Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Хлынцева, Анна Евгеньевна

• Хлынцева, Анна Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хлынцева, Анна Евгеньевна

v7 гп

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Введение.

1.2. Таксономия возбудителя сибирской язвы.

1.3. Эпидемиологическая характеристика сибиреязвенной 17 инфекции.

1.4. Источники инфекции.

1.5. Пути, механизмы передачи и восприимчивый организм.

1.6. Роль спор B.anthracis в эпидемиологическом процессе.

1.7. Микробиологическая и биохимическая характеристика 25 возбудителя сибирской язвы.

1.8. Процесс спорообразования.

1.9. Структура споры.

1.10. Антигенный состав спор и вегетативных клеток.

1.11. Методы детекции спор и вегетативных клеток В. anthracis.

1.12. Моноклональные антитела как основа современных методов 50 иммуноанализа.

1.12.1. Получение моноклональных антител.

1.12.2. Свойства моноклональных антител.

1.12.3. Области применения моноклональных антител.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы»

Актуальность.

Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.

По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [22].

Возбудитель — Bacillus anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу. Хорошо растет на различных питательных средах. Вегетативные формы быстро погибают без доступа воздуха, при прогревании, под воздействием различных дезинфицирующих средств. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.

Источником В. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [14]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [28]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть, щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Заболеваемость носит преимущественно профессиональный характер. Основным резервуаром В. агЛЬгасгБ считается почва [14]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы - известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой. [24]. Споры попадают в кожу через микротравмы; при алиментарном инфицировании (употребление зараженных продуктов) возникает кишечная форма. Передача возбудителя может происходить воздушно-капельным путем (вдыхание инфицированной пыли, костной муки). В этих случаях возникают легочная и генерализованная формы сибирской язвы. В странах Африки допускается возможность передачи инфекции посредством укусов кровососущих насекомых. Заражения человека от человека обычно не наблюдается. Сибирская язва широко распространена во многих странах Азии, Африки и Южной Америки. В США и странах Европы наблюдаются единичные случаи заболеваний сибирской язвой.

Основными факторами вирулентности возбудителя сибирской язвы являются капсула и бинарный экзотоксин. Однако, в конечном итоге, вирулентность бактерии определяется суммой факторов, которая до конца не изучена.

Капсульные антигены кодируются генами, расположенными на плазмиде рХ02, а токсинный комплекс и некоторые ферменты, необходимые для синтеза капсулы - на плазмиде рХ01. Роль капсулы при инфекции заключается в защите вегетативной формы патогена от фагоцитоза макрофагами. Вместе с бинарным токсином, состоящим из протективного антигена, связывающегося с недавно идентифицированными клеточными рецепторами и двух эффекторных белков - летального и отёчного факторов, первичными мишенями которых являются, соответственно, макрофаги и нейтрофилы, капсула практически полностью защищает патоген от ранних стадий иммунного ответа организма-хозяина.

Однако, действие сибиреязвенного токсина не ограничивается блокировкой иммунного ответа и реакции макрофагов и нейтрофилов. При развитии лёгочной, кишечной, и септической форм инфекции, действие токсинов становится системным, и приводит к гибели организма. Механизм интоксикации до конца не ясен, однако очевидно, что при определённой концентрации токсина в крови, наступает так называемое «состояние невозврата», при котором любая терапия существующими в настоящее время методами, оказывается неэффективной.

Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [31]. Однако, экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как В. сегет и др.).

Таким образом, для разработки эффективных средств иммунодиагностики сибирской язвы, необходимы дополнительные фундаментальные и прикладные исследования. Помимо создания собственно диагностических систем, существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для В. аШкгаЫБ. В качестве основы для быстрой разработки различных типов современных диагностикумов наиболее перспективными и универсальными являются панели моноклональных антител (МКА), на основе которых можно создавать широкий спектр диагностических средств, учитывающих как особенности патогенеза сибирской язвы, так и современные форматы высокочувствительных систем детекции микроорганизмов и их факторов вирулентности. Поэтому одной из существенных задач исследований в области иммунодетекции возбудителя сибирской язвы является получение высокоспецифичных МКА для конструирования на их основе эффективных тест-систем, адаптированных к масштабируемому серийному производству сертифицированных медицинских иммунобиологических препаратов.

В настоящее время в России существуют четыре коммерческих препарата для иммунологического определения сибирской язвы: «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые (адсорбированные) люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие» (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи ), «ИХ тест-система В. anthracis» (ГНЦ ПМБ). Чувствительность первых двух препаратов не превышает 105 микробных клеток/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминесцирующие иммуноглобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis. Третий препарат в соответствии с инструкцией по применению предназначен для учебных целей, а чувствительность «ИХ тест-системы В. anthracis» не превышает 108 - 109 спор/мл. В связи с этим, необходимость в создании новых методов и средств индикации возбудителя сибирской язвы не вызывает сомнений.

Существенное значение для иммунодиагностических тест-систем играет методический формат, в котором они существуют - от детекции антигена в прямом ИФА до подходов, предусматривающих селективное концентрирование антигена или иммобилизацию специфических моноклональных антител на магнитных частицах. Выбор формата тест-системы влияет на ее чувствительность, экспрессность и специфичность и накладывает ограничения на применимость тест-системы для решения различных диагностических задач. В данной работе были использованы современные и эффективные методические подходы, основанные на латексных частицах и магноиммуносорбентах.

Цель исследования - создание комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфических МКА, анализ их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к В. ап^гаск. Провести изучение полученных МКА на наличие внутри- и межвидовой перекрестной активности при помощи коллекции патогенных и сапрофитных бацилл.

2. Разработать на основе полученных МКА диагностические тест-системы в формате ИФА и латекс-агглютинации.

3. Сконструировать систему для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА.

4. Идентифицировать антигенную мишень полученных МКА, использованных при разработке диагностических тест-систем.

Научная новизна:

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. агйкгасЬ. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. Идентифицирована антигенная мишень МКА, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis. Показано взаимодействие МКА, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в E.coli.

Практическая значимость работы:

1. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

2. Высокоэкспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/12159 от 20 октября 2011 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).

3. Тест-система на основе магноиммуносорбентов способна специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1x103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений Санэпиднадзора.

4. Получен Патент на изобретение №2439148 Cl РФ «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1Е6 -продуцент моноклональных антител для специфичного обнаружения спор Bacillus anthracis».

5. Разработаны и внедрены на Федеральном уровне методические указания «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» МУ 4.2.2941-11, 2011 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Полученная панель из шести МКА, являющихся специфичными к белку ЕА1 S-слоя возбудителя сибирской язвы и не дающих перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, может быть использована для создания иммунодиагностикумов для определения В. anthracis.

2. «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обладает чувствительностью от 1x105 спор/мл до 2x106 спор/мл и выше и высокой специфичностью. Данный латексный диагностикум может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной форм возбудителя сибирской язвы.

3. «Набор реагентов. Тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме моноклональная» обеспечивает выявление спор возбудителя сибирской язвы с высокой чувствительностью (1 хЮ спор/мл) и специфичностью. Концентрация спор возбудителя сибирской язвы на поверхности МИС позволяет максимально освобождаться от посторонней микрофлоры при исследовании проб окружающей среды (вода, почва).

Работа выполнена

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ФБУН ГНЦ

ПМБ.

Личный вклад соискателя

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с Е.В. Беловой

ГНЦ ПМБ), A.B. Козырь (ГЩ ПМБ), A.B. Колесниковым (ГНЦ ПМБ), С.С. Ветчининым (ГНЦ ПМБ), И.В. Жарниковой (СтавНИПЧИ). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Р.И. Миронова, Н.М. Лунева.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на: IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Всероссийской научной конференции, посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ», «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); Научно-практическая конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); Научно-практическая конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); III Научно-практическая школа-конференция СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании ученого совета ГНЦ ПМБ 24 декабря 2008 г., протокол № 8. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 22 от 28 декабря 2011г.).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и в одном патенте на изобретение № №2439148 С1 РФ. и в МУ 4.2.2941-11, 2011 г.

Объем и структура диссертации

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Хлынцева, Анна Евгеньевна

выводы

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. anthracis. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия МКА с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания. Высокоэкспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию.

3. Было показано, что наибольшей эффективностью и чувствительностью обладает тест-система на основе магноиммуносорбентов, способная специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1x103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений санэпиднадзора.

4. Идентифицирована мишень для моноклональных антител, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis ЕА1. Показано взаимодействие моноклональных антител, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в Е. coli.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.б.н., проф. И.Г. Шемякину (ГНЦ ПМБ) и к.б.н. A.B. Козырь (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов и обсуждении их результатов.

Выражаю благодарность за помощь в проведении испытаний сконструированных тест-систем сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ: зав. лабораторией микробиологии сибирской язвы к.м.н. Маринину Л.И., н.с. Мироновой Р.И.; сотрудникам ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ: зав. лабораторией иммунодиагностики и биотехнологии д.м.н., проф. Храповой Н.П., с.н.с. лаборатории сибирской язвы к.м.н. Баркову A.M., с.н.с. к.м.н. Барковой И.А.; сотрудникам ФГУЗ СтавНИПЧИ зав. научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций д.м.н., проф. Тюменцевой И.С., в.н.с. д.б.н. Жарниковой И.В., с.н.с. к.б.н. Ждановой Е.В.; сотрудникам ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Кравец Е.В и н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Дугаржаповой З.Ф.

Приношу искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности были учтены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приоритетной задачей лабораторной диагностики сибирской язвы является создание новых чувствительных и достоверных способов детекции спор и вегетативной формы В. аЫкгайь в различных объектах окружающей среды и материале от животных и людей [30].

Традиционные методы обнаружения возбудителя сибирской язвы включают подготовку суспензии пробы, приготовление мазков, окрашивание их антиспоровой люминисцирующей сывороткой и микроскопию с использованием люминисцентного микроскопа. Чувствительность этого метода не превышает 105 спор/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминисцирующие иммуноглобулины не обладают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами В. сегет и Влкип^гетгв [6].

В данной работе основное внимание было сосредоточено на разработке современных высокоспецифичных тест-систем на основе иммуноферментного анализа (ИФА), латекс-агглютинации и тест-системы для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы с использованием магноиммуносорбентов.

Тест-системы на основе ИФА традиционно широко используются в клинической диагностике биологических патогенов, токсинов, а также целого ряда других биологических и химических соединений, однако тестирование методом ИФА возможно только в лабораторных условиях, поскольку данный метод обладает низкой экспрессностью и требует наличия определенного набора оборудования и соблюдения условий чистоты при проведении эксперимента.

Тест-система на основе реакции латекс-агглютинации, отличается простотой постановки анализа, возможностью быстрого получения ответа, отсутствием необходимости использования специальных устройств для регистрации результатов.

Наряду с достоинствами, данные диагностические методы обладают невысокой чувствительностью определения - для проведения анализа необходимо как минимум 105 - 106 микробных клеток или спор. Поэтому другой важной задачей диагностики возбудителя сибирской язвы является предварительная пробоподготовка материала, включающая в себя селективное концентрирование биологических частиц. Одним из наиболее прогрессивных методов пробоподготовки является селективное концентрирование биоматериала при помощи магнитных частиц с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. Преимуществом использования магноиммуносорбентов является то, что при их использовании не требуется предварительного концентрирования исследуемых проб с отделением выявляемых микроорганизмов от контаминирующей микрофлоры и других примесей. В результате использования магноиммуносорбентов, способных осуществлять на себе селективное концентрирование микроорганизмов, появляется возможность исследования проб с высокой степенью загрязненности, возможность забора проб при неограниченных объемах из объектов внешней среды, проб с низкой концентрацией микроорганизмов, при этом метод обладает высокой чувствительностью (1x102 - 1x103 микробных клеток или спор в пробе) и специфичностью [11].

Цель настоящей работы состояла в создании комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфических МКА, анализа их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.

Для разработки иммунодиагностических тест-систем на основе МКА была получена и охарактеризована панель из шести МКА, обладающая специфичностью и отсутствием перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами. Специфичность данных антител была определена путем постановки дот-блот анализа с 2 вакцинными, 4 аттенуированными и 10 природными штаммами возбудителя сибирской язвы В. anthracis и с 21 штаммом наиболее распространенных близкородственных споровых сапрофитов.

МКА, используемые при конструировании иммунодиагностических тест-систем должны обладать не только специфичностью к возбудителю заболевания, но и быть высокоаффинными и формировать, так называемые пары антител, которые используются для разработки тест-систем в формате ИФА и МИС. В ходе работы были определены три МКА (1Е6, 6В6 и 3G3), которые имели наибольшую аффинность по сравнению с другими МКА. В качестве компонентов иммуноферментной тест-системы, основанной на методе непрямого твердофазного ИФА и магноиммуносорбентов была выбрана I пара МКА (1Е6 - 6В6).

С применением отобранных МКА были разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания. Высокоэкспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию. Было показано, что наибольшей эффективностью и чувствительностью обладает тест-система на основе магноиммуносорбентов, способная специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1x10 спор/мл.

Идентификация антигенной мишени МКА использованных при конструировании тест-систем показала, что полученные МКА связывались с рекомбинантным ЕА1 антигеном возбудителя сибирской язвы. Так как, антиген ЕА1 является главным компонентом S-слоя клеток В. anthracis, была проведена оценка диагностической значимости разработанных диагностикумов для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы. В результате было установлено, что сибиреязвенный латексный диагностикум выявляет как споры, так и вегетативные клетки штаммов сибирской.

Несмотря на наличие в ЕА1 участков, антитела к которым крос-реактивны с гомологичными белками из родственных микроорганизмов (В. сегеш, В. Мипщетя), методом конкурентного фагового дисплея, в ЕА1 были обнаружены эпитопы, присущие только В. аМИтЫя [77]. Это означает, что не только в антителах, селектированных методом фагового дисплея из животных иммунизированных ЕА1, но и в достаточно широкой панели МКА к данному белку, полученных стандартным способом, высока вероятность обнаружения таких антител. Поскольку полученные в этой работе данные свидетельствуют об уникальности эпитопов, распознаваемых описанной панелью МКА, данные антитела могут быть использованы для эпитопного картирования ЕА1 с целью локализации антигенных детерминант, уникальных для В. аШкгасгз и анализа их уникальности на уровне различий в аминокислотной последовательности близкородственных вариантов ЕА1.

Роль белка ЕА1 в жизненном цикле патогена, а также в патогенезе сибирской язвы неясна. Считается, что делеция гена eag, кодирующего ЕА1, не приводит к дефектам спорообразования и не влияет на морфологию спор [110, 143]. Локализация значительных количеств данного белка на поверхности вегетативной и споровой форм микроорганизма может указывать на его роль во взаимодействиях между патогеном и организмом-хозяином. Вместе с тем, иммунодоминантность данного белка и отсутствие нейтрализующего иммунного ответа к ЕА1 [116], позволяет высказать предположение о том, что этот антиген является одним из компонентов системы противодействия патогена иммунной системе хозяина, позволяющей бактериям избежать нейтрализации. Получение панели антител к ЕА1, содержащей клоны специфичные только к В. аШкгаЫБ, будет способствовать не только созданию высокоспецифичных диагностикумов, но и ответу на вопрос о роли данного белка в патогенезе сибирской язвы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хлынцева, Анна Евгеньевна, 2012 год

1. Абалакин В А. Закономерности врождённого и приобретённого иммунитета против сибирской язвы: Дис. д-ра мед. наук. М., 1990.

2. Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Ефременко В.И. Афанасьев E.H., Жарникова И.В. Совершенствование метода индикации возбудителя сибирской язвы // ЖМЭИ 2003. - №6. - С. 47-51.

3. Абелев Г.И. Моноклональные антитела // Соросовскийобразовательный журнал. 1998. - №1. - С. 16-20.

4. Баркова И.А„ Липницкий A.B., Барков A.M., Евтеева Е.В. Использование иммуноглобулинов к отдельным внеклеточным антигенам Bacillus anthracis СТИ для идентификации сибиреязвенного микроба // Биотехнология. 2005. - №2. - С.91-96.

5. Дзантиев Б.Б., Жердев A.B., Попов В.О., Венгеров Ю.Ю., Старовойтова Т.А. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений // Клин.лаб.диагн. 2002. - № 8. - С.25-32.

6. Евтеева Е.В. Внеклеточные антигены сибиреязвенного микроба и их диагностическое значение: Автореферат диссертации на соискание ученойстепени кандидата медицинских наук (далее: Автореф. дис. канд. мед. наук). Волгоград, 2003.

7. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М., Медгиз, 1985.

8. Ерёменко Е.И., Цыганкова О.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. Прорастание спор возбудителя сибирской язвы // Ж. микробиол. 2006. -№1. - С. 72-24.

9. П.Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней // Журн. микробиол. 1997. - №2. - С.102-106.

10. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Бинатова В.В. Способ получения иммуносорбента (варианты). Патент РФ № 2138813 от 27.09.1999.

11. И.Иванов П., Барышников А. Моноклональные антитела в лечении рака // Вместе против рака. 2000. - №2.

12. Ипатенко Н.Г., Татаринцев Г.Т., Седов В. А., Гущин В.Н. Эпизоотология сибирской язвы // Ветеринария. 1987. - №9. - С. 35-37.

13. Кац JI.H. Цитологическое и цитохимическое исследование капсулы и оболочки клетки Вас. anthracis // Ж. микробиол. 1964. - Т. 33, в. 5. - С. 115119

14. Кноп А.Г. Влияние антропогенного преобразования природы на почвенные очаги сибирской язвы // Современные проблемы зоонозных инфекций. Тез. докл. Всесоюзной межведомственной конференции (Симферополь, 1981 г.)/М., 1981.-С.25-27.

15. Коваленко А. А Разработка хемилюминесцентного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы: Автореферат дис. канд. биол. наук. Саратов, 1992.

16. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания. МУК 4.2.2413-08. // Утв. Роспотребнадзором 29.07.2008.

17. Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды. Методические указания. М.: ВО «Агропромиздат», 1989.

18. Левина Е.Н., Кац Л.Н. Изучение антигенов Вас. anthracis и Вас. cereus с помощью люминесцентно-серологического и цитохимического методов исследования // Ж. микробиол. 1966. - №4. - С. 98-103.

19. Лукьянова С.В., Кравец Е.В., Шкаруба Т.Т. Сибиреязвенные вакцины и перспективы их совершенствования // Инфекционные болезни 2011. - Т.9, №1. - С. 51-56.

20. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов А.В., Никифоров В.В. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. Оболенск, 2008.

21. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В, Старицын Н.А., Померанцев А.П., Алешкин В. А. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

22. Никифоров В.Н. Клиника, диагностика и лечение сибирской язвы. М., 1981.

23. Новые методы иммуноанализа / Под ред. Коллинз У.П. М.: Мир, 1991. 28,Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев

24. П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

25. Свешников П.Г., В.В. Малайцев, И.М. Богданова, Солопова О.Н. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию. М.:1. Издательство МГУ, 2006.

26. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: ИНтерСЭН, 2002.

27. Черкасский Б.Л., Жанузаков Н.Ж. Сибирская язва. Алма-Ата: Кайнар, 1980.

28. Черкасский Б.Л., Иванова A.A. Эпидемиологическая ситуация по зоонозам в России // Эпидемиол. и инфекц. бол. 1996. - №2. - С. 12-15.

29. Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Федоров Ю.М., Серов В.А., Ведерников В.А., Пыталев П.Н. Эпидемиология, эпизоотология и профилактика сибирской язвы в бывшем СССР // Журн. микробиол. 1993. - №5. - С. 117121.

30. Шляхов Э. Н., Присакарь В. И. Эпидемиологический надзор при сибирской язве (По материалам Молдавской ССР) / Кишинев: Штиинца, 1989.

31. Шляхов Э.Н., Литвин В.Ю. Эколого-эпидемиологические принципы классификации инфекционных болезней человека // Журн. микробиол. -1989.-№7.-С. 109-114.

32. Abrami L., Liu S., Cosson P., Leppla S.H., Van Der Goot F.G. Anthrax toxin triggers endocytosis of its receptor via a lipid raft-mediated clathrin-dependent process//J. Cell Biol. 2003.-V. 160, N 3.-P. 321-328.

33. Anon. Milzbrandvirus nach 1300 Jahren noch aktiv? I I Gesundheitspolitische Umschau 1982. - N 33. - P. 60.

34. Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley K., Frangoulidis D., Meyer H. Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis H Mol. Cell. Probes 2008. - V. 22, N 5-6. - P. 313-315.

35. Bailey-Smith K., Todd S.J., Southworth T.W., Proctor H., Moir A. The ExsA protein of Bacillus cereus is required for assembly of coat and exosporium onto the spore surface // J. Bacteriol. 2005. - V. 187, N 11. - P. 3800-3806.

36. Beaman T.C., Pankratz H.S., Gerhardt P. Paracrystalline sheets reaggregated from solubilized exosporium of Bacillus cereus II J. Bacteriol. 1971. - V. 107, N l.-P. 320-324.

37. Beaman T.C., Pankratz H.S., Gerhardt P. Infrastructure of the exosporium and underlying inclusions in spores of Bacillus megaterium strains // J. Bacteriol. -1972.-V. 109, N3.-P. 1198-1209.

38. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affmiti by non-competitive enzyme immunoassay // J. Immunol. Methods -1987. -V. 100, N 1-2. P. 173-179.

39. Beecher D.J. Forensic application of microbiological culture analysis to identify mail intentionally contaminated with Bacillus anthracis spores // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72, N 8. - P. 5304-5310.

40. Bergman N.H., Passalacqua K.D., Gaspard R., Sherton-Rama L.M., Quackenbush J., Hanna P.C. Murine macrophage transcriptional responses to Bacillus anthracis infection and intoxification // Infect. Immun. 2005. - V. 73, N2.-P. 1069-1080.

41. Berson S.A., Yalow R.S. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods // Nature 1959. - V. 184, N 21. - P. 1648-1649.

42. Brigati J., Williams D.D., Sorokulova I.B., Nanduri V., Chen I.H., Turnbough Jr. C.L., Petrenko V.A. Diagnostic probes for Bacillus anthracis spores selected from a landscape phage library // Clin. Chem. 2004. - V. 50, N 10. -P. 1899-1906.

43. Bruno J.G., Kiel J.L. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electrochemiluminescence detection // Biosens. Bioelectron. 1999. - V. 14, N5.-P. 457.

44. Zhen B., Song Y.J., Guo Z.B., Wang J., Zhang M.L., Yu S.Y., Yang

45. R.F. In vitro selection and affinity function of the aptamers to Bacillus anthracisspores by SELEX // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) 2002. - V. 34, N 5. - P. 635-42.

46. Caldwell D.R. Microbial Physiology and Metabolism. Belmont, CA: Star Publishing Company, 1995.

47. Campbell G.A., Mutharasan R. Piezoelectric-excited millimeter-sized cantilever (PEMC) sensors detect Bacillus anthracis at 300 spores/mL // Biosens. Bioelectron. 2006. - V. 21, N 9. - P. 1684-1692.

48. Chen Y., Fukuoka S., Makino S. A novel spore peptidoglycan hydrolase of Bacillus cereus: biochemical characterization and nucleotide sequence of the corresponding gene, sleL // J. Bacteriol. 2000. - V. 182, N 6. - P. 1499-1506.

49. Chopra A.P., Boone S.A., Liang X., Duesbery N.S. Anthrax lethal factor proteolysis and inactivation of MAPK kinase // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278, N 11.-P. 9402-9406.

50. Cieslak T.J., Eitzen Jr. E.M. Clinical and epidemiological principles of anthrax // Emerg. Inf. Dis. 1999. - V. 5, N 4. - P. 552-555.

51. Cole H.B, Ezzell Jr. J.W., Keller K.F., Doyle R.J. Differentiation of Bacillus anthracis and other Bacillus species by lectins // J. Clin. Microbiol. -1984.-V. 19, N1.-P. 48-53.

52. Couture-Tosi E., Delcroix H., Mignot T., Mesnage S., Chami M., Fouet A., Mosser G. Structural analysis and evidence for dynamic emergence of Bacillus anthracis S-layer networks II J. Bacteriol. 2002. - V. 184, N 23. -P. 6448-6456.

53. Descotes I.P., Joubert L. Reconversions epidemiologiques actuelles de la fievre charbonneuse et opportunité de la reactulisation de la réglementation spéciale//Rev. Med. Vet. 1978. -V. 129, N8-9. - P. 1209-1221.

54. Dixon T.C., Fadl A.A., Koehler T.M., Swanson J.A., Hanna P.C. Early Bacillus ¿mi/zram-macrophage interactions: intracellular survival and escape II Cell. Microb. 2000. - V. 2, N 6. - P. 453-463.

55. Driks A. Proteins of the spore core and coat / A.L. Sonenshein, J A. Hoch, R. Losick. Bacillus subtilis and its closest relatives. Washington, DC: American Society for Microbiology, 2002. P. 527-536.

56. Ellerbrok H., Nattermann H., Ozel M., Beutin L., Appel B., Pauli G. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCRI IFEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 214, N 1. - P. 51-59.

57. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry 1971. - V. 8, N 9. -P. 871-874.

58. Ezzell Jr. J.W., Abshire T.G. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis I I Infect. Immun. 1988. - V. 56, N 2. - P. 349-356.

59. Fasanella A., Losito S., Adone R, Ciuchini F., Trotta T., Altamura S.A., Chiocco D., Ippolito G. PCR assay to detect Bacillus anthracis spores in heat-treated specimens // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41, N 2. - P. 896-899.

60. Fasanella A., Losito S., Trotta T., Adone R., Massa S., Ciuchini F., Chiocco D. Detection of anthrax vaccine virulence factors by polymerase chain reaction // Vaccine 2001. - V. 19, N30. - P. 4214-4218.

61. Firoved A.M., Miller G.F., Moayeri M., Kakkar R., Shen Y., Wiggins J.F., McNally E.M., Tang W., Leppla S.H. Bacillus anthracis edema toxin causes extensive tissue lesions and rapid lethality in mice // Amer. J. Path. 2005. -V. 167, N5.-P. 1309-1320.

62. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through and acid-dependent process // J. Biol. Chemistry. 1986. - V. 261, N 16. - P. 7123-7126.

63. Fujikura T. Current occurrence of anthrax in man and animals. Proc. Intern. Workshop on Anthrax. Winchester, England, Apr. 11-13, 1989 / Salisbury Med. Bull. Special Supplement. - 1990. - N 68. - P. 1.

64. Gerhardt P. Cytology of Bacillus anthracis // Fed. Proc. 1967. - V. 26, N 5.-P. 1504-1517.

65. Giorno R., Bozue J., Cote C., Wenzel T., Moody K.S., Mallozzi M., Ryan M., Wang R., Zielke R., Maddock J.R., Friedlander A., Welkos S., Driks A. Morphogenesis of the Bacillus anthracis spore // J. Bacteriol. 2007. - V. 189, N. 3.-P. 691-705.

66. Hahn U.K., Boehm R., Beyer W. DNA vaccination against anthrax in mice-combination of anti-spore and anti-toxin components // Vaccine 2005. - V. 24, N 21.-P. 4569-4571.

67. Haldenwang W.G. The sigma factors of Bacillus subtilis II Microb. Reviews 1995. -V. 59, N 1. -P. 1-30.

68. Hanna P. Lethal toxin actions and their consequences // J. Appl. Microbiol. -1999. V. 87, N 2. - P. 285-287.

69. Hao R., Wang D., Zhang X., Zuo G., Wei H., Yang R., Zhang Z., Cheng Z., Guo Y., Cui Z., Zhou Y. Rapid detection of Bacillus anthracis using monoclonalantibody functionalized QCM sensor // Biosens. Bioelectron. -2009. -V. 24, N 5. -P. 1330-1335.

70. Harrison L.H., Ezzell J.W., Abshire T.G., Kidd S., Kaufmann A.F. Evaluation of serologic tests for diagnosis of anthrax after an outbreak of cutaneous anthrax in Paraguay // J. Infect. Dis. 1989. - V. 160, N 4. - 706-710.

71. Heffernan B.J., Thomason B., Herring-Palmer A., Hanna P. Bacillus anthracis anthrolysin O and three phospholipases C are functionally redundant in a murine model of inhalational anthrax // FEMS Microb. Lett. 2007. - V. 271, N 1. -P. 98-105.

72. Kaufmann A.F., Meltzer M.I., Schmid G.P. The economic impact of a bioterrorist attack: are prevention and postattack intervention programs justifiable? // Emerg. Infect. Dis. 1997. - V. 3, N 2. - P. 83-94.

73. Kim H.S., Sherman D., Johnson F., Aronson A.I. Characterization of a major Bacillus anthracis spore coat protein and its role in spore inactivation // J.Bacteriol. 2004. -V. 186, N 8. -P. 2413-2417.

74. Klein-Albers C., Bohm R. The detection of Bacillus anthracis protective antigens by enzyme immunoassay (EIA) using polyclonal and monoclonal antibodies // Zentralbl.Veterinarmed. B. 1989. -V. 36, N 3. - P. 226-230.

75. Klichko V.I., Miller J., Wu A., Popov S.G., Alibek K. Anaerobic induction of Bacillus anthracis hemolytic activity // Bioch. Biophys. Res. Comm. 2003. - V. 303, N 3. - P. 855-862.

76. Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature 1975. - V. 256, N 5517. - P. 495497.

77. Kuehn A., Kovac P., Saksena R., Bannert N., Klee S.R., Ranisch H., Grunow R. Development of antibodies against anthrose tetrasaccharide for specific detection of Bacillus anthracis spores // Clin. Vaccine Immunol. 2009. - V. 16,1. N 12.-P. 1728-1737.

78. Kumar S., Tuteja U. Detection of virulence-associated genes inclinical isolates of Bacillus anthracis by multiplex PCR and DNA probes // J. Microbiol. Biotechnol.-2009.-V. 19, N11.-P. 1475-1481.

79. Kurzchalia T. Anthrax toxin rafts into cells // J. Cell. Biol. 2003.1. V. 160, N3.-P. 295-296.

80. Lai E., Phadke N.D., Kachman M.T., Giorno R., Vazquez S., Vazquez J.A., Maddock J.R., Driks A. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillussubtilis and Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 2003. - V. 185, N 4. - P. 14431454.

81. Lai E.M., Phadke N.D., Kachman M.T. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 2003. -V. 185, N4.-P. 1443-1454.

82. Lim D.V., Simpson J.M., Kearns E.A., Kramer M.F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare // Clin. Microbiol.Rev. 2005. -V. 18, N 4. - P. 583-607.

83. Liu H., Bergman N.H., Thomason B., Shallom S., Hazen A., Crossno J., Rasko D.A., Ravel J., Read T.D., Peterson S.N., Yates III J., Hanna P. Formation and composition of the Bacillus anthracis endospore // J. Bacteriol. -2004.-V. 186, N 1.-P. 164-178.

84. Longchamp P., Leighton T. Molecular recognition specificity of Bacillus anthracis spore antibodies // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87, N 2. -P. 246-249.

85. Love T.E., Redmond C., Mayers C.N. Real time detection of anthrax spores using highly specific anti-EAl recombinant antibodies produced by competitive panning // J. Immunol. Methods 2008. -V. 334, N 1-2. - P. 1-10.

86. Manchee R.J., Broster M.G., Melling J., Henstridge R.M., Stagg A.J. Bacillus anthracis on Gruinard Island // Nature 1981. - V. 294, N 5838. -P. 254-255.

87. Matz L.L., Beaman T.C., Gerhardt P. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus // J. Bacteriol. 1970. - V. 101, N 1. — P. 196-201.

88. Merrill L., Richardson J., Kuske C.R., Dunbar J. Fluorescent heteroduplex assay for monitoring Bacillus anthracis and close relatives in environmental samples // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, N 6. - P. 3317-3326.

89. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M., Fouet A. The capsule and S-layer: two independent and yet compatible macromolecular structures in Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 1998. - V. 180, N 1. - P. 52-58.

90. Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M., Gounon P., Fouet A. Molecular characterization of the Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the major cell-associated antigen // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23, N6.-P. 1147-1155.

91. Mignot T., Mock M., Fouet A. Developmental switch of S-layer protein synthesis in Bacillus anthracis II Mol. Microbiology. 2002. - V. 43, N 6. -P. 1615-1628.

92. Mock M., Fouet A. Anthrax // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. -P. 647-671.

93. Moir A. How do spores germinate? // J. Appl. Microb. 2006. -V. 101, N3.-P. 526-530.

94. Mosser E.M., Rest R.F. The Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin, anthrolysin O, kills human neutrophils, monocytes, and macrophages // BMC Microb. 2006. - V. 6. - P. 56.

95. Nieri P., Donadio E., Rossi S., Adinolfi B., Podesta A. Antibodies for therapeutic uses and the evolution of biotechniques // Curr. Med. Chem. 2009. -V. 16, N6.-P. 753-779.

96. Oncu S., Oncu S., Sakarya S. Anthrax an overview // Med. Sci. Monit. - 2003 .-V. 9, N11.-P. 276-283.

97. Phillips A.P., Ezzell J.W. Identification of Bacillus anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigens // J. Appl. Bacteriol. 1989. - V. 66, N 5. - P. 419-432.

98. Phillips A.P., Martin K.L. Comparison of direct and indirect immunoradiometric assays (IRMA) for Bacillus anthracis spores immobilised on multispot microscope slides // J. Appl. Bacteriol. 1983. - V. 55, N 2. - P. 315— 324.

99. Quinlant J. J., Foegeding P. M. Monoclonal antibodies for use in detection of Bacillus and Clostridium Spores // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -V. 63, N2.-P. 482-487.

100. Quinn C.P., Semenova V.A., Elie C.M., Romero-Steiner S., Greene

101. D.A., Stephens D.S., Perkins B.A. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8, N 10. - P. 1103— 1110.

102. Radstrom P., Knutsson R, Wolffs P., Lovenklev M., Lofstrom C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples // Mol. Biotechnol. 2004. - V. 26, N2. - P. 133-146.

103. Raines K.W., Kang T.J., Hibbs S., Cao G., Weaver J., Tsai P., Baillie L.W., Cross A.S., Rowen G.M. Importance of nitric oxide synthase in the control of infection of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 2006. - V. 74, N 4. - P. 22682276.

104. Ramarao N., Lereclus D. The InhAl metalloprotease allows spores of the B. cereus group to escape macrophages // Cell. Microb. 2005. - V. 7, N 9. -P. 1357-1364.

105. Rao S.S., Mohan K.V., Atreya C.D. Detection technologies for Bacillus anthracis: prospects and challenges // J. Microbiol. Methods. 2010. -V. 82, N 1. - P. 1-10.

106. Redmond C., Baillie L.W., Hibbs S., Moir A.J., Moir A. Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis II Microbiology 2004. -V. 150, pt. 2.-P. 355-363.

107. Riesenman P.J., Nicholson W.L. Role of the spore coat layers in Bacillus subtilis spore resistance to hydrogen peroxide, artificial UV-C, UV-B and solar UV radiation // Appl. Env. Micro. 2000. - V. 66, N 2. - P. 620-626.

108. Scolnik P.A. MAbs. A business perspective // mAbs. 2009. - V. 1, N2.-P. 179-184.

109. Setlow P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat, and chemical // J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 101, N 3. - P. 514525.

110. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin // Infect. Immun. 2003. - V. 71, N 6. - P. 3183-3189.

111. Steichen C., Chen P., Kearney J.F., Turnbough Jr. C.L. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium//J. Bacteriol. 2003. - V. 185, N6.-P. 1903-1910.

112. Steichen C.T., Chen P., Kearney J.F., Turnbough C.L. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium//J. Bacteriol.-2003.-V. 185, N6.-P. 1903-1910.

113. Steichen C.T., Kearney J.F., Turnbough C.L. Characterization of the exosporium basal layer protein BxpB of Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 2005. -V. 187, N 17.-P. 5868-5876.

114. Stratis-Cullun D.N., Griffin G.D., Mobley J., Vass A.A., Vo-Dinh T. A miniature biochip system for detection of aerosolized Bacillus globigii spores // Anal. Chem. 2003. - V. 75, N 2. - P. 275-280.

115. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium // Mol. Microbiol. 2002. -V. 45, N 1. - P. 169-178.

116. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. Polymorphism in the collagen-like region of the Bacillus anthracis BclA protein leads to variation in exosporium filament length // J. Bacteriol. 2003. - V. 185, N 5. - P. 1555-1563.

117. Tang S., Moayeri M., Chen Z., Harma H., Zhao J., Hu H., Purcell R.H., Leppla S.H., Hewlett I.K. Detection of anthrax toxin by an ultrasensitive immunoassay using europium nanoparticles // Clin. Vaccine Immunol. 2009. -V. 16, N3.-P. 408-413

118. Thompson B.M. The role of the glycoprotein BclB in the exosporium of Bacillus anthracis: PhD dissertation. Kansas State University, 2007.

119. Thorne C. B., Gomez C.G., Housewright R.D. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis. II. The effect of carbon dioxide on peptide production on solid media // J. Bacteriol. 1952. - V. 63, N 3. -P. 363-368.

120. Tims T.B., Lim D.V. Rapid detection of Bacillus anthracis spores directly from powders with an evanescent wave fiber-optic biosensor // J. Microbiol. Methods-2004.-V. 59,N l.-P. 127-130.

121. Turner A.J., Galvin J.W., Rubira R.J., Miller G.T. Anthrax explodes in an Australian summer // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87, N 2. - P. 196-199.

122. Wang D.B., Yang R., Zhang Z.P., Bi L.J., You X.Y., Wei H.P., Zhou Y.F., Yu Z., Zhang X.E. Detection of B. anthracis spores and vegetative cells with the same monoclonal antibodies // PLoS One. 2009. - V. 4, N 11: e7810.

123. Wang S.H., Wen J.K., Zhou Y.F., Zhang Z.P, Yang R.F, Zhang J.B., Chen J., Zhang X.E. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR on DNA chip // Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 20, N 4. -P. 807-813.

124. Weyant R.S., Edmonds P., Swaminathan B. Effect of ionic and nonionic detergents on the Taq polymerase // Biotechniques 1990. - V. 9, N 3. -P. 308-309.

125. Williams D.D., Benedek O., Turnbough Jr. C.L. Species-specific peptide ligands for the detection of Bacillus anthracis spores // Appl. Environ. Microbiol. -2003. -V. 69, N 10. P. 6288-6293.

126. Williams D.D., Turnbough C.L. Surface layer protein EA1 is not a component of Bacillus anthracis spores but is a persistent contaminant in spore preparations // J Bacteriol. 2004. - V. 186, N 2. - P. 566-569.

127. Wilson W.J., Erler A.M., Nasarabadi S.L., Skowronski E.W., Imbro P.M. A multiplexed PCR-coupled liquid bead array for the simultaneous detection of four biothreat agents // Mol. Cell. Probes 2005. - V. 19, N 2. - P. 137-144.

128. Zahavy E., Heleg-Shabtai V., Zafrani Y., Marciano D., Yitzhaki S. Application of fluorescent nanocrystals (q-dots) for the detection of pathogenic bacteria by flow cytometry // J. Fluoresc. 2010. - V. 20, N 1. - P. 389-399.

129. Zhang Y., Qiu J., Zhou Y., Farhangfar F,, Hester J., Lin A.Y., Decker W.K. Plasmid-based vaccination with candidate anthrax vaccine antigens induces durable type 1 and type 2 T-helper immune responses // J. Vaccine 2008. -V. 26, N5. -P. 614-622.

130. Биотехнологии. 2010. ----------------------------------------------------------------------------------------------------

131. Метрология, стандартизация, контроль1. УДК 571.27 + 579.61л к хлынцЕвд'-*, е.в. голова1, и.в. жабников а'", и.о. тюменцсвл2.а н куличенко1, и л. дятлов1, и г. шемякин1

132. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных частиц с иммобилизованными моноклопальнымиантителами

133. Ключеные с.чики: активность, магнитоиммуносорбситы, моноклинальные антитела, специфичность.

134. Трудности индикации В. амНгаш в объектах внешней среды обусловлены не только низкой концентрацией, но и сходством возбудителя с другими видами аэробных спорообразуюших микроорганизмов рода ВасШш.

135. Хлынцсва Анна"Ёвгеньевна, Белова Елена Валентиновна, Жарникова Ирина Викторовна. Тюменцева Ирина Степановна, Кули-ченко Александр Николаевич. Дятлов Иван Алексеевич, Шемякин Игорь Георгиевич.

136. Получение гибридом. Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/c массой90 з4-месячного возраста (ФГУН ГНЦ ПМБ).

137. Б и от и 11 и л и р о в :i н и ц антител. При готов л е -мне биотннилирующего реагента проводили по методу Diik 6. Концентрацию биотитшлирован-ных антител определяли по ОП фракций при длине полны 280 им, рабочий ти тр конъюгированных моноАТ .в ИФА.

138. Получение сибиреязвенных иммупопс-роксишиных коныогатов осуществляли методом периодатного окисления по 7. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике [8] в «с;ждвич»~варианте ИФА.

139. Получение магннтонммуносорбентных диагностикумов. На поверхности 0,4 г активированных МС иммобилизовали белковый лиганд

140. Для проведения анализа были приготовлены биотинилированные образцы всех полученных антител; двусайтовый дот-блот-анализ прово1. X')1. Бнотсмтлогня. 20¡0, М- 4

141. КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ СПОР ВасШпотНгай

142. В ри/\ч/ас1сп.х - - - 41. В. /¡гтих 4

143. В, 1агегохрот.\ - . -41. В. ршиШ.ч 4

144. В, ашЬтп.ч СТИ-1 4- -+■ -ь 4 1- 4 4 4- 4- •4- 4- 4- 4- 4 4 -4- + 4- + 4- 4- 4

145. В. ашЬгас'ш М-71 4- + 4- .(. + +. 4- 4 4- 4 I- 4- 4-4-4- 4- 4- 4- 4- 4- +

146. В. тВи-аах М-7 1/1 2 4- 4- 4- 1 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- 4- 4- + 4- 4- -4- 4- 4- +

147. В. <1гн/1гас1х 34 Р2 ■(■ + + 4- 4- -I 4- 4- + + + + 4 + + 4- 4- -4- 4- 4

148. В. атНгаси 228/8 .1. .) + 4- 4- 4- + + 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- + 4- + 4

149. В аги/п-цс/Х 220 .). Д. + 4-4- 4- 4- 1 4- + + 4- 4- + 4

150. В. апИи-ас'п 81/1 + 4-4- .(. + (- 4- 4- + + + 4-4-4- 4- 4 4- 4- 4- 4

151. В. Ш11/ИЖ1.'! 6381 4- -(- 4- 4- 4- 4- + + 4- + + 4- 4- + 4- -4 4- + + + 4

152. В. ап/1,гаси А-205 + 4 4- + 4- + -4- 4- 4- + + 4- 4- -1- 4- + 4-4- 4- + 4

153. В. апг/н-аах А-206 4- + 4- 4- + 4- + 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- .) + + 4- 4- 4

154. В. амЬ-аах А-2 10 4- 4- 4- + 4- 4- 4- 4- 4- 4-4-4- + + 4- 4- 4- + 4- + 4

155. В. ап/ЬгисЬ А-2 1 1 4- + + 4 4- 4- + 4- + 4- 4 4- 4- 4- 4- 4-4-4- 4- -1- 4

156. В. anthrac.it 8189 4- -4- 4- 4- 4- 4- 4 4- 4- 4- 4- + 4- -К 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4

157. В. атЬгпс!* ЮЗ 4- 4- -4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- + + 4 4- 4- + 4- + + 4- 4- +

158. В. ап/Ьгасчх 1 73 -4-4- + 4- 4 + 4-4- 4-4- 4-4- 4- + 4

159. В. ашИгаах 4-7 4-4- 4-4- 4-4- 4-4- 4-4- + 4- + + 44. +). ( ++), ( + ) — различная степень интенсивности реакции; (--) — отсутствие реакции.1. Биотехнология, 2010, № 485