Научно-практические основы рационального использования дрожжей и лактобактерий, выделенных в Центральной части Северного Кавказа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Хозиев Алан Макарович

• Хозиев Алан Макарович
• доктор наук
• 2023

Оглавление диссертации доктор наук Хозиев Алан Макарович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Зеленая масса растений, как сырье для биосинтеза белка

1.1.1 Биоконверсия сырья растительного происхождения

1.1.2 Общая характеристика вторичного ресурса - пивной дробины

1.1.3 Основные свойства растений, используемых в диссертационных исследованиях

1.2 Свойства продуцентов биотехнологических процессов

1.2.1 Общая характеристика дрожжевых грибов

1.2.2 Селекция штаммов дрожжей

1.2.3 Использование штаммов микроорганизмов -продуцентов в разных отраслях хозяйственной деятельности человека

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3 ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ РИБОСОМАЛЬНЫХ ГЕНОВ

3.1 Систематическое разнообразие дрожжевых грибов в РСО - Алания

3.2 Морфологические свойства изучаемых штаммов дрожжей

3.3 Идентификация исследуемых штаммов микроорганизмов на основе анализа

последовательности рибосомальных генов

Глава 4 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ПИТАТЕЛЬНАЯ ЦЕННОСТЬ ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ ГОРЦА САХАЛИНСКОГО В РАЗНЫЕ ФЕНОФАЗЫ ОНТОГЕНЕЗА

4.1 Состав зеленой фитомассы горца сахалинского

в различные фенофазы вегетации

4.2 Анализ структурного состава минеральных компонентов зеленой массы горца сахалинского в свежем и консервированном виде

4.3 Содержание биологически активных веществ (БАВ) в зеленой массе горца

сахалинского

4.4 Результаты исследования химического состава консервированной

силосованием зеленой массы горца сахалинского

4.5 Качественный и количественный аминокислотный состав силосов из зеленной

массы горца сахалинского

Глава 5 БИОКОНВЕРСИЯ ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ ГОРЦА САХАЛИНСКОГО

Глава 6 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ГИДРОЛИЗАТАХ

6.1 Реализация биоресурсного потенциала штаммов дрожжей при биоконверсии

зеленой массы горца Вейриха, интродуцированного в РСО-Алания с

о.Сахалин

6.2 Реализация биоресурсного потенциала штаммов дрожжей при биосинтезе

микробного белка на гидролизатах из зеленой массы щирицы запрокинутой

(Amaranthus retroflexus L.)

Глава 7 ТЕХНОЛОГИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ИЗ ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ СИЛЬФИИ

ПРОНЗЕННОЛИСТНОЙ

Глава 8 БИОКОНВЕРСИЯ ОТХОДОВ АЛКОГОЛЬНОГО ПРОИЗВОДСТВА

8.1 Результаты исследования минерального состава пивной дробины

8.2 Культивирование дрожжей из коллекции НИИ биотехнологии Горского ГАУ

на питательной среде из пивной дробины

8.3 Культивирование дрожжей на кислотном гидролизате пивной дробины

Глава 9 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ СЕЛЕКЦИИ ГОРСКОГО ГАУ В РАЦИОНАХ РЕМОНТНЫХ СВИНОК

9.1 Результаты использования штаммов молочнокислых микроорганизмов при

выращивании ремонтных свинок

9.2 Химический состав и питательность кормов, используемых в опыте

9.3 Число КОЕ в образцах молока, сквашенных музейными и местными

штаммами лактобактерий для использования в кормлении подопытных поросят

9.4 Динамика изменения живой массы подопытных свинок в процессе проведения

научно-хозяйственного опыта

9.5 Промеры тела подопытных животных

9.6 Динамика изменения некоторых показателей крови подопытных животных

9.7 Микробный пейзаж кишечника подопытных животных

9.8 Переваримость и использование питательных веществ рациона

9.9 Метаболизм азота

9.10 Обмен макро- и микроэлементов в организме подопытных животных

9.11 Рентабельность использования заквасок из местных и музейных штаммов при откорме свинок

Глава 10 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ

10.1 Эффективность использования в рационах кормления цыплят-бройлеров кросса «КОББ500тм» биомассы дрожжей РюЫа kudriavzevп и Metschnikovia

pulcherrima

10.2. Влияние биомассы дрожжей местной селекции в составе рациона на

физиологические показатели кур-несушек кросса Coobb

10.3 Результаты анализа состава крови цыплят-бройлеров кросса СООВ

10.4 Использование биомассы дрожжей в рационах кормления перепелов породы Фараон

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научно-практические основы рационального использования дрожжей и лактобактерий, выделенных в Центральной части Северного Кавказа»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Разнообразие форм взаимоотношений человека и окружающего микромира стимулирует интерес к изучению хозяйственно-ценных, экологических и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов. Расширение знаний подобного свойства позволяет планировать стратегию эффективного взаимодействия человека с окружающей микробиотой.

Современное увеличение потребностей в биоресурсах растущего населения планеты приводит к колоссальному давлению на эволюционно сформировавшиеся межвидовые взаимосвязи и сокращению видового разнообразия микробиоты.

Изучение морфологических, биохимических, генетических свойств каждого микроорганизма и сохранение многообразия микробиоты является актуальным направлением исследовательских работ в биотехнологии биологических ресурсах.

Широкий диапазон ферментативных возможностей дрожжевых грибов делает эти микроорганизмы перспективными и привлекательными объектами исследований современных микробиологов и микологов.

Лактобактерии широко используются в жизнедеятельности человека, как продуценты многих продуктов питания, а также в качестве лечебно-профилактических препаратов, так как лактобактерии представляют собой активных антагонистов возбудителям желудочно-кишечных заболеваний. Кроме того, данная группа микроорганизмов обладает способностью активизировать процессы пищеварения как у человека, так и у животных, в силу чего они способствуют повышению интенсивности роста молодняка сельскохозяйственных животных.

К наиболее перспективным микроорганизмам относятся дрожжевые грибы и молочнокислые микроорганизмы. Современные микробиологи, используя возможности передовых методов генетических исследований, проявляют интерес как к полезным, так и вредным для человека свойствам штаммов микроорганизмов (Xanthopoulou et а!., 2019).

На основе исследования морфологических особенностей и последовательностей ДНК генов 16S рДНК и 26S рДНК исследуемые авторами изоляты были «идентифицированы как Bacillus safensis, Stenotrophomonas maltophilia, Metschnikowia pulcherrima» (Ling, 2019).

Полезные свойства для человека дрожжевых грибов в первую очередь связаны с их уникальным ферментативным спектром биохимических возможностей (Gan H. et al., 2017).

Ферментация биологически активных веществ является важным для биотехнологических производств свойством продуцентов. Так, например, дрожжевые грибы Rhodotorula mucilaginosa активно используются в качестве источника каротиноидов, одноклеточные грибы Hanseniaspora uvarum могут приносить пользу в качестве источников белка, а также могут вызывать порчу вина (Kethireddy, 2016). Antonio de Anchieta Сатага Jr. и др. изучили и описали технологические свойства таких винных дрожжей, как Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima и Lachancea thermotolerans (Cаmara Jr. et al. 2019).

Микробиология - одно из приоритетных направлений развития науки и производства, которое использует биологические возможности микроорганизмов для удовлетворения нужд человечества. Наиболее древним процессом микробиологического производства является брожение (Рогов, 2004).

Широкое использование сообществ микроорганизмов в техногенных процессах стимулирует процесс изучения закономерностей развития и функционирования различных микробных групп (Хохлачева, 2015).

Таким образом, изучение биоресурсного потенциала, видового состава и физиологических особенностей дрожжевых грибов в Центральной части Северного Кавказа и эффективности практического применения идентифицированных штаммов микроорганизмов представляется перспективным направлением исследований.

Следовательно, расширение знаний о разнообразии микробиоты и биоресурсном потенциале местных штаммов микроорганизмов, являются актуальными.

Целью диссертационной работы явилось: Выделение чистых культур местных штаммов дрожжей из различных природных источников и разработка технологии производства биомассы дрожжей на растительных гидролизатах и определение влияния биомассы местных штаммов дрожжей и лактобактерий в качестве кормовой добавки на хозяйствено ценные свойства молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Для осуществления поставленной цели решались задачи:

1. Проведение анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 18S рРНК, при использовании автоматического секвенатора АЕ3000 и анализ филогенетического родства изучаемых микроорганизмов по базе данных GenBank и RDP-II в Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» -ГосНИИгенетика. Депонирование в БРЦ (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика идентифицированных и ферментативно активных штаммов дрожжей.

2. Определить биологические и промышленно ценные свойства выделенных штаммов дрожжей и разработать высокобелковые кормовые добавки на растительных гидролизатах из зеленой массы многолетних, высокоурожайных растений и пивной дробины.

3. Установить возможность использования растительного сырья: горца сахалинского (Reynoütria sachalinensis), горца Вейриха (Aconogonon weyrichii (F. Schmidt) H. Hara), щирицы запрокинутой (Amaranthus retroflexus L.), сильфии пронзеннолистной (Silphium perfoliatum L.) и пивной дробины в качестве основы для приготовления питательной среды при культивировании дрожжевых грибов.

4. Установить эффективность культивирования дрожжевых грибов с целью биосинтеза микробного белка на питательных средах из растений: горца сахалинского, горца Вейриха, щирицы запрокинутой, сильфии пронзеннолистной.

5. Определить возможность реализации биоресурсного потенциала молодняка свиней при включении в рационы кормления разных видов лактобактерий, полученных из музея ВКПМ, а также собственной селекции.

6. Определить интенсивность реализации биоресурсного потенциала молодняка сельскохозяйственной птицы при включении в состав рационов кормления биомассы физиологически активных штаммов дрожжей.

7. Расчет экономической эффективности использования идентифицированных и депонированных в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгентика штаммов дрожжей и лактобактерий в кормлении молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Научная новизна работы заключается в проведении скрининга дрожжей, изолированных из различных субстратов в Центральной части Северного Кавказа.

Выделены, идентифицированы, депонированы в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика новые штаммы микроорганизмов -продуцентов биологически активных веществ: Hanseniaspora uvarum ВКПМ Y-4278, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y - 4280, Metschnikowia pulcherrima ВКПМ

Y - 4277, Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ Y - 4282, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y - 4281, Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y - 4339, Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y - 4340, Pichia kudriavzevii ВКПМ Y - 4341, Pichia kluyveri ВКПМ Y - 4343, Torulaspora delbrueckii ВКПМ Y - 4279, Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ В - 4342, Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y -4864, Kluiveromyces laktis ВКПМ Y - 4865, Metschnikowia siensis ВКПМ Y - 4866, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y - 4867, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y -4868, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y - 4869, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ

Y - 4870.

Установлена эффективность использования фитомассы высокоурожайных растений: горца сахалинского, горца Вейриха, щирицы запрокинутой, сильфии пронзеннолистной, как сырья для биосинтеза высококачественного микробного белка с использованием дрожжевых грибов из коллекции НИИ биотехнологии ФГБОУ ВО Горский ГАУ.

Установлена зависимость физиологического статуса молодняка сельскохозяйственных животных и птицы от уровня введенных в состав рациона кормления биомассы штаммов дрожжей местной селекции и лактобактерий.

Получено 26 патентов Российской Федерации на новые штаммы дрожжей и продукты, производимые с их использованием, что подтверждает научную новизну диссертационной работы.

Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность практического применения кормовых добавок, производимых с использованием новых штаммов дрожжей и лакто бактерий, в рационах молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Теоретическая и практическая ценность диссертационной работы заключается в расширении знаний о систематическом разнообразии микробиоты окружающей среды и биологических особенностях отдельных её представителей.

Использование результатов проведённых исследований способствует расширению возможностей по снижению дефицита микробного белка, путем использования новых штаммов продуцентов белка.

Выделены чистые культуры дрожжей с поверхности ягод винограда, изучены их свойства и определена таксономическая принадлежность микробиоты различных сортов винограда: Бургунд, Восторг, Молдова, Каберне, Рислинг рейнский, Цветочный.

Изолирован и идентифицирован штамм дрожжей, выделенный из образца почвы участка фильтрации мелассной барды, который рекомендован в качестве деструктора и источника кормового белка

Определены урожайность и химический состав растительных субстратов: зеленной и консервированной массы горца сахалинского, зеленной массы горца Вейриха, щирицы запрокинутой и сильфии пронзеннолистной в различные фенофазы развития и определены оптимальные сроки сбора данного сырья для дальнейшей биотрансформации штаммами продуцентов местной селекции.

Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в учебном процессе при реализации требований ФГОС ВО, а также предприятиями пищевой и перерабатывающей промышленности и агропромышленного комплекса Северного Кавказа, в том числе для реализации биоресурсного потенциала молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Практическое использование биомассы штаммов дрожжей Hanseniaspora uvarum ВКПМ У - 4278, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У - 4280, Metschnikowia pulcherrma ВКПМ У - 4277, Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ У -4282, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У - 4281, Metschnikowia pulcherrma ВКПМ У - 4339, Metschnikowia pulcherrma ВКПМ У - 4340, Pichia kudriavzevii ВКПМ У - 4341, Pichia kluyveri ВКПМ У - 4343, Torulaspora delbrueckii ВКПМ У - 4279, Rhodotorula mucilaginosa ВКПМ В - 4342 в качестве кормовой добавки реализовано на ООО «Агропромышленный холдинг Мастер-Прайм Березка», ООО «МИП «Экодом», что отраженно в актах внедрения результатов научно-исследовательской деятельности.

Методология и методы исследований. Общенаучная методология и системный подход использованы при планировании работы, экспериментальных исследований и анализе результатов.

Ресурсоведческие, стандартные физико-химические, биохимические, микробиологические и статистические методы обработки экспериментальных данных составили теоретико-методологическую основу работы.

Экспериментальные исследования проводились в соответствии с общепринятыми методиками изучения дрожжей. Учеты и наблюдения проводились стандартными методами с использованием приборов, оборудования, компьютерных программ. Полученные данные обрабатывались математически и достоверны, по существу.

Основные положения, выносимые на защиту:

^ Результаты выделения и идентификации новых штаммов дрожжей.

^ Химический состав использованных для биоконверсии растительных субстратов.

^ Качественные показатели биомассы дрожжевых грибов.

^ Практическое использование новых идентифицированных штаммом дрожжевых грибов в агропромышленном комплексе.

^ Результаты реализации биоресурсного потенциала использованием в кормовых рационах молодняка свиней штаммов лактобактерий.

Степень достоверности результатов. Научные положения, результаты и выводы, приведенные в диссертации достоверны, так, как базируются на анализе большого экспериментального материала, корректном использовании апробированных методов биологических и химических исследований, а также математической статистики.

Апробация и реализация результатов исследований. Основные научные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-производственных конференциях разного уровня: VII международной научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика», Севастополь 2019; Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва, Гостиный двор, 25-27 февраля 2018; Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Горского ГАУ. Владикавказ, 29-30 ноября 2018 г.; Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 20-22 февраля 2017 г. Москва, Гостиный двор; Международной научно-практической конференции «Перспективы развития АПК в современных условиях». Владикавказ, 2017; Международной научно-практической конференции: Перспективы развития АПК в современных условиях. Владикавказ, 2016; Международной научно-практической конференции: Современные достижения биотехнологии. ВГАОУ ВО СКФУ. Ставрополь, 2015; Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Горского ГАУ. Владикавказ, 2013; Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Достижения науки - сельскому хозяйству». - Владикавказ, 2017; Ежегодных научно-практических конференциях Горского ГАУ по итогам года Владикавказ, 2004 - 2020 гг.

Результаты диссертационного исследования явились частью отчетов по научно-исследовательской работе ФГБОУ ВО ГГАУ за 2004-2020 гг.

Публикация результатов исследований. Автором опубликовано 93 научные работы, включая 26 патентов Российской Федерации на изобретения.

Общий объем опубликованных работ составил 45,41 п.л., лично автора 34,05 п.л., в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 23 статьи; в изданиях международных баз данных Scopus / WoS - 7/2; в прочих изданиях опубликовано 37 работ; издано 2 монографии по результатам научной работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 454 страницах компьютерного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований (9 глав), заключение, список литературы, приложения. Диссертация содержит 56 таблиц, 32 рисунка, 18 справок о депонировании штаммов в ВКПМ ГосНИИгенетика, 26 патентов РФ, 6 приложений. Список литературы включает 282 источников, из них на иностранных языках - 74.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Диссертационное исследование является составной частью плана научно-исследовательской деятельности ФГБОУ ВО Горский ГАУ, номер государственного учета НИОКТР - АААА-А18-118100590061-4, АААА-А17112820155-2, номер гос. регистрации 01.2.007 08206, 01.2.007 08213. регистрации 115012130046.

Личный вклад автора. Автором выделено и депонировано в БРЦ (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика 20 штаммов дрожжевых грибов. Лично автором в результате диссертационных исследований изучены морфологические и физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов дрожжей. Доказана эффективность использования изучаемых штаммов дрожжевых грибов и в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы.

Автором изданы монографии на основании результатов выполненных исследований, основной объем которых выполнен лично автором, осуществлен анализ полученных данных, сформулированы положения диссертации, которые аргументируют ее новизну и практическую значимость. Осуществлена подготовка статей к публикации, а также презентации и доклады к выступлениям на конференциях разного уровня.

Диссертация является обобщением научных исследований, рационального использования систематического разнообразия микробиоты Центральной части Северного Кавказа. Личное участие автора также заключается в обосновании направлений исследований и разработке программы их выполнения, планировании и организации экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований. Основная часть научных исследований выполнена автором на базе НИИ биотехнологии ФГБОУ ВО Горский ГАУ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Зеленая масса растений, как сырье для биосинтеза белка 1.1.1 Биоконверсия сырья растительного происхождения

Термин биоконверсия произошел от латинского conversio - превращение, что довольно ярко отражает суть данного процесса. Биоконверсия - это трансформация различных органических соединений, в том числе растительного происхождения, под действием ферментных комплексов микроорганизмов, или посредством их компонентов, с получением пищевых и кормовых продуктов (Шлейкин, 2015). Биотехнологические процессы имеют ряд преимуществ перед химическими процессами: во-первых, использование ферментов самих продуцентов, во-вторых, возможность осуществления процесса в одну стадию, в-третьих, использование более низких температур. Существует большое количество технологических схем и способов получения из фитомассы кормовых добавок в результате биоконверсии посредством гидролиза (Карпов, 2000; Sanchez, 2009).

«Получение белоксодержащих кормовых добавок микробным синтезом обеспечивает высокую скорость накопления биомассы вне зависимости от климатических условий с использованием доступного постоянно возобновляемого растительного сырья (преимущественно в виде отходов основного производства) и получение белка, сбалансированного по аминокислотному составу и другим компонентам. Существовавшее на протяжении длительного времени в СССР производство кормовых дрожжей из гидролизатов, получаемых кислотным гидролизом растительного сырья, в настоящее время на постсоветском пространстве практически прекращено, несмотря на востребованность этого вида продукции. Это обусловлено применением неэффективных энергоемких и экологически небезопасных технологических процессов (фактически кардинально не менявшихся с периода основания отрасли и не обеспечивающих высокого выхода целевых продуктов) при значительном количестве отходов (главным образом гидролизного лигнина и

загрязненных сточных вод), а также морально и физически устаревшего оборудования (износ основных фондов в последние годы работы отрасли на большинстве заводов превышал допустимые нормы)» [Болтовский В.С., 2021].

На современном этапе развития науки и общества очень актуальным является вопрос переработки органических отходов, которые в свою очередь являются биологическим ресурсом или вторичным сырьем. Доступные технологии далеки от совершенства, так как не являются безотходными (ВеШа, 2016; Матковский, 2010).

По данным В. П. Комова, на планете Земля количество возобновляемого растительного сырья составляет 800 миллиардов тонн. Кроме этого от 4-6 миллиардов тонн накоплено отходов производства - древесно-растительного материала. Для микробиологической промышленности наличие такой обширной сырьевой базы открывает широкие перспективы для биоконверсии фитомассы в кормовые компоненты (Комов, 2015).

О. А. Неверова (2014) указывает на то, что биоконверсия предполагает процесс трансформации или преобразования компонентов органической природы в процессе ферментации микроорганизмами (Неверова, 2014). Биоконверсия состоит из подготовки сырья (гидролиза), нормализации состава среды в соответствии с требованиями продуцента конечного продукта и ферментации (Работнов, 1980). Так как в результате гидролиза образуется легко усваиваемая дрожжами глюкоза, то на этом субстрате можно культивировать продуценты с различными технологическими требованиями (Губанова, 2010).

Подготовка растительного сырья к микробиологическому синтезу может осуществляться следующими способами: гидротермическим воздействием, химической обработкой (щелочью или кислотой), а также воздействием ферментных комплексов микроорганизмов (Сухарькова, 2002).

В работах Ь. К Ьупё и соавторов (2002) отмечено, что благодаря присутствию цементирующего вещества в матриксе, волокна целлюлозы имеют правильную кристаллическую упаковку. Структурные характеристики матрикса находятся в прямой зависимости от возраста и вида растения. Как следствие, от

структуры компонентов зависит эффективность биотрансформации фитомассы (Ьупё, 2002).

В 2009 году проблему биологической конверсии целлюлозосодержащих субстратов исследовала Е. М. Мордвинова, которая определила, что наиболее эффективным способ утилизации растительных масс является щелочная предобработка субстрата. Наиболее перспективным направлением дальнейшей биоконверсии является ферментация микробной биомассы с целью получения кормового белка (Мордвинова, 2009).

В настоящее время во всем мире обострилась проблема сокращения запасов органического ископаемого сырья. В связи с этим пристальное внимание уделяется возможности переработки возобновляемой в результате фотосинтеза биомассы растительного сырья, методами химической и биотехнологической переработки. Каждый год на нашей планете биосинтезируется огромное количество растительной фитомассы (около двухсот миллиардов тонн) (Алешина, 2001).

Традиционно основным поставщиком углеводов для биотехнологических процессов является растительное сырье: побочные продукты сельского хозяйства и деревоперерабатывающей промышленности. Углеводы фитомассы растений входят в состав сахаров крахмала, воска, целлюлоз, гемицеллюлоз, жиров, белков и других структурных компонентов (Белооков, 2006). «Установлено, что в коре веток содержание фитомассы превышает аналогичный показатель древесины на 5,9 %, а содержание влаги в коре веток ниже на 4,1% чем в древесине» (Волков А.С., 2021). «Кукуруза - это сравнительно нетребовательная культура, поэтому она подходит для любой местности. Кукурузные кочерыжки один из перспективных видов сырья особенно имеющийся в большом количестве в южных районах России» (Валеева Р.Т., 2019).

На территории Российской Федерации В. И. Левахиным и Ю. И. Левахиным отмечается уменьшение площадей для посева силосных растений. В хозяйствах с развитым животноводством наиболее используемой кормовой культурой является кукуруза (Левахин, 2005). В западных странах площади для посева кукурузы

расширены в 1,5 раза. Это показывает, что кукуруза является значимой кормовой культурой (Яковчик, 2004).

Различие в происхождении и неодинаковом составе растительного сырья, который зависит от большого количества факторов, способствуют тому, что и выход биомассы микроорганизмов из единицы ферментируемой массы сырья неодинаков (Федотова, 2002).

Реализация биопотенциала микроорганизмов в процессе конверсии растительного сырья рассматривается как основное направление в биотехнологии (Элисашвили, 1993). Благодаря широкому спектру ферментационных возможностей наиболее перспективными продуцентами биоконверсии растительного сырья, посредством гидролиза, в биомассу с высоким содержанием качественного по аминокислотному составу кормового белка являются дрожжевые грибы (Джанаев, 2012).

Благодаря богатому аминокислотному составу белков и наличию различных биологически активных веществ, вторичные биоресурсы предприятий агропромышленного комплекса, являются перспективным источником для создания перспективных белково-витаминных кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы (Серба, 2015).

В результате исследования состава биологически активных веществ фитомассы Т. Г. Разиной (2006) было отмечено, что, несмотря на небольшие концентрации БАВ, они оказывают большое влияние на уровне систем и клеток. Химический состав БАВ растений зависит от ряда факторов и представлен такими функционально активными соединениями: антрагликозиды, флаваноиды, витамины, эфиры жирных кислот и глицерина и др. (Разина, 2006).

Антрагликозиды - это вещества желтого или оранжевого цвета, содержащиеся в растениях в виде гликозидов или в свободном состоянии. Антрагликозиды имеют разнообразный химический состав и легко извлекаются благодаря хорошей растворимости в воде (Liu, 2021).

Помимо антрагликозидов в большом числе растений находятся фенольные соединения. Флавоноиды являются биологически активными веществами с широким спектром терапевтического действия (Kim, 2003).

Витамины, содержащиеся в растениях необходимы в небольших количествах живым организмам для нормализации метаболических процессов в качестве регуляторов белкового, жирового и углеводного обменов (Haegele, 2000).

Жиры фитомассы растений относятся к биологически активным веществам и обладают иммуномодулирующем действием и антитоксическими свойствами (Mishima, 1998).

Сложные эфиры жирных кислот и глицерина относятся к жирным маслам, которые состоят из предельных жирных кислот: стеариновой, капроновой, миримистиновой, пальмитиновой, масляной, лауриновой и октановой (Наниева, 2014).

Проблема рационального использования ресурсов и переработка органических отходов в настоящее время остро стоит перед современной наукой и практикой. Интенсивный прогресс технологий стимулирует заинтересованность в биотехнологических разработках по получению биотоплива. Жиры растительного и и животного происхождения в результате внедрения подобных разработок применяются в качестве сырья для получения биодизеля. Для этих же целей возможно использовать липиды дрожжей, которые схожи с растительными жирами. Следовательно, одной из перспективных отраслей биотехнологии является биологическая конверсия возобновляемого растительного сырья в различные продукты (Van Hamme, 2001).

При ферментативной трансформации жидких субстратов, имеющих в своем составе достаточное количество утилизируемого азота и углерода целесообразно использовавние биоконверсии. В случае использования твердых компонентов в качестве основного субстрата необходимо наличие мощных ферментных комплексов у микроорганизмов - продуцентов (Неверова, 2014).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Хозиев Алан Макарович, 2023 год

Литература

1. Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky, Thomas J. White. PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic press, INC. 1990.

2. Биохимия, 2007, 72, 12, 1659-1667

3. E. De Clerck, * T. Vanhoutte, T. Hebb, J. Geerinck, J. Devos, and P. De Vos. Isolation, Characterization, and Identification of Bacterial Contaminants in Semifinal Gelatin Extracts Applied and Environmental Microbiology, June 2004, p.3664-3672.

4. Prashant K. Mishra, Roland T.V. Fox, Alastair Culham. Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identication of pathogenic Fusaria. FEMS Microbiology Letters 218 (2003) 329-332

Директор БРЦ ВКПМ д.б.и., проф.

Синеокий

117545, Москва, 1 -й Дорожный проезд, д. 1, ФГБУ «ГосНИИгенетика» тел: [phone] e-mail: [e-mail]

Идентификация штамма 3-ж (9-2018) на основе анализа последовательности рибосомальных генов.

Выдано: А.М. Хозиев Дата: 07.12.2017

I. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для

анализа 18S РНК

II. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit) III. Идентификация штамма по последовательности 18 S рДНК

III .1. Выбор праймеров и режимы ПЦР. Консервативные праймеры для наработки последовательности гена, кодирующего

18S рРНК [1]:

NS1 - gtagtcatatgcttgtctc NS4 - cttccgtcaattcctttaag Режим реакции ПЦР:

1. 95оС - 3мин.

2. 35 циклов

95оС - 30 сек., 57оС - 30 сек., 72оС- 30 сек.

3. 72оС - 5мин

Консервативные праймеры для наработки последовательности гена, кодирующего 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 [2]: ITS1 - TCCGTAGGTGAACCTGCG ITS4 - TCCTCCGCTTATTGATATGC Режим реакции ПЦР:

1. 95оС - 3мин.

2. 35 циклов

95оС - 30 сек., 57оС - 30 сек., 72оС- 30 сек.

3. 72оС - 5мин

Консенвативные праймеры для амплификации домена D1/D2 гена 26 S р РНК NL-1 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG NL-4 GGTCCGTGTTTCAAGACGG

Режим реакции ПЦР:

1. 95оС - 3мин.

2. 35 циклов

95оС - 30 сек., 52оС - 30 сек., 72оС- 30 сек.

3. 72оС - 5мин

III.2. Секвенирование генов 18S рРНК и 5.8S рРНК, сравнение секвенсов и построение деревьев родства.

Секвенирование проводилось на автоматическом секвенаторе АЕ3000.

Для анализа секвенсов использовалась специализированная компьютерная программа BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast].

Достоверность результатов. Были определены последовательности достаточные для отнесения штамма к определенной таксономической группе микроорганизмов. V. Условия электрофореза ПЦР исследуемых образцов.

1,0% агарозный гель, электрофорез при напряженности электрического поля 5 В/см

Этапы анализа.

а) Секвенирование участков последовательности, кодирующей ген 18S рРНК.

При секвенировании участка ДНК, кодирующего ген 18S рДНК исследуемого штамма, получена следующая последовательность:

GCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGTAAATTGCAGGTTG

GAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTG

AGAGCCCCGTAKCGTGCATGTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGT

TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAG

AGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAG

AGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGAT

TTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGSGCTCTGGGTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGT

TTTCGTTGCAGAATAAGGACAATTGGAATGKGGC

б) Анализ последовательностей гена, кодирующего 18S рРНК. Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 18S рДНК, изучаемого штамма был проведен с помощью сервера BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast]. Результаты.

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующей систематической группе: Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina;

Saccharomycetes; Saccharomycetales; Pichiaceae; Pichia.

Штаммы, принимающие участие в анализе, и уровень сходства последовательности 18 S рДНК изучаемого штамма показаны в таблице:

Description

Pichia kluyveri strain UMY556 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate B-WHX-12-24 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain UCDFST 04-151 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate SFM25 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate SFM24 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate SFM19 26S ribosomal RNA gene,

Ident Accession

cover

100% 99% KP171597.1

100% 99% KJ739840.1

100% 99% MF101741.1

100% 99% MG017566.1

100% 99% MG017565.1

100% 99% MG017560.1

partial sequence

Pichia kluyveri isolate SFM16 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate D5 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Fungal sp. isolate CRYb3 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate PYCC 4997 large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate PYCC 4371 large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri NRRL Y-11519 28S rRNA, partial sequence; from TYPE material

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7275 large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7145 large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7274 large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:1365 large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain LT03 large subunit ribosomal RNA

gene, partial sequence

Pichia kluyveri partial 26S rRNA gene, isolate OK25 Pichia kluyveri strain S1-5 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate FIG1.2 large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain CAB 1268 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain NS9 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate 11/2-104 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain UMY596 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain 13F1A 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain LKC17 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P43C009 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P43C008 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P40A003 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

100% 99% MG017557.1

100% 99% KY296067.1

100% 99% MF281043.1

100% 99% MF788149.1

100% 99% MF536907.1

100% 99% NG 055122.1

100% 99% KY108826.1

100% 99% KY108825.1

100% 99% KY108823.1

100% 99% KY108820.1

100% 99% KU902896.1

100% 99% LT549060.1

100% 99% KU862648.1

100% 99% KT767192.1

100% 99% KR632578.1

100% 99% KM924532.1

100% 99% KT156709.1

100% 99% KP171598.1

100% 99% KP058530.1

100% 99% KJ472904.1

100% 99% JX188203.1

100% 99% JX188201.1

100% 99% JX188199.1

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P25B004 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P01C002 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P01C002 internal transcribed spacer

1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kudriavzevii strain JM3 26S ribosomal RNA gene,

partial sequence

Pichia fermentans strain JNT-2 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain YM25970 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate B-WHX-12-16 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans isolate MG-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans isolate TAFS-2 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain CEC RMab-1-37 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain CEC RCS-0-39 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain CEC WC-0-39 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain CEC RCF-0-36 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain YTQNJ-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain YE-4 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain JE-9 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain JE-5 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain JE-14 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain JE-22 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain ZE-8 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kudriavzevii strain KKUY 0103 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

100% 99% JX188197.1

100% 99% JX188196.1

100% 99% JX188195.1

100% 99% KC510041.1

100% 99% KC783395.1

100% 99% KC494716.1

100% 99% KC544470.1

100% 99% JX848642.1

100% 99% JX848637.1

100% 99% JX103191.1

100% 99% JX103190.1

100% 99% JX103189.1

100% 99% JX103188.1

100% 99% JX049440.1

100% 99% J0771735.1

100% 99% J0771716.1

100% 99% J0771715.1

100% 99% J0771714.1

100% 99% J0771710.1

100% 99% J0771711.1

100% 99% J0690246.1

Pichia kluyveri strain 296 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain PP10 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri partial 28S rRNA gene, strain Y57 Pichia kluyveri var. kluyveri strain NL3 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SS1-5 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SL2-1-3 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SL2-1-2 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain LKS-3 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain LKC-4 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain C2-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri partial 26S rRNA gene Pichia kluyveri partial 26S rRNA gene, isolate H7S1K5 Pichia kluyveri partial 26S rRNA gene, isolate H7S0K2 Pichia kluyveri partial 26S rRNA gene, isolate H1S0K2 Pichia kluyveri strain CBS 1367 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain GU12S24 26S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain N246 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate 845 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SYHZW-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri gene for 26S rRNA, partial sequence, strain: RS75

Pichia kluyveri gene for 26S rRNA, partial sequence, strain: RS19

Pichia kluyveri isolate QHH2 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain 11G-1(2) 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain A11-1-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain M118 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain M144 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain C734 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain C735 26S ribosomal

Query Ident Accession

cover

100% 99% JN544053.1

100% 99% JN004187.1

100% 99% FR870031.1

100% 99% HM191634.1

100% 99% HM123753.1

100% 99% HM123749.1

100% 99% HM123748.1

100% 99% HM123740.1

100% 99% HM123736.1

100% 99% HM123730.1

100% 99% FN667994.1

100% 99% FM180554.1

100% 99% FM180553.1

100% 99% FM180530.1

100% 99% DQ104733.1

100% 99% FJ873561.1

100% 99% EU268643.1

100% 99% FJ649194.1

100% 99% EU809456.1

100% 99% AB438166.1

100% 99% AB438163.1

100% 99% EU642629.1

100% 99% EU441907.1

100% 99% EU386756.1

100% 99% EU386706.1

100% 99% EU386701.1

100% 99% EU373464.1

100% 99% EU368747.1

RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate 9 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate 8 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SYHZ2-4 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri clone GS13F 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain C732 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SYGHZW-2 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain NRRL Y-11519 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri isolate YQYHY 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain 69 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain NX2G 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri var. kluyveri strain GS3X 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia sp. YS 10F partial 26S ribosomal RNA gene, strain YS 10F

Pichia sp. YSF10 partial 26S rRNA gene, isolate YSF10 Pichia kluyveri isolate G130 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri 26S rRNA gene, isolate ESAB8 Candida sp. BG00-10-19-1-7-4 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri 26S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri isolate UECE-559 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain YM26557 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain S1-2Y4B 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P43C008 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

100% 99% EU285498.1

100% 99% EU285497.1

100% 99% EU285539.1

100% 99% EU293168.1

100% 99% EF116919.1

100% 99% EU293421.1

100% 99% EF550251.1

100% 99% EF585435.1

100% 99% EF564420.1

100% 99% EF564399.1

100% 99% EF564382.1

100% 99% AM397862.1

100% 99% AM275339.1

100% 99% DQ466543.1

100% 99% AJ746339.1

100% 99% AY242304.1

100% 99% U75727.1

99% 99% JN676084.1

99% 99% KY463387.1

100% 99% KF738157.1

100% 99% JX188202.1

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97% [2]. Как видно из таблицы, анализируемый штамм можно отнести к нескольким видам.

■»1с1|(}цегу_16]<Ш

Success

asivmycetes | 10 leaves aswmyoeta | X leaves Plchkji fi"nfk^u.11 is i-i)l.il<' MG-1 26S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri stra 1:1 CB' RCF-O-36 26S ritosomal RNA gene. partial sequence asut:nu«-k> | 4 leaves

Pi cilia kluyveri strain P-WIAIWIi* internal traruc Ii:xxl tracer I. partial sequence 5 KS rilH'sotnal RNA gene and internal transcribed spacei 2.complete sequence: and Large snbimil r... Fidiiii kluyveri strain VC-t 2bS rihosonul RNA gene, partial sequence ll. 111.1 kluyveri strain 2% 2bS ribosomal RNA gene, pjrtul sequence Fidiiii kluyveri partial 2HS rRNA gene, strain Yi7

Fidiiii kluyveri viir. kluyveri strain MJ 26S rilwsunul RNA gene. piirtLiI sequence Picliiakluyveri strain LKS-3 265 rihosoittal RNA gene. |>arliiil sequence Rdiii kluyveri partial 26S rRNA gene. Lwibte I ITS IKS Fidii» kluyveri partial 2AS I RNA gene, nuble II7SDK2 Fidiiii kluyveri partial 265 rRNA gene. isolate 111SOK2 Pidiii! kluyveri strain CDS IW7 2+>S ribosomil RNA gene. partial sequence Pidiiakluyveri var. kluyveri »rauiGtll2S242<>S rihosofital RNA gene. partial sequence Rdiii kluyveri isolate H 26S ri bosom al RNA gene, partial sequence Fidiiti kluyveri strain SYHZ2-4 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain SI-2Y4B 26S ribosinml RNA gene, pulial sequence

asevmveetes and fungi |4H leaves lascomycetcs | K leaves

EFLdita kluyverieaLnu$«dleclian CBS:7I4> large suhuiut rilwsomal RNA gene, partial sequence

*PidiLi kluyveri strain P1IIC1WI2 internal transcribed spacer!, |>atlial sequence: 5.HS riht»iorcial RNA gene and internal transcrilied spacer 2. complete sequence: and Large subnnil ribosomal iFidiia kluyveri strain P2iBIXW htenul trailer feed .spacer I. partial sequence; 5 XS ribosomal RNA gene and internal transcribed Spacer 2. complete sequence: and large subunit hbotorml RNAge...

Fidiiii kluyveri strain P43QXW internal train tribe J spacer 1. partial sequence; 5 85 ribosouul RNA gene and i menu I trails, rilied spacer 2. complete sequence: and Luge subunit ribosomal RNA ge... * Fichu kluyveri strain P43CHHI internal transcribed spacer I. patty I sequence; i.8 S ribiMOtml RNA gene and internal transcribed spacer 2. complete sequence; iind Luge subunit ribosomal RNA ge... Ril.u] kluyveri strain P40A003 internal transcrilied spacer ]. partial sequence; 5.BS ribosomal RNA gene and internal transcribed spaoer 2. complete sequence; and large subunit riltosoiml RNA ge...

View port at (0,0) of 1374x480 f^-1

Nodes 201(0 selected ]

Для установления филогенетического родства близких видов был также использован метод сравнения нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген 5,8 S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры и ITS2 [2].

При секвенировании участка ДНК, кодирующего ген 5,8 S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2, получена следующая последовательность:

CCGTATCCTCCKCTTATTGATRTGCGCAGGTTCACCTACGRARTCCTCCGCTTATTGATA TRMTKCARGTTCACYTMSYSCWTCAYCCTCYTTTCGWATAAGGSTAGCCYGTTCTCAA CTCTGCTTGCGCAAGAAGGAACGACGCTSAGACGGCATGCCCCATGGAATACCATGGG GCGCAATGTGCGTTSAAGAACTCGATGATTCACGATGGCTGCCATTCACAMTAGGTAT CGCATTTCGCTGCGCTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCCTTGTTGAAAGTTTT GKTWTGWTAARACTTAGTGACTGGTATTATTACGATTTTAGGTGTTTGATGCGCTCACG CATGTGTATAAATATGATCACAGTTTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGAAGAGGAC Штаммы, принимающие участие в анализе, и уровень сходства последовательности, кодирующей ген 5,8 S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 изучаемого штамма, показаны в таблице:

Description Query ident Accession

cover

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7770 small subunit riboso

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gen75% 93% KY104554.1 spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA g Pichia fermentans 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal gene, internal transcribed 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain F254 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain F230 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain AUMC 11205 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain P11 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:11089 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:11067 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7274 small subunit

75% 93% AY027508.1

76% 93% KY580407.1

76% 93% KY580398.1 75% 93% KY495773.1

75% 93% MF574304.1

75% 93% KY104563.1

75% 93% KY104562.1 75% 93% KY104557.1

75%

93% KY104556.1

75%

75%

75%

92% KY076614.1

92% KF468217.1

92% KY104564.1

75%

92% KY104560.1

ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7908 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence Pichia fermentans isolate IWBT-Y995 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain E223 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; ' and internal transcribed spacer 2, partial sequence Pichia kluyveri culture-collection CBS:1365 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7145 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:188 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed

spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 75% 92% KY104559.1 spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:1367 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed

spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 75% 92% KY104558.1 spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri culture-collection CBS:7275 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia sp. 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence Pichia fermentans strain UniFGPF2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia fermentans strain UniFGPF1 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal

75%

75%

75%

75%

92% KY104555.1

92% KX021899.1

92% KT029805.1

92% KT029804.1

RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri isolate 34 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain YCH1204 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain YH7.16 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence

Pichia kluyveri strain E225 internal transcribed spacer 1, partial

sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and

internal transcribed spacer 2, partial sequence

Pichia kluyveri 18S rRNA gene (partial), ITS1, 5.8S rRNA

gene, ITS2 and 26S rRNA gene (partial), isolate H1S0K2

Pichia fermentans strain YF12b 18S ribosomal RNA gene,

partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal

RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete

sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain F301 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and

28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain F228 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and

28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain F563 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and

28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain PMM10-1033666L isolate ISHAM-

ITS ID MITS2781 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;

internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and

internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S

ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain LL11 070 18S ribosomal RNA gene,

partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S

ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal

transcribed spacer 2, partial sequence

Pichia kluyveri strain F431 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and

28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia kluyveri strain F141 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

76%

92% KT175195.1

76% 92% KM982973.1

75% 92% KF747755.1

75% 92% KF468219.1

75% 92% FM864201.1

75% 92% DQ674358.1

75% 92% KY580405.1

76% 92% KY580400.1

76% 92% KY580390.1

75% 92% KP132502.1

74% 93% KF057561.1

76% 92% KY580403.1

75% 92% KY580401.1

76% 92% KY580393.1

76%

92% KY580391.1

76%

92% KY611839.1

76% 92% KM402064.1

76%

92% KM402063.1

gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain F122 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain F575 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain AUMC 11238 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain UFLA CWFY26 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain UFLA CWFY25 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Pichia fermentans strain YC5.2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain LL11_074 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1 and 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence

Pichia kluyveri strain M149 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia kluyveri strain M148 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia fermentans strain YF01g internal transcribed spacer 1,

partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; 75% 92% DQ659348.1 and internal transcribed spacer 2, partial sequence Pichia kluyveri strain F576 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pichia fermentans isolate NCL137 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence;

75%

92% KF747751.1

74% 93% KF057565.1

75% 92% EF203931.1

76% 92% EF203930.1

75%