Совершенствование методов изготовления и контроля сибиреязвенной преципитирующей сыворотки и стандартного бактерийного антигена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Шморгун, Борис Игоревич

• Шморгун, Борис Игоревич
• кандидат ветеринарных наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Шморгун, Борис Игоревич

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика ВасШия апМгас

2.2. Антигенная структура В. ашИгаая

2.3. Диагностика

2.4. Открытие и практическое использование реакции преципи- 25 тации

2.5. Способы и методы изготовления преципитирующей сибире- 28 язвенной сыворотки

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.1.1. Материалы

3.1.2. Методы

3.2. Разработка методов получения преципитирующей сибире- 41 язвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием культуры вакцинного штамма антракса

3.2.1. Изучение состава термостабильных преципитирующих ан- 41 тигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов

3.2.2. Изучение возможности использования культуры вакцинного 45 штамма антракса для изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки

3.2.3. Изучение активности и специфичности преципитирующей 51 сибиреязвенной сыворотки в процессе хранения

3.2.4. Изучение возможности использования культуры вакцин- 55 ного штамма антракса для изготовления стандартного сиби-реязвенноного бактерийного антигена

3.2.5. Активность и специфичность опытно-промышленных серий 59 антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, изготовленных из культур вакцинных бескапсульных штаммов

ЪА¥г и 55-ВНИИВВиМ

3.2.6. Изучение активности и специфичности стандартного сиби- 63 реязвенного бактерийного антигена в процессе хранения

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование методов изготовления и контроля сибиреязвенной преципитирующей сыворотки и стандартного бактерийного антигена»

Сибирская язва - остро протекающая, особо опасная зоонозная болезнь, к которой наиболее чувствителен крупный рогатый скот, овцы, козы лошади, и другие виды домашних и диких животных. Среди хищников чувствительны к сибирской язве норки, соболя, лисицы клеточного содержания. Слабочувствительны к заражению в естественной среде обитания собаки, кошки, волки и другие виды диких плотоядных.

В настоящее время достигнуто стойкое благополучие поголовья животных России по сибирской язве. Благодаря ежегодным плановым профилактическим мероприятиям, охватывающим все поголовье восприимчивых животных. Поэтому указанная инфекция проявляется в настоящее время только в виде спорадических случаев, число которых имеет постоянную тенденцию к сокращению. На фоне видимого благополучия, в силу биологической специфики возбудителя болезни (длительное переживание в почве и другие), сохраняется постоянная угроза встречи животных и человека с вирулентными формами В. аыкгааз. Поэтому необходимо обладать совершенными средствами и методами диагностики болезни, которые позволяют в возможно короткие сроки и максимально достоверно ставить диагноз и, следовательно, своевременно проводить профилактические и лечебные мероприятия по купированию очагов сибиреязвенной инфекции.

Диагноз на сибирскую язву ставят на основании анализа эпизоотических данных, клинических признаков, и лабораторных исследований. При этом лабораторные исследования имеют решающее значение, поскольку болезнь может протекать без характерных клинических признаков и пато-логоанатомических изменений - при подозрении на сибирскую язву животных не вскрывают. В ветеринарных лабораториях используют следующие диагностические тесты: микроскопия мазков-отпечатков, бактериологические исследования с целью выделения чистых культур и изучения их свойств, идентификация выделенных культур по культуральным и биохимическим свойствам, биопроба на лабораторных животных, серологические исследования.

Одним из основных способов диагностики сибирской язвы остается метод исследования материала в реакции преципитации (реакция Асколи).

На протяжении многих лет исследователи занимались вопросом получения специфичной и активной преципитирующей сыворотки, которая достоверно и в короткий срок выявляла бы кожевенно-меховое сырье и патологический материал, полученные от животных павших при подозрении на сибирскую язву. Необоснованное применение штаммов возбудителя антракса при получении сыворотки приводило к частым неудачам, так как задачу подбора штаммов, использованных при гипериммунизации продуцентов нельзя решить без детального изучения антигенной структуры возбудителя указанной болезни.

В настоящее время по этому вопросу опубликовано много работ отечественных и зарубежных авторов, но сравнительная характеристика антигенной структуры различных штаммов возбудителя сибирской язвы недостаточно изучена. Поэтому подбор новых штаммов для получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе сравнительного изучения антигенной структуры В. аМкгааз является перспективным направлением, имеющим научное и практическое значение.

Цель работы

Разработать способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием одного вакцинного бескапсульного штамма В. аШкгааз, вместо четырёх аттенуированных штаммов, среди которых обязательно присутствие одного капсулогенного; разработать способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма взамен вирулентного, при этом оба препарата по активности и специфичности не должны уступать существующим коммерческим препаратам, изготовленным по стандартной методике.

Задачи исследований:

1. Изучить состав термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов В. ашкгаая в реакции диффузной преципитации и иммуноэлектрофорезе и на основе полученных результатов отобрать новые производственные штаммы с более широким набором специфических антигенов.

2. Установить возможность использования вновь отобранных штаммов для изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

3. Предложить оптимальную схему гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием антигена, изготовленного из одного вакцинного бескапсульного штамма.

4. Изучить активность и специфичность полученной преципитирующей сыворотки в сравнении с коммерческой сывороткой биофабричного производства.

5. Установить возможность замены вирулентного производственного штамма сибирской язвы на вакцинный при промышленном изготовлении стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена.

6. Изучить активность и специфичность полученного антигена в сравнении с коммерческим препаратом биофабричного производства.

7. Определить активность и специфичность преципитирующей сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена в процессе хранения.

Научная новизна. Установлено, что все изученные нами сибиреязвенные штаммы (вирулентные и авирулентные) содержат идентичный термостабильный преципитирующий антиген, соответствующий стандартному сибиреязвенному антигену. Впервые показана возможность получения высокоактивной и специфичной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки при использовании для гипериммунизации продуцентов одного вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ взамен четырёх, используемых ранее, один из которых капсулогенный, а также для получения высокоактивного и специфичного стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма ЪА1?г или 55-ВНИИВВиМ, взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБКг

Практическая значимость. На основании полученных результатов разработан оригинальный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с изменённой схемой гипериммунизации лошадей с использованием в качестве антигена одного вакцинного штамма. Указанный способ изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей»; утвержденной 03.11.1992 Главным управлением ветеринарии Минсельхозпрода РФ. Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 10-, 19.77-89 "Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая", утвержденный ГУВ Госагропрома СССР 05.05.1989.

Предложенная схема гипериммунизации позволила сократить количество инъекций антигена, по сравнению с существующей, за счет отсутствия необходимости создания грундиммунитета у продуцентов и тем самым уменьшить срок иммунизации лошадей на 26-30 дней, что упростило технологию производства и снизило материальные затраты. Кроме того, изъятие из производства капсулогенного сибиреязвенного штамма М-71, обладающего достаточно высоким уровнем вирулентностости, исключает возможность контаминации культурой данного штамма других биопрепаратов, которые изготавливают на тех же биопредприятиях, что и преципитирую-щую сибиреязвенную сыворотку.

Одновременно разработан способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена, который изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного», утверждённой ГУВ государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989 года. Разработанный способ получения антигена исключает из производственного процесса вирулентную сибиреязвенную культуру штамма ЗБКг, заменив её вакцинным штаммом 34р2 или 55 ВНИИВВиМ.

Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 1009-26-89 "Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный", утвержденных ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на:

- Ученых Советах ФГУ ВГНКИ в 1989-1991 годах;

- конференциях молодых ученых ВИЭВ в 1989 г., ФГУ ВГНКИ, ВНИ-ИВВиМв 1990 г.,

- XII Пленарном заседании Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой при Минздраве СССР и Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам в 1990 году (г. Ташкент)

-межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ в 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Зарегистрирован отчет по законченной теме «Разработать и внедрить промышленный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинных бескапсульных штаммов, усовершенствовать методы её контроля», УДК 619:616:98:579.852.1: 615.373:616.9-07, № гос. регистрации 01910034968, Москва ВГНКИ, 1992 год.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты разработки, испытания и внедрения в биологическую промышленность новых способов изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ взамен ранее применяемых 4-х аттенуированных штаммов антракса;

- результаты разработки стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием вакцинного штамма 34¥г или 55-ВНИИВВиМ взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБКг.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика Bacillus anthracis

По современной классификации возбудитель сибирской язвы животных и человека вид Bacillus anthracis принадлежит к классу Schizomycetes, отряду (порядку) Eubacteriales, семейству Bacillaceae, и роду и подроду Bacillus (Колесов С.Г., 1976). Этот род объединяет 48 видов аэробных или факультативно анаэробных бацилл, которые разделены на две группы: в первую включено 22 вида, во вторую - 26 видов. Лучше изучены бациллы первой группы. Наиболее близкие к бацилле антракса по антигенной структуре являются, такие виды: В. cereus, В. anthracoides, В. pseudoanthracis, В. mycoides, В. subtilis и др. Все они сапрофиты, кроме В. cereus, которая синтезирует активный фермент патогенности лецитиназу и способна вызывать пищевые токсикозы (Ипатенко Н.Г., 1996).

Bacillus anthracis - сравнительно крупная палочка (длина - 3,0-10,0 мкм, ширина - 1,0-1,3 мкм), неподвижная, образует капсулы и споры. По Граму красится положительно, но в молодых и старых культурах встречаются грамотрицательные клетки.

В препаратах, приготовленных из крови и тканей, больных или погибших от сибирской язвы животных, неокрашенные бактериальные клетки имеют форму гомогенных прозрачных палочек со слегка закругленными концами. Палочки лежат поодиночке или соединены в короткие цепочки (Колесов С.Г., 1976).

Бациллы, выращенные на плотных или жидких питательных средах, формируют цепочки разной длины. В мазках культур штаммов, давших в жидких питательных средах типичный рост в виде хлопьевидного осадка, палочки чаще располагаются длинными цепочками, а в изготовленных из культур с атипичным диффузным ростом они образуют короткие цепочки, состоящие из 3-5 члеников.

В окрашенных препаратах внутренние концы палочек выглядят обрубленными или слегка вогнутыми, а свободные внешние концы - закругленными.

Бацилла ферментирует с образованием кислоты, но без газа: глюкозу, мальтозу, медленно сбраживают сахарозу, трегалозу, фруктозу и декстрин. Арабинозу, рамнозу, галактозу, лактозу, маннозу, раффинозу, инулин, манит, дульцит, сорбит, инозит не сбраживает. Крахмал гидролизует. Утилизирует цитраты (соли лимонной кислоты), образуют ацетилметидкарбинол и в следствии этого дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра (Коле-сов С.Г., 1976).

Бациллы в организме животного и при культивировании на искусственных питательных средах с большим содержанием нативного белка образуют капсулу.

Капсула имеет несколько слоев. Внутренняя часть ее образована кислыми мукополисахаридами, наружная - мукопептидами и полипептидами (Ипатенко Н.Г., 1996).

Капсула, состоящая из 98 % воды, обладает защитным осмотическим действием против притока большого количества воды в клетку, а также защищает её от различных воздействий среды, в том числе и от иммунных механизмов организма и в частности препятствует фагоцитозу и способствует фиксации бацилл к клеткам макроорганизма.

Капсулу сибиреязвенного микроба составляет поли-Д-глутаминовая кислота, которая является одним из факторов вирулентности В. амИгаая (Бакулов И.А., 2001).

Важнейщим свойством, присущим возбудителю сибирской язвы, является способность образовывать при неблагоприятных условиях споровые формы, обеспечивающие микробу неопределенно длительное сохранение жизнеспособности во внешней среде (почве, придонном иле и других субстратов).

Типичные сибиреязвенные споры сильно преломляют свет; овальной, иногда округлой формы, расположены поодиночке размером 1,2-1,5 '

0,8-1,0 мкм. При образовании споры находятся в центре палочки, не превышая поперечника клетки (Колесов С.Г., 1976).

В сухом остатке вегетативных клеток бацилл содержится 6,80 % азота и 12,00-13,50 % минеральной золы, в сухом остатке спор - соответственно 12,14 и 41,15 %. Клетки сибирской язвы образуют ферменты липазу, диастазу, протеазу, желатиназу, дегидрадазу, цитохромоксидазу, пероксидазу, каталазу, аргиназу и др. (Ипатенко Н.Г., 1996). Споры содержат аланинра-целазу, нуклеозидрибозидазу, аденозиндезаминазу.

Одним из основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis является бинарный трехкомпонентный экзотоксин, который образуется в процессе жизнедеятельности микроба in vivo. Экзотоксин также можно получить in vitro на специальных средах. Его продуцируют как вирулентные, так и авирулентные (бескапсульные) штаммы возбудителя сибирской язвы (Г.В. Дунаев, 1972).

Сибиреязвенный токсин (экзотоксин) состоит из трех отдельных белков - протективного (иммуногенного) антигена (РА, фактор II), летального (LF, фактор III) и отечного (эдематогенного, воспалительного) (EF, фактор I) - факторов с молекулярной массой 85, 83 и 89 кД соответственно. Все три компонента сибиреязвенного экстрацеллюлярного токсина обладают антигенными свойствами и серологически активны (Бакулов И.А., 2001; Т.С. Dixon, 1999).

При изучении химической природы факторов сибиреязвенного токсина было установлено, что II и III факторы являются гетерогенными в молекулярном отношении протеинами, а I фактор - липопротеином (D.C. Fisch, R.E.Lincoln, 1967; A.Buzzell, 1967; M.H.Wilkie, M.K. Ward, 1967; D.C. Fisch et al., 1968). Было установлено, что I фактор содержит 12 % азота, 6,2 % золы, 6,4 % углеводов, 0,7 % фосфора и менее 3 % липидов, соответственно II фактор - 13,9 % азота, 1,6 % золы, 3,7 % глюкозы, 0,2 % фосфора. В очищенном препарате III фактора обнаружено до 90 % протеина, и до 15,1 % азота, 0,2 % золы, меньше 0,5 % глюкозы и 0,05 % фосфора (J. L.

Stanley, К. Sargeant, H. Smith, 1960; J. L. Stanley, H.Smith, 1961; H. Smith, J. L. Stanley, 1962; N.Stamatin, 1964).

С целью выяснения иммуногенности каждого из трёх названных компонентов сибиреязвенного токсина N.Eckert, P.F. Bonventre (1963); V.G.Mahlandt с соавт. (1964) провели экспериментальную работу на морских свинках и крысах. Они установили, что фактор III обладал выраженными иммуногенными свойствами и защищал против заражения спорами возбудителя антракса оба вида животных, а также и против заражения крыс полным комплексом токсина. Фактор II иммунизировал против заражения спорами крыс и морских свинок, но оказался не иммуногенным при заражении токсином крыс. Фактор I не обладал иммунизирующими свойствами, однако с помощью реакции иммунодиффузии в геле в сыворотке крови морских свинок обнаружены антитела, титры которых не превышали 1 :4,1 : 8. Это подтверждается работами Leppla S.H., 2002; Linie S.F., 2004; Reu-veny S„ 2001; Modyeri M., 2003.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Шморгун, Борис Игоревич

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что штаммы сибиреязвенных микроорганизмов: капсульные-вирулентные и бескапсульные-вакцинные обладают общим идентичным термостабильным антигеном, который вступает в реакцию преципитации (реакция Асколи) со специфической сибиреязвенной сывороткой.

2. Разработана, испытана и внедрена в практику схема гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием в качестве антигена вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ.

3. Разработана, испытана и внедрена в практику технология изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе применения бескапсульного вакцинного штамма (55-ВНИИВВиМ или 34¥2).

4. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка и стандартный сибиреязвенный бактерийный антиген, изготовленные по новой технологии, не уступают по активности и специфичности коммерческим образцам указанных препаратов.

5. Активность и специфичность преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного бактерийного антигена, изготовленных с использованием авирулентных вакцинных штаммов, практически не снизилась в процессе их хранения в течении 3,5 лет (срок наблюдения).

6. Замена производственных вирулентных капсульных штаммов на авирулентные вакцинные полностью исключает возможность заражения людей, контаминацию окружающей среды капсульными культурами В. ап-Мгаая и имеет важное социальное, экологическое и экономическое значение.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Предложены способы получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием авирулентных бескапсульных вакцинных штаммов, вместо вирулентных капсулогенных.

Способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием одного вакцинного штамма внедрён на Тобольской биофабрике в 1992 году, и на Орловской биофабрике - с 1994 года, где и используется по настоящее время. Способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена внедрён на Тобольской биофабрике с 1989 года, а на Орловской биофабрике - с 1994 года и используется по настоящее время.

Материалы диссертации использованы при разработке следующей нормативной документации:

- Инструкция по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, утверждена ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989г.

- ТУ 10-09-26-89 Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный, утверждены ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989 г.

- Временная инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена директором ВГНКИ 30.12.1990 г.

- ТУ 10.19.77-89 Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая, утверждены ГУВ Госагропрома СССР 05.05.1989 г.

- Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена ГУВ МСХ и продовольствия РФ 03.11.1992 г.

- Изменения в инструкцию по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждены директором ВГНКИ 30.12.1994 г.

- Извещение №1 об изменении ТУ 10.19.77-89, утверждено директором ВГНКИ 30.12.1994 г.

Заключение

Таким образом, обобщая литературные данные по разработке и использованию преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, можно сделать вывод, что на протяжении многих лет различные исследователи занимались вопросами совершенствования методов получения специфичной и активной преципитирующей сыворотки, которая достоверно и в короткий срок выявляла бы кожевенно-меховое сырье и патологический материал, полученные от животных павших при подозрении на сибирскую язву. Преципитирую-щая сибиреязвенная сыворотка, которая готовилась в период с 1927 по 1941 годы путем гипериммунизации лошадей антигеном из матрикса 1-ой вакцины Ценковского, обладала недостаточным уровнем специфичности.

С 1941 по 1953 годы преципитирующую сибиреязвенную сыворотку готовили с использованием для гипериммунизации лошадей вирулентных культур В. апШгаав, обезвреженных формалином (метод Н.М. Никифоровой и М.И. Ананьева). Недостатком этого метода являлись длительность процесса гипериммунизации и повышенная реактивность лошадей на вводимые им сибиреязвенные формолкультуры. При этом нередко имели место случаи гибели животных в процессе гипериммунизации, а также сохранялась опасность заражения работников производства и окружающей среды. При этом получаемая сыворотка была недостаточно активной.

Начиная с 1952 по 1991 годы, биофабрики готовили преципитирующую сибиреязвенную сыворотку путем гипериммунизации лошадей живыми слабовирулентными и иммуногенными культурами штаммов сибирской язвы (метод С.Г. Колесова и В.Н. Грачева). Недостатком этого метода являлся небольшой срок использования лошадей (из-за отхода), длительный период процесса гипериммунизации необходимость грундиммунизации, а также использование капсульного сибиреязвенного штамма М-71 (вторая вакцина Ценковского), создающего угрозу контаминации живых противо-сибиреязвенных вакцин, которые, как правило, готовятся на тех же биопредприятиях, что и сибиреязвенные диагностические и лечебные сыворотки и глобулины. Все это и послужило предпосылкой к проведению исследований в направлении использования вакцинных бескапсульных сибиреязвенных штаммов, а возможно одного штамма для использования его в качестве антигена при гипериммунизации лошадей-продуцентов с целью получения активной и специфичной преципитирующей сыворотки для постановки реакции Асколи и стандартного бактерийного антигена, что в случае удачи полностью освобождало сывороточное производство от использования капсулогенных и вирулентных штаммов В. атЬгаЫз.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

Исследования выполнены согласно плану НИР ВГНКИ в период с 1988-1993 гг. в ФГУ ВГНКИ и на Тобольской биофабрике.

3.1.1. Материалы

Сибиреязвенные штаммы: вирулентные - ЗБКг, Коломна, Тула, 4-7, №17, 34, 37, 46, 47, 76, 81, 228, 230, 231, 243, 253, 362, 833, 992, 1051/35, 1159, 1168, 2555/18, 2781, 3305; вакцинные - СТИ-1, 34Р2, 55-ВНИИВВиМ, Шуя-15, 94, 916-1, Ихтиман, М-71 (матрикс 2-ой вакцины Ценковского).

Ложносибиреязвенные штаммы: В. ап1кгасо1йе8 № 1213, В. megaterium № 182, В. яиЫШз №6633, В. рБеийоапШгааз №104, В. теБеШеп-сш № 66, В. сегеиз №8035.

Растворы: 0,9 % раствор хлористого натрия (физиологический) с рН 7,2-7,4; 10 % раствор лимоннокислого натрия; 5 % раствор хлорамина; 5 % раствор фенола; 30 % раствор хлористого кальция; фосфатный буферный раствор с ионной силой 0,1.

Питательные среды: 2 % мясо-пептонный агар (МПА); агар Дифко; агар Сабуро; мясо-пептонный бульон (МПБ) с рН 7,2-7,4; мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом. Гороховый агар, используемый для получения биомассы сибиреязвенных культур (антигенов) при изготовлении сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, который готовили по следующей прописи: 1 кг спелого гороха вымачивали в водопроводной воде в течение 18 часов. Вымоченный горох заливали десятью литрами дистиллированной воды, добавляли 50 г хлористого натрия и варили 1,5-2,0 часа до размягчения гороха. Затем полученный отвар доводили до исходного объёма дистиллированной водой, устанавливали рН 7,7-7,8, фильтровали через лавсановую ткань и добавляли 3 % агар-агара. Полученный гороховый агар фильтровали через ватно-марлевый фильтр, разливали в стеклянные бутыли-четверти по 400-500 см , стерилизовали при температуре 120 °С в течение 30 минут, затем использовали для выращивания сибиреязвенных культур.

Препараты. Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный 1975 год выпуска, серии №№: 6-8; 1983 г., серии №№: 8, 17-19, 21-23, 25, 26, 28; 1985 г., серии №№: 23, 24, 26, 30, 31, 34-36, 39,41^3,45, 46,48, 50, 51, 5356, 61, 62, 64, 67, 68, 78, 79; 1986 г., серии №№: 1, 2, 4-6, 8-10, 12- 15, 19, 21, 22, 24, 56, 70; 1987 г., серии №№>: 26-28, 30-38, 47; 1988 г., серии №№: 20, 33, 39-59; 1989 г., серии №№: 25, 30, 35; 1990 г., серии №№: 18-20, 27, 30, 32; 1991 г., серии №№: 61-65.

Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая 1983 года выпуска серии №№: 8, 17-23, 25, 26, 28; 1984 г., серии №№: 23, 24, 26, 30, 31, 34-36, 39,41-43, 45, 46, 48, 50, 51; 1985 г., серии №№: 51, 53-56, 61, 62, 64, 67, 68, 78, 79; 1986 г., серии №№: 1, 2, 4 - 6, 8 - 10, 12 - 15, 19, 21, 22, 24, 56, 70; 1987 г., серии №№: 26 - 28, 30 - 38, 47; 1988 г., серии №№: 20, 33, 39 - 59; 1989 г., серии №№: 25, 30, 35; 1991 г., серии №№: 40,46, 50.

Использовали антигены, приготовленные из высушенных паренхиматозных органов животных, павших от сибирской язвы; антигены из сухих кож животных (лошадей, крупного рогатого скота, овец, коз, кроликов), павших от сибирской язвы и приготовленные из пресносухих кож здоровых животных, а также антигены из микробных клеток Вас. ап1кгасо1йв8, Вас. рзеийоаМкгаЫз.

Приборы и оборудование. Микроскоп биологический световой по ГОСТ 8284-78, аппарат для иммуноэлектрофореза фирмы ЬКВ, потенциометр типа рН - 340, центрифуга Т-24 (ГДР) с частотой вращения до 5000 g, термостат с температурой (37±1) °С, холодильники с температурой (4±2) °С и (-35 ± 5) °С, автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75, торзионные весы типаВ-801.

Животные. Лошади в возрасте от 3 до 6 лет массой не ниже 350 кг -30 голов, кролики массой 2,5-3,0 кг - 106 голов.

3.1.2. Методы

Изготовление антигенов для гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сыворотки.

Вегетативные культуры сибиреязвенных штаммов выращивали на гороховом агаре в термостате при температуре (37±1) °С в течение 20-22 ч. Смывали физиологическим раствором, доводили концентрацию микробных тел до 2,0-3,0 млрд в 1 см по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Полученный антиген (вегетативную культуру) проверяли на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, типичность морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Для этого на обезжиренных предметных стеклах делали мазки микробных культур, высушивали, фиксировали в течение 15 мин в спирт-эфире, окрашивали по Граму, просматривали под микроскопом.

После этого высевали микробные культуры в МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, на МПА, агар Сабуро. Посевы инкубировали при температуре (37±1) °С (на агаре Сабуро - при 20-24 °С) в течение 10 суток.

При наличии в мазках типичной грамполсшгельной культуры, состоящей из крупных палочек и цепочек, типичного роста в МПБ в виде рыхлого белого осадка на дне пробирки без помутнения бульона, на МПА и агаре Сабуро в виде серовато-белых колоний с серебристым оттенком К и Ю-форм, при отсутствии роста анаэробных культур в МППБ под вазелиновым маслом, сибиреязвенную культуру использовали для гипериммунизации лошадей.

Гипериммунизация лошадей сибиреязвенным антигеном.

Для создания грундиммунитета лошадей внутрикожно и подкожно иммунизировали споровой культурой штамма М-71 в нарастающих дозах

3 ^ от 0,3 до 20,0 см , с концентрацией 1,0 млрд. микр. клеток в см . Интервал между первой и второй инъекциями антигена - 8 суток, между последующими - 3-4 дня.

Антиген из вакцинных штаммов лошадям вводили внутривенно в нао растающих дозах от 5,0 до 70 см , с концентрацией 2,0-3,0 млрд. микр. клео ток в см соответствующих вегетативных культур штаммов В. аШкгаыБ. Интервал между инъекциями - 3-4 дня.

Получение сибиреязвенной преципитирующей сыворотки.

Сыворотку от лошадей по окончании периода гипериммунизации (через 8-10 суток после введения последней дозы антигена) получали по следующей методике: лошадей перед взятием крови, предварительно выдерживали 12 часов на голодной диете, не ограничивая водопой. Затем животных термометрировали, и от имеющих нормальную температуру брали кровь из расчета 8,0 см на 1 кг массы продуцента в первое крововзятие и 14,0-16,0 см в последующие кровь собирали в градуированные стеклянные баллоны емкостью 15-20 литров. Сыворотку получали цитратным методом, используя стерильный 10 % раствор лимоннокислого натрия с последующим сепарированием для отделения форменных элементов крови и дефиб-ринацией плазмы. 1

Раствор 10 % лимоннокислого натрия добавляли из расчета 34,0 см на 1 л крови. Внутреннюю поверхность баллонов увлажняли этим раствором так, чтобы в баллоне не оставалось следов конденсационной влаги. Во время взятия крови раствор лимоннокислого натрия перемешивали с кровью круговыми движениями баллона 2-3 раза за период крововзятия.

По окончании крововзятия содержимое баллона осторожно перемешивали и подсоединяли баллон к вакуумной системе для перекачки крови в приемные бачки сепараторного отделения, откуда кровь поступала в сепаратор. Когда сепараторный баллон наполнялся десятью литрами цитратной крови, запускали сепаратор. После того, как скорость вращения барабана достигала 4000§ (обычно через 2-3 мин после включения сепаратора), открывали кран бачка, из которого кровь поступала в приемник сепаратора.

Из сепаратора отделившуюся плазму перекачивали в дефибринатор и для превращения фибриногена в фибрин к ней добавляли 30 %-ный раствор химически чистого хлористого кальция из расчета 1,3 см3 на 1 л плазмы.

Раствор хлористого кальция готовили в 3-х литровых бутылях. Дефибри-нацию плазмы проводили в 600-литровых дефибринаторах с электрическим приводом на мешалку, делающую поочередно по 8 оборотов то в одну, то в другую сторону в течение одной минуты. Дефибринация заканчивалась обычно за 35-45 мин.

Полноту перехода фибриногена в фибрин определяли по следующей методике: в пробирку наливали 7,0-9,0 см испытуемой сыворотки и добавляли 5,0-6,0 см3 насыщенного раствора хлористого натрия, смесь тщательно перемешивали и оставляли на 5-10 мин в покое. Прозрачность смеси являлась показателем достаточно полного перехода фибриногена в фибрин.

Перед окончанием дефибринации плазму подвергали консервированию 0,5 %-ным раствором химически чистого фенола из расчета 100,0 см 5 %-ного раствора фенола на 900,0 см3 плазмы при постоянном перемешивании. После перемешивания сыворотку вместе с фибрином оставляли в де-фибринаторе на 18-20 часов, охлаждая до 12-16 °С. По истечении этого времени сыворотку перекачивали по трубопроводу через нижний кран в отстойник, где она выдерживалась в течение 2-х месяцев при температуре 612 °С, после чего отстоявшаяся сыворотка по трубопроводу поступала для грубой фильтрации. На следующий день сыворотка по трубопроводу (при давлении не более 0,5 атм) поступала на стерилизующую фильтрацию. Стерильная сыворотка накапливалась в баллоне-сборнике, из которого производилась расфасовка в стерильные флаконы. Флаконы над пламенем закрывали стерильными резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Изготовление антигенов из бактериальной массы для использования в реакции преципитации Асколи.

Культуры сибиреязвенных и ложносибиреязвенных штаммов выращивали на МПА в матровых колбах в течение 18-20 ч при температуре (37±1) °С. Бактериальную массу каждого штамма снимали с агара шпателем и высушивали при температуре (37±1) °С до постоянного веса.

После этого высушенную бактериальную массу растирали в фарфоровой ступке в условиях стерильного бокса и полученный порошок переносили в бутыли и заливали его физиологическим раствором из расчета 1:3000 - 1:5000. Экстрагирование проводили 24-48 ч при температуре (40±2) °С, затем фильтровали через асбестовую вату, фасовали в ампулы по 1 см , запаивали и автоклавировали 30 мин при температуре 120 °С.

Изготовление антигенов из кожи и органов животных для реакции преципитации Асколи.

Измельченные сухие кусочки кожи и органов (по 1-2 г) растирали в ступке с песком, переносили в цилиндр и заливали физиологическим раствором (с 0,3 % кристаллического фенола) в соотношении 1:10 и экстрагировали 18-24 ч при температуре (20±2) °С.

Затем проводили фильтрацию через асбестовую вату и полученные экстракты расфасовывали в ампулы по 1 см , запаивали и автоклавировали в течение 30 мин при температуре 120 °С.

Постановка реакции преципитации по Асколи.

В уленгутовскую пробирку наливали 0,2-0,3 см прозрачной преци-питирующей сыворотки. Если сыворотка оказывалась мутной, то ее предварительно фильтровали через асбестовую вату. Затем тонкой пастеровской пипеткой наслаивали (или подслаивали) равное количество исследуемого антигена (бактерийного, кожного или из органов), так, чтобы не перемешать компоненты и была четко выражена граница между ними.

Реакция считалась положительной, если на границе между компонентами в течение 2 мин появлялось тонкое беловатое кольцо преципитации, которое при покачивании пробирки хорошо видно.

Постановка реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле.

Реакцию ставили по методу Оухтерлони (1949), используя оборудование фирмы ЬКВ. В качестве геля применяли 1 %-ный агар Дифко, который готовили на физиологическом растворе. В специально подготовленные лунки закапывали (по 2-3 раза) компоненты реакции (дезинтеграты-антигены и сыворотки). После внесения компонентов иммунодиффузию

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА ^ проводили в специальной влажной камере при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 24, 48 и 72 часа после последнего внесения компонентов в лунки. Линия преципитации проявлялась достаточно четко уже через 24 часа. Линии идентичных серологических систем сливались, неидентичных - перекрещивались.

Постановка иммуноэлектрофореза (ИЭФ).

Реакцию ставили по методу Грабара и Уильямса (1953) на досках фирмы ЬКВ. Для постановки использовали 1 %-ный агар Дифко, приготовленный на фосфатном буферном растворе и ионной силой 0,1. В специально подготовленные лунки вносили примерно по 2 мкл дезинтегратов (антигенов) из исследуемых штаммов. После электрофоретического разделения белков (в течение 2 ч) в продольную канавку, прорезанную в агаре, вносили по 0,05 см сыворотки, полученной с использованием дезинтегратов из исследуемых штаммов. Иммунодиффузия проходила в течение 24 часов во влажной камере.

После иммунодиффузии в течение 3 суток проводили иллюирование белков, которые не участвовали в преципитации. Затем пластинки с гелем накрывали фильтровальной бумагой и высушивали в термостате при температуре (37±1) °С. Для окраски белков применяли амидо черный 10В. Полосы преципитации после окраски довольно четко видны в зависимости от используемого дезинтеграта штамма.

3.2. Разработка методов получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием культуры вакцинного штамма антракса

3.2.1. Изучение состава термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов

При изучении состава преципитиногенов у штаммов В. аШкгааБ нас интересовало также количественное их содержание у каждого штамма. Для определения состава преципитиногенов мы изучали их способность стимулировать образование антител в организме кроликов и реагировать с гомологичными антителами in vitro в РДП и иммуноэлектрофорезе. В качестве антигенов в РДП и иммуноэлектрофорезе использовали культуры штаммов В. anthracis, выращенные и обработанные для РП, дезинтеграты культур, а также коммерческий сибиреязвенный бактерийный стандартный антиген.

С целью получения сывороток для РДП и иммуноэлектрофореза мы гипериммунизировали кроликов приготовленными антигенами (микробные дезинтеграты штаммов М-71, СТИ-1, 34F2, Шуя-15, 55-ВНИИВВиМ). Дезинтеграты микробных клеток получали по методу A.A. Маничева 1983. Для этого культуру каждого штамма выращивали на МПА при температуре (37±1) °С в течение 16-20 ч, смывали и центрифугировали трехкратно в физиологическом растворе по 40 мин при 10000g для отмывки от питательной среды. После этого разводили осадок физиологическим раствором до концентрации 20,0 млрд микробных клеток в 1 см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Микробные клетки, содержащиеся в полученной суспензии, разрушали путём пятикратного замораживания при температуре (-35±5) °С и оттаивания при температуре (37±1) °С. Степень полного разрушения клеток контролировали с помощью светового микроскопа и высевов дезинтеграта на МПА. Посевы должны оставаться стерильными. В 1 см получаемого дезинтеграта содержалось 10-15 мг белка.

Полученные антигены (дезинтеграты) вводили кроликам подкожно в а нарастающих дозах: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 см . Интервал между инъекциями составлял 4-6 суток. Через 7-9 суток после последнего введения антигена кроликов обескровливали и получали сыворотку.

С целью систематизации полученных данных полосы преципитации и соответствующие им антигены условно обозначали буквами А, Б, В, Г, Д, Е, Ж. В таблице 1 отражены результаты постановки РДП и иммуноэлектрофореза.

Из данных таблицы 1 видно, что в РДП микробные дезинтеграты формировали с сыворотками от 4-х до 6-ти полос. Наиболее точно это было установлено с помощью иммуноэлектрофореза, так как в нем разделение компонентов реакции происходит в зависимости от электрофоретической подвижности, а в РДП пассивно.

С помощью иммуноэлектрофореза было установлено, что все изученные сибиреязвенные штаммы различаются по антигенному составу, но обладают преципитиногенами Б, В, Д, Е, Ж. Антиген А содержат все штаммы, кроме 34?2. Антиген В штаммы СТИ-1, Шуя-15, 34?2 содержат в незначительном количестве. Антиген Г выявлен у штаммов СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ. У штамма 55-ВНИИВВиМ полоса преципитации Г формируется в реакции только с неразведённым дезинтегратом, т.е. антиген Г у штамма 55 содержится в незначительном количестве.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Шморгун, Борис Игоревич, 2007 год

1. Абдуллин Х.Х. Сравнительное изучение полисахаридного гап-тена у сибиреязвенного вируса, вакцин Ценковского, Ланге и СТИ // Уч. записки КВИ. 1952. - Т. 59 - С. 17-21.

2. Аллергическая диагностика сибирской язвы и бациллоносительство у сельскохозяйственных животных / Х.Х. Абдуллин, A.M. Алимов, Н.С, Садыков, Д.Ш. Ахмеров // Реферативный журнал Ветеринария. 1983. - №5. - С. 25-27.

3. Агульник М.А., Расовская Р.И. Влияние мокрого и сухого соления кож на показания реакции преципитации по методу Асколи // Дезинфекция и исследование техживсырья. Изд. ВАСХНИЛ. 1937, Т.1.-С. 127-131.

4. Алексеев С.А. Получение преципитирующей сибиреязвенной сыворотки // Архив вет. Наук, 1930, №26. с. 24-26.

5. Алексеев С.А. Преципитация как диагностикум в ветеринарной медицине. Опыт получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки. Анализ процесса образования преципитинов // АВН 1912, № 8. - с. 18-22.

6. Аристовский В.М., Минкевич И.Е., Фрид С.М. Реакция преципитации // Микробиология. М., 1949. - С. 98-122.

7. Ахмеров Д.Ш. Изучение эпизоотических особенностей сибирской язвы у сельскохозяйственных животных / Д.Ш. Ахмеров, Р.Н. Ни-замов, Н.С. Садыков // Актуальные проблемы животноводства. Казань, 1983.-С. 9-10.

8. Ахмеров Д.Ш. Разработка и усовершенствование методов диагностики сибирской язвы / Д.Ш. Ахмеров, А.К. Галиуллин, Р.Н. Низа-мов // Отчет о НИР. Казань, 1983. - С. 35- 46.

9. Бакулов И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении "старой" болезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, В.В. Селиве-стров. Владимир: Посад, 2001. - 284 с.

10. Беззубец С.К. Получение преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и ее применение // Труды 1-го Всероссийского вет. научно-организационного съезда. М., 1927, т. 1.-е. 133-140.

11. Беззубец С.К. О приготовлении экстрактов из сибиреязвенных кож для реакции преципитации // Практическая ветеринария и коневодство. 1927, № 9 - с. 11-13.

12. Беззубец C.K. Получение преципитирующей сыворотки и её применение // Вестник современной ветеринарии. 1930. - №3-4. - С. 30-37.

13. Беззубец С.К., Воскресенский В.Т. Методика получения строго специфичной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки // Советская ветеринария. 1932, № 19-20. - с. 17-21.

14. Белова Е.В. Моноклональные антитела к протективному антигену Вас. anthracis / E.B. Белова, С.А. Дубилей, Т.Б. Кравченко // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004. - №3. - С. 21.

15. Борисович Ю.Ф. Культурально-морфологические и биологические свойства измененных микробов сибирской язвы // Труды ВГНКИ. 1953. - Т. 4.-С. 203.

16. Гинсбург H.H. Фагоцитоз разных штаммов // ЖМЭИ. 1963, №11.-с. 3-7.

17. Гинсбург H.H. Дальнейшее развитие учения о сибирской язве // Антракс. Кишинёв, 1964. - С.4.

18. Гинсбург H.H. Фагоцитоз разных штаммов // ЖМЭИ. 1966. -№ 1. - С. 125-129.

19. Грачев В.Н. Гипериммунизация и экспулуатация лошадей при получении преципитирующей сыворотки в процессе гипериммунизации // Науч. труды ГНКИ. 1955, т. 5 - с. 40-46.

20. Грачев В.Н. Степень нарастания титра преципитированной сибиреязвенной сыворотки в процессе гипериммунизации // Науч. труды ГНКИ- 1952, т.З-с. 170-172.

21. Губарев Е.М. Химические основы вирулентности и патогенно-сти микроорганизмов. Успехи современной биологии // ЖМЭИ. 1964. - № 6. - С. 4-6.

22. Дальнейшее изучение в эксперименте эффективности химической сибиреязвенной вакцины / Н.И. Александров, Н.Е. Гефен, Ю.С. Воронин, Ю.В. Езепчук и др. // ЖМЭИ. 1964. - № 8. - С. 45-50.

23. Дунаев Г.В. Изучение иммунологической активности депонированной абациллярной сибиреязвенной вакцины / Г.В. Дунаев, Е.В. Назаренко, С.А. Сомова // Борьба с болезнями сельхоз. животных. -Киев, 1963.-т. 1.-С. 39-40.

24. Дунаев Г.В. Изучение протективного антигена и цитологии бациллы антракса в процессе токсиногенеза: Автореф. дис. .д-ра мед. наук. Харьков, 1972. - 54 с.

25. Езепчук Ю.В. Исследования по получению внеклеточного защитного сибиреязвенного антигена: Автореф. дис. . канд. вет. наук; -Ленинград, 1961. 24 с.

26. Зайцев М.Г. Реакция преципитации и практическое ее применение для определения фальсификации мяса // Уч. Записки КВИ. Казань. - 1953, т. 18. -С.4.

27. Златогоров С.О. Учение о микроорганизмах. М. - 1918.-е.96.

28. Кац Л.Н. Цитологическое и цитохимическое исследование капсулы и оболочки клетки Вас. anthracis II Микробиология. 1964. -Т. 23.-С. 836-843.

29. Кивалкина В.П. Зависимость между вирулентностью и энергией размножения у различных штаммов сибиреязвенных бацилл // Уч. Записки КВИ. Казань, 1952. - Т. 59. - С. 33-34.

30. Коляков Я.Е. Ветеринарная микробиология. М. - 1952. - с.217

31. Колесов С.Г. Метод получения активной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и использование ее в широкой практике // Ветеринария. 1955, № 5. - с. 17-19.

32. Колесов С.Г., Грачев В.Н. Получение преципитирующей сибиреязвенной сыворотки методом гипериммунизации лошадей живой культурой сибирской язвы // Труды ВГНКИ. 1955, т. 5. - с. 76.

33. Колесов С. Г. Сибирская язва. М.: Колос, 1976. - 228 с.

34. Колесов С.Г. Совершенствование сибиреязвенных и листери-озных биопрепаратов // Труды ВГНКИ. 1976. - т. 22-23. - с. 37-42.

35. Конышев Р.В., Пеннер Я.Я. Физико-химические факторы в реакции преципитации по способу Асколи // Труды Северо-Кавказского научно-исслед. вет. профилактич. ин-та. Пятигорск - 1932, № 1. - с. 40.

36. Кудрявцев Г.А., Роланов Д.С. Гипериммунизация лошадей по внутрикожному способу профессора Безредко // Вет. Дело. 1926, №11-12. - с.66-69.

37. Кузин A.M. Химия и биология патогенных микробов. // М. Медгиз. 1946. - с.96.

38. Кузьмин H.A. К вопросу об антигенах оболочки Вас. anthracis II Научн. тр. MB А. 1972. - Т. 61. - С. 122-124.

39. Кузьмин H.A. Некоторые данные о соматических антигенах Вас. anthracis IIЖМЭИ. 1971. - №2. - С. 131-137.

40. Кузьмин H.A. Об антигенных связях возбудителя сибирской язвы и сапрофитных аэробных бацилл // Сб. сибирская язва в СССР и перспективы ее ликвидации. М. - 1968. - С. 67-68.

41. Левенберг И.Г. Работа Московской Асколевской лаборатории// Советская ветеринария. 1930, № 19-20. - с. 14-16.

42. Левина E.H. Антигенная и фаговая специфичность патогенных бактерий (люминесцентно-серологические, иммунологические и имму-ноцитохимические исследования): Автореф. дис. . докт. мед. наук. -М., 1967. 53 с.

43. Левина E.H., Кац Л.Н. Антигенная структура вакцинного штамма Вас. anthracis // ЖМЭИ. 1964. - №10. - С. 85-89.

44. Левина E.H., Кац Л.Н. Изучение антигенов Вас. anthracis и Bac.cereus с помощью люминисцентного, серологического и цитохимического методов исследования // ЖМЭИ. 1966. - № 4. - С. 98.

45. Левитов Н.П. Глобулины и альбумины преципитирующей сибиреязвенной сыворотки // Практическая ветеринария. 1928, № 11. -с.13-14.

46. Левитов Н.П. Неспецифические реакции при исследовании кож на сибирскую язву по Асколи и их устранение в свете устойчивости глобулинов в коллоидных растворах. // Практическая ветеринария. 1929, № 11-12.-с. 17-20.

47. Левитов Н.П. Температурная кривая, время появления бацилл и преципитиногена в крови животных, зараженных антраксом // Вет-специалист на соцстройке. 1931, № 11. - с. 7-10.

48. Липатов Г.И., Расовская Р.И. Исследование мороженного кожсырья // Советская ветеринария. 1940, № 11-12. - с. 24-25.

49. Липатов Г.И. Об исследовании сибиреязвенного кожсырья реакцией преципитации / Дисс. на соиск. канд. вет. наук // М. 1947. - с. 240.

50. Машков A.B., Бодиско В.П. Антигенные свойства в капсуль-ной и бескапсульной формах и диагностическое значение соответствующих им сывороток // Тез. Науч. Работ / Моск. науч.-иссл. ин-т вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. М., 1958. - Т.11. - С. 77-79.

51. Машков A.B. Антигенные свойства сибиреязвенных культур в капсульной и бескапсульной формах и диагностическое значение соответствующих им сывороток // Тезисы докладов / Моск. науч.-иссл. ин-т вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. М., 1956. - С. 98.

52. Машков A.B. Живая сибиреязвенная вакцина // Профилактика инфекций живыми вакцинами. М., i960 - С. 324.

53. Мерчина C.B. Изучение антигенной структуры В. anthracis и В. cereus / C.B. Мерчина, В.А. Русалеев, Т.А. Елантьева // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции. Ульяновск. -2003.-С. 249-250.

54. Мерчина C.B. Классификация и таксономия двух видов В. anthracis и В. cereus / C.B. Мерчина, В.А. Русалеев, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. 2002. -№8. - С. 12-15.

55. Никифорова Н.М. Определение степени активности и специфичности преципитирующих сибиреязвенных сывороток // Дифференциация и исследование техживсырья. М, 1937. - С. 241.

56. Никифорова Н.М., Ананьев М.И. Получение преципитирующих сибиреязвенных сывороток // Отчет о НИР/ГНКИ. 1947. - с. 3945.

57. Никифорова Н.М., Коппа Э.К. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка // Биопрепараты для сельскохозяйственных животных. М., 1935. с. 280-298.

58. Петровская В.Г. Полипептиды капсульного антигена, вирулентность микроба // Проблема вирулентности бактерий. Ленинград, 1967.-С. 24-26.

59. Подкопаев В.П. О неспецифических показаниях реакции Ас-коли при исследовании кож на сибирскую язву // Вестник современной ветеринарии, 1929, №5-6.

60. Покшишевский H.A. Преципитация, как метод диагностики зараженности сибиреязвенных кож и сырья // Практическая ветеринария и коневодство, 1929, № 8.

61. Радкевич Д.А. Получение преципитирующей сибиреязвенной сыворотки для термопреципитации по Асколи // Вестник современной ветеринарии, 1925, № 1.

62. Расовская Р.И. Исследование сырых животных продуктов по методу Асколи // Брошюра, 1934.

63. Расовская Р.И. Обзор литературы о преципитирующей сибиреязвенной сыворотке // Агротехзнание, 1934 г.

64. Расовская Р.И., Поляков A.A., Терентьев Ф.А. и др. Комиссионная проверка исследования мокросоленого кожсырья на сибирскую язву // Дезинфекция и исследование техживсырья, 1937.

65. Рево М.В. Материалы по изучению агрессивной функции антигенных фракций Вас. anthracis II Ученые записки КВИ. 1939. - Т. 51,.-Вып. 2. - С. 3-8.

66. Рево M.B. Антигенная структура сибиреязвенной бациллы и ее иммунологическое значение (Автореферат) // Ученые записки КВИ. -1940.-Т. 52.-Вып. 1.-С. 91-115.

67. Рево М.В. Антигенная структура сибиреязвенной бациллы и ее иммунологическое значение (Автореферат) // Казанский мед. Журнал. -1940, №6. -С. 61.

68. Розенберг P.M., Романов Д.С. Метод получения преципити-рующей сибиреязвенной сыворотки высокого титра и диагностика антракса с помощью их. // Труды 2-го съезда научных и практических ветработников Украины, 1927.

69. Руженцев Д.С. Термопреципитация по Асколи при исследовании на сибирскую язву животного сырья // Практическая ветеринария. -1927.-№8.-С. 18-25.

70. Свинцов П.М. Опыт очищения сибиреязвенной сыворотки от гетеропреципитинов методом истощения для асколизации // Советская ветеринария. 1938. - № 11. - С. 15-17.

71. Селянинов Ю.О. Оценка экспрессии протективного антигена вакцинными штаммами В. anthracis / Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова, A.A. Стрижаков // Труды международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ. Покров, 2003. - С. 228.

72. Серологическое родство возбудителя сибирской язвы с некоторыми спорообразующими аэробными микробами / В.В. Акимович, Н.С. Гончарова, И.Н. Земцова и др.// Специфическая профилактика особо опасных инфекций. М., 1964. - С. 226-236.

73. Сибирская язва сельскохозяйственных животных / Н.Г. Ипа-тенко, В.А. Седов, B.C. Зелепукин. М.: Агропромиздат, 1987. - с. 114115.

74. Сибирская язва / Н.Г. Ипатенко, В.А. Гаврилов, B.C. Зелепукин и др. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1996. - 335 с.

75. Сухорецкий B.C. О серологической дифференциации бацилл сибирской язвы от антрокоидов. / Учен. Записки Витебского ветинсти-тута. 1952.-т. XI.-С. 42-47.

76. Сухорецкий Б.С. Зависимость реакции преципитации от концентрации антигена в экстракте / Уч. записки Витебского ветинститута. 1956. - т. XIV. - вып. 1. - С. 37-42.

77. Шляхов Э.Н. Получение и изучение в эксперименте препарата для аллергической реакции при сибирской язве // Тез. докл. науч. конф. по штаммам, стандартам и диагностическим препаратам. М„ 1957. -С. 53-55.

78. Шляхов Э.Н. Эпидимиология, диагностика и профилактика сибирской язвы. Кишинев, 1960. - 125 с.

79. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Химический антраксин: Некоторые биологические, биохимические и иммунологические данные // Антракс. Кишинев, 1964. - С. 97-116.

80. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Химический антраксин (принципы получения, биологические свойства) // Антигены микроорганизмов и ответная реакция. Кишинев, 1962. - С. 8-10.

81. Шляхов Э. Н., Груз Е. В., Присакарь В. И. Сибирская язва // Кишинев, 1975.-С. 162.

82. Anthrax / Т.С. Dixon, М. Meselson, J. Guillemin et al. // N. Engl. J. Med. 1999. - Vol. 341. - № 11. -P. 815-826.

83. Ascoli A. Die Präzipitiondiagnose bei Milzbrand // Zbl. Bact. I. Abt. Orig.-1911.-58. -S. 63-70.

84. Ascoli A. Zur Technie meiner Prazipitinreaktion zur Milzbranddiagnose Berl. Tier.arztl. Woch. 1911, № 22. - S. 385.

85. Ascoli A., Valenti. Biologische Milzbranddiagnose.// Zeitschr. F. Hyg.u. Infectionskrankh der Haustiere, 1910, Bd VII, H 5/6. S. 378.

86. Ascoli A. Die Prazipitindiagnose bei Mibzbrand // Centralbl. Bact. Parasit. Infeckt. 1911. -58. - S. 63-70.

87. Baba T. Studies on the immunospecific and nonspecific substances of Bacillus anthracis. I. The preparation of on antigenis polisacharide from the heatcol cell extract of the B. anthracis II Jap. J. Bact. 1963. - Vol. 18. -№12.-P. 445-457.

88. Baba T. Studies on the immunospecific and nonspecific substances of Вас. anthracis. II Preparation of immunospecifica substance // Jap. J. Bact. 1964. - Vol. 19. - № 1. - P. 1-3.

89. Baba T. Serological and chemical properties of the immunospecific and nonspecific substances // Jap. J. Bact. 1964. - Vol. 19. - № 2. - P. 5860.

90. Barber G., Lilisteanu E., Naft J. Svr. les polyosi des tu Bacillus anthracis // Arch. Roum. Path. Exp. Microbos, 1957, 164, 573.

91. Barber G., Lilisteanu E., Naft J. Uber die lokalisation dez spezifischen substanxen bei Anthrax bazillus // Zbl. Bact. Abt. I. Orig. 1959. -S. 67-72.

92. Barber G., Petrovice A., Lilisteanu E., Naft J. Pascherches sur les haptenedu «Bacillus anthracis» et lewr // Arch. Roum. Path. Exp. Microbos, 1960.

93. Beall F. A., Tayior M., Thorne C.B. Rapid erthal effect in rats of a tie rol. Upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis // J. Bact, 1962, v. 83, №6. -p. 1274-1280.

94. Beall F.A. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis // I. Bacteriol. 1964. -83.-P. 1274-1280.

95. Boor A.K. An antigen prepared in vitro effective for immunization against anthrax. Preparations and evaluation of the crude protective antigen //J. Infect. Dis. 1955. - V. 97. - № 2. - P. 194-202.

96. Buzzel A. Biochemical and Biophysical characterization of anthrax toxin / Federation Prec. 1967. - v. 26. - p. 1234-1237.

97. Cave-Brown J., Cave J. To serologically active polysaccharides form Bacillus anthracis // J. Chem. Soc. 1954. - № 11. - P. 3866-3874.

98. Combiesco D., Sori E.,Stamatesco S. Recherches zur les substances solubles spécifiques (residual antigens) // Arch. Roumain pathol. Exp. Et microbial. 1929. - №2. - P. 291-310.

99. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen / C. Petosa, R. J. Collier, K. R. Klimpel et al. // Nature. 1997. - Vol. 385. - № 6619. -P. 833-838.

100. Eckert N., Bonventre P.F. In vivo effects of Bac.anthracis culture filtrates // J. Infect. Disseases. 1963. - №112. - P. 226.

101. Fisch D.C., Lincoln R.E. Biochemical and biophisical characterization of antrax toxin // Fed. Proc. 1967. - 26. - P. 1534-1538.

102. Francke G.R. Untersuchungen über den milzbranelnachweis an Hauten mittels der Präzipitation // Arch. Tierheilkd. 1924. - 51. - S. SSOSSI.

103. Gladstone G.P. Immunity to anthrax: protective antigen present in cell all-free culture filtrates // Brit. J. Exp. Path. 1946. - Vol. 27. - P. 391-410.

104. Gladstone G.P. Immunity to anthrax: production of the cell-free protective antigen in cellophane sacs // Brit. J. Exp. Path. 1948. - Vol. 3. -P. 379-389.

105. Gladstone G.P. Bacterial antigens and protective vaccines with special reference of anthrax immunité // Lab. J. 1955. - 8. - P. 291-298.

106. Grabar P., Staub A.M. Recherohes immunochemiques sur la bac-teridie charbonneuse // Ann. Inst. Pasteur. 1946. - Vol. 72. - № 78. - P. 534-544.

107. Guex-Holzer S. Anthrax-polupeptid und andere spezifische Substanzen der kapsei in der Bacillus-gruppe // Schweiz. L. Allem / Pathol. Und Bacteriol. 1951. - № 14. - S. 515.

108. Immunological studies of anthracs: evalution of the immuno-genicity of three components of anthrax IV / V.G. Mahlandt, F. Klein, R.E. Lincoln et al. // J. Immun. 1964. - Vol.96. - № 4. - P. 727-733.

109. Ivanovics G., Bruckner V. Die chemische structur der kapselsubstanz des milzbrand Bacillus und der serologischen indentischen spezifischen substanz des Bacillus mesentericus // Z. Immun. Forsch.exp. Ther. -1937.-Bd. 90.-S. 304.

110. Ivanovics G. Untersuchungen über des Polysaccharid der milzbrandbazillen. Die reaction der spezifischen substanz und des antikoppers des milzbrandbazillen kapsei // Z. Immun. Forsch. 1940. - V. 97. - S. 402.

111. Ivanovics G., Erdos L. Ein beitrag zum wesen der kapselsubstanz des milzbrandbazillus // Z. Immun. Forsch. Exp. Ther. 1937, - Bd. 90. - № l.-S. 5-19.

112. Ivanovics G., Foldes J. An immunospecific substance of B. cer-eus sionilar to polysacharide obtained from B. anthracis II Naturwissenschaften. -1958. V. 45.-S. 15.

113. Ivanovics G., Foldes J. Problems concerning the phylogenesis of Bazillus anthracis II Acta. Microb. Hung. 1958. - № 1. - P.89.

114. Keppie J. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. II. Some biological properties of bacterial products / J. Keppie, H. Smith, P.W. Harris-Smith // Brit. J. Exp. Pathol. 1953. Vol. 34. - P. 486.

115. Keppie J., Smith H., Harris-Smith P.W. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis III. The role of the terminal bacterimia in death of guinea pigs from anthrax // Brit. J. Exp. Pathol., 1955, v. 36. -p. 315-322.

116. Keppie J., Harris-Smith P.W., Smith H. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. IX Its aggressions and their mode of action // Brit. J. Exp. Pathol. 1963. - Vol. 44. - P. 446^153.

117. Kramar E. Untersuchungen über die chemische beschaffenheit der kapselsubstanz einiger kapselbacterien // Zbl. Bact., Abt. Ong. 1922. -V. 87. - P. 404-409.

118. Leppla S.H. Development of an improved vaccine for anthrax / S.H. Leppla, J.B. Robbins, R.H. Schneerson // J. Clin. Jnvest. 2002. - Vol. 110.-P. 141-144.

119. Little S.F. Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine. / S.F. Little, B.E. Yvins, P.F. Fellows // Vaccine. 2004. - Vol. 22. - P. 422-430.

120. Lincoln R.E., Fisch D.C. Anthrax toxin // Microb. Toxin. New-York-London, 1970, v. 3. - p. 361 - 414.

121. Lincoln R.E., Walker J.S., Klein F., Haines B.W. Anthracs // Advances in Vet. Sei., New-York-London, 1964, v. 9. p. 327 - 368.

122. Michel C., Brouillaud J., Pouet P. Etude par immunidiffusion des rapports antigeniques entre Bacteridium anthracis et. B. Cereus II Bull. Acad. Vet. France. 1972. - V. 45. - № 8. - P. 391-399.

123. Modyeri M. Bacillus anthracis lethal toxin induces TNF-a-independent hypoxia-mediated toxicity in mice / M. Modyeri, D. Heines, H. Young // J. Clin. Jnvest. 2003. - Vol. 112. - P. 670-682.

124. Molnar D.M. Poduction of toxin in vitro by Bacillus anthracis U J. Bacteriol. 1959. - V. 75. - P. 325-331.

125. Pathophysiological changes in the rat associated with anthrax toxin / D.C. Fisch, F. Klein, R.E. Lincoln et al. // J. Infect. Dis. 1968. -Vol. 118.-№1.-P. 114-124.

126. Pfeiler, Derescher. Untersuchungen über die Beziehungen der Pseudomilzbrandbacillen zu den Milzbranderregern mittels Präcipita-tionsmetode // Zeitschr. F. Infektionskrankh. D. Haustiere. 1913, - Bd. 13 -S. 391.

127. Puziss M Large-scale production of protective antigen of Bacillus anthracis II Appl. Microbiolog. 1959. - №11. - P. 330-334.

128. Puziss M., Howard M.B. Studies on immunity in anthrax. XI Conti of cellular permeability by bicarbonate relation to protective antigen elaborate 1 //J. Bacteriol. 1963. - v. 85. - P. 237-251.

129. Puziss M, Wright G.G. Studies on immunity in anthrax. X. Ge-ladsorded protective antigen for immunization of man // J. Bact. 1963. -Vol. 85. - № l.-P. 230-237.

130. Reuveny S. Search for Correlated of Protective Immunity Conferred by Anthrax Vaccine / S. Reuveny, M.D. White, Y.Y. Adar // Infect and Immun. 2001. - Vol. 69. - P. 2888-2893.

131. Sargeant K., Smith H. Production in vitro of the toxin of Bacillus anthracis previonctin recognized in vivo // J. Gen. Microbiol. 1958. - №19. -P. 91-103.

132. Sargeant K, Stanley J, Smith H. The serological Relationship between Purified Preparations of Factor 1 and 2 of Anthrax Toxin Produced in vivo and in vitro // J. Gen. Microbiol, 1960, v. 22, № 1. p. 219.

133. Sargeant K. Purificati on of Factor I and II of Anthrax Toxin Produced in vivo / K. Sargeant, J.L. Stanley, H. Smith // J. Gen. Microbiol. -1960. Vol. 22. - №1. - P. 206-218.

134. Schutz, Pfeiler Der Nachweis des Milzbrandes mittels der Prazipitationsmethode // Arch. F. Wissensch. u prakt. Tierheilkunde, 1912, Bd. 38.-S. 207.

135. Siedel G. Strassmann R. Zur bacteriologischen und serologischen Diagnose des Milzbrandes // Arch. Exper. Veter. med., 1956, Bd. 10. S. 335.

136. Smith H., Zwartouw H.T,, Gallop R.C. The nature of the aggressing produced by Bacillus anthracis growing in vivo // J. Biochem. 1954. -Vol. 56.-№8.-P. 132.

137. Smith H., Keppie J., Stanley J. The Chemical Basis of virulence the specific toxin produced by B. anthracis in vivo // Brit. J. Exp. Pathol., 1955, v. 36.-p. 460-472.

138. Smith H., Zwartouw H.T. The polysaccharide from Bac. anthracis grown in vivo // J. Biochem. 1956. - Vol. 63. - № 3. - P. 447^-53.

139. Smith H„ Tempest D.W. The uptake of amino acids during the terminal bacteriamia in guinea pigs infected with Bacillus anthracis II J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 17. - № 3. - P. 731.

140. Smith H. The basis of immunity to anthrax // Proc. Roy. Soc. Med. 1958. - Vol. 51. - № 5. - P. 375.

141. Smith H., Stanley J. Production of factor I and II of Anthrax toxin produced in vivo // J. Gen. Microbiol. 1962. - V. 22. - P. 206-218.

142. Stamatin N. Contribute la cunocaterea biologei carbunos in diverse soluri si conditii de mediu // Anual. Lucr. Stiint. 1964. - V. 4. - P. 447-456.

143. Staub A, Grabar P. Recherches immunochimignes sur la bac-teridie charboneus. 1. Le li gude Iodeme de cobaye et les polyosides. // Ann. Inst. Past. 1944. - Vol. 70. - P. 16.

144. Stanley J.L., Smith H. Production in vitro of the toxin Bac. anthracis previously recognised in vivo // J. Gen. Microb. 1958. - Vol. 19. -P. 91-103.

145. Stanley J.L., Smith H. Purification of factor i and recognition of third factor of the anthrax toxin // J. Gen. Microbiol. 1961. Vol. 26. - № 1. -P. 49-66.

146. Stanley J.L., Smith H. Tue three factors of anthrax toxin: their immunogenicity and lack of demonstrable enzymic activity // J. Gen. Microbiol. 1963. - V. 31. - №2. - P. 329-337.

147. Strange R.E., Beiton F.C. Production of toxin in vitro by Bacillus anthracis and its separation into two components // Brit. J. Exp. Pathol. -1954.-V. 35.-№2.-P. 153.

148. Strange R.E., Tohrne C.B. Futhes purification studies on the protective antigen of Bac. anthracis produced in vitro // J. Bacteriol. 1958. -Vol. 76. - № 2. - P. 192-202.

149. Strange R.E, Belton F.C. Studies on a protective antigen produced in vitro from B. anthracis medium and methods of production // Brit. J. Exp. Pathol. 1954. - Vol. 35. - P. 144-153.

150. Takagi S. Bacillus anthracis // Jap. J. Bact. 1962. - № 17. P.817.

151. Thorne C.B. Production of glutamyl polypeptide B. subtilis // J. Bacteriol. 1954. - Vol. 68. - P. 307.

152. Thorne C.B., Molnar D.M. D-amino acid transmutation in Bacillus anthracis H J. Bacteriol. 1955. - Vol. 70. - P. 420.

153. Thorne C.B. Production of toxin in vitro by B. anthracis and its separation into two components /C.B. Thorne, D.M. Molnar, R.E. Strange // J. Bacteriol. 1960. Vol. 79. - № 3. - P. 450-455.

154. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bac. anthracis II Ann. New-York. Acad. 1960. - Vol. 88. - P. 1024-1033.

155. Thorne C.B. Capsules formation and gintamyl polypeptids synthesis by B. anthracis and B. subtilis II Bact. Anatomy. Sixth. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 1956. - P. 68.

156. Tomcsik J., Szongott H. Über ein spezifisches protein der kapsei des milzbrandbazillus // Z. Immun. Forsch, u Exper. Therap. 1932. - Bd.76.-S. 214-234.

157. Tomcsik J., Szongott H. Über ein spezifisches protein der kapsei des milzbrandbazillus // Z. Immun. Forsch, u. Exper. Thepar. 1933. - Bd.77.-S. 86.

158. Tomcsik J., Bodon G. Über das Vorcomen der milzbrandbazillen kapselsubstanz im blute von infizierten tieren und ihre bedeutung fur den infections verlauf// Z. Immun. Forsch. 1935. - Bd 85. - № 4. - S. 308.

159. Tomcsik J., Bodon G. Über die serologische identitaet der kapselsubstanz von auf nuhrboden gezuchte ten und tierschen milzbrandbazillen // Z. Immun. Forsch. 1934. - Bd. 83. - S. 426.

160. Tomcsik J., Bodon G. Über das vorkommen der milzbrandba-zilles kapsei substans in blute von inficirten tieren und ihre bedeutung triz den infectionsverlauf // Z. Immun. Forsch. 1938 - Bd. 93. - № 2. - S. 196.

161. Tomcsik J. Complex structure of the bacterial capsule in the genus Bacillus II Experimentia. 1951. - № 7. - P. 459-460.

162. Tomcsik J., Ivanovics G. Die schutzwirkung des milzbrandinfec-tion // Z. Immun. Forsch, u. Exper. Therap. 1938. - Bd 94. - S. 28-44.

163. Tomcsik J., Baumann-Grace J. Serologisch Typen von B. Cereus und ihre Verwandtschafftit B.anthracis // Schweiz. Z. allem. Pathol, und Bacterid., 1959, v.22. -p.114.

164. Wilkie M.N., Ward M.K. Characterization of anthrax toxin // Fed. Proc. 1967. - Vol. 26. - №5. - P. 1527-1531.

165. Wright G.G. Studies on immunity in anthrax. 111. Elaboration on protective antigen in chemically defined, nonprotein medium / G.G. Wright, M.A. Hedberg, J.B. Slein // J. Immun. 1954. - Vol. 72. - № 4. - P. 263282.