pen реализует концепцию портативного аналитического зонда для не деструктивного анализа образцов ткани, в котором на поверхность исследуемого образца в автоматическом режиме подаются для экстракции и отбираются капли растворителя. Исследования показали хорошие результаты в профилировании образцов опухолей ткани груди, легких, щитовидной железы и яичников ex vivo и возможность in vivo диагностики на мышиной модели с опухолями[12]. В методе nano-DESI поверхность образца омывается непрерывным потоком растворителя с потоком около 1 мкл в минуту, что позволяет точнее локализовать область экстракции, чем в методе DESI. Из-за конструктивных особенностей этот метод не применим для in vivo анализа, однако позволяет получать масс-спектрометрические изображения с пространственным разрешением 200 мкм[13]. Иной подход используется в методе spray-from-tissue, в котором фрагмент исследуемого образца помещается непосредственно на иглу электромпрейного источника и обтекается растворителем одновременно с процессом ионизации. Этот метод ориентирован на интраоперационную ex vivo диагностику тканей опухоли мозга человека и его главным преимуществом является отсутствие транспортной линии растворителя с растворенными молекулами аналитов, что позволяет избежать проблем с загрязнением системы транспорта и влиянием образца на псоледующие измерения [14].

Наиболее распространенным методом ионизации непосредственно субстрата является paper spray. В этом методе ионизация электрораспылением происходит с поверхности пробы бумажного

треугольника, на которую наносится исследуемый раствор. Этот метод больше ориентирован на клиническое исследование физиологических жидкостей для ранней диагностики рака[15], но может быть доработан для ex vivo интраоперационной диагностики тканей[11]. Так же существуют методы, в которых ионизация электрораспылением происходит непосредственно с образца, например в Tissue spray ionization небольшой фрагмент исследуемой ткани фиксируется на конце электроспрейной иглы[16]. Недостатком такого подхода является то, что ионный источник электроспрейной ионизации является нестабильной системой, резко реагирующей на изменение параметров. Изменение формы и размера образца в каждом эксперименте значительно усложняет получение повторяемых результатов.

Термодесорбция, химическая десорбция, ионизация плазмой Методы ионизации с использованием плазмы могут использовать различные режимы электрических разрядов: тлеющий, коронный или диэлектрический барьерный[17]. Эти методы обеспечивают простоту конструкции, что позволяет конструировать портативные ионные источники. Особенно перспективны подобные методы для контроля хирургических операций, в которых используется элекрохирургия. Побочным эффектом применения аппаратов высокочастотной электрохирургии является образование аэрозолей оперируемой ткани, который может быть использован для масс-спектрометрического анализа. На этой концепции базируется метод Rapid evaporative ionization mass spectrometry (REIMS)[18]. Когда к хирургическому инструменту подается высокочастотный электрический ток, ткани, соприкасающиеся с ним, локально нагреваются и испаряются, образуя аэрозоль с заряженными частицами. В рядовой реализации метода REIMS аэрозоли по трубке подаются к атмосферному входу в масс-спектрометр. Этот метод сочетает

удобную интеграцию в существующие хирургические инструменты с возможностью масс-спектрометрического анализа тканей in vivo, in situ в режиме реального времени. Однако у метода есть следующие недостатки: ограниченная область применения, поскольку высокочастотная хирургия используется как рутинный инструмент для операций на печени, но неприменима для нейрохирургии, а также меньшая информативность масс-спектрометрических данных в сравнении с более мягкими методами ионизации.

Лазерная абляция

В общепринятой классификации в группу методов с лазерной ионизацией обычно включают "гибридные" или "двухэтапные" методы ионизации, в которых лазерная ионизация применяется для ионизации уже десорбированных молекул, например в electrospray assisted laser desorption ionization (ELDI)[19]. УФ лазер используется для вторичной ионизации в электроспрее. Однако в этом обзоре я классифицирую методы непосредственно по механизму десорбции молекул из образца, поэтому к методам с лазерной десорбцией я отнесу только методы, где абляция происходит за счет энергии лазерного излучения, которые применяются для быстрого анализа биологических тканей.

Испарение ткани в процессе лазерной абляции в атмосфере происходит в результате локального нагрева и вскипания образца, которое приводит к ударному повышению давления и образованию факела[20]. Помимо первичной ионизации энергией лазерного излучения, так же при схлопывании факела на поверхности образца образуется локальная зона пониженного давления, которая может поднять крупные частицы с поверхности образца[21]. Эти частицы остаются в газообразном состоянии достаточно долго для вторичной ионизации каплями электроспрея или другими методами.

Технологичность и удобство методов с лазерной абляцией делает их привлекательными для использования в интраоперационной диагностике опухолевых тканей. Например, на основе метода водной лазерной ионизации [22] создана система Spidermass для быстрого масс-спектрометрического анализа образцов in vivo.

Масс-спектрометрическая визуализация Возможность реализации методов прямого масс-спектрометрического анализа в условиях окружающей атмосферы без сложных процедур подготовки проб биологического материала позволяет развивать не только методы прямого масс-спектрометрического профилирования, но и подходы построения масс-спектрометрических изображений (масс-спектрометрической визуализации). Для получения информации о пространственной локализации соединений в образцах масс-спектрометрическими методами следует применять десорбционные методы ионизации. Они позволяют проводить ионизацию образца с участка малого размера - до 1 мкм2. Наиболее распространенными в мировой практике являются десорбционная электрораспылительная ионизация (DESI) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI), при помощи которых возможно измерение масс-спектрометрических профилей в режиме пространственного сканирования[23-25]. Результатом этих методов является масс-спектрометрические изображения- наборы многомерных данных, в которых масс-спектру, соответствующему молекулярному профилю биологического образца, сопоставляется координата точки на образце, в которой этот профиль был зарегистрирован. Полученные таким образом данные могут быть использованы для построения выводов на биологическом уровне о молекулярном строении объектов, особенностях распространения определённых веществ в них и распределении разнообразных патологий в рамках исследуемого объекта. В

частности, при помощи такого подхода удобно проводить идентификацию участков гетерогенности в образцах опухолей головного мозга. Использование масс-спектрометрической визуализации позволяет проводить идентификацию образцов диффузных глиом разной степени злокачественности и выявлять внутри этих образцов некротические зоны и зоны врастания опухолей [26].

Применение масс-спектрометрии в клинической практике позволяет создавать методы молекулярного анализа, помогающие врачу принимать важные решения при диагностике и лечении различных заболеваний. Применение прямого профилирования в нейрохирургии дает возможность, в сочетании с другими методами, обеспечивать полноту удаления опухоли, минимизируя объем иссекаемого материала. Комбинирование прямой масс-спектрометрии и визуализации способствует получению синергетического эффекта, автоматизируя и упрощая анализ, повышая степень его достоверности, что необходимо для создания востребованной в нейроонкологии навигационной системы, основанной на масс-спектрометрии. Несмотря на прогресс, демонстрируемый различными исследовательскими группами, успех применения масс-спектрометрии в нейрохирургии будет зависеть от дальнейшего развития физико -химических методов ионизации и детектирования биологических аналитов[3].

Предобработка масс-спектрометрических данных

В зависимости от настроек прибора масс-спектры могут представлять собой значения интенсивности спектра с относительно равномерным шагом по оси m/z (профильный масс-спектр), либо список положений и интесивностей выделенных максимумов в масс-спектре (центроидный масс-спектр). Как правило спектры низкого разрешения представляются в виде профилей, в то время как спектры высокого разрешения в виде центроид. В соответствии с этим подходы к предварительной обработке спектров могут различаться. Профильные масс-спектры подвергаются первичному биннингу, когда суммируются все значения внутри заданных интервалов по оси m/z. Чаще всего ширину интервалов стараются выбрать в соответствии с разрешением прибора. Центроидные спектры требуют выравнивания для того, чтобы привести положение близких пиков в различных сканах к одному значению m/z. В обоих случаях необходимо очистить данные от шума, обусловленного ошибками детектора или присутствием низкоинтенсивных ионов, для этого можно удалить все пики, интенсивность которых ниже заданного порога, либо приравнять нулю значения в соответствующих бинах. Существуют алгоритмы вычисления локальных значений шума, которые позволяют отфильтровывать пики или бины по величине соотношения сигнал/шум. Кроме того, при анализе как центроидных, так и профильных масс-спектров отбрасываются бины или пики, которые встречаются слишком редко, например менее чем в 10% всех спектров одного типа. Данные после выравнивания, биннинга, обесшумливания и фильтрации выбросов образуют матрицу характеристик пригодную для дальнейшего исследования методами мультивариантной статистики и машинного обучения [27].

Для преобразования масс-спектров в числовые векторы также наиболее используемым методом является разбиение (binning), в котором весь диапазон m/z разбивается на набор "бинов" фиксированной ширины, а

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Елиферов Василий Алексеевич, 2020 год

Список литературы

1. Ostrom Q.T. et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2006-2010 // Neuro. Oncol. 2013. Vol. 15, № suppl_2. P. ii1-ii56.

2. Eliferov V.A. et al. [The role of lipids in the classification of astrocytoma and glioblastoma using MS tumor profiling]. // Biomed. Khim. Russia (Federation), 2020. Vol. 66, № 4. P. 317-325.

3. Иванов Д.Г., Пеков С.И., Бочаров К.В., Борматов Д.С., Спасский А.И., Жванский Е.С., Сорокин А.А., Елиферов В.А., Заворотнюк Д.С., Ткаченко С.И., Халиуллин И.Г., Куксин А.Ю., Шурхай В.А.3,5, Кононихин А.С., Николаев Е.Н. П.И.А. Новые возможности масс-спектрометрии для сопровождения онкологических операций // Химическая физика. 2020. Vol. 39, № 6. P. 41-46.

4. Pekov S.I. et al. Inline cartridge extraction for rapid brain tumor tissue identification by molecular profiling. // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 18960.

5. Zhvansky E.S. et al. Assessment of variation of inline cartridge extraction mass spectra // J. Mass Spectrom. John Wiley & Sons, Ltd, 2020. Vol. n/a, № n/a. P. e4640.

6. Javanshad R., Venter A.R. Ambient ionization mass spectrometry: real-time{,} proximal sample processing and ionization // Anal. Methods. The Royal Society of Chemistry, 2017. Vol. 9, № 34. P. 4896-4907.

7. Harris G.A., Galhena A.S., Fernández F.M. Ambient Sampling/Ionization Mass Spectrometry: Applications and Current Trends // Anal. Chem. American Chemical Society, 2011. Vol. 83, № 12. P. 4508-4538.

8. Takáts Z. et al. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. // Science. United States, 2004. Vol. 306, № 5695. P. 471473.

9. Lopez-Clavijo A.F. et al. Liquid Extraction Surface Analysis (LESA) Electron-Induced Dissociation and Collision-Induced Dissociation Mass Spectrometry of Small Molecule Drug Compounds // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2018. Vol. 29, № 11. P. 2218-2226.

10. Rahman M.M., Chingin K. Stable and reproducible nano-electrospray ionization of aqueous solutions and untreated biological samples using ion current limitation combined with polarity reversing // Anal. Methods. The Royal Society of Chemistry, 2019. Vol. 11, № 2. P. 205-212.

11. Chiang S., Zhang W., Ouyang Z. Paper spray ionization mass spectrometry: recent advances and clinical applications // Expert Rev. Proteomics. Taylor & Francis, 2018. Vol. 15, № 10. P. 781-789.

12. Zhang J. et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system // Sci. Transl. Med. 2017. Vol. 9, № 406. P. eaan3968.

13. Lanekoff I. et al. Imaging nicotine in rat brain tissue by use of nanospray desorption electrospray ionization mass spectrometry. // Anal. Chem. United States, 2013. Vol. 85, № 2. P. 882-889.

14. Kononikhin A. et al. A novel direct spray-from-tissue ionization method for mass spectrometric analysis of human brain tumors. // Anal. Bioanal. Chem. Germany, 2015. Vol. 407, № 25. P. 7797-7805.

15. Mendes T.P.P. et al. Paper Spray Ionization Mass Spectrometry as a Potential Tool for Early Diagnosis of Cervical Cancer // J. Am. Soc. Mass Spectrom. American Chemical Society, 2020. Vol. 31, № 8. P. 1665-1672.

16. Wei Y. et al. Tissue spray ionization mass spectrometry for rapid recognition of human lung squamous cell carcinoma // Sci. Rep. 2015. Vol. 5, № 1. P. 10077.

17. Cody R.B., Laramée J.A., Durst H.D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. // Anal. Chem. United States, 2005. Vol. 77, № 8. P. 2297-2302.

18. Balog J. et al. Identification of biological tissues by rapid evaporative ionization mass

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

spectrometry. // Anal. Chem. United States, 2010. Vol. 82, № 17. P. 7343-7350. Shiea J. et al. Electrospray-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for direct ambient analysis of solids. // Rapid Commun. Mass Spectrom. England, 2005. Vol. 19, № 24. P. 3701-3704.

Nemes P., Vertes A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry // Anal. Chem. American Chemical Society, 2007. Vol. 79, № 21. P. 8098-8106.

Tabersky D. et al. Aerosol entrainment and a large-capacity gas exchange device (Q-GED) for laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry in atmospheric pressure air // J. Anal. At. Spectrom. The Royal Society of Chemistry, 2013. Vol. 28, № 6. P. 831-842.

Ogrinc N. et al. Water-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for minimally invasive in vivo and real-time surface analysis using SpiderMass // Nat. Protoc. 2019. Vol. 14, № 11. P. 3162-3182.

Eberlin L.S. et al. Pancreatic Cancer Surgical Resection Margins: Molecular Assessment by Mass Spectrometry Imaging. // PLoS Med. 2016. Vol. 13, № 8. P. e1002108.

Clark A.R. et al. Rapid discrimination of pediatric brain tumors by mass spectrometry imaging // J. Neurooncol. 2018. Vol. 140, № 2. P. 269-279.

Rohner T.C., Staab D., Stoeckli M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. // Mech. Ageing Dev. Ireland, 2005. Vol. 126, № 1. P. 177-185. Jarmusch A.K. et al. Differential Lipid Profiles of Normal Human Brain Matter and Gliomas by Positive and Negative Mode Desorption Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Imaging. // PLoS One. 2016. Vol. 11, № 9. P. e0163180. Xi B. et al. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. // Methods Mol. Biol. 2014. Vol. 1198. P. 333-353.

Urban J. Resolution, Precision, and Entropy as Binning Problem in Mass Spectrometry BT - Bioinformatics and Biomedical Engineering / ed. Rojas I., Ortuno F. Cham: Springer International Publishing, 2018. P. 118-128.

Gu H. et al. 1H NMR metabolomics study of age profiling in children. // NMR Biomed. 2009. Vol. 22, № 8. P. 826-833.

Yang C., He Z., Yu W. Comparison of public peak detection algorithms for MALDI mass spectrometry data analysis // BMC Bioinformatics. BioMed Central, 2009. Vol. 10. P. 4. Sorokin A. et al. Feature selection algorithm for spray-from-tissue mass spectrometry. // Eur. J. Mass Spectrom. (Chichester, Eng). England, 2017. Vol. 23, № 4. P. 237-241. Gladson C.L., Prayson R.A., Liu W.M. The pathobiology of glioma tumors. // Annu. Rev. Pathol. 2010. Vol. 5. P. 33-50.

Ostrom Q.T. et al. Epidemiology of gliomas. // Cancer Treat. Res. United States, 2015. Vol. 163. P. 1-14.

Diamandis P., Aldape K. World Health Organization 2016 Classification of Central Nervous System Tumors. // Neurol. Clin. United States, 2018. Vol. 36, № 3. P. 439447.

Pedeutour-Braccini Z. et al. Microfoci of malignant progression in diffuse low-grade gliomas: towards the creation of an intermediate grade in glioma classification? // Virchows Arch. 2015. Vol. 466, № 4. P. 433-444.

Ermolaev A.Y. et al. [Cytologic control of the resection margins of hemispheric gliomas and metastases]. // Zh. Vopr. Neirokhir. Im. N. N. Burdenko. Russia (Federation), 2020. Vol. 84, № 1. P. 33-42.

Park D.M., Rich J.N. Biology of glioma cancer stem cells. // Mol. Cells. Korea (South), 2009. Vol. 28, № 1. P. 7-12.

Bao S. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. // Nature. England, 2006. Vol. 444, № 7120. P. 756-760. Bourne T.D., Schiff D. Update on molecular findings, management and outcome in low-grade gliomas. // Nat. Rev. Neurol. England, 2010. Vol. 6, № 12. P. 695-701. Sanai N., Chang S., Berger M.S. Low-grade gliomas in adults. // J. Neurosurg. United

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

States, 2011. Vol. 115, № 5. P. 948-965.

Jakola A.S. et al. Comparison of a strategy favoring early surgical resection vs a strategy favoring watchful waiting in low-grade gliomas. // JAMA. United States, 2012. Vol. 308, № 18. P. 1881-1888.

Brat D.J. et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade

Gliomas. // N. Engl. J. Med. 2015. Vol. 372, № 26. P. 2481-2498.

Olson T.P. et al. Frozen section analysis for intraoperative margin assessment during

breast-conserving surgery results in low rates of re-excision and local recurrence. //

Ann. Surg. Oncol. United States, 2007. Vol. 14, № 10. P. 2953-2960.

D'Halluin F. et al. Intra-operative touch preparation cytology following lumpectomy for

breast cancer: a series of 400 procedures. // Breast. Netherlands, 2009. Vol. 18, № 4.

P. 248-253.

Mesurolle B. et al. Sonography of postexcision specimens of nonpalpable breast lesions: value, limitations, and description of a method. // AJR. Am. J. Roentgenol. United States, 2006. Vol. 186, № 4. P. 1014-1024.

Mosterd K. et al. Surgical excision versus Mohs' micrographic surgery for primary and recurrent basal-cell carcinoma of the face: a prospective randomised controlled trial with 5-years' follow-up. // Lancet. Oncol. England, 2008. Vol. 9, № 12. P. 1149-1156. Zitelli J.A., Moy R.L., Abell E. The reliability of frozen sections in the evaluation of surgical margins for melanoma // J. Am. Acad. Dermatol. 1991. Vol. 24, № 1. P. 102106.

Barlow R.J., White C.R., Swanson N.A. Mohs' micrographic surgery using frozen sections alone may be unsuitable for detecting single atypical melanocytes at the margins of melanoma in situ. // Br. J. Dermatol. England, 2002. Vol. 146, № 2. P. 290294.

Ciccarelli G. et al. Radiography of the surgical specimen in early stage breast lesions: diagnostic reliability in the analysis of the resection margins. // Radiol. Med. Italy, 2007. Vol. 112, № 3. P. 366-376.

Tang R. et al. A pilot study evaluating shaved cavity margins with micro-computed tomography: a novel method for predicting lumpectomy margin status intraoperatively. // Breast J. United States, 2013. Vol. 19, № 5. P. 485-489.

Pappo I. et al. Diagnostic performance of a novel device for real-time margin assessment in lumpectomy specimens. // J. Surg. Res. United States, 2010. Vol. 160, № 2. P. 277-281.

Schnabel F. et al. A randomized prospective study of lumpectomy margin assessment with use of MarginProbe in patients with nonpalpable breast malignancies. // Ann. Surg. Oncol. 2014. Vol. 21, № 5. P. 1589-1595.

Doyle T.E. et al. High-frequency ultrasound for intraoperative margin assessments in breast conservation surgery: a feasibility study // BMC Cancer. BioMed Central, 2011. Vol. 11. P. 444.

Evers D.J. et al. Diffuse reflectance spectroscopy: towards clinical application in breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. 2013. Vol. 137, № 1. P. 155-165. Wilke L.G. et al. Rapid noninvasive optical imaging of tissue composition in breast tumor margins. // Am. J. Surg. 2009. Vol. 198, № 4. P. 566-574.

Nguyen F.T. et al. Intraoperative evaluation of breast tumor margins with optical coherence tomography. // Cancer Res. 2009. Vol. 69, № 22. P. 8790-8796. Sanai N. et al. Intraoperative confocal microscopy for brain tumors: a feasibility analysis in humans. // Neurosurgery. United States, 2011. Vol. 68, № 2 Suppl Operative. P. 282-290; discussion 290.

Chang T.C. et al. Interobserver agreement of confocal laser endomicroscopy for bladder cancer. // J. Endourol. 2013. Vol. 27, № 5. P. 598-603. Haka A.S. et al. Diagnosing breast cancer using Raman spectroscopy: prospective analysis. // J. Biomed. Opt. 2009. Vol. 14, № 5. P. 54023.

Jermyn M. et al. Intraoperative brain cancer detection with Raman spectroscopy in humans. // Sci. Transl. Med. United States, 2015. Vol. 7, № 274. P. 274ra19.

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

Ferreira C.R. et al. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Point-of-Care Diagnostics and Other Clinical Measurements. // Clin. Chem. 2016. Vol. 62, № 1. P. 99-110. Xu X. et al. Direct Infusion-Three-Dimensional-Mass Spectrometry Enables Rapid Chemome Comparison among Herbal Medicines // Anal. Chem. American Chemical Society, 2020. Vol. 92, № 11. P. 7646-7656.

González-Domínguez R., Sayago A., Fernández-Recamales Á. Direct infusion mass spectrometry for metabolomic phenotyping of diseases. // Bioanalysis. England, 2017. Vol. 9, № 1. P. 131-148.

Rathahao-Paris E. et al. Evaluation and validation of an analytical approach for high-throughput metabolomic fingerprinting using direct introduction-high-resolution mass spectrometry: Applicability to classification of urine of scrapie-infected ewes. // Eur. J. Mass Spectrom. (Chichester, Eng). England, 2019. Vol. 25, № 2. P. 251-258. Freund D.M. et al. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. // J. Vis. Exp. 2018. № 136.

Pirro V. et al. Analysis of human gliomas by swab touch spray-mass spectrometry: applications to intraoperative assessment of surgical margins and presence of oncometabolites. // Analyst. 2017. Vol. 142, № 21. P. 4058-4066. Pirro V. et al. Intraoperative assessment of tumor margins during glioma resection by desorption electrospray ionization-mass spectrometry. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2017. Vol. 114, № 26. P. 6700-6705.

Liu J., Cooks R.G., Ouyang Z. Biological Tissue Diagnostics Using Needle Biopsy and Spray Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem. American Chemical Society, 2011. Vol. 83, № 24. P. 9221-9225.

St John E.R. et al. Rapid evaporative ionisation mass spectrometry of electrosurgical

vapours for the identification of breast pathology: towards an intelligent knife for breast

cancer surgery. // Breast Cancer Res. 2017. Vol. 19, № 1. P. 59.

Phelps D.L. et al. The surgical intelligent knife distinguishes normal, borderline and

malignant gynaecological tissues using rapid evaporative ionisation mass spectrometry

(REIMS). // Br. J. Cancer. 2018. Vol. 118, № 10. P. 1349-1358.

Jarmusch A.K. et al. Lipid and metabolite profiles of human brain tumors by desorption

electrospray ionization-MS. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016. Vol. 113, № 6. P.

1486-1491.

Balog J. et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. // Sci. Transl. Med. United States, 2013. Vol. 5, № 194. P. 194ra93. Ma X., Ouyang Z. Ambient ionization and miniature mass spectrometry system for chemical and biological analysis. // Trends Analyt. Chem. 2016. Vol. 85, № A. P. 1019.

Eberlin L.S. et al. Ambient mass spectrometry for the intraoperative molecular diagnosis of human brain tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. Vol. 110, № 5. P. 1611 LP - 1616. Sorokin A. et al. Untangling the Metabolic Reprogramming in Brain Cancer: Discovering Key Molecular Players Using Mass Spectrometry. // Curr. Top. Med. Chem. United Arab Emirates, 2019. Vol. 19, № 17. P. 1521-1534.

Armitage E.G., Kotze H.L., Lockyer N.P. Imaging of metabolites using secondary ion mass spectrometry // Metabolomics. 2013. Vol. 9, № 1. P. 102-109. Altelaar A.F.M. et al. Gold-enhanced biomolecular surface imaging of cells and tissue by SIMS and MALDI mass spectrometry. // Anal. Chem. United States, 2006. Vol. 78, № 3. P. 734-742.

Pacholski M.L. et al. Static time-of-flight secondary ion mass spectrometry imaging of freeze-fractured, frozen-hydrated biological membranes. // Rapid Commun. Mass Spectrom. England, 1998. Vol. 12, № 18. P. 1232-1235.

Sjövall P., Lausmaa J., Johansson B. Mass spectrometric imaging of lipids in brain tissue. // Anal. Chem. United States, 2004. Vol. 76, № 15. P. 4271-4278. Ogrinc Potocnik N. et al. Sequencing and Identification of Endogenous Neuropeptides with Matrix-Enhanced Secondary Ion Mass Spectrometry Tandem Mass Spectrometry.

// Anal. Chem. 2017. Vol. 89, № 16. P. 8223-8227.

81. Oppenheimer S.R. et al. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. // J. Proteome Res. 2010. Vol. 9, № 5. P. 2182-2190.

82. Le Rhun E. et al. Evaluation of non-supervised MALDI mass spectrometry imaging combined with microproteomics for glioma grade III classification. // Biochim. Biophys. acta. Proteins proteomics. Netherlands, 2017. Vol. 1865, № 7. P. 875-890.

83. Ermini L. et al. Imaging mass spectrometry identifies prognostic ganglioside species in rodent intracranial transplants of glioma and medulloblastoma // PLoS One / ed. Vertes A. 2017. Vol. 12, № 5. P. e0176254.

84. Liu X. et al. Molecular imaging of drug transit through the blood-brain barrier with MALDI mass spectrometry imaging // Sci. Rep. 2013. Vol. 3, № 1. P. 2859.

85. Römpp A. et al. Mass spectrometry imaging of biological tissue: an approach for multicenter studies. // Anal. Bioanal. Chem. Germany, 2015. Vol. 407, № 8. P. 23292335.

86. Santagata S. et al. Intraoperative mass spectrometry mapping of an onco-metabolite to guide brain tumor surgery // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. Vol. 111, № 30. P. 1112111126.

87. Agar N.Y.R. et al. Development of stereotactic mass spectrometry for brain tumor surgery. // Neurosurgery. 2011. Vol. 68, № 2. P. 280-289; discussion 290.

88. Eberlin L.S. et al. Discrimination of human astrocytoma subtypes by lipid analysis using desorption electrospray ionization imaging mass spectrometry. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2010. Vol. 49, № 34. P. 5953-5956.

89. Eberlin L.S. et al. Classifying human brain tumors by lipid imaging with mass spectrometry. // Cancer Res. 2012. Vol. 72, № 3. P. 645-654.

90. Belov M.E. et al. Design and Performance of a Novel Interface for Combined MatrixAssisted Laser Desorption Ionization at Elevated Pressure and Electrospray Ionization with Orbitrap Mass Spectrometry // Anal. Chem. American Chemical Society, 2017. Vol. 89, № 14. P. 7493-7501.

91. Schäfer K.-C. et al. Real time analysis of brain tissue by direct combination of ultrasonic surgical aspiration and sonic spray mass spectrometry. // Anal. Chem. United States, 2011. Vol. 83, № 20. P. 7729-7735.

92. Hsu F.-F. Mass spectrometry-based shotgun lipidomics - a critical review from the technical point of view. // Anal. Bioanal. Chem. 2018. Vol. 410, № 25. P. 6387-6409.

93. Zhvansky E.S. et al. Unified representation of high- and low-resolution spectra to facilitate application of mass spectrometric techniques in clinical practice // Clin. Mass Spectrom. 2019. Vol. 12. P. 37-46.

94. Zhvansky E.S. et al. Metrics for evaluating the stability and reproducibility of mass spectra. // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 914.

95. Zhvansky E.S. et al. High-resolution mass spectra processing for the identification of different pathological tissue types of brain tumors. // Eur. J. Mass Spectrom. (Chichester, Eng). England, 2017. Vol. 23, № 4. P. 213-216.

96. Rao W. et al. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016. Vol. 27, № 1. P. 124-134.

97. Feider C.L. et al. Ambient Ionization Mass Spectrometry: Recent Developments and Applications // Anal. Chem. 2019/03/14. 2019. Vol. 91, № 7. P. 4266-4290.

98. Wan K.X., Vidavsky I., Gross M.L. Comparing similar spectra: from similarity index to spectral contrast angle. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. United States, 2002. Vol. 13, № 1. P. 85-88.

99. Lau D. et al. Intraoperative perception and estimates on extent of resection during awake glioma surgery: overcoming the learning curve. // J. Neurosurg. United States, 2018. Vol. 128, № 5. P. 1410-1418.

100. Pedregosa F. et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python // J. Mach. Learn. Res. 2011. Vol. 12, № 85. P. 2825-2830.

101. Ohgaki H., Kleihues P. The Definition of Primary and Secondary Glioblastoma // Clin.

Cancer Res. 2013. Vol. 19, № 4. P. 764 LP - 772.

102. Richardson T.E. et al. Genetic and Epigenetic Features of Rapidly Progressing IDH-Mutant Astrocytomas // J. Neuropathol. Exp. Neurol. Oxford University Press, 2018. Vol. 77, № 7. P. 542-548.

103. Guenther S. et al. Spatially resolved metabolic phenotyping of breast cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometry. // Cancer Res. United States, 2015. Vol. 75, № 9. P. 1828-1837.

104. Tai'b B. et al. Lipid accumulation and oxidation in glioblastoma multiforme // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 19593.

105. Perrotti F. et al. Advances in Lipidomics for Cancer Biomarkers Discovery. // Int. J. Mol. Sci. 2016. Vol. 17, № 12.

106. Wolrab D. et al. Oncolipidomics: Mass spectrometric quantitation of lipids in cancer research // TrAC Trends Anal. Chem. 2019. Vol. 120. P. 115480.