Научные основы производства кумыса на чистых культурах. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, Хрисанова, Л. П.

• Хрисанова, Л. П.
• 1966

Оглавление диссертации Хрисанова, Л. П.

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПРОИЗВОДСТВА КУШСА П. МИКРОФЛОРА КУШСА И ВЗАИМООТНОШЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕЙ В КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТА!

Ш. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ ВНШНЕЙ СРЕДИ НА

БИ0ХЙМИЧЕСШ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕЙ. а)Влияние т#2»РН и температуры на развитие и брожение молочнокислых бактерий б)Влияние ^Н2,РН и температуры на развитие и брожение дрожжей

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

РАЗДЕЛ I.МИКРОФЛОРА КУШСА а) Дрожжи б) Молочнокислые бактерии

РАЗДЕЛ П. БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЧИСТЫХ КУЛЬТУР КУМЫСНОЙ ЗАКВАСКИ

1).Изучение взаимосвязи между размножением, образованием продуктов брожения ЗассЬаготусев 1ае1;1в и условиями среды (1Н2 и РН)

2)Изучение взаимосвязи между брожением

LactaЬвcteriшй Ъи^вгХсит и условиями среды (чН2 и РН) стр* I- 3 4 ' 5- II

3) Динамика развития и брожения дрожжей, сбраживающих лактозу и молочнокислых бактерий при их совместном культивировании. 85

РАЗДЕЛ Ш.ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КУМЫСЕ. 97 А. ВЛИЯНИЕ НАЧАЛЬНОЙ КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ НА РАЗВИТИЕ И БРОЖЕНИЕ КУЛЬТУРЫ 4* БассЬаготусев ХасЩв. 98 - 102 Б. ПОЛУПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ПРОВЕРКА Биохимические свойства кумыса на чистых культурах в зависимости от факторов внешней среды (Ъ^^Н, температуры) 103

РАЗДЕЛ 1У.КУМЫС ИЗ ОБЕЗЖИРЕННОГО КОРОВЬЕГО

МОЛОКА НА ЧИСТЫХ КУЛЬТУРАХ. 121

I.Краткая история производства кумыса из коровьего молока. 126

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 129

Влияние некоторых факторов внешней среды на биохимические процессы в коровьем кумысе. 129

РАЗДЕЛ У. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КУМЫСА ИЗ КОБЫЛЬЕГО И КОРОВЬЕГО МОЛОКА,ПРИГОТОВЛЕННЫЕ НА ЧИСТЫХ КУЛЬТУРАХ. 149

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 161 вывода 177

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научные основы производства кумыса на чистых культурах.»

Кумыс известен как диетический и лечебный напиток более 150 лет. Он широко распространен в Юго-Восточных районах Союза.

Кумысолечение возникло и развилось в России. Благотворное влияние кумыса, особенно при туберкулезе, фурункулезе и желудочно-кишечных заболеваниях, засвидетельствовано многими поколениями русских врачей. Вместе с тем лечебные свойства кумыса до последнего времени еще не получили исчерпывающего научного обоснования.

Вопросам микробиологии кушса, и, особенно её видовой принадлежности, посвящено большое число работ. Известна ведущая микрофлора кумыса и некоторые ее свойства. В настоящее время уже никто не оспаривает преимущество кумыса, приготовленного на чистых культурах.

Однако до настоящего времени нет единого принципа в подборе чистых культур для кумыса. Более того, во многих кумысолечебницах Башкирии, Средней Азии, Казахстана и Поволжья готовят кумыс на естественных заквасках, что не позволяет получать стандартный продукт по химическим свойствам и тем более по его лечебным качествам.

Нет научно-обоснованной технологии этого ценного продукта. j Существующая технология, в основном разработана чисто эмпирическим; путем и не отвечает современным требованиям.

Отсутствие научно-обоснованной технологии кумысоделия отрицательно отражается на развитии кумысолечения.

Производство кумыса связано с микробиологическими процессами. Но в литературе не было найдено работ по более глубоким исследованиям биохимических свойств ведущей микрофлоры кумыса - дрожжей и молочнокислых бактерий, как при раздельном, так и- при совместном их культивировании. Неясным остается вопрос о характере взаимоотношений между молочнокислыми бактериями и дрожжами в кумысе.

Почти ничего не известно о возможности смещения брожения в кумысе под действием факторов внешней среды, с целью интенсификации процесса образования спирта, как основного показателя активности дрожжей,при жизнедеятельности которых образуются наиболее ценные продукты брожения.

По-видимому, проблема интенсификации наиболее ценных процессов брожения в кумысе, может быть разрешена не только за счет специального подбора чистых культур дрожжей и молочнокислых бактерий,но вероятно, и за счет создания оптимальных условий для их жизнедеятельности (окислительно-восстановительных условий,активной кислотности и температуры).

Данных,по которым можно было бы с достаточной определенностью судить о роли аэрации,температуры и активной кислотности в обмене молочнокислых бактерий и дрожжей в кумысе, чтобы управлять процессами брожения, до сих пор нет.

Неизвестна и количественная характеристика окислительно-восстановительных условий для процесса образования спирта в кумысе.

Решение этих вопросов даст возможность научно обосновать принципы подбора культур для закваски и правильно организовать технологический режим производства кумыса.

В настоящей работе для разрешения нами поставлены следующие задачи:

1. Отбор лучших культур дрожжей и молочнокислых бактерий для производства кумыса и изучение их биохимических,антибиотических, редуцирующих и органолептических свойств.

2. Подбор симбиотической комбинации совместного культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий.

3. Изучение влияния факторов внешней среды (tH2,PH и температуры) на динамику брожения кумыса.

4. Проверка возможности использования тех же культур для производства кумыса из коровьего обезжиренного молока.

III I

Примечание: В шкробиологии для выражения количественной характеристики окислительно-восстановительных условий биологических сред применяется окислительно-восстановительный потенциал (ЕН).

Значение ЕН условное, показывающее разность потенциалов,которая возникает между платиновым электродом, погруженным в раствор и нормальным водородным электродом. Поэтому иногда величину окислительно-восстановительного потенциала выражают не через Ей, а через индекс' представляющий отрицательный логарифм давления малекулярного водорода в растворе.

- окислительно-восстановительный потенциал, т.е. величина, характеризующая насыщение среды кислородом или водородом и в то же время отражающей соотношение окислителей и восстановителей в среде.

В пределах от 0 до 40 ^ характеризует все степени восста-новленности или окисленности среды - от насыщения ее водородом до насыщения кислородом.

В нашей работе для выражения окислительно-восстановительного потенциала молока, культуральной жидкости, закваски и кумыса мы также применяли индекс

К соединениям, создающим окислительно-восстановительную систему молока, относятся витамин С, лактофлавин;, токоферол, цистин, глютатион, пигменты, растворимый кислород, многие ферменты, продукты жизнедеятельности микрофлоры. Окислительно-восстановительная система молока непостоянна. Непостоянство объясняется неустойчивым состоянием этих составных частей в молоке, взаиыодейст-; вием их между собой, потреблением кислорода воздуха микрофлорой, : размножением, отмиранием, сменой микробов, выделением ими разнообразных продуктов жизнедеятельности.

Окислительно-восстановительные процессы, протекающие в молоке, связаны с переносом электронов, изменением зарядности соединений, что и определяется окислительно-восстановительным иотенциа- ; лом ( Ч^).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ х

I. КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПРОИЗВОДСТВА КУМЫСА

Приготовление кумыса основано на комбинированном (молочнокислом и спиртовом) брожении кобыльего молока.

Использование брожения для приготовления различных алкогольных и кисломолочных напитков возникло задолго до того, как стала известна природа микробов-возбудителей брожения.

Способ приготовления кумыса, заключающийся, главным образом, в вымешивании и создании наиболее анаэробных условий для спиртового брожения, был известен еще скифам, кочевавшим в степях Юго-Восточной России около 2500 лет назад до нашей эры и дошел до настоящего времени с различными вариантами.

Особенно широкое распространение получил кумыс в 19 веке,когда стало известно его благотворное влияние на больных туберкулезом. В приуральских степях кумыс изготовляли кустари-самоучки,которые управляли брожением,основываясь на органолептической пробе и интуиции, передавая свои "секреты" из поколения в поколение.

Закваски.

В кустарном кумысоделии в качестве первичной закваски применялось много заквасок,из которых особенно были распространены "кор"

- промытый и высушенный осадок старого,крепкого кумыса и "катык"

- простокваша из топленого коровьего молока. Использовались также различные смеси; например, пшена,солода и меда, или смесь катыка с ячменным или пшеничным отваром.

Со времени изучения микробиологии кумыса появились и первые попытки приготовления кумыса на чистых культурах.

Постников Б.(1908) сын основателя первой кумысолечебницы Н.В. Постникова, Гинзберг(1909),Бачинская и Рубинский,Николаева (19131916). Все они пользовались чистыми культурами,выделенными ими и готовили небольшое количество кумыса.

Наибольшего успеха добилась Горовиц-Власова(1923).Она осуществила приготовление кумыса на чистых культурах в производственном масштабе в Оренбургско^узулукском кумысолечебном округе.В качестве возбудителей брожения она дспользовала дрожжи ТогиХа и Вас^ег1ит Ъи1&аг1сшп.

Ноззе стали применять чистые культда для производства кушеа в некоторых кумысолечебницах Башкирии,Боровое (Зимницкая,1934* АалдинаДУЗ?). У

Халдиной оыли выделены чистые культуры .дробей и аолочнокис-лых оактерий из Башкирского кумыса Шафраново¿ого района. Дро^-си отодрались ею- по способности самостоятельно сбра^шьатъ лактозу и ооразовывать приятный вкус и аромат. Молочнокислые палочки типа оолгарской - по способности ооразовывать чистый молочнокислый вкус, с сильными кислотообразующими свойствами.

Однако в настоящее время, но данным Гриценко (1964), не только в колхозах, но и в кумысолечебницах Башкирии, самыми распространенными первичными заквасками являются естественные закваски (катык, кислое молоко с ячменным или пшеничным отваром и т.п.). Закваски на чистых культурах шкрооргашзков почти не применяются.

Ь санатории "Лцыри" готовится кумыс на чистых культурах с 1944 года. Основателями этой кумысолечеоницы с первой научно-исследова-телъекоп кумысной лабораторией были Берлин Л.Ю. и Халдина и.Ф.

Способы приготовления к.ушса. наиболее старый способ - турсучный, использовался кочевниками в течение многих столетий. Свежевыдоенное кобылье молоко наливалось в ¡епки, емкостью 25-30 литров, сшитые из шкуры ноги лоыадл, и:,;ею-цих коническую форму с широким основанием и длинным рукавом, ку„а вставлялась ьутовка для взбалтывания кушеа. &ти иеьки по-татарски называются турсукаш, по-башкирски - сабаш, а на Кавказе - бурдюками. По мере опорожнения от кумыса туре у к доливался сверим ъоло-коа, пока вкус кумыса не портился. Тогда туреук промывали, сушили и снова наливали колокоы. Оседлые башкиры, татары и калмыки употребляли для приготовления кумыса деревянные ка^ки-челяки. Со времени Постникова стал применяться кадочно-бутылочный способу при котором последняя стадия дозревания кушеа происходит в бутылках. чстоды лро.!звог,сгва куыыоа были различны, но в основном куыюы готовились с созреванием (процесс брожения происходил в челяках) и отличались между собой длительностью созревания, характеров вымешивания и различными температурами, при которых протекают процессы брожения.

Технология приготовления кумыса перешла к нам от кустарей куше оде лов.

Войткевич (1929-1930) впервые предпринял попытку научного обоснования кумысоделия. Он ввел первый объективный критерий в производство кумыса в виде учета кислотности яра смешивании закваски с молоком. Установив, что коагуляция казеина происходит при кислотности 45-50° Тернера, Войткевич считал, что продолжительность вымешивания должна быть всего 5-10 минут, так как роль вымешивания, по его мнению, заключается в равномерном распределении кислотности во всей, массе смеси и разбивании; сгустков казеина в момент образования геля, что вполне достигается при 10 минутном вымешивании. Температура смеси'равняется при этом 30-32°. Затем молодой куше, с кислотностью не менее 50° Тернера разливают в бутылки, укупоривают и для ускорения газообразования оставляют при комнатной температуре на 20-30 минут и выносят на ледник.

Таким образом, он предложил новый ускоренный, более легкий метод приготовления куиыеа без созревания ж, без длительного вымешивания.

Однако, этот метод не: получил широкого распространения, так как кумыс не обладал полнотою специфического вкуса и имел жидкую консистенцию.

С выводами Войткевича о роли созревания и вымешивания в производстве кумыса не согласуются данные большинства исследователей (Жилин, 1929; ЗимницкаяДалдииа, 1937,194?; Сигрист и Богданов И.Ф. 1938 и другие).

Почти везде, где изготовляется кумыс, применяется эмпирический способ с созреванием в различных вариантах. Он заключается в том, что после смешивания закваски с молоком смесь оставляют при 25-27° на созревание в течение нескольких часов, во время которого смесь периодически через определенные промежутки времени, вымешивают (от 1/4 до 1,5 часа). За время созревания смесь омолаживают свеневыдоен-ным молоком столько раз, сколько доят кобыл.

По другому варианту - смесь оставляют спокойно стоять 2-3 часа затем длительно и энергично взбалтывают ее мутовкой от I до 3 часов. После чего кумыс разливает в бутылки, закупоривают, выдерживают при комнатной температуре некоторое время и выносят на ледник.

Но принципу 2-го варианта созревания готовили кумыс Зимницкая на курорте им.Фрунзе и Халдина на курорте Шафраново и в санатории "Мцыри". Способ этот сводится к следующему:лроизводственная закваска, приготовленная на чистых культурах молочномслых палочек и дрожжей, по окончании созревания, которое протекает 10-12 часов при температуре 25-26°, выносится на холод, где охлаждается до 6-8°.

При приготовлении кумыса охлажденная закваска с кислотностью около 140~150°Т, добавляется в парное или подогретое до 31-35° кобылье молоко в таком количестве, чтобы заквашенное молоко имело кислотность 45°Т и температуру 25-26°.

Во время приливания закваски к теплому молоку производят все время вымешивание полученной смеси в течение 15-20 минут.

После заквашивания смесь вымешивается в течение первого часа 3-4 раза по 1-2 минуты и затем оставляется в челяке для созревания. Когда кислотность смеси достигает 50-55°Т и по вкусу она приблизится к вкусу кумыса (для чего требуется 2-3 часа), смесь подвергают вновь вымешиванию в течение 30-60 минут.

По о^чании вымешивания кумыс разливают в бутылки,укупоривают корковой пробкой и оставляют на некоторое время в мастерской для газирования. Продолжительность газирования зависит от температуры помещения и кислотности приготовленного кумыса.(примерно 20-30 минут).

Халдина (1937), в целях выявления лучшего метода,провела исследование кумысов,приготовленных различными способами (с созреванием и без созревания,с длительным вымешиванием и 10-ти минутным вымешиванием). Кумыс изготовлялся из одних и тех же исходных продуктов (закваски и молока).

Эти данные показывают,что при созревании стимулируется спиртовое брожение,в результате которого в кумысе образуется больше спирта и веществ,обусловливающих вкус и аромат кумыса.В кумысе без созревания наиболее активно молочнокислое брожение.

Вымешивание,по мнению Халдиной, измельчает суспендированные белковые частицы,в результате куше становится как-бы гуще.

Куше,приготовленный с созреванием (2-3 часа) и длительным (30-60 минут) вымешиванием имел выраженный вкус и аромат,более густую консистенцию и получил более высокую оценку, чем кумыс, приготовленный без созревания с 10-ти минутным вымешиванием.

Дальнейшие исследования Сигриста и Богданова И.Ф.(1988) подтвердили данные Халдиной относительно высокой дисперсности белков кумыса. Авторы учитывали дисперсное состояние белков кумыса определением вязкости по Оствальду. Они установили высокую вязкость кумыса и объясняют ее результатом влияния не только размешивания,но и действием микрофлоры и кислотности. Однако экспериментального обоснования этому объяснению не было дано.

Данные Жилина (1952) также показывают,что взбалтывание усиливает спиртовое брожение; в кумысе со взбалтыванием спирта - 2,4% а без взбалтывания - 1,91%,- при одинаковом количестве молочной кислоты -1,13%. Он же указывает на глубокий гидролиз белковых частиц в кумысе за счет брожения. йнихов (1956) придерживается другого мнения. Он утверждает,что в процессе брожения в односуточном кумысе происходит очень незначительное изменение белков. Высокая вязкость и большое количество растворимых азотистых соединений в кумысе объясняется исключительно свойствами кобыльего молока.

Богданов В.М.(1962) отмечает, что цель вымешивания в процессе сквашивания кумыса заключается не столько в разбивании свернувшегося белка, сколько в увеличении доступа воздуха к дрожжевым клеткам для усиления развития дрожжей и спиртового брожения.

Гриценко'(1964) провела экспедиционное обследование кумысоде-лия Башкирии, с целью изучения существующих в настоящее время приемов изготовления кумыса на естественных заквасках. Башкирия до настоящего времени является центром кумысолечения в нашей стране. Данные Гриценко показали,что кумысоделие, несмотря на высокую ценность продукта, ведется очень примитивными методами не только в колхозах,но и в санаториях,где кумыс является одним из факторов лечения больных.

Мастера в большинстве своем не знакомы с основами молочного дела и микробиологии. Технологический режим контролируется только органолептически. Все это ведет к частой порче производственной закваски и снижению вкусовых и диетических свойств кумыса.

Как в колхозах,так и в кумысолечебницах Башкирии самыми распространенными первичными заквасками являются катык,кислое молоко с ячменным и пшеничным отваром и т.п. Закваски на чистых культурах микроорганизмов почти не применяются.

Мастера не придерживаются какой-либо одной технологии и готовят кумыс в силу своего умения,традиций и местных условий.

Из множества методов Гриценко были выявлены общие приемы в технологии изготовления кумыса,на основании которых все методы объединены в два: метод длительного сбраживания,который применяется в основном в колхозах и совхозах и метод кратковременного сбраживания, применяемый в кумысолечебницах.

Первый метод - метод длительного сбраживания кумысной смеси при температуре 26-28° в течение 7-12 и более часов,с периодическим, через каждые 2-3 часа, освежением смеси парным молоком и последующим дображиванием этой смеси при температуре 18-22° в течение 8-10 часов. Кумыс,получаемый этим методом, имеет характерный терпкий кумысный вкус и запах. Общая кислотность его равна 130--160°Т, а постоянная - П5-145°Т. Спирта содержится до 2%.

Второй метод - метод кратковременного сбраживания кумысной смеси с высокой исходной кислотностью (65-70°Т) при температуре 26-28° в течение 1-1,5 часов с однократным заквашиванием молока и 40 минутным смешиванием,разливом в бутылки и последующим дображиванием смеси при температуре 10-12° в течение 17-24 часов и более. Кумыс, получаемый методом кратковременного сбраживания, более газирован. Величина общей титруемой кислотности, равная 9СЗ-140°Т создается не только за счет молочной кислоты,но и углекислоты, образующейся при спиртовом брожении.Постоянная кислотность равна 70-1Ю°Т, содержание спирта - 1,5-1,8%.

Второй метод более приемлем в условиях крупного производства кумыса, так как обеспечивает быстрое освобождение емкостей для заквашивания новых партий молока и позволяет получать кумыс с меньшей кислотностью.

Вестерник (1940) считает современный кумыс излишне кислым и содержащим мало спирта. По его мнению, современный кумыс, по сравнению с кумысом, который готовили в прошлом столетии, менее ценен в терапевтическом отношении.

Сигрист (1948) также отмечает, что в кумысе часто встречается преобладание молочнокислого брожения над спиртовым и поэтому необходимо разработать новую технологию его приготовления с тем,чтобы содержание спирта в нем было не менее 1,5% при невысокой кислотности,

В заключение обзора работ, посвященных вопросу производства кумыса, следует сказать, что несмотря на древнюю историю, более чем 100 летнюю известность кумыса, как лечебного средства, научно-обоснованной технологии его приготовления до сих пор нет.

Существующие в большинстве санаториев и курортах методы произ-водства'кумыса исключаю® возможность получать стандартный напиток по химическому составу, органолептическим и лечебным свойствам.

Это объясняется прежде всего тем, что состав микрофлоры, применяемых естественных заквасок, носит случайный характер. Кроме того различные методы производства кумыса подобраны эмпирически и научно не обоснованы.

В связи с этим глубокое исследование биохимических свойств чистых культур, выделенных из кумыса, отбор производственно ценных из них и выяснение оптимальных условий для их жизнедеятельности, имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Эти вопросы почти совсем не освещены в литературе.

Разрешение их поможет в разработке единого принципа в подборе чистых культур для кумыса и научного обоснования технологии его производства.

П. МИКРОФЛОРА КУМЫСА И ВЗАМ.Ю0ТН0ШШМЕ •¿ОЛСЧНОКпШЩ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕЙ В ЖлОЛОЛОЧШ МОЯ ¿2АХ.

Первые исследования микрофлоры кумыса относягея к 80-м годам прошлого столетия и заключались только в бактериоскопии кумыса (Ландовский, 1374; Биль,1881; Сорокин, 1883).

В дальнейших исследованиях были выделены возбудители молочнокислого и спиртового брожения, и кроме морфологических признаков описаны их культуральные и некоторые физиолого-биохимические свойства. Молочнокислые бактерии. Впервые выделил и .описал молочнокислую палочку кумыса Шипин (1899). По описанию она близка к болгарской палочке, хотя он и не сравнивает с ней, т.к. болгарская палочка была выделена только, в 1903 г.

Рубинский (1910), Бачинская (1911), Бердников (1909) выделили из кумыса молочнокислые палочки и дали им названия соответственно кшп1эв ВасЬ. ВаМпвку ,Вве* * аг1еп1а1е Вкбва&Еш&у» к^ук-ЬасШие

Бердникова, которые отличаются между собой только по способности к кислото-образованию ( Вае^Ш&шкг - более слабый кислотообра-зователь) и температурному оптимуму развития.

Но данным дальнейших исследований(Межбич, 1328; Жилин,1929; Белокопытова и Люк-Смирнова, 1929; Войтке'вич,1934; 1937; Марков -0соргин,1933; 1941; Халдана,1946; %рамшана,1949), молочнокислая палочка кумыса относится к йхеппоЬ*гЬег1шв: Ьи1з«г£е«в, которой принадлежит главная роль в молочнокислом брожении кумыса.

Согласно "Определителю бактерии11 Красильни ков а (194-9) кшйлв Вас^ВвМадйсу и Щук ЫеШм Бердникова являются разновид* ностыо саисаеКлш, !Й1гааоЬвс4ег1ш1 Ъи1&аг1сит называется Ьтс*оЪас*ег1ит Ьи1&&г1с1Ш, Вас^егхит ОгхепЪаХе получили название Ьав*оЬ«е*«1ш1 Ог1«^а1е (Вв^всМввкжЗ) •

Таким образом СвасавЮат^Ьас^оЬа^егХиш ЪиЗ^аг!стш и ьас!оЬас1;ег1гда 0г1 являются различными видами одного рода ЪяейоЬах&еПж*.

Возможно все они принадлежат к одному виду bactobacterium bulga-ncam, а отмеченное различие в морфологии клеток,кислотообразовании и температурном оптимуме, является следствием различных условий культивирования и применения различных методик.

Исследования последних лет (Жилин, 1953; Маханта,19бО;Ь'огданов, 1962; Гриценко,1964) также показывают,что главным возбудителем молочнокислого брожения в кумысе является молочнокислая палочка типа bactobacterium btilgarlcim»

Этим выводам не соответствуют данные, полученные Горовыц-Власо-вой (1923).Выделенная ею из кумыса палочка (автор ей дала название Bacterium Orenburg!!) имеет очень мало общего с молочнокислыми бактериями. А именно:грамотрицательная,очень слабый кислотообразо-ватель и пептонизирует белки.

Правда, через два года она характеризует ее как сильный кислото-образователь. Эту палочку автор считает главным возбудителем иолоч-нокислого брожения в кумысе. Но так как Bacterium Orenburg!! грамотрицательна,то вряд ли ее возможно отнести к молочнокислым бактериям.Халдина (1946) считает,что Bacterium Orenburgii близка к Bacterium Goli aerogenes.

Многие исследователи отмечают присутствие стрептококков в кумысе. О их роли в молочнокислом брожении кумыса мнение исследователей расходится. Межбич(1923),1илин(1929),признавая присутствие Str. lactis в кумысе, считают их не обязательным агентом молочнокислого брожения кумыса. Белокопытова,Люк-Смирнова(1929),Ломакин(1933^читают, что получение высоких вкусовых достоинств кумыса возможно при условии введения в закваску на чистых культурах,кроме Bact* caucasicum и кумысных дрожжей - Str»lactis.

Королев (1932) высказал предположение,что поскольку кумыс готовится из сырого молока,в котором Str.lactis неизбежно присутствует в достаточном количестве,то если бы он и принимал участие в созревании кумыса,внесение его в закваски представляется излишним. Войткевич(1937) отрицает роль стрептококков в кумысе ввиду их быстрой гибели в кислой среде,создаваемой молочнокислой палочкой.

Халдина{1946) установила присутствие в некоторых образцах кумыса различных стрептококков (strЛactiв♦str»cremoris»8tг.citгovoгus) но же придает им значения в кумысообраэовашш.

Этот вопрос изучал Маханта (1960).Он установил,что причина быстрого исчезновения стрептококков в кумысе заключается в более низкой буферности кобыльего молока по сравнению с коровьим. Резкое снижение РН после внесения большого количества закваски, создает концентрацию водородных ионов ниже критической для развития стрептоког ков (РН=4,0-4,2) и они быстро погибают.

На основании обзора этих работ можно считать установленным,что главным возбудителем молочнокислого брожения в кумысе является молочнокислая палочка типа болгарской.Молочнокислые стрептококки играют второстепенную роль в образовании кумыса.

В литературе имеются сообщения о наличии уксуснокислых бактерий в кисломолочных продуктах.Но роль их по-разному рассматривается исследователями.Феофилова(1958)считает уксуснокислые бактерии посторонними микроорганизмами в кефирном грибке.Богданов(19575X962 и Гибшман(1952) отмечают симбиотические взаимоотношения между молочнокислыми и уксуснокислыми бактериями.Смешанные культуры более активны и сохраняются в молоке без пересевов больше года.Богданов объясняет положительное влияние уксуснокислых бактерий снижением кислотности,обогащением среды витамином В^ и частичным расщеплением белка.

Максимова и Грудзинская{1959),подбирая бактериальную закваску для кефира,установили,что уксуснокислые бактерии лучше чем дрожжи активируют развитие молочнокислых бактерий и сохраняют их длительное время в жизнедеятельном состоянии.-Уксуснокислые бактерии задерживают развитие дрожжей и резко снижают выход спирта.

Гриценко(1964),изучая возможность биологического обогащения кумыса витамином В12 установила,что обогащение кумыса витамином В12 с помощью уксуснокислых бактерий невозможно,т.к.время,необходимое им для синтеза витамина В12 недостаточно,по сравнению с продолжительностью созревания,принятой в технологии производства кумыса. Кроме того,уксуснокислые бактерии значительно подавляют развитие дрожжей и снижают выход спирта в кумысе.

Таким образом,поскольку кумыс является кисломолочным напитком главным образом спиртового брожения,то вводить уксуснокислые бактерии в* закваску на чистых культурах не следует ввиду подавления ими развития дрожжей и резкого снижения выхода спирта в кумысе.

Кумысные дрожжи.

Впервые культуры дрожжей из кумыса были выделены Григорьевым (1885) ,позднее Шипиным(1899) и отнесены к семейству Б-ассЬ-агошу— ее-Ьаееае» Отнесение к спорообразующим дрожжам было ошибочно,видимо из*~за несовершенства микробиологической методики. В дальнейшем,ряд I исследователей (Бачинская,1911;Первозванский,1922;Горовиц-Власова, 1925;Войткевич,1934;Марков-Осоргин,1941;Халдина,1946 и др.)устано- ; вили неспособность кумысных дрожжей к спорообразованию и отнесли их к семейству Фото1орв1й®сеае роду Тол;.1орэ1в.

Маханта (1960) и Гриценко(1964) согласно классификации Кудряв-цева,снова отнесли дрожжи кумыса к семейству Saccharomycetaceae» хотя способность дрожжей к спорообразованию ими и не установлена. Однако Гриценко указывает,что отнесение ею кумысных дрожжей к истинным сахаромицетам является условным,так как дрожжи,с которыми; она работала,отличаются слабым спиртообразованием и не выявленной способностью к спорообразованию.

Согласно литературным данным (Марков-Осоргин,1941; Халдина,1946: Гриценко,1964 и другие) в кумысе обнаружено,в основном,три вида дрожжей: дрожжи,самостоятельно сбраживающие лактозу; дрожжи, не сбраживающие лактозу,но сбраживающие другие сахара и дрожжи, не способные сбраживать никаких Сахаров.

Большинство исследователей считают,что главным возбудителем спиртового брожения, образования вкуса и аромата в кумысе,являются дрожжи,сбраживающие лактозу.(Королев,1932; Войткевич,1934;Марков--0соргин,1941; Халдина,1947 и др.)

Относительно роли дрожжей,не сбраживающих лактозу, мнения исследователей расходятся.Одни (Бачинская,19X1; Первозванский,

1922;Войткевич,1934;Халдина,Х946;Курамшина.Д949) не придают им существенного значения ни в спиртовом брожении,ни в образовании вкусовых достоинств кумыса.Другие (Маханта,1960; Богданов,1962) указывают,что дрожжи, не сбраживающие лактозу, могут развиваться в молоке при совместном развитии их с молочнокислыми бактериями, но значительно слабее чем дрожжи, сбраживающие лактозу. Но данным Гриценко (1964) дрожжи, не сбраживающие лактозу, обладают более сильной антибиотической активностью к гнилостным и сапрофитным микроорганизмам, чем дрожжи, сбраживающие лактозу. Поэтому наличие их в кумысе желательно.

Относительно дрожжей, не способных сбраживать никакие сахара и отнесенные к роду МусоЛегта, мнение исследователей (Марков-Осоргин 1941: Халдина, 194-6; Маханта,1960; Гриценко, 1964) в основном едино: дрожжи МусоДегта являются загрязнением микрофлоры кумыса и нередко портят вкус и аромат кумыса вследствие окисления ими спирта, молочной кислоты и пептонизации белка. Яилин (1929,1957) придерживается противоположного мнения. Он считает указанные дрожжи необходимым компонентом микрофлоры кумыса, обуславливающие его вкус и аромат. Исчезновение этих дрожжей из закваски,по его мнению, свидетельствует о "старении" ее и является показанием к замене закваски.

На основании обзора литературы, посвященной изучению микрофлоры кумыса, можно сказать, что работ по микробиологическому изучению образцов разных кумысов было много (Рубинекий,Первозванский, Войткевич,Марков-Осоргин,Халдина и др.). Основное внимание уделялось изучению видовой принадлежности микрофлоры,для чего изучались, главным образом, морфологические и некоторые физиолого-биохимиче-ские свойства, которые могут резко изменяться в зависимости от условий культивирования. Условия культивирования в работах не указывались.

В литературе также не освещены более глубокие исследования биохимических свойств микроорганизмов кумыса в динамике их развития. Между тем этот вопрос представляет значительный интерес с точки зрения улучшения качества кумыса путем выявления и подбора производственно-ценных культур.

Антибиотические свойства дрожжей, сбраживающих и не сбраживающих лактозу.

Исследования последних 20 лет показали,что среди дрожжей имеются такие штаммы, которые в процессе своей жизнедеятельности образуют вещества, обладающие свойствами в малых дозах подавлять жизнедеятельность (действовать бактериостатически) или вызывать гибель (действовать бактерицидно) других конкурирующих с ними микроорганизмов (Иваницкая,1959).

Способность дрожжей,встречающихся в кисломолочных продуктах, образовывать антибиотические вещества, была установлена сравнительно недавно. Скородумова (1951) показала,что дрожжи,сбраживающие лактозу и выделенные из различных кисломолочных продуктов, способны образовывать антибиотические вещества,подавляющие рост некоторых видов сапрофитных микроорганизмов, например Bacillus subtiiis» Bacillus mycoides, ßacterium Coli»Bacterium prodiglosum, Mycobacterium аГЬшв, Mycobacterium luteumt Mycobacterium perrugostim( Micrococcus candicane» а также задерживающие рост туберкулезной и тифозной палочек в разведении 1:400 (бактерицидного действия) и в разведении 1:800 (бактериостатического дйШ действия).

Дальнейшими исследованиями Скородумовой (1954) было доказано, что способностью образовывать антибиотические вещества обладают не только дрожжи, сбраживающие лактозу,но и другие виды дрожжей, при наличии в среде того углевода,который они могут сбраживать.

Антибиотические свойства дрожжей, выделенных из кумыса, по отношению к туберкулезной палочке, установлены Жилиным (1952) и дурамшиной (1956,1958), а к некоторым сапрофитным микроорганизмам

Гриценко (1964).

Антибиотически активные дрожжи, ведущие спиртовое брожение в кисломолочных напитках (кумыс,курунга,ацидофильно-дрожжевое молоко) образуют антибиотические вещества в самих напитках, которые и придают им лечебнне свойства (Скородумова,1961). Действие антибиотических веществ лечебных кисломолочных продуктов на микрофлору кишечника человека или животных, не резкое, как у препаратов антибиотиков^ постепенное.Прежде всего подавляются гнилостные микроорганизмы, а не нормальная кишечная микрофлора, которая принимает участие в синтезе ряда витаминов и обезвреживании ядовитых продуктов обмена веществ. Жилин (1952) также отмегал оздоровительное влияние антибиотических веществ кумыса на микрофлору кишечника, заключающееся в подавлении анаэробных гнилостных процессов.

Данные этих исследований по-новому освещают вопрос о лечебном действии кумыса при туберкулезе и желудочно-кишечных заболеваниях. Антибиотические свойства не зависят от вида исходного сырья, а являются результатом накопления в молоке продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий и особенно дрожжей.

На основании этих данных в основу технологии производства кумыса должен быть положен подбор антибиотически активных рас дрожжей, сбраживающих лактозу.

Взаимоотношение между молочнокислыми бактериями и дрожжами в кисломолочных продуктах.

Совместное существование молочнокислых бактерий и дрожжей, широко распространенное в природе и практике человека, считается классическим примером анабиотического взаимоотношения между двумя этими группами микроорганизмов.

Сиусиотичеекий характер взаимоотношений между молочнокислыми бактериями и дрожжами имеет место в кисломолочных продуктах - кефир, кумыс, лебен (Египет), мацони, или ыацун (Кавказ), айран, а также м в некисломолочных - хлебном квасе, кислом ржаном тесте.

Постоянство тесного сожительства видимо основано на взаимовыгодных условиях совместного существования.

Однако, причины такого сожительства и характер взаимоотношений между ними до сих пор экспериментально мало обоснованы. литературные данные о взаимоотношениях молочнокислых бактерий и дрожжей противоречивы. Некоторые исследователи считают их симбиотическйми, другие метабиотическими,доходящие до антагонистических.".

Селибер и Бычковская (1956) установили различные типы взаимоотношений дрожжей rrSacchsramyceB cerevisiae с молочнокислыми бактериями кислого теста. В молодых (первые 24 ч.) совместных культурах с дрожжами палочки Betabacteria® ведут себя как сильные конкуренты. В смешанной культуре подавляется размножение дрожжей и бактерий, повышается кисдотонакопление за счет усиления кислотообразующей функции каждой клетки по сравнению с монокультурами, где количество бактерий столько же или даже больше.

После первых суток жизнедеятельность бактерий начинает затухать а для дрожжей создаются более благоприятные условия для своего развития. В этот период их взаимоотношения приближаются к типу метабиотических.

Представители молочнокислых бактерий палочки рода Thermobaeterium ведут себя с дрожжами как симбионты.

Очевидно группировка этих микроорганизмов в тесте является подвижным сообществом,в котором преобладающим компонентом может в зависимости от условий - стать любой из его членов.

Авторы отмечают способность дрожжей усваивать молочную и уксусную кислоты,это и следует считать одним из' факторов, обусловливающих их совместное сожительство с молочнокислыми бактериями. ha метабиотический характер взаимоотношений между

LjDulgaricum u Saccharomyces lactls указывает Ризванов(1960).

Он отмечает,что в первые 24ч. более слабо развиваются дрожжи, позже - бактерии.

Автор выяснил,что характер взаимоотношений этих культур зависит от количества посевного материала. Внесение избыточного числа бактерий тормозит размножение обоих культур в первые часы их совместного культивирования по сравнению с монокультурами.Отношение бактерий и дрожжей (1000:1) стимулирует размножение обоих культур в смешанной культуре, а затем наблюдается тенденция к выравниванию с монокультурами. (Симбиотический характер взаимоотношения). Если при посеве количество дрожжей превышает количество бактерий, то в первые 24 часа интенсивность размножения бактерий снижается почти в 2 раза. Данные того же автора показывают, что продолжительное совместное культивирование указанных культур может привести к изменению морфолого-физиологических и биохимических свойств, увеличению средних размеров клеток, что имеет большое значение при осмотическом механизме питания, увеличение размеров колоний молочнокислых бактерий;

Автором экспериментально установлено, что благоприятное влияние дрожжей на молочнокислую палочку заключается в том,что дрожжи являются источником следующих аминокислот: цистина,лизина, аргинина, гйстидина, аспарагиновой и глютаминовой кислот, треонина, ала-нина, пролина, триптофана, метионина, фенилаланина,лейцина, а также витаминов группы Б,

Ряд исследователей отмечают симбиотические взаимоотношения между молочнокислыми бактериями и дрожжами.

Так, Шапошников (1948) считает, что параллельное существование двух организмов на одном субстрате обычно приводит к конкуренции между ними из-за питательных веществ. Однако, в случае молочнокислых бактерий и дрожжей конкуренция сильно ограничивается тем, что дрожжи в аэробных условиях для своего развития используют продукт жизнедеятельности молочнокислых бактерий - молочную кислоту

Понижение кислотности среды, в свою очередь, благотворно влияет на развитие молочнокислых бактергй. Кроме того, дрожжи являются богатым источником витаминов и с ило <лсют, к которым так требовательны молочнокислые бактерии. Королев еще в 1932г. также отмечал положительное влияние дрожжей на молочнокислые бактерии и объяснял их снижением кислотности среды за счет прямого потребления молочной кислоты дрожжами, изменением белка молока в результате протео-лиза и выделением витаминов, необходимых для развития молочнокислых бактерий.

Вместе с тем, Королев указывал, что при совместном развитии дрожжей и молочнокислых бактерий образуется меньше спирта, чем в чистой культуре дрожжей и объяснял это явление недостатком лактозы, которая используется в данном случае, не только на спиртовое брожение, но и на молочнокислое.

Скородумова (1961) отмечает,что симбиотические отношения дрожжей и молочнокислых бактерий заключаются возможно в способности дрожжей образовывать витамины - тиамин,флавин,никотиновую кислоту, которые являются составными частями ферментов,участвующих в окислительных процессах в организме, углеводном обмене и спиртовом брожении.

Sondes (1955) указывает,что дрожжи рода Toruiopsia при совместном их культивировании в молоке со Streptobacterium thermophilum u Lact©bacterium bulgaricum пептонизируют свернувшееся молоко и снижают его кислотность путем использования молочной кислоты. Жизнеспособность молочнокислых бактерий сохраняется в течение 5-8'месяцев.

Чужова (1958) исследовала лечебный кисломолочный напиток "ку-рунга" (типа кумыса) и установила тесное биологичеакое сожительство между молочнокислыми стрептококками и ацидофильной палочкой с одной стороны и дрожжами - с другой.

Данные Маханта (I960) также показывают,что дрожжи,сбраживающие лактозу,быстрее развиваются в кобыльем молоке в присутствии молочнокислых бактерий,чем в чистой культуре. Из трех исследованных автором молочнокислых бактерий Str»iactis, str. themophilus, bulgaricum лучше всего спиртовое брожение протекает с болгарской палочкой.

Феофилова (1958) отмечает наличие прочного симбиоза в кефирном грибке между гетероферментативной молочнокислой палочкой Beta-bacterium caucasicum и дрожжами сбраживающими лактозу.Совместное культивирование стимулирует развитие обоих культур за счет их продуктов обмена.

Данные Богданова и Дятницыной (1959) так же указывают на симбиотические взаимоотношения микрофлоры кефирного грибка, в которую входят молочнокислые стрептококки и палочки, дрожжи сбраживающие и не сбраживающие лактозу, а также типа Мусодерма и уксуснокислые бактерии. Авторы обратили внимание на то,что дрожжи развиваются лучше всего в присутствии молочнокислых палочек,а молочнокислые стрептококки в чистом виде оказывают угнетающее действие на развитие дрожжей. Угнетающее действие str. lactis на развитие дрожжей и снижение выхода спирта отмечают Деауров, 1936; Во8ткевич,1948; Феофилова,1958 и др.).

Однако по данным Максимовой не все расы молочнокислых стрептококков оказывают подавляющее действие на развитие дрожжей и образование спирта.

Максимовой и Грудзинской (1959) были сделаны весьма интересные наблюдения. Они установили, что молочнокислые стрептококки оказывают неодинаковое влияние на размножение дрожжей и образование спирта в кефире. Одни из них подавляют развитие дрожжей и образование спирта, количество которого не превышало 0,1%; другие, напротив, стимулировали ш развитие дрожжей и интенсифицировали образование спирта, процент которого достигал:до 1,7; третьи, стимулировали размножение дрожжей, но тормозили образование спирта. Так, при культивировании дрожжей со etr.disßefcllactie - штамм 13 дрожжей оказывалось в 2-3 раза больше (около 6 мл&• в I мл), а спирта в 10 раз меньше (0,06-0,1$), чем при культивировании со Str» dlasetileeti* - штамм 704 (0,7-1,1% спирта).

Оказывается, как установила иаксиыова (1954,1957), эти два штамма молочнокислых стрептококков облагают .разной способностью создавать окислительно-восстановительный потенциал в среде при своем развитии, от величины которого и зависит образование спирта. : (Str^dlaevtllsotf* - штамм 13 создает ЪНр около 10; Str. dlscetilacti® - штамм 704 - ниже 5)

Молочнокислые стрептококки, обладающие сильно редуцирующими свойствами, создают в среде более низкий окислительно-восстановительный потенциал, т.е. более анаэробные условия, и спирта образуется больше.

Эти наблюдения согласуются с данными Феорловой (1958),которая указывала, что образование спирта идет лучше в относительно анаэробных условиях чем в относительно аэробных.

В заключение можно сказать,что взаимоотношения между молочнокислыми бактериям и дрожжами могут быть различными от симбиоза до антагонизма, характер которых зависит от специфики мнкроорга- -низмов и от условий окружающей их среды.

Механизм и внутренний смысл симбиоза между молочнокислыми бактериями и дрожжами весьма сложны и еще не могут быть в достаточной степени объяснены в настоящее время. В большинстве случаев " метабиотиче.скнй и симбиотический характер взаимоотношений между этими микроорганизмами основан во-первых, на способности использовать продукты обмена друг друга (молочная* уксусная, кислоты, : спирт, витамины,аминокислоты); во-вторых, - оба вида микроорганизмов, образуя такие продукты, как спирт и молочная кислота, препятствуют развитию посторонних микробов и таким образом защищаются от конкуренции; в-третьих, дрожжи потребляют растворенный в среде кислород, создавая тем самым более анаэробные, т.е. благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий.

Исходя из того,что типы взаимоотношений дрожжей и молочнокислых бактерий могут быть различными, следует вопрос о наличии или отсутствии симбиоза решать не в общей форме, а возможно более конкретно, с учетом специфики микроорганизмов, обмена веществ в оптимальных для каждой культуры условиях, изменения обмена веществ при совместном культивировании исследуемых культур, особенно с точки зрения лабильности обмена под влиянием различных условий, а также и с учетом особенностей естественных мест обитания.

Поскольку кумыс является напитком смешанного [молочнокислого и спиртового) брожения, то вопрос о взаимоотношении молочнокислых бактерий и дрожжей в кумысе, имеет исключительно большое значение.

Для того,чтобы подобрать симбмотическую закваску для кумыса и тем самым повысить качество его (вкус »лечебные и диетические свойства) необходимо более глубокое изучение обмена веществ исследуемых культур,и главным образом»изучение развития и брожения в динамике, как чистых культур молочнокислых бактерий и дрожжей,так и их различных комбинаций. Исследований в этом направлении недостаточно. Ш. ВШШ1£ ФАаТОРОВ ВНЕиЗи СРЕДЫ НА

СВОаСТВА С ^ьМ^ЫХ БАКТЕРИЙ И ДРОЯ1ЕЙ.^

Одной из основных задач современной микробиологии является управление биохимическими процессами, осуществляемыми микроорганизмами. Актуальность постановки проблемы управления обменом веществ у микроорганизмов отмечалась еще ВЛ.Омелянсюш в 1926г. и Королевым (1932), в настоящее время академиком В.Н.Шапошниковым и ИЛ. Работновой(/^5<У

Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов необходим определенный комплекс условий внешней среды. В этот комплекс входит количественный и качественный состав питательной среда и ряд физико-химических факторов - активная кислотность (РН), окислительно-восстановительный потенциал (^2) - аэрация,температура, свет, влажность и т.д.

По отношению к каждому фактору жизнедеятельность микроорганизма ограничена определенными пределами. В этих пределах зависимость от факторов часто выражают тремя кардинальными точками:минимум, ниже которой активность невозможна; оптимум,, при которой активность максимальная; максимум, за пределами которой активность прекращается.

Изменение условий в пределах этих границ вызывает угнетение одних и активизацию других ферментов, что приводит к смещению различных сторон обмена веществ микроорганизмов. Микроорганизмы потенциально обладают очень большим набором ферментов. Но в каждый момент развития не все ферменты активизированы, а только те, которые отбираются условиями, при которых происходит развитие в данный момент.

Академик В.Н.Шапошников, разрабатывая на протяжении 40 лет технологию ряда производств, основанных на ферментативной деятельности микроорганизмов, показал, что производственные процессы могут быть правильно организованы только на основе углубленного изучения физиологической сущности обмена веществ применяемого микроорганизма. й Л.Работнова (1957) доказала, что в управлении обменом веществ решающее значение имеют факторы внешней среды. Автором было показано, что одни® из мощных факторов,.влияющих на биохимическую активность микроорганизмов, являются окислительно-восстано-вителъяые условия среды, что реакции окисления - восстановления являются центральными в обмене веществ. Поэтому воздействие на них автор считает наиболее перспективным. Изменяя потенциал путем аэрации или введения в среду веществ с восстановительными или окислительными свойствами, можно регулировать микробиологические процессы. Существуют границы окислительно-восстановительного потенциала &Н2) в пределах которых бактерии аогут развиваться. Анаэробы развиваются при ьЕ^ от 0 до 13; аэробы - от 7 до 23.

Другим очень важным фактором, регулирующим развитие и обмен веществ микроорганизмов, автор считает актмвнуя кислотность среды (рН). На примере ряда брожений Работнова показала, что изменения в гН2 и рН среды вызывает сдвиги в соотношении продуктов брожения. Путем регулирования ЛН2 и рН среды была установлена возмозш ность управления обменом веществ.

Особенно отчетливо заметно влияние факторов внешней среды на бродильные процессы, где имеются сопряженные окислительно-восстановительные системы. В практике бродильных процессов очень важно уметь управлять ими в целях интенсификации выхода наиболее ценных продуктов брожения.

Большой интерес представляет изменение соотношения продуктов брожения в кумысе, производство которого основано на смешанном брожении (молочнокислом и спиртовом). Состав микрофлоры этого продукта сложный и управлять их обменом очень трудно. Каждый микроорганизм потребляет определенные вещества среды и выделяет свои продукты обмена, изменяя условия среды,что отражается на характере брожения, ив конечном счете, на качестве готового продукта. г

С.А.Королев (1932) отмечал, что физико-химические условия имеют решающее значение для жизнедеятельности микроорганизмов в молоке и молочных продуктах.

Из многих факторов,с помощью которых можно управлять бродильными процессами в молоке, являются также окислительно-восстановительные условия среды СъД2), активная кислотность (рН) и температура.

В литературе мы не нашли сведений о влиянии факторов внешней среды (ч^»РН) на развитие и брожение микрофлоры (молочнокислых бактерий и дрожжей) кумыса. Поэтому использовали литературные данные, посвященные влиянию этих факторов на развитие и характер брожения (биохимические свойства) молочнокислых бактерий и дрожжей, культивируемых раздельно в различных биологических жидкостях и синтетических средах.

В литературе имеются данные,свидетельствующие о лабильности обмена веществ отдельных представителей молочнокислых бактерий и дрожжей. а)Влияние факторов внешней среды на развитие и брожение молочнокислых бактерий.

Влияние

Возбудители молочнокислого брожения относятся к группе факультативных анаэробов. При своем развитии они значительно снижают окислительно-восстановительный потенциал среды, за счет выделяемых ими редуцирующих веществ, природа которых еще не известна.Глубина снижения потенциала зависит от вида бактерий,от состава среды и условий культивирования.

Некоторые исследования посвящены изучению влияния окислительно-восстановительного потенциала среды на ход брожения. Так, Наутег (по панель,Х935) указывал,что каждый процесс обмена характеризует определенный потенциал. Он показал,что молочнокислые бактерии образуют молочную кислоту из сахара при £Н2=5-5,8

Успенский (по Некрасову П.I.,1937) отмечал,что одни виды молочнокислых бактерий не развиваются и не образуют молочную кислоту при гН2 выше 8. Другие же ведут биохимические процессы при высоком среды, создаваемом кислородом,который остается для них инде-ферентным газом.

Вопрос об участии кислорода в молочнокислом брожении, как гомоферыентативном так и гетероферыентативном, не решен до настоящего времени. Литературные данные по этому вопросу противоречивы.

В наиболее ранних исследованиях молочнокислые бактерии относят к анаэробным микроорганизмам, в виду отсутствия у большинства из них оксидаз, цитохроыных систем, каталазы, разлагающей перекись водорода и, таким образом, неспособности их использовать кислород в энергетических процессах. Перекись водорода, накапливаясь в культурах, оказывает вредное действие на развитие и брожение их. Так, <з«юта&» е»Я£ебХ«£Г ¿1934) (цитировано по Работновой,1957) отмечают,что стрептококки и ь^ЪвХ^ктЮш не образуют молочную кислоту при аэрации. Молочнокислое брожение этих гоыоферментатив-ных культур протекает при определенном ЬЕ^ окружающей среды (гн2 ЩфроШЗХЁХ£|!СШ = 5).

Казанская (1951) показала, что гомоферментативная молочнокислая палочка ЪасЛаЬвс^еГЬгвскИ - раса БДШ тяготеет к анаэробным условиям. Размножение в высоком цилиндре идет лучше (124 алн/ыл) по уравнению с развитием в тонком слое (65 илн/мл). Количество молочной кислоты соответственно 15.0 ы-экв. триозы и 5,25 м-экв.

Другие исследователи (таш- Вгушш Мтеп « Егшш,

1957, Работнова, 1957; Тарасова, 1959; Квасников, 1960 и другие) не отрицая присутствия перекиси водорода в культурах, признают не только возможность развития некоторых ге те роферментативных молочнокислых бактерий при аэрации, но и отмечают сдвиги в соотношении продуктов брожения. А именно, образование в аэробных условиях более окисленных продуктов.

Шапошников (1960) объясняет-это явление непосредственным окислением некоторых продуктов•обмена кислородом, поэтому вредное действие его уменьшается. Но вмешательство кислорода здесь имеет не биологический, а скорее химический характер» Шапошников указывает, что не всякое окисление можно рассматривать как дыхание, и, чтобы его признать, нужно доказать,что дыхание является энергетическим процессом, используемым в процессе жизнедеятельности.

А таких данных в этих работах нет. известно, что для осуществления дыхательного процесса необходим целый комплекс ферментов (окислительные дегидразы, флавиновые ферменты, цнтохромная система, каталаза) и кодегидразы.

Ряд исследователей ( ВаПв, 1939; Палладина,1941; Johneon ** McCleeke?, 3358j Квасников,1960'и др.) отмечают возможность использования кислорода молочнокислыми бактериями в энергетических процессах. Авторами обнаружены у некоторых молочнокислых бактерий пероксидазы и |лавопротеины. ижПв ш Квасников отмечают наличие каталазы у некоторых штаммов и предполагают наличие цитохромов.

Таким образом исследуемые ими штаммы могут использовать кислород по типу аэробов.

Дэвис ( Borle, 1933) нашел кислородное дыхание у гомофермента-тивиых молочнокислых бактерий L«eta&«cfe*r£am delbrfiekii. поместив отмытые от субстрата клетки в раствор молочнокислого натрия, он наблюдал энергичное поглощение кислорода и окисление молочной кислоты.

Опыты Дэвиса с Lactobacterlum delbrtckit (син. Tbermobact» cereale) были воспроизведены Шапошниковым, который доказал,что нормально развивающаяся культура не обладала способностью к дыханию, а, наоборот, лучше развивалась в анаэробных условиях. (Шапошников и Мантейфель, 1923; Шапошников и Захаров, 1929; мантейфель и Дратвина,Х937 и др.). Это заключение подтвер- -дается во-первых, характером кривых кислотообразования Т»сеге«1е и других представителей гомоферментатиБНОго молочнокислого брожения, показывающих в начале энергичное, затем постепенно замедляющееся кислотонакопление, рано или поздно останавливающееся,но никогда не обнаруживается снижения; во-вторых, выход молочной-кислоты достигает почти 100% от потребленного сахара и при этом никакого образования углекислоты, которая обнаруживалась бы,если бы кислород использовался бактериями в энергетическом обмене; в-третьих, кислотонакопление совпадает с темпом размножения.

Противоречивость результатов исследований о роли кислорода в обмене молочнокислых бактерий объясняется рядом обстоятельств.

Многие исследования, особенно зарубежные, проведены с отмытыми суспензиями бактерий или с изолированными из них ферментами. К этим исследованиям следует отнестись критически, так как результаты этих наблюдений не совместимы с процессами, осуществляемыми нормально развивающейся культурой. Шапошников (1960) подчеркивал, что правильное представление о характере и путях превращения веществ, в частности углеводов, в развивающихся культурах, можно получить только путем детального изучения процесса брожения в динамике развития данной культуры. Иначе можно притти к совершенно ошибочным представлениям.

Большое значение имеют исследования по изучению влияния аэрации на развитие и обмен молочнокислых бактерий в связи с другими факторами внешней среды (кислотность,температура, состав среды и т.д.).

Работноза (1957) установила,что введение в среду редуцирующих веществ, способных принимать на себя кислород, стимулирует развитие анаэробных бактерий и подавляет аэробные.

Данные ГречушкиноЙ (1961) показывают, что аэрация резко угнетает развитие ь#р*н£©асе1;1стт и смещает соотношение продуктов брожения. Причем смещение зависит от РН и от состава среды.

При оптимальной (РН) кислотности аэрация повышает выход окисленного продукта - уксусной кислоты, а восстановленный продукт - спирт - не образуется совсем. При сильнокислом значении РН (без мела) аэрация не только не угнетает, а .увеличивает выход спирта. Факт лабильности образования спирта ь»р«и&»«ее*1с«* в разных условиях культивирования, автор объясняет специфической приспособительной реакцией организма на неблагоприятные условия кислотности. Внесение 2$ дробины (белкового вещества,обладающего редуцирующими, свойствами) почти полностью исключает действие аэрации на развитие и обмен Ж*реп*аасгМ:е1Ш* -^нные исследований {Шапошникова и Семеновой, 1949; Работновой 1957; Феофил0вой,1958; Тарасовой, 1958) также свидетельствуют о том,что аэрация смещает соотношение продуктов гетерофермента-тквного молочнокислого брожения в сторону увеличения выхода более окисленного продукта - уксусной кислоты. В анаэробных условиях образуются более восстановленные продукты - спирт и молочная кислота.

Работнова (1957) в своих опытах показала, что гомоферментативные молочнокислые бактерии b*delbrffefcH независимо от аэрации хорошо развиваются и сбраживают сахар до молочной кислоты в широких пределах от 0 до 30. При этом изменения в ходе брожения не наблюдалось, т.е. протекает типичное гомофер-ыентативное брожение с образованием.только молочной кислоты.

Максимова (1954,1957,1961) установила,что образование диацети-ла в заквасках для масла,' обуславливающего его аромат - это окисли тельно-восстановительный процесс, который зависит от редуцирующих свойств ароматообразующих бактерий - S*r#di«eetilec*i® ; и Факторов внешней среды. Автор нашла оптимальные условия для образования диацетила (Шр-У;' РН-4-5; "fc-25°).Создание оптимальных окислительно-восстановительных условий для образования диацетила в закваске Максимова достигала путем 3-х кратного кратковременного (5)) перемешивания. Все способы аэрации (продувание кислорода, воздуха,перемешивание) увеличивали урожай клеток.

Работнова, на основании литературных данных и своих исследований по вопросу о взаимосвязи обмена веществ микроорганизмов и окисли-тельно-восстановителышх условий,пришла к следующему заключению. Существует определенная взаимозависимость между реакциями обмена веществ у микроорганизмов и величиной ~1Я2 среды.Величина зависит от реакций обмена веществ и,наоборот, обмен веществ зависит от гн2. Окислительно-восстановительный потенциал является не только следствием,но и причиной, обуславливающий тот мли иной характер процесса обмена веществ, так как от окислительно-восстановительных-условий зависит активность ферментов.Деятельность ферментов может j быть прекращена или активирована определенным ЪН2 что,в свою оче- i редь, ведет к изменению процессов обмена.

•

Приведенные экспериментальные данные многих исследователей убедительно показывают, что окислительно-восстановительные условия среды являются одним из важнейших факторов, влияющих на направление молочнокислого брожения.

Влияние аэрации на развитие и брожение молочнокислых бактерий зависит от индивидуальных особенностей микроорганизма, от состава среды и от условий культивирования. Большинство молочнокислых бактерий лучше развиваются в Аэробных условиях. Среди молочнокислых бактерий имеются виды, развитие и активноать которых стимулируется аэрацией.

Влияние РН

Активная кислотность среды;, (рН) является важным фактором, влияющим на биохимические процессы, на ферментативную деятельность микроорганизмов, поэтому изменения рН среды вызывают сильные сдвиги в обмене веществ микроорганизмов. Эти смещения в большинстве случаев носят приспособительный характер. Попадая в неблагоприятные условия кислотности микроорганизмы выделяют в среду кислые, щелочные шли нейтральные продукты обмена, удерживая тем самым РН среды на оптимальней- для своего развития уровне. (Работнова, 1957). '

Механизм действия активной кислотности еще не ясен. Работнова (1957) указывает,что кроме непосредственного действия водородных или гидроксильных ионов на клетку, может быть и косвенное влияние РН через компоненты среды.

Активная кислотность (рН) является,как и, одним из основных факторов внешней среды, регулирующих развитие и брожение молочнокислых бактерий.

Оптимальные и крайние границы рН для развития молочнокислых бактерий изучали многие исследователи. :(&гжвЬех£»(1919Н <*г1»-1ен®*т т Р«аеяЬах£,(1940)г В**!* а (1539) и другие.

Данные этих исследований показывают,что большинство стрептококков способно развиваться в широких пределах рН(3,4-$),однако оптимальные границы рН для их развития находятся в более узких пределах(5§5-7,5),

Относительно влияния РН на молочнокислое брожение,среди исследователей нет единого мнения.Даже о влиянии РН на гомоферментативное молочнокислое брожение данные противоречивы.

Большинство исследователей считают,что гомоферментативные молочнокислые бактерии не имеют никаких приспособлений для борьбы с кислот. ностью.Они накапливают молочную кислоту до тех пор,пока не погибнут от кислотности,ими же созданной.

Наиболее изучена из этой группы бактерий - bactobacterium delbrSckii»b>delbriekli осуществляет типичное гомоферментативное молочнокислое брожение,которое используется для промышленного получения молочной кислоты. рН среды влияет только на количественное образование молочной кислоты.Качественного смещения в брожении L.deibrffekli не наблюдается.В сильно кислых условиях,создаваемых самими бактериями,развитие угнетается и образование молочной кислоты прекращается,ее образуется не более 1,7%.Остается много не сброженного сахара.Зта же бактерия при нейтрализации кислоты мелом сбраживает сахара до 10%.(Работнова,1957).

Наблюдения(Coben. a.Clarkr( 1919) показывают,что Lact©bacterium buigaricum Прй рн=4,5 не растет; при РН=5,1-6,8 делает 1,6 генераций в час и при РН=7,5 роста нет. Между тем отсутствие роста наблюдается только при начальном РН=4,5 а в старжх культурах подкисление среды идет-до РН=3,9. Авторы предполагают,что брожение может итти в более кислой среде,чем размножение.

Данные ©шввЗдхв a*FlTexLvi942iGanealc8 a.Campbell (1944) цитировано по Работновой,1957) показывают,что гомоферментативное брожение Str*i£<psefaei«ie и Str.faeealis может быть смещено путем изменения РН среды.

Авторы изучали выход продуктов брожения str.liquefaciens. Оказалось,что при подщелачивании среды количество молочной кислоты среди продуктов брожения уменьшается от 87мм при РН=5 до 61мм при РН=9. Количество летучих кислот и спирта увеличивается.

Продукты брожения 8ггЛедиеГас1епв (в мм при разных РН) по б^ипваДлгв а»Итеп» продукты брожения :рШ=5 :РН=7 Рй=9

Молочная кислота :87 : 73 61 уксусная 11 :6,1 :9,4 15,6 муравьиная й :7,7 :16,8 26,4

Этиловый спирт •3 5 •7 3 11,2

Сброженная глюкоза :63,6 112

Найденный углерож Л : 95 :90 88

Из таблицы видно,что брожение,близкое к гомоферментативному,в ще— лочной среде превращается в типично готероферментативное.

Способность к образованию в нейтральных и щелочных средах большего количества летучих кислот и спирта,снижающих РН,а в кислой - в основном молочной кислоты, объясняется по-видимому,приспособительным характером бактерий.

Данные о возможности смещения гетероферментативного,молочнокислого брожения в зависимости от РН также немногочисленны и противоречивы.

Согласно большинству исследований гетероферментативное молочнокислое брожение может смещаться под действием РН среды,(Иерусалимский, 1942; Шапошников,Семенова, 1949;Работнова,1957;й.васников, 1960;

Гречушкина,1961 и др.) Смещение брожения носит различный характер и обусловлено, главным образом,непосредственным воздействием активной кислотности среды на деятельность ферментов-активированием одних и торможением других. Оптимум РН для развития бактерий и для образования некоторых продуктов брожения,а то и брожения в целом,могут не совпадать.Оптимум РН для развития подавляющего большинства гетероферментативных молочнокислых бактерий лежит в кислой зоне.При их развитии £ яезабуферен-ных средах происходит сильное подкисление среды в результате образования кислот.При низком РН развитие угнетено,брожение прекращается и никакого видимого регулирования среды не наблюдается.

Шапошников и Семенова{1949) изучая в динамике процесс брожения, гетероферментативной бактерии ifo»* Bfrtsbecteriш* breve показали,что молочная кислота не только образуется,но и потребляется молочнокислыми бактериями. Причем при РН выше 6 наблюдается потребление молочной кислоты, при Рй ниже б происходит ее образование. Уксусная кислота i наибольшем количестве образуется при более щелочном РН, а при снижении РН в меньшем количестве).

Гибшман (1939); Tea Веугаш а.Pe* te (19.351,

Максимова (1954) и др. установили,что аромат ообразующие стрептококки в кислых условиях, неблагоприятных для их развития, образуют повышенные количества нейтральных продуктов С^ - соединений: дмацетила, ацетоина и 2,3 бутиленгликоля. Накопление нейтральных продуктов в сильнокислой среде объясняется авторами,как мера самозащиты этих бактерий от увеличения кислотности среды. В щелочных условиях.выход этих веществ сокращается, а иногда и вовсе не образуется.

Гречушкина (1961) также отмечает значительное смещение соотношения продуктов брожения Lactobaeteriam penfeaecetieo» при изменении РН среды. В сусле с мелом, где РН по ходу брожения поддерживается около 5, наблюдается максимальный урожай клеток и основным продуктом брожения является молочная кислота. В сшшюкислом сусле (без мела) развитие и брожение сильно угнетены. Основным продуктом брожения является спирт. Его образование также носит приспособительный характер, как мера борьбы бактерий с высокой кислотностью, и зависит от РН и состава питательной среды. Orle Iemsen и Panlenborgt( 1940) »Fornechon отмечают, что границы-РН для развития молочнокислых бактерии зависят от состава питательной среды. Чем беднее питательная среда, тем уже предел оптимальной РН для роста бактерий.

По данным в» ш— (1953) (цитировано по Г'речушкиной) измег нение РН среды не влияет на соотношение продуктов молочнокислого брожения.

Неодинаковость влияния изменения РН среды на развитие и брожение молочнокислых бактерий объясняете я,видимо, большим разнообразием их обмена.

ИЛ.Работнова на основании своих исследований по влиянию рН на обмен веществ микроорганизмов считает, что можно наметить 3 следующие возможные пути воздействия рН на процессы обмена вещест: рН среды может влиять на ферментные системы клетки, обуславливающие образование тех или иных продуктов.

В зависимости от рН среды может меняться состояние компонентов среды и состояние промежуточных продуктов, что может отражаться на образовании конечных продуктов. рН влияет на окислительно-восстановительные условия среды, о чем свидетельствует следующая формула: 2РН

Более окисленным условиям соответствует более щелочная среда, а восстановленным - кислая. При изменении рН может изменяться а последний влияет на ход бродильного процесса. Литературные данные показывают, что влияние активной кислотности среды на развитие молочнокислых бактерий и на образование конечных продуктов брожения - огромно.

Для большинства представителей молочнокислых бактерий (как гомоферментативных, так и гетероферментативных) выявляется общая закономерность. Молочная кислота образуется в более кислой среде, а летучие кислоты - (более кислые кислоты, т.е. с большим числом СООН) - уксусная и муравьиная - в более щелочной. Соотношение этих последних кислот, образуемых бактериями, зависит от РН среды.

Спирт образуется главным образом в сильно кислой, среде и является приспособительным свойством, как мера борьбы бактерий с высокой кислотностью.

Условия и биологический смысл образования спирта, который бывает основным продуктом брожения у некоторых молочнокислых бактерий, не выяснены.

Влияние температуры.

Изменение температуры в пределах, допускающих развитие молочнокислых бактерий, вызывает изменение в обмене веществ, которое специфично для их отдельных представителей. Кроме того, кардинальные температуры для различных физиологических процессов одного и того же организма могут не совпадать* Например, для следующие оптимумы для различных функций (по Ьашашш, 1959, цитировано по Гречушкиной, 1961).

Скорость размножения - 34°

Скорость брожения - 40°

Образование кислоты - 30° поэтому изменение температуры может привести к очень многообразным изменениям в обмене веществ, выражающихся в несоответствии скоростей роста и брожения, изменения соотношения продуктов брожения и т.д.

Однако, работ, посвященных изучению влияния температуры на изменение разных сторон обмена веществ молочнокислых бактерий, очень мало.

Влияние температуры на развитие и брожение молочнокислых бактерий изучается, главным образом^ с точки зрения выяснения температурных границ и степени устойчивости их к высушиванию при высоких и низких температурах в целях длительного сохранения культур и продуктов, приготовленных с их применением. В основном это относится к представителям молочнокислых бактерий, применяемых в производстве молочных продуктов.

Иышелецкий (194-4) и Королева (1961,1963) считают,что среди молочнокислых бактерий имеются термотолерантные, которые выносят пастеризацию. Королева установила, что причиной излишней кислотности творога и любительской сметаны является термоустойчивая молочнокислая палочка,, близкая по морфологическим и физиологическим свойствам ¿ЬиХвагхстш и Ь»ас1<1орЬ11ит^ но отличается от последних высокой териоустойчивостью при пастеризации {85-90°).

Богданов (1959) указывает на терморезистентность молочнокислых стрептококков фекального происхождения» Богданов (1930,1959) и Скалрн (1955) указывают, что бетабактерии, Str. lactie tt bBXgaricuffir выделенные из кисломолочных продуктов южных районов страны, имеют более высокий оптимум температуры для кислотообразования.

Кислотообразование, bjrolgerleim. разных климатических зон в зависимости от температуры (по Богданову, 1959). она ;Кислотность среды в °Т при температуре 40° 45° через 24 часа

Северная : 142 : 118 центральная : 160 : 132 южная : 165 : 186 юго-восточная : 184 : 200 па основании своих исследований Богданов (1959) подчеркивает о необходимости применения, для производства кисломолочных продуктов, местных рас молочнокислых бактерий и культивирования их при оптимальной температуре.

Б литературе имеются сведения, хотя и немного, которые показывают- о возможности сдвигов брожения молочнокислых бактерий при изменении температуры культивирования.

Княгиничев и Мирошниченко (1958) установили, что повышение температуры увеличивает выход летучих кислот и газообразование в закваске кислого теста, приготовленной на бетабактериях без дрожжей. и ЫсЬмшп (1Э59) (цитировано по Гречушкиной, 1964) изучали действие различной температуры (27,30,37 ) на брожение в динамике развития £«е(оЬ«е*ег1ш» Ъгете в разных условиях аэрации. Выяснилось,что аэрация не оказывала влияния на брожение, которое менялось только под действием температуры. Температура не влияла на скорость образования и выход уксусной кислоты. Но скорость образования и выход молочной кислоты быланиже при 27°, чем при 30 и 37°.

Stent ТтшОлт (1941), выращивая ЪМ1&шгШш п Str» thermophilue в молоке-при 37 и 50°, установили, что при 50° снижается образование молочной кислоты, а выход летучих кислот почти не меняется.

Но данным Рнбшыая (1938,1959), Яалладиной (1941) - ароматообразующие стрептококки при 20-30° накапливают больше диацетила и летучих кислот, чем при 35-45°.

B®mg(I948) установил в своих опытах, что St г* lactie при 30-37° образует главным образом молочную кислоту, а при 15-20°

- большое количество побочных продуктов, в том числе ацетил-метил

- карбинол.

Большого внимания заслуживают работы Максимовой (1954,1957,1961) и Гречумкиной (1961), которые изучали влияние температуры на обмен молочнокислых бактерий в связи с другими факторами внешней среды.

Максимова установила оптимальную температуру для образования диацетила ароматообразующими стрептококками (str^lsGetHeetie^

- штамм 13) в закваске для масла в связи с кислотностью и аэрацией (температура - 25°, РН=4-5, 1Н2=7,0)

Данные Гречушкиной (1961) показывают, что степень и характер влияния температуры на обмен Lactobacterluia pentoacetlcrxm зависят от РН и аэрации. Наиболее отчетливо действие температуры на обмен гетероферментативной Lactabacterluii pento&ceticum пооявляетея в оптимальных условиях кислотности и аэрации. При 37° наблюдаетеяуразвитие и нормальная биохимическая активность.

Температуры, выше оптимальной, задерживают деление клеток, увеличивают выход молочной кислоты и сокращают образование спирта настолько, что при 48-50° брожение становится почти гомоферментатквным.

При температуре, ниже оптимума, стимулируется размножение и увеличивается относительный выход спирта.

В заключение можно сказать следующее: I) вопросу выяснения температурных границ развития, выживаемости, сохранения биохимической активности молочнокислых бактерий от действия высоких и низких температур, посвящена довольно большая литература. 2.) Изменение температуры вызывает глубокие смещения в обмене веществ молочнокислых бактерий, но это влияние необходимо, пови-димому, рассматривать только в конкретных условиях культивирования той или иной бактерии в связи с другими факторами внешней среды. А таких сведений очень мало.

Обобщая литературные данные, касающиеся влияния факторов внешней среды (Ц^РН и температуры) на развитие и брожение молочнокислых бактерий можно сказать следующее. Влияние аэрации, кислотности и температуры на развитие и выход продуктов брожения молочнокислых бактерий огромно и зависит от индивидуальных особенностей микроорганизма, от состава среды и от условий культивирования.

Сведений о том,какую величину^Н^ (т.е. количественную характеристику окислительно-восстановительных условий) создают при своем развитии в молоке (как коровьем,так и кобыльем) молочнокислые бактерии кумыса мы не нашли ни в отечественной ни в зарубежной литературе.

Не освещен в литературе и вопрос о взаимосвязи между условиями среды {ЪН2 и РН молока) и биохимической активностью в динамике развития чистых культур молочнокислых бактерий, выделенных из кумыса.

Решение этих вопросов дает возможность улучшить качество кумыса путем подбора производственно-ценных культур молочнокислых бактерий.

1ш1мг б) Влияние гн2, РН и температуры на развитие и брожение дрожжей.

Б настоящее время процесс спиртового брожения является одним из наиболее изученных бродильных процессов.

Изучение спиртового брожения, начатое еще Л.Настером, продолжается до сего времени. Пастер (1861) впервые вскрыл сущность брожения. Им были впервые поставлены и блестяще разрешены вопросы первостепенной важности - об энергетическом значении и смысле брожения, о возможности жизни без кислорода, т.е. без дыхания, считавшегося, со времени Лавуазье, существеннейшим и неотъемлемым признаком жизни.

Однако, охарактеризовать химическую сущность процессов,совершающихся при брожениях, по состоянию химии того времени, он не мог.

Химизм спиртового брожения был изучен более поздними исследователями и в основном с помощью бесклеточного дрожжевого сока, обладающего способностью сбраживать углеводы по типу спиртового брожения. Впервые дрожжевой сок был получен 9асЬв*т*ож в 1897г. затем Лебедевым (1911,1913). Последний усовершенствовал и упростил получение дрожжевого сока, который получил широкое при-: менение и носит название "Йебедевского мацерационного сока". Но особенного успеха в изучении химизма спиртового брожения достигнуто работами Иванова (1905) и Гарден и йонга, которым удалось выяснить роль фаефатов в спиртовом брожении; работами Векг!,. Жпйехв'а (цитировано по Шапошникову, 1948), »руегЬ©£*'& (1918), Йостычева (1924) и многих других, которые выделили ряд фосфорных эфиров гексоз и выяснили те ферментные системы,которые ответственны за осуществление отдельных звеньев превращения гексоз в спиртовом брожении.

Итогом этой упорной полувековой и весьма плодотворной исследовательской работы многих крупнейших ученых является современ- ; ная схема спиртового брожения: аХаР + Ар!^ошна^ОНОфОС11ГЙ ^^

2 Ф0СФ0ТРШ™ + 1оV фосфоглицериновая альдолаза дегндразн' кислота пировиноградная»ацетальдегид + С0о кислота * КоН« + £ дегидраза этилового спирта

С»и/>Г I

Влияние &Н2.

В отличие от молочнокислых бактерий, дрожжи являются более совершенными организмами. Они обладают большим набором ферментов, с помощью которых могут осуществлять как окислительное расщепление углеводов (дыхание), так и анаэробное брожение, при котором энергию для своей жизнедеятельности они черпают за счет сопряженных окислительно-восстановительных реакций промежуточных продуктов расщепления углеводов (в основном гексоз). Таким образом, дрожжи в анаэробных условиях осуществляют процесс брожения, а в аэробных -переключаются на дыхание. Это переключение носит название "пастеровский эффект". Механизм пастеровского эффекта окончательно открыт Знгельгардтом (1944), Энгельсом и лючается в выключении определенного звена в зимазном кошшексФГ Местом приложения пастеровского эо^окта в цепи реакций превращения сахара в спирт и углекислоту является реакция образования дифосфорного эфира, которая осуществляется ферментом фосфоферазой.

При высоком еН (от +50 до +200 мв) фосфофераза инактивируется и дрожжи переключаются на окислительное расщепление сахара.

Таким образом, причиной переключения с дыхания на брожение, и обратно у дрожжей являются окислительно-восстановительные условия среды (ЪН2).

Деятельности других бродильных ферментов дрожжей (инвертазы, зимазы,сахаразы) также соответствует определенная,оптимальная величина Повышение величины ЪН2 инактивирует их (иоу1«вЛ, 1930; ырееш, 1933,1934; Селибер и Пятова, 1937; Щ£ж*т9Т9*г).

Ауенозин^рауэос-срФ-ньЯ ¡¿Ьс/юТа,

Гесударавпшая БИБЛИОТЕКА СССР им. В. И, Ленин«,!

Чувствительность дрожжей к высокому окислительно-восстановктельно-му потенциалу окружающей среды заключается в инактивации жизненно важных ферментов с ЗЯ - группой при высоком гн2. Ферменты с окисленной 25- группой теряют активность. (Энгельгардт,Шапот, 1954). йтак, изменение %Н2 может изменить соотношение активности отдельных звеньев ферментативного комплекса, осуществляющего энергетический обмен, что в свою очередь вызывает серьезные сдвиги во всех процессах обмена дрожжей.

Согласно литературным данным (Костычев,1919; Меугс^оГ» 1925, Вий*«®. Ш4 и другие) способность у различных дрожжей переключаться с дыхания на брожение и обратно - неодинакова и зависит не только от ЪН^ среды, но и от вида дрожжей, их адаптации к тем или иным условиям, от состава питательной среды, от наличия сбраживаемого субстрата и многих других факторов.

Костычев (1919) отмечал, что некоторые дрожжи и при аэрации не прекращают брожения, которое, по его мнению, идет исключительно из-за избытка зимазы, без особой пользы для дрожжей, т.к. им вполне .достаточно энергии для жизнедеятельности за счет дыхания• Более поздними исследованиями Костычева и Фаермана (1928) установлено, что усиленная аэрация изменяет характер биохимических. превращений у дрожжей. Дрожжи в сильно аэробных условиях сбраживали такие вещества (глицерин,маннит), которые в нормальных условиях не сбраживали. Авторы предполагают,что из глицерина и маннита образуется запасное вещество гликоген, которое уже потом сбраживается. Но нормальный ход брожения изменен»

Данные ■едгехдоГ'*, (1925) показывают, что дикие дрожжи -Тот«1в в анаэробных условиях ведут энергш юе брожение,а в аэробных полностью переключаются на дыхание, как на более экономичный способ использования сахара и получения энергии. Культурные же дрожжи, используемые в виноделии, в результате длительной селекции и разведения обладают сильно развитой бродильной функцией и почти не способны к дыханию даже в аэробных условиях.

Юд*угег и Hoederiieide (1934) в целях выяснения связи между ЕН и обменом веществ у дрожжей исследовали суспензии б видов дрожжей с различной способностью к брожению. Оказалось, в атмосфере азота, где возможно только брожение, Зй в суспензиях всех дрожжей устанавливался на уровне от 80 до 100 мв. При доступе воздуха дрожжи осуществляли брожение в той мере, в какой свойственно каждому исследуемому виду: соотношение Ей в суспензий дыхания к бро- дрожжей с Ъ% жению. глюкозы

Ssccharomyees cererisia 0,18 t I6Ghb marxísmte 5,0 + 240мб

Tortila candida 7,5 280мв

Cryptocaeeas dermatidee 11,5 ЗООмв

8аеекшр&щ$е§>е сегетг!«Ю. в растворе лактата, т.е. в растворе несбраживаемого ими субстрата, осуществляют только дыхание и Ш = 320 мв. считает, что определенный потенциал характеризует тот или иной характер обмена.

В литературе имеются данные, которые показывают, что влияние аэрации на развитие и брожение дрожжей зависит от других факторов внешней среды, особенно от наличия в среде восстановителей. Так, Golliagewrrdtb в» Eeld (1935), показалц что добавление к синтетической среде восстановителя тиогликолевой кислоты стимулирует рост дрожжей *при небольшом посевном материале. Это свидетельствует о том,что такая аэробная функция дрожжей, как рост, . требует пониженного окислительно-восстановительного потенциала. Добавление бисульфита { leaberg) меняет направление спиртового брожения в сторону образования глицерина. Этот способ имеет громадное значение в промышленности получения глицерина и применялся в большом масштабе в Германии в первую мировую войну.

Исследованиями Веселова (1953) было установлено влияние кислородного режима на развитие дрожжей при производстве пива.

-Веселов различает 2 фазы в брожении по отношению к кислородному режиму, из которых 1-я обуславливает 2-ю. В первую, сусло насыщается кислородом, идет интенсивное размножение дрожжей, сопровождаемое накоплением альдегидов, сивушных масел. Последние образуются (по предположению автора) за счет окислительного дезами-нирования аминокислот и обуславливают вкус молодого пива. Азот аминокислот используется в процессе азотного питания при размножении дрожжей. Во вторую, анаэробную фазу, образующиеся аль- . дегиды восстанавливаются и превращаются в высшие спирты, обуславливающие вкус и аромат зрелого пива.

В целях сокращения продолжительности процесса образования пива, Веселов предложил увеличить количество посевного материала и исключать аэрацию. При этом качество пива повышается.

При таком ведении производства одновременно с ограничением прироста дрожжей, будет ограничено и образование альдегидов, а значит будет сокращено.время для их восстановления.

Дальнейшие исследования Нилова и Скурихяна (1959),- Грачевой, Атрушкевич и Романенко (1961), Веселова,Канн и Грачевой (1963) установили, что образование дрожжами свободных альдегидов и высших спиртов, обуславливающих вкус и аромат, зависит не только от вида дрожжей (винных,пивных и пекарских),но и в значительной степени от биохимического состава сбраживаемых сред, условий культивирования. Образование альдегидов и высших спиртов наблюдается в период основного образования биомассы дрожжей.

Наблюдения Утенковой-Ранцан (1954) доказывают, что увеличение концентрации сахара и снижение количества задаточных дрожжей способствует увеличению выхода спирта при брожении. В условиях бурного и быстрого брожения живых дрожжей всегда наблюдается наименьшее количество спирта.

Повышение выхода спирта осуществляется за счет снижения накопления побочных продуктов брожения: глицерина,уксусной кислоты, избыточной углекислоты.

Перемешивание среды оказывает очень большое влияние на урожай и брожение в тех случаях,когда микроорганизмы образуют какие-либо вредные продукты обмена,как например молочная кислота у гомофермен-тативных молочнокислых бактерий{Комарова,1954;Шапошников)и спирт у дрожжей,

Те1еш±лаку и в^веЬонрд/Ьг» (1929)показали,что одно перемешивание без аэрации,осуществляемое в специальном приборе,увеличивало уродай дрожжей в такой же степени,как продувание воздуха,когда осуществляется одновременно и аэрация и перемешивание.Питательная среда,в которой протекают химические процессы,вызываемые дрожжами,неоднородна. Молекулы углеводов,витаминов и других необходимых для жизни веществ прежде всего потребляются ими в зонах непосредственно прилегающих к клеткам.В результате в зонах около клеток накапливаются продукты обмена и клетки начинают голодать несмотря на большое количество питательных веществ в отдаленных участках среды.

В заключение обзора литературы по влиянию аэрации и окислительно-восстановительных условий среды на развитие и брожение дрожжей можно сказать следующее:

Из факультативных аэробов дрожжи наиболее изучены по отношению их к кислороду. I дрожжей обнаружен так называемый пастеровский эффект, т.е.способность переключаться с анаэробного обмена (брожения)на аэробный (окислительный обмен) при доступе воздуха.Кроме того,установлено,что многие виды дрожжей способны к одновременному ведению как окисления так и брожения.Дрожжи чувствительны к ЕН среды. Это явствует из того,что они резко снижают окислительно-восстановительный потенциал в среде,после чего только начинают размножаться.Такая аэробная функция дрожжей,как рост,требует пониженного окислительно-восстановительного потенциала среды.

Чувствительность различных видов дрожжей к окислительно-восстановительным условиям среды крайне разнообразна и находится в тесной связи с другими факторами внешней среды.Поэтому,для выяснения действия аэрации на тот или иной вид дрожжей, необходимо в каждом случае подходить индивидуально с изучением размножения и образования продуктов брожения в динамике развивающейся культуры дрожжей в связи с другими факторами среды.

Влияние РН

Спиртовое брожение было первым примером, на котором выявилось большое значение Рй для всего хода биологических превращений.

Классические работы Bevbtrg'* и Hiraeh, (1919) по спиртовому брожению живых культур и Seuberg'« и ЖкгЬгт {1917) мацерацион-ного сока показали, что при изменении кислотности среды можно добиться значительных сдвигов в соотношении продуктов брожения. Спиртовое брожение в естественно-кислой среде протекает при РН около 4 и основным продуктом брожения является спирт. Krabezg вел брожение при №8,0. В этих условиях накапливалось больше глицерина, меньше спирта и появлялась уксусная кислота, которая в обычных условиях дрожжевого брожения не образовывалась.

1940) установил, что при РН=?,5 дрожжи образуют до 2 t/л уксусной кислоты, а при РН=3,5~4,-5 она не только не образуется, но исчезает. Уксусная кислота, добавленная извне-восстанавливается в спирт.

Таким образом,спиртовое брожение проходит в 2 фазы. В начале развития дрожжей на нейтральных средах образуется уксусная кислота, которая и обуславливает снижение РН, характерное для спиртового брожения. По достижении кислой реакции среды, основными продуктами брожения являются спирт и углекислота.

Большое влияние изменение РН среды оказывает на соотношение продуктов брожения в таких бактериальных брожениях, как ацетоно-бутиловое, бутил - изопрояшювое, ацетоно-этиловое, представляющие комплекс сопряженных биохимических процессов, из которых каждый имеет свой оптимум РН. В нейтральных и более щелочных условиях значительно увеличивается образование летучих кислот, а в кислых условиях - нейтральных про „ стов•cir*b«r&er,P*t»recm ж ffrved, 1520* Шапошников, i^u,I939; Зайцев, 1939;

Лерусалиыский, 194-2; Работнова, 1957).

С данными Wevb*rg*m. по влиянию РН на спиртовое брожение П. Шапошникова,Иерусалимского,Работновой, и др. по бактериальным брожениям, не согласуются результаты более позднего исследования Геллер (1958), в отношении образования кислот.

Геллер,изучая влияние РН на брожение БассЬаготусеэ сегеу±а1ае краса 111). ЗассЬ.РошЬе в динамике развивающихся культур, установила :

Все исследуемые штаммы дрожжей обладали разной чувствительностью к щелочным условиям среды.

Нейтральная среда РН=б,5-7,0 незначительно влияет на размножение ЗассЬ,сеге1г1э1 ее (раса ХП), а РН среды 7,5-8,3 резко угнетает размножение дрожжей. Динамика брожения :в нормальных условиях показала,что процесс подкисления идет главным образом за счет нелетучих кислот. Летучие кислоты накапливались у 26 часовой культуры. В нейтральной среде и в среде с РН=7,5~8,5 подкисление среды идет уже за счет увеличения уксусной кислоты. (О,уксусной кислоты в естественно-подкисленной среде, 1,2%-при РН=8).

По мнению Геллер небольшое количество уксусной кислоты, выделяемой дрожжами в щелочных условиях по сравнению с количеством летучих кислот, выделяемых бактериями в тех же условиях, объясняется резким угнетением размножения дрожжей в щелочных условиях и "природой" дрожжей. Дрожжи-образователи спирта и в обычных условиях почти не дают летучих кислот, поэтому увеличение в данных опытах с 0,12 до 0,96 Г/л видимо, является величиной большой, если учесть и слабое развитие.

Веселов (1953), изучая динамику образования альдегидов в разных условиях спиртового брожения при производстве пива, установил, что кислая реакция снижает количество альдегидов.и глицерина.

Из работ по изучению влияния кислотности среды на деятельность дрожжевых ферментов интересные исследования Гужовой и Логиновой (1963). Они установили,что для мезофильной культуры ( зассЬ# сегеу1а1а* раса ХП) наибольшая активность дегидраз трикарбоно-вого цикла (янтарная, молочная,лимонная,уксусная) проявляется в слабокислой среде при РН=5,5-6,5 а для термотолерантной культуры - в щелочной.

По мнению авторов у термотолерантных культур более активно протекают восстановительные процессы и поэтому оптимум активности дегидраз сдвинут щелочную сторону.

Работнова (1957) на основании литературных данных ,и своих исследований считает,что изменения в соотношении продуктов брожения под влиянием изменения РН среды носят приспособительный характер. Эти изменения являются результатом действия ферментативного механизма, регулирующего РН, устанавливая его на оптимальном для развития уровне.

Обобщая литературные данные, касающиеся влияния РН на спиртовое брожение, можно сказать следующее: РН является мощным фактором в регулировании процессов брожения. Изменяя РН среды можно интенсифицировать выход нужных продуктов обмена, учитывая выявившиеся закономерности: в нейтральной и щелочной среде накапливаются главным образом летучие кислоты, в кислой - нейтральный продукты (эталол,бутанол и др.) и молочная кислота.

Влияние температуры.

Согласно многочисленным литературным данным температурный оптимум размножения клетки и ее ферментативной деятельности не совпадают. Так, по спиртовому брожению и мпп» (цитир. по Геллер,1958), исходя из собственных данных, отмечают,что максимальное развитие дрожжей наблюдалось при 36°, а процесс сбраживания сахара при 40°.

Но в литературе очень мало освещен вопрос о влиянии температура на обмен веществ дрожжевых организмов в целом, (размножение, соотношение продуктов брожения в динамике развития культуры). данные Логиновой (1960) показывают о возможности адаптации дрожжей к повышенной температуре. Автором была получена термофильная раса в результате длительных пересевов при постоянно по

О о вышающейся температуре от 30 до 40 .

Для изучения биохимической активности адаптивной расы она использовала отмытые суспензии и наблюдала сбраживание углеводов ими при 30° и 40°. Автор установила, что брожение у адаптивной расы идет при 40°также интенсивно как и при 30°, но урожай клеток различен: 70ЛО6 при 30°, 26.10* при 40°.

Она делает вывод, что биохимическая активность каждой клетки при 40° значительно выше. А уменьшение урожая клеток связано с быстрой гибелью, т.к. у термофильной расы было 41 млн/ал к 22ч. развития. у обычной 30 млн/мл к 22 ч.развития

40 40 ч. -"термофильной 36 -"- 40 ч

Зти данные показывают, что скорость размножения термофильных культур выше.

Комарова (1951) считает,что ускорение спиртового брожения при повышенной температуре является результатом 2-х факторов - температуры и естественного перемешивания среды газом, т.к. его образуется больше при повышенной температуре. Наличие газа способствует: передвижению клеток, увеличивая площадь соприкосновения со средой, облегчает устранению ядовитой зоны (спирта) около клеток,образующейся в результате выделения продуктов обмена, а также способствует соприкосновению клеток с новыми питательными веществами.

Наиболее полное представление о влиянии температуры на спиртовое брожение показывают данные Геллер (1958). Она изучала динамику = размножения и биохимической активности БассЬаготусев РотЬе»

Оказалось,что с изменением температуры изменяется характер размножения культуры и биохимическая активность клеток.

При оптимальной температуре (27°) развитие идет с наименьшей лаг-фазой (6-8ч.), затем идет интенсивное размножение с конечным микробным числом в 115,2 млн/мл.

Уменьшение температуры до 22-23° увеличивает лаг-фазу до 26ч., затем идет интенсивное размножение с максимальным уродаем до 143 млн/мл.

При 18°лаг-фаза длится 40ч. максимум клеток 84 млн/мл. Повышение температуры значительно сокращает лаг-фазу,но общий выход клеток падает до 83 млн/мл.

Скорость размножения с повышением температуры увеличивается, наибольшая при 33°-6,4 клетки /час/ см. график стр.50)

Скорость размножения зассЬаготусее РотЬе в зависимости от температуры. (#03ърьфи**) •

Повышение температуры до 33° повышает биохимическую активность клеток.

Динамика брожения £«ссЬ.Ршгё*е при 330,27°,23° показала,что первые часы при 33° характеризуются более интенсивным размножением я биохимической активности. Повышение температуры вызывает ускорение биохимической активности-. При 33° момент наступления максимума скорости образования спирта и выделения С02 наблюдается к 26 часам развития, при 23° и 27° - к 39 часам.

Таким образом, температура оказывает огромное влияние на сдвиги в соотношении продуктов брожения, биохимическую активность дрожжевых клеток и скорость их размножения.

Согласно литературным данным,посвященным изучению влияния факторов внешней среды на биохимические свойства дрожжей,можно сказать,что аэрация,кислотность и температура оказывают очень большое влияние на развитие и выход продуктов брожения дрожжей.йзменяя условия среда можно направлять процессы брожения в желаемую сторону. Чувствительность различных видов дрожжей к окислительно-восстано» вительным условиям, кислотности среды и температуре крайне разнообразна и находится в тесной связи с другими факторами внешней среды.

Сведений о том,какой окислительно-восстановительный потенциал (£Н2) создают при своем развитии в молоке дрожжи»сбраживающие лактозу, мы не нашли в литературе.

Не оавещен в литературе и вопрос о взаимосвязи между условиями среды (1Н2*РН молока) и биохимической активностью, {в частности процессом образования спирта) дрожжей,сбраживающих лактозу.

Решение этих вопросов представляет интерес с точки зрения повышения качества кумыса путем подбора производственноценных культур дрожжей.

На основании обзора литературы по вопросам состояния производства кумыса, состава, свойств и взаимоотношения микрофлоры кумыса, влияния факторов внешней среды на биохимические свойства молочнокислых бактерий и дрожжей надо сказать следующее.

Несмотря на высокую ценность кумыса как диетического и дополнительного лечебного средства, применяемого одновременно, . с антибактериальными препаратами против Туберкулеза, желудочно-' кишечных и других заболеваний, свойства культур и технология производства кумыса изучены крайне недостаточно. Поэтому необходимы более глубокие знания биохимических свойств чистых культур молочнокислых бактерий и дрожжей, их взаимоотношений,а также влияния факторов внешней среды (ЧН^РН, температуры) на размножение микрофлоры и биохимические процессы кумыса.

Изучение этих вопросов представляет интерес с точки зрения подбора производственно-ценных культур и симбиотичеекой закваски для производства кумыса,научного .обоснования технологии производства кумыса. Эти данные помогут также найти пути для управления процессов брожения в кумысе с целью интенсификации образования наиболее ценных продуктов брожения и получения стандартного напитка.

Для решения этих задач необходимо*уточнить видовой состав микрофлоры кумыса на естественной закваске 5 отобрать из коллекции и изучить биохимические, антибиотические и редуцирующие свойства лучших культур молочнокислых бактерий и дрожжей в динамике их развития при раздельном и совместном культивировании; изучить влияние факторов внешней с^еды (*Н2,РН и температуры) на биохимические процессы в кумысё^Гпроверить возможность использования этих культур для производства кумыса кГз коровьего молока.

МЕТОДИКА НОСлху^АНМ

I. Методика постановки опыта.

Основные серии опытов.

В целях отбора лучших культур для производства кумыса проводилось изучение развития и биохимических свойств (характера процесса брожения) молочнокислых бактерий и дрожжей. В качестве питательной среды использовали стерильное кобылье молоко (5 минут при 0,8 атм.)* Посевным материалом служили суточные культуры молочнокислых бактерий и 2-х суточные - дрожжей.

Молоко заквашивали отдельно молочнокислыми бактериями из расчета 5%, выдерживали при температуре 33-34°С и дрожжами - на расчета 5 петель (о(- 2мм) на 100 мл. молока и выдерживали при оптимальной для их развития температуре - 2б-28°С. Продолжительность опытов 4-6 суток.

Для отбора лучшей комбинации чистых культур молочнокислых бактерий н дрожжей для кумысной закваски изучали характер процессов брожения при совместном культивировании различных вариантов дрожжей и молочнокислых бактерий. Образцы молока заквашивали смешанными культурами из расчета 10 мл. молочнокислых бактерий и смывы дрожжей с 2-х косячков суслового агара на 0,5 л. молока. Температура культивирования - 2б-28°С. Продолжительность опытов 5-6 суток.

Обе серии опытов проводились в динамике развивающихся культур. По ходу брожения в культуральной жидкости определяли количество дрожжей и молочнокислых бактерий, окислительно-восстановительный потенциал (*СЙ2), РН, титруемую кислотность, содержание спирта, летучих кислот, антибиотические и оргаиолептмческие свойства, лучший вариант использовали для приготовления опытных партий кумыса

В целях обоснования технологии производства кумыса и выявления' возможности управления процессами брожения было изучено влияние Факторов внешней среды {*Й2,РН,температуры) на микробиологические и биохимические процессы кумыса в динамике.

Для приготовления опытных«партий кумыса применялись чистые культуры молочнокислых бактерий (типа болгарской палочки), дрожжей, ббраживаюцих лактозу, мезофидышй молочнокислой палочки, выделенные из кумыса.

Активность закваски для кумыса поддерживалась путем периодического добавления парного кобыльего молока.

Опыты проводились в широкогорвых колбах Эрленмейера, емкостью 0,7-1,0 литра, при объеме культуральной жидкости 0,5-0,7 литра.

Для выявления значения каждого фактора на развитие лик^чоры и соотношение продуктов брожения в кумысе, действие их исследовалось отдельно на фоне оптимальных 2-х других факторов.

Различные окислительно-восстановительные условия в кумысе создавались путем перемешивания в различные периоды брожения, различной продолжительности и кратности (окисленные условия) и без перемешивания в закрытом аппарате (условия ограниченного доступа воздуха).

Различную величину РН устанавливали путем добавления различного количества закваски с кислотностью 110° Тернера.

Созревание (сквашивание) кумыса проводилось при температуре 26-28°С. По достижении определенной для данного опыта кислотности, опытные образцы помещали в холодильник при + 4 + 6°С.

По ходу брожения в кумысе определяли в определенной последовательности изменение г^» РН, содержание спирта, летучих кислот, количество клеток, антибиотическую активность, органолептические свойства и консистенцию, начиная от момента внесения закваски в. молоко и до конца опыта.

2) Методика микробиологических и биохимических исследований.

Для работы использовались чистые культуры молочнокислых бактерий и дрожжей из коллекции микробиологической кумысной лаборатории санатория "Мцыри", а также культуры, выделенные из 7 образцов естественного кумыса Оренбургской области.

Выделение чистых культур микроорганизмов из кумыса на естественной закваска проводилось методом посева кумыса на плотные питательные среды, а также методом обогащения в жидкой среде с последующим посевом на плотную среду.

В качестве плотных питательных сред использовались следующие: суеловый и сывороточный агар - для дрожжей; агар с гидролизован-ным молоком (по Богданову) и молочной савороткой с пептоном (по Скородумовой) - для молочнокислых бактерий.

Выделение чистых культур молочнокислых бактерий проводилось путем отвивки изолированных колоний в стерильное обезжиренное молоко, а дрожжей - на скошенный сусловый агар. Чистота выделенных культур обеспечивалась многократным пересевом на чашки Петри и последующей отвивкой характерных изолированных-колоний.

Коллекция микроорганизмов поддерживалась в активном состоянии путем периодических пересевов на соответствующие среды. Коллекция дрожжей проверялась на способность сбраживать лактозу и образовывать антибиотические вещества к 5 непатогенным бактериям: ВасЬ »Со11 ,Вас111ив тевехгбегГсшз,Вас111ив шусо!<1ев,Вас111ил воЬ-ЫНа, ВесЬегЗлш ргси11 ставши

Антибиотическая активность дрожжей определялась по методике, рекомендуемой А.М.Скородумовой (1961).

Опыты ставились одновременно с 5 тест- объектами. Две капли (0,1мж.) суточной бульонной культуры тест-объекта вносили в расплавленный. и охлажденный до 45° картофелъно-лактозный агар и разливали в чашку Петри. После застывания агара на его поверхность наносили штрихами по радиусам 4-8 культур исследуемых штаммов и выдерживали при температуре 26-28°. Через 20-24 часа вокруг штрихов были видны зоны отсутствия роста бактерий.

Морфологические, культуральные и физиологические признаки изучали только у лучших по антибиотическим и сбраживающим лактозу свойствам дрожжей и молочнокислых бактерий.

Морфологические признаки изучались микроскопированием фиксированных и окрашенных метиленовой синью препаратов чистой культуры при увеличении в 900-1350раз. При этом устанавливались форма, строение клетокГих размеры, расположение. Выяснялось отношение к окрашиванию по Грамму»

Культуральные признаки изучались путем посева чистых культур на плотные и жидкие питательные среды. Выросшие колонии описывались по следующей схеме: размер,форма, расположение, цвет,консистенция.

При развитии в обезжиренном молоке отмечалось наличие или отсутствие сгустка, его характер; наличие пигмента, следов газообразования, пептонизации казеина. При развитии в жидком сусле отмечалось наличие или отсутствие пленки, ее характер.

Из физиологических свойств изучались энергия и предел кислото-образования, температурный оптимум, отношение к различным источникам углерода, образование продуктов жизнедеятельности (летучих кислот, спирта).

• Энергия кислотообразования определялась приростом титруемой кислотности за час при посеве одной петли С<э1-2мм) в 10 мл. стерильного обезжиренного молока.

Предел кислотообразования определялся величиной титруемой кислотности культур после 7-суточной выдержки в термостате при оптимальной температуре.•

Температурный оптимум определялся по времени свертывания мо- :

ГУ лока при минимальном заражении при температурах 27; 35; 45; С.

Отношение к источникам углерода определялось методом культи- : вирования чистых штамов на жидкой среде с различными источниками углерода: гексозами - глюкозой,галактозой; маннозой; дисахаридами - лактозой, мальтозой, сахарозой; спиртом-ыаннитом.

Средой служил дрожжевой бульон следующего состава: пептон - 0,5% --------вой автолизат - 2,5%

Углевода добавлялись в количестве 1%.

Идентификация бактериальных форм проводилась по Красильникову (1949), дрожжевых - по Кудрявцеву (1954).

КЙ2 Мвзо4 индикатор

РН среды

Методы одрйдедевня.,кодиче„с:ш мвдюпджшацмрв »продуктов • . йр.ожеяиа^шстиваой шттышш Ш1 и шсдядадшь. восстановительного потенциала (гЛ0)

В культуральной среде по ходу брожения - в динамике развития культур - определяли количество молочнокислых бактерий чашечным методом на сывороточном агаре и на агаре с гидролизовашшы молоком. Дрожжи учитывались чашечным методом на сусловом,сывороточном агаре и по методике подсчета лейкоцитов (Толмачева,1963).

Маирвт летучие кислоты - микрометодом по (описан у Окородуновой, 1949); результаты выражали в мл.0,1 н ВаОН, пошедших на титрование 100 мл. дистиллята, отогнанного из 50 мл. испытуемого продукта; этиловый спирт - флотационным методом; титруемая кислотность - титрованием культуральной жидкости 0.1 н »«ОН

Титр антибиотической активности опытных партий заквасок и кумыса определялся по методике, предложенной Скородумовой.

Закваску или кумыс нагревали на водяной бане до кипения. При этом казеин выпадал в осадок с отделением сыворотки. Для определения титра антибиотических веществ использовали сыворотку в различных разведениях и вносили ее в стельные чашки Петри; в первую - i мл. сыворотка, во вторую - I мл. разведения в т'сетью - I мл. разведения 1:4, 1:5 и т.д. В чашки Петри вливали по 9 мл. расплавленного и охлажденного до 40-45 картофелъно-лактозного агара, который легкими вращательными движениями смешивали с araоом в первой чашки - 1:40 и т.д. Для подсушивания поверхности агара чашки Петри по

1(ЕеК(ШШ не 30-50 мин. в термостат со слегка приподнятыми крышками. В -срчестве тест-объектов использовались те же 5 культур микроорганизмов. С наружной стороны дно чашки петри разделяли на 5 секторов и на каждом из них записывали название культуры, которш должна быть посеяна. с внесенной сывороткой: таким ооразом получали разведения

1:10; во второй - 1:20, в третьей

В каждый сектор петлей наносили кадл» водной суспензии соответствующих тест-объектов й выдерживали в термостате при температуре 30° в течение суток. Титр антибиотика отмечался по тому наибольшему разведению, при котором задерживался рост какого-либо из взятых тест-объектов,с указанием культуры бактерий,по которой установлен титр.

РН - электрометрическим методом с помощью потенциометра.

Определение окислительно-восстановительного потенциала (1H2) ' проводилось электрометрическим методом потенциометром ЛИ—58 с помощью платиновых платинированных электродов.используемых для определения в биологических жидкостях.

Эта методика является для молока новой и описываем ее подробно,

В микробиологической практике производят не единичные определения потенциала, а погружают электрод в культуральяую жидкость на все время культивирования микроба и получают кривую изменений tlu во времени." Это удобно потому,что не нужно ждать (2-3 часа)

С. установления потенциала после погружения.

В виду нечеткого установления потенциала в биологических средах и влияния случайных причин (осаждение бактерий на электроды, доступ кислорода воздуха к электродам и т.д.): измерение необходимо вести в стерильных условиях и не на одном, а на двух-трех электродах.

Употребляемый нами электрод представляет собой платиновую пластинку размером 0,5x0,-5 см, приклепанную к платиновой проволочке диаметром 0,3 мм. длиной 10-15 мм. Проволочка вплавляется в стеклянную трубочку таким образом, чтобы конец ее внутри трубочки был припаян к медной проволочке, ведущей к потенциометру.

Платинирование осуществлялось в растворе хлорной платины. Платинирование и поляризация электродов и определение потенциала проводились по методике, принятой на кафедре микробиологии т.

Все электроды (14 штук) после платинирования и поляризации при погружении их в смесь, состоящую из равных объемов 0,1Н. растворов закисного и окисного железа, давали близкие показания (расхождение 6-8 мв). Подготовленные электроды стерилизовали. Для чего их укрепляли в ватную пробку по 2-3 штуки вместе с пустой стеклянной трубкой, которую в дальнейшем заменяли агаровым мостиком. Затем их стерилизовали в колбах (емкостью 0,5л.). Отдельно в колбах емкостью" в I литр стерилизовали по 0,7 литра кобыльего молока.

Агаровые мостики для соединения с каломельным электродом готовили так: стеклянные трубки диаметром б мм. сгибали над пламенем горелки. На один конец мостика надевали резиновую трубку с зажимом; в нижний конец резиновой трубки вставляли короткую стеклянную трубку, закрытую с конца ватой. Другой конец мостика, закрепив в ватную пробку, опускали в стеклянную колбу, погрузив его в предварительно подготовленную смесь, состоящую из 3^-ного Сигара и. насыщенного раствора кс€ . В одну ватную пробку укрепляли 6-7 мостиков. Далее колбу с мостиками и агаром стерилизовали, затем1в каждый из них засасывали агаровую массу через наружный конец трубки, не допуская пузырьков воздуха. После охлаждения агаровой массы мостики готовы к работе.

При постановке опыта ватную пробку, с которой стерилизовалось-молоко в количестве 0,7 литра, заменяли после заквашивания последнего стерильной пробкой с 2-3 электродами и агаровым мостиком. Для соединения с каломельным электродом с наружного конца агарового мостика снимали короткие трубки - стеклянную и резиновую. Электроды и мостик' до конца опыта находились на одном и том же уровне - в среднем слое молока.

За первые 10-12 часов культивирования измерение потенциала производили через каждые 2-3 часа, а в последующие дни - один раз в сутки. Из другой параллельной колбы в те же промежутки времени в определенной последовательности отбирали пробы для определения титруемой кислотности,РН, количества молочнокислых бактерий и дрожжей,содержания спирта, летучих кислот, антибиотической активности. Численное значение определяли по у^нению гН2 "0^029 + где = + Ее, а Ех - величина замеренного потенциала в вольтах; йс - разница потенциалов нормального водородного (равного условно нулю) и каломельного электродов в вольтах.

Опыты проводились в двух-трех-кратной и более повторностях. ^осле окончания опыта электроды промывали сначала водопроводной а затем дистиллированной водой. Хранились до следующего опыта в дбетиллированной воде. Перед началом каждого опыта электроды подвергались вновь поляризации и стерилизации.

XXX X

Лабораторная и полупроизводственная работа выполнена в Московском областном противотуберкулезном санатории "Мцыри" в 1962-1964г для проведения опытов использовалось сборное молоко кумысной фермы санатория "Мцыри".

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Хрисанова, Л. П.

выводы

1. в составе микрофлоры кумыса, кроме ранее известных видов микроорганизмов (дрожжей,термо|ильных молочнокислых палочек и уксуснокислых бактерий) обнаружены и выделены мезофильные молочнокислые бактерии, стимулирующие развитие дрожжей и образование спирта, определенные как ьсшъл&сиу» $?расильников£ 1954).

2. Из состава микрофлоры кумыса решающее значение для его качества имеют дрожжи, сбраживающие лактозу ( ^а^аготуиД

Изученные штаммы ^различны по своей производственной ценности. Культуры, обладающие сильными редуцирующими свойствами и образующие,кроме спирта и летучих кислот, антибиотические вещества, витамины группы В, вещества, обусловливающие хороший вкус и аромат продукта, являются производственно ценными культурами. Их оптимальные условия для развития и брожения, в процессе которых образуются биологически ценные вещества, лежат при в пРеДелах 9-12, РН-4,0 и температуре - 26-28°.

3. Взаимоотношение между дрожжами и молочнокислыми бактериями кумыса зависит от свойств, последних и условий среды, Культуры,создающие при совместном культивировании /^Д? ниже ^ и РН - 3,6-4,0 обусловливают симбиотические взаимоотношения. Симбиоз основан на потреблении кислорода дрожжами и способности использовать продукты обмена друг друга.

4. В состав микрофлоры кумысной закваски на чистых культурах рекомендуется вводить ЯасЖаъмуЩ ШЛ, ¿и^юАит ц ¿¿¿¡¡¡^ обладающие сильными редуцирующими свойствами.

5. Главными факторами, влияющими на биохимические свойства кумыса, являются окислительно-восстановительные условия,активная кислотность и температура,

6. Технологический режим приготовления кобыльего кумыса отли чается от коровьего,так как химический состав исходного молока различный. Оптимальные условия для получения кумыса из кобыльего молока: начальный РН - 3,9-4,1у умеренная аэрация (непрерывное вымешивание) в течение 30-60 минут в начале брожения, температура созревания - 26-28°. Из коровьего молока: начальный РН -- 5,2-5,4, умеренная аэрация (непрерывное вымешивание) по 15 минут в начале брожения и при кислотности 80-90°Т, температура сквашивания - 26-28°.

7. Антибиотические свойства кумыса зависят не столько от вида исходного молока, а от свойств культур и технологии приготовления.

8. Применение одинаковых антибиотически активных культур для: приготовления кумыса из кобыльего и коровьего молока и разработанного для каждого из них технологического режима, дало возможность получить антибиотически равноценные продукты,стабильные для каждого из них]по химическому составу, однородной газированной консистенции и хорошими органолептическими свойствами. Себестоимость коровьего кумыса равна 10-12 копейкам.

Приношу глубокую благодарность профессору Р.Б.Давидову -научному руководителю работы, профессору В.М.Богданову,кандидатам биологических наук Л.В.Каштанову, А.М.Скородумовой и А.К. Максимовой за ценные советы и указания,главному врачу, санатория; "Мцыри", кандидату медицинских наук Н.С.Пономаревой, а также сотрудникам кафедры молочного дела ТСХА за внимание и помощь ] при выполнении данной работы. х х х х

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИГОТОВЛЕНИЮ ЗАКВАСКИ ДЛЯ КУМЫСА. зажедсш для кумыса как из кобыльего так и из коровьего молока используют чистые культуры молочнокислых палочек типа болгарской и дрожжи, сбраживающие лактозу. Чистые культуры выделены из кобыльего кумыса и отобраны по антибиотической активности к гнилостным бактериям и туберкулезной палочке.

Выращивание чистых культур и приготовление первичной закваски производят в лабораторных условиях.

В 0,5 литра стерильного обезжиренного молока вносят дрожжи, смытые с 2-х агаровых косячков суслового агара и содержимое I пробирки (8-10 мл.) культуры болгарской палочки, перемешивают и помещают в термостат при 2б-28°С на 12-14 часов до образования сгустка. После чего Закваску перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа для развития дрожжей. Затем охлаждают до 4-7°С и хранят до употребления при этой же температуре.

Для приготовления производетвенной закваски обезжиренное молоко пастеризуют при 92-95°С 30 минут, затем охлаждают до 30^0, вносят 5% маточной закваски и сквашивают до образования сгустка при 28°С. После чего охлаждают до 16-18°С и выдерживают при этой температуре 3-4 часа для развития дрожжей, затем перемешивают, охлаждают и хранят нри 5-7°С до употребления. Кислотность производственной закваски должна быть 120-140°Т. Консистенция после перемешивания однородная, газированная.

Первичную закваску для кобылъего кумыса готовят также как и для коровьего.

Для изготовленип производственной закваски в первичную закваску ежедневно по 4-5 раз (в течение 4-6 дней) добавляют парное кобылье молоко в таком количестве, чтобы кислотность смеси была 60-70°Т.

Каждый раз в момент прибавления молока смесь тщательно перемешивают в течение 10 минут. Производственную закваску поддерживают и освежают при температуре 26-28°.

Кислотность закваски должна быть П0-120°Т, Консистенция однородная, газированная. Вкус чистый молочнокислый дрожжевой»

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРОИЗВОДСТВУ КУШСА ИЗ КОБЫЛЬЕГО МОЛОКА НА ЧИСТЫХ КУЛЬТУРАХ.

В парное кобылье молоко добавляют закваску с кислотностью П0-120°Т в таком количестве,чтобы заквашенное молоко имело кислотность 50°Т (РН=4,0) и температуру 26-28°. Для лучшего распределения закваски в молоке полученную смесь вымешивают в течение 15-20 минут и оставляют для созревания до кислотности 7Л. После чего смесь снова вымешивают в открытой емкости 30-60 минут (в зависимости от количества).

По окончании вымешивания кумыса, его разливают в бутылки,укупоривают и оставляют при температуре^20° для спиртового брожения и накопления углекислого газа до накопления кислотности 80°Т. После чего кумыс помещают в холодильник при температуре 4-7° до употребления.

В зависимости от продолжительности выдержки кумыса, а соответственно количеству спирта и кислотности кумыс подразделяют на слабый, средний и крепкий. Слабый кумыс имеет кислотность 60-80°^ и спирта 0,8-1,0%. Средний соответственно 81-Ю5°Т и 1,1-1,75%, крепкий 106-120°Т и спирта - 1,75-2,5 и более %. Титр антибиотической активности к гнилостным микроорганизмам и туберкулезной палочке в I мл.кумыса (после автоклавирования) 1:20 - 1:50.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРОИЗВОДСТВУ КУМЫСА ИЗ КОРОВЬЕГО ОБЕЗЖИРЕННОГО МОЛОКА НА ЧИСТЫХ КУЛЬТУРАХ,

В обезжиренное коровье молоко с кислотностью не выше 19°Т добавляют 20-35% сыворотки (можно без сыворотки), 3% сахара и пастеризуют при 90-92°Т в течение 20 минут, охлаждают до 32-33°, вносят 10-12% закваски (кислотность 28-30°Т) и непрерывно вымешивают 15 минут в открытой емкости. Смесь после внесения закваски и вымешивания охлаждается и должна быть не выше 26-28°С. Сквашивание протекает при 26-28° до кислотности 90-96°Т. (избегая встряхивания во время сквашивания), затем кумыс вторично вымешивают,фильтруют через 2 слоя марли, разливают в бутылки, укупоривают кронен-коркой и оставляют при 16-18° на 3-4 часа для развития дрожжей, накопления углекислого газа и спирта, (при комнатной температуре 1,5-2 часа). По достижении кислотности Ю6-П0°Т кумыс помещают в холодильник при температуре 4-7° на 12-14 часов (слабый кумыс).

Для получения более ровной и газированной консистенции бутылки с кумысом необходимо встряхивать, как при созревании так и при хранении.

Лучше использовать 2-х суточный кумыс. Для достижения большей крепости кумыс выдерживают на холоду до 6 суток.

Готовый кумыс должен иметь приятный кисломолочный, освежающий дрожжевой вкус, однородную газированную консистенцию. Кислотность 120-130°Т. Спирта-0,4-0,6%.

При микроскопировании мазка в поле зрения должно быть не менее 15-20 дрожжевых клеток. Титр антибиотической активности к гнилостным микроорганизмам и туберкулезной палочке в I мл.кумыса (после автоклавирования) 1:20 - 1:50.

Выньте ¿в копия

МИНИСТЕРСТВО МЯСНОЙ И МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

СССР

ПРИКАЗ №. 28 гор.Москва 22-го февраля 1966г.

О выпуске некоторых новых и улучшенного качества мясных и молочных продуктов"

Предприятия и Научно-йсследовательские Институты Министерства Мясной и Молочной промышленности СССР представили предложения по выпуску новых и улучшенного качества мясных и молочных продуктов.

На проведенном в феврале 1966г. Министерством смотре заслужили одобрения новые и улучшенного качества продукты в целях увеличения производства улучшенного качества мясных и молочных продуктов

ПРИКАЗЫВАЮ: б) включить б план на I966 год разработку поточного способа выработки кумыса из обезжиренного коровьего молока и кефира Кавказского, имея в виду строительство в 1966г. специализированного опытного завода по их производству. ад.Шшистр Мясной промышленности А' V* подпись С.Антонов

Ксшш верна:

V и , Л

СССР

Мясной и Молочной Промышленности

ДИРЕКТОРУ ВНИМИ тов.ЛИПАТОВУ И.Н.

КОПИЯ

Главное Управление

Маслодельной и Молочной промышленности

16 марта 1966 года

Направляя копию письма Министерства Здравоохранения СССР от 5-го марта 1966г.,по вопросу производства кумыса из коровьего молока, прошу ускорить представление технической документации на этот продукт.

Список литературы диссертационного исследования Хрисанова, Л. П., 1966 год

1. БИЛЬр I88I.Кумыс и обмен веществ во время лечения KYMHSИздательство Риккера.

2. БЕХОВА Е.А. 1958.Рибофлавин и тиамин в кобыльем молоке.Доклады Всесоюзной конф. по молочному делу. Сельхозгиз,М.,

3. БОГДАНОВ В.М. 1957."Микробиология молока и молочных продуктов,Дищепромиздат,!,, 15. " 1959.Молочнокислая микрофлора молока и молочных продуктов различных кжматических зон. Тр.ВНИМИ,вып.20.

4. БОГДАНОВ В.М. 1959.Выделение чистых культур для производстваПЯТНИЦЙНА И.Н. кефира. Труды ВНИМИ, выпуск 20.

5. БОГДАНОВ В.М. 1962.Микробиология молока и молочных продуктов.Пйщепромиздат.М. 18. " 1962.0 микрофлоре кумыса. Молочная промышленность Ш 10.

6. Б^ЙИН В.Н. 1940.Вйтамины,издание 2-е,М.-Л.Г1ищепромиздат,20. " I960.Биохимические функции витамина Вхр. Вопросы медицинской химии,т.6,в.47

7. БУТЯГИН П.В. 1909.0 влиянии низких температур на жизнеспособность бактерий. Известия Томского 1ниверситета. Томск.

8. ВАЛДЙАН А.Р. 1952.Синтез витаминов микрофлорой пищеварительного тракта с/хоз.животных. Известия АН Латвийской CCP,te I,

9. ВЕСЕЛОЕ И.Я. 1955.0-^^ в изучении скорости обмена веществ удрожжей и молочнокислых бактерий. Сессия АНСССР по мирному использованию атомной энергии.Изд.АНСССР,М.

10. ВЕСЕЛОВ И.Я. 1959.0 физиологической роли образования молочнойКУЗНЕЦОВА Э.Г. кислоты гомоферментативншш бактериями, Тр.йн-та микробиологии АНСССР.,выпуск 6.

11. ЗАйКОВСКАЯ Н.Н. 1935.Химико-бактериологические исследованиякумыса района курорта "Боровое". Курортология и физиотерапия,! 6,

12. ИВАНИЦКАЯ Л.Н. 1959.Исследование антибиотических свойствдрожжей. Антибиотики, 6.

13. ИЕРУСАЛИМСКИЙ Н.Д.1944.Исследование двухфазности брожения дляпереработки трудно сбраживаемого сырья (мелласы). Микробиология,т.13. выпуск 2-3. 80. " 1963.Основы физиологии микробов. М.АН СССР,

14. ИМШЕНЕЦКИЙ А.А. 1944.Микробиологические процессы при высоких температурах. Изд.АН СССР,

15. ИМШЕНЕЦКИЙ А.А. 1944.Микробиологические процессы при высоких температурах. Издат.УН СССР.

16. ИНЙХОВ Г.С. I93I.Химия молока и молочных продуктов.

17. Русского ботанического общества.1956.Избранные труды по физиологии и биохимии шкроорганизмов. Т.П.изд.АН СССР. 1939.0 приготовлении напитка типа кумыс из сыворотки и пахты.

18. МАРЙ0В-0С0РГИН В.Н.1933йумыс,его приготовление и лечебно-профилактическое значение. Уфа,Башгиз. 133. 134.МАХАЩА К.Ч, 1.4I.Микроорганизмы кумыса. Сборник научных работ Башкирского ин-т£ Зпйдемйологйи,микробиологии и санитари! выпуск I. ^фа.

19. СМИРНОВА А.Э. 1953.Дрожжевой автолизат как источник витаминного питания.микроорганизмов. Труды ВНМСй,т.4,стр.65.

20. СОКОЛОВСКИЙ В.П. 1959.Очерки по истории отечественнойдиетотерапии и организации питания : в лечебных учреждениях. М.,Медгйз. 2ОЗ.СОК0ЛЬСКАЯ А. 1955.Влйяние поваренной соли на развитие молочнокислых бактерий. Молочная промышленность,! 2.

21. СОЛОВЬЕВ В.А. 1952.К методике определения чувствительности туберкулезных микобактерий к антибиотикам. Проблемы туберкулеза,3,

22. С0Р0КИН Н.В. 1883.К вопроеу о ферменте кумыса.Дневник казанского общества врачей, №. 5.

23. ФЕ0ФИЛ0ВА Е.Д. 1958.Микрофлора кефирного зерна,Микробиология,ШП,выпуск 2. 212.1АЛДИНА М.Ф. 1939.Кумыс и его приготовление. Молочно-маслодельная пронышленность,^

24. ШАПОШНИКОВ В.Н. I960.Физиология обмена веществ микроорганизмо:в связи с эволюцией функ1|ий. Издательство АН СССР,!.

25. ШКЙН А.А. 1929.Химический состав кобыльего молока иизменение его в зависимости от различных условий. Ж.Курортно-санаторное дело",3.

26. ШИПИН Д. 1889.К бактериологии кумыса.Диссертация, СПБ.

27. ШШ0НК0 В. 1864.Приготовление кумыса из кобыльего и коровьего молока,его употребление и действие на человеческий организм. Пермь. 234.1ТАЛЬБЕРГ С М . 1959.Разработка технологии сухой диетической БАННИКОВА Л.А. простокваши. Труды ВНИММ,выпуск 20.

28. ШТАНГЕ В.А. 1895.Лечеййе кумжсом и кефиром.Приложение к руководству общей терапии ЦИМСЕНА,т.1,СПБ. 1886.

29. ЭНГЕЛЬГАРДГ В.А.и 1943.0 механизме пастеровского эффекта.САКОВ А.Е. "Биохимия",8,выпуск I.

30. ЭНГЕ1ЬГАРДГ В.А. 1944.0 взаимоотношениях дыхания и брожения.Успехи современной биологии,17,выпуск 3. !• АЖНАОЕН 1 1934 .^Jeг lascheltmng der alkoholischen jjjHlGEN f Zuckerapaltong dmrch Hefe in Milchsiure-gartmg II. BIoc.iem»Zt schr » ,268 ,H.4-6 .

31. I0»Studien uber der Humys.Zbt «.fur Bact • I I • a b t ^Bd •28•