Молекулярно-генетическая характеристика возбудителей фасциолёза - Fasciola hepatica (Linnaeus,1758) и F. gigantica (Cobbold,1855) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.11, кандидат биологических наук Гуляев, Андрей Сергеевич

• Гуляев, Андрей Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гуляев, Андрей Сергеевич

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Особенности биологии и экологии, эволюция и происхождение сосальщиков рода /число/я

1.2. Фасциолициды и проблема резистентности фасциол к антигельминтным препаратам

1.3. Структура и состав митохондриального генома трематод

1.4. Молекулярно-генетические методы, применяемые для исследования трематод

1.5. Исследования генов рДНК кераИса

1.6. Исследования митохондриального генома фасциол

1.7. Исследования ядерных белок-кодирующих генов фасциол

2. Собственные исследования

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Фиксация образцов и выделение ДНК

2.2.2. Подбор праймеров

2.2.3. Полимеразная цепная реакция

2.2.4. Элюция и секвенирование

2.2.5. Клонирование

2.2.6. Статистическая и биоинформатическая обработка результатов

2.3. Результаты исследований 60 2.3.1. Характеристика полиморфизма белок-кодирующих локусов митохондриального генома фасциол

2.3.2. Филогенетический анализ локусов nadl и coxl F.hepatica из разных частей ареала

2.3.3. Филогенетические реконструкции с использованием последовательностей генов

Fasciola spp. из открытых источников

2.3.4. Характеристика митохондриального генома F.hepatica и F.gigantica

2.3.5. Внутри- и межвидовой полиморфизм транспортных РНК мт-генома печеночных сосальщиков

2.3.6. Структура, полиморфизм и филогенетический анализ генов тубулина-Р2 (tubb2)

3. Обсуждение

Выводы

Практические предложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика возбудителей фасциолёза - Fasciola hepatica (Linnaeus,1758) и F. gigantica (Cobbold,1855)»

Актуальность проблемы. Фасциолез является одним из опасных гельминтозов животных и человека. В мире до 17 миллионов человек заражено фасциолёзом и ещё 250 миллионов находятся под угрозой заражения (Robinson and Dalton, 2009). Инвазированность жвачных животных фасциолами в отдельных регионах России достигает 80%, глобальные потери сельского хозяйства от фасциолёза, оцениваются в три миллиарда долларов (Горохов, 1986; Вогау, 1994; Архипов, 1999; Лошкарева, 2005).

Для борьбы с фасциолёзом применяются антигельминтики из класса салициланилидов и бензимидазолов. Известны случаи возникновения резистентности фасциол к действию препаратов обеих групп, причины которой пока еще полностью не раскрыты (Fairweather, 1999; Miller et al., 1994; Gaasenbeek, 2000; Jackson, 2000; Robinson, 2002).

Ядерные и митохондриальные ДНК интенсивно используются для изучения родственных взаимосвязей и динамики генетических процессов в популяциях, описания структуры вида и истории его возникновения. Общебиологический интерес представляют процессы систематики и филогении трематод, взаимодействия паразита с окружающей средой, в качестве которой выступает не только комплекс природных абиотических факторов, но и сам организм животного-хозяина.

Все эти результаты свидетельствуют о высокой генетической неоднородности популяций сосальщиков двух видов в разных частях мирового ареала. Частичные последовательности мт-генов nadl и coxl были успешно использованы для дифференциации западно-азиатских и восточно-европейских популяций фасциол. На изученном ареале были обнаружены 13 гаплотипов, распределенных по двум генеалогическим линиям (Semyenova et al., 2006). Генетический полиморфизм обнаружен в отдельных популяциях F.hepatica стран Европы, Латинской Америки и Африки (Mas-Coma et al., 2003; Walker et al., 2007, 2011; Teofanova et al., 2011; Kantzoura et al., 2011). Неожиданно высокая нуклеотидная дивергенция мтДНК обнаружена у морфологически неразличимых образцов F.gigantica из Танзании и Индии, инфицирующих различных дефинитивных хозяев (Walker et al., 2012).

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в поиске новых маркеров ядерного и митохондриального генома для выявления генетической дифференциации Fasciola hepatica и F. gigantica и установления взаимосвязей между этими видами печеночных сосальщиков.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Скрининг генетической изменчивости популяций из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор) по полным последовательностям двух митохондриальных генов nadl, coxl.

2. Подтверждение существования двух генеалогических линий F.hepatica.

3. Установить особенности внутри- и межвидовой изменчивости трематод рода Fasciola из популяций России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана на основании полных последовательностей мт-генов, которые кодируют двенадцать белков, две субъединицы рРНК и 23 транспортных РНК.

4. Определить уровни генетической дивергенции и выявить филогенетические взаимосвязи между двумя видами трематод рода

Fasciola на основании полиморфизма белок-кодирующих последовательностей мтДНК.

4. Изучить структуру ядерного гена тубулина-(32 (tubb2) и оценить уровни внутри- и межвидовой изменчивости сосальщиков рода Fasciola.

5. Разработать методические рекомендации для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков, пригодной для дальнейшего использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы кодирующие последовательности мт-генома шести представителей двух видов печеночных сосальщиков F. hepatica и F. gigantica, обитающих на территории России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана. На основании полиморфизма белок-кодирующих последовательностей мтДНК определен уровень генетической дивергенции и установлены филогенетические взаимосвязи между двумя видами сосальщиков рода Fasciola. Впервые у сосальщиков рода Fasciola изучена структура ядерного гена тубулина-|32 (tubb2), являющегося основной мишенью для действия антигельминтных препаратов группы бензимидазолов.

Практическое значение работы. Разработаны методические рекомендации для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков, пригодной для дальнейшего использования в полимеразной цепной реакции. Методические положения одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН от 22 марта 2012 года (протокол №1).

Разработанные новые маркеры мтДНК могут использоваться для видовой идентификации возбудителей фасциолеза на разных стадиях жизненного цикла, что значительно повышает эффективность санитарно-эпидемиологических мероприятий, направленных на выявление природных очагов фасциолеза и разработку методов борьбы с ними. Кроме того, особенности популяционного распространения полиморфизма гена (ШЬЬ2) в перспективе могут быть использованы для поиска генов резистентности к действию антигельминтных препаратов. Все эти результаты могут найти применение при разработке медико-ветеринарных программ в соответствующих учреждениях РАН и РАСХН, таких как Центр Паразитологии ИПЭЭ РАН и ВИГИС РАСХН, ветеринарных академиях, институтах, факультетах и других учреждениях медико-ветеринарного профиля.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях:

1. Международная научная конференция «Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов», посвященная 130-летию со дня рождения академика К.И. Скрябина (9-11 декабря 2008 года);

2. III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия» (24 - 29 мая 2010);

3. Международная научная конференция «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (30 ноября - 3 декабря 2010);

4. Международная научная конференция «Ломоносов» (9-13 апреля, 2012);

5. Научная конференция «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (16-18 мая, 2012);

6. The 3rd Moscow International Conference "Molecular Phylogenetics (MolPhy-З)" (July 31 - August 4,2012);

7. Межлабораторный семинар Института биологии гена РАН (29 января 2013 г.).

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом 4-х летних научных исследований автора. Подтверждение существования генеалогических линий F. hepático, скрининг генетической изменчивости популяций из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор) по полным последовательностям митохондриальных генов; выявление внутри- и межвидовой изменчивости сосальщиков рода Fasciola из разных географических популяций; выявление филогенетических взаимосвязей между двумя видами сосальщиков рода Fasciola; разработка методических рекомендаций для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков аспирантом выполнены лично. В совместных статьях с Васильевым В.А., Семеновой С.К., Архиповым И.А., Гороховым В.В. и Москвиным A.C. основная часть исследований (более 80%) была выполнена диссертантом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Существование двух генеалогических линий F.hepatica в популяциях из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор).

2. Особенности внутри- и межвидовой изменчивости трематод рода Fasciola из популяций России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана.

3. Уровни генетической дивергенции и филогенетические взаимосвязи между двумя видами сосальщиков рода ГаБсШа.

4. Структура ядерного гена тубулина-|32 (ЫЬЬ2) и его уровни внутри- и межвидовой изменчивости у трематод рода РаясЫа.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, 3 статьи в издании, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы включает 145 наименований, в том числе 18 отечественных и 127 иностранных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 23 рисунками. Приложение на 25 страницах.