Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Шеховцов, Сергей Викторович

• Шеховцов, Сергей Викторович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шеховцов, Сергей Викторович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика семейства Opisthorchiidae.

1.2 Биологическая характеристика исследуемых видов.

1.2.1 Развитие в первом промежуточном хозяине.

1.2.2 Развитие во втором промежуточном хозяине.

1.2.3 Развитие в окончательном хозяине.

1.3 Географическое распространение.

1.3.1 Ареал O.felineus.

1.3.2 Ареал С. sinensis.

1.3.3 Ареал О. viverrini.,.,.

1.3.4 Ареалы М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum.

1.4 Морфологическое строение и систематическое положение изучаемых видов.

1.5 Систематическое положение исследуемых видов.

1.5.1 п\сем Opisthorchiinae.

1.5.2 п\сем Metorchiinae.

1.6 Характеристика молекулярных маркеров.

1.7 Характеристика митохондриальных геномов плоских червей.

1.8 Молекулярно-филогенетические исследования описторхид.

1.9 Работы по изучению внутривидовой изменчивости описторхид.

1.10 Филогенетические методы анализа последовательностей.

1.10.1 Методы, основанные на вычислении филогенетических дистанций.

1.10.2 Метод максимальной парсимонии.

1.10.3 Метод максимального правдоподобия.

10.11 Филогеография трематод.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Выделение биологического материала.

2.1.1 Компрессионный метод выделения метацеркарий.

2.1.2 Выделение метацеркарий путем переваривания мышц рыбы в искусственном желудочном соке.

2.1.4 Выделение марит из печени искусственно зараженного хозяина.

2.2 Выделение нуклеиновых кислот.

2.2.1 Выделение ДНК из марит и метацеркарий фенольным методом.

2.2.2 Выделение ДНК из марит и метацеркарий перевариванием протеиназой К.

2.2.3 Выделение ДНК из марит и метацеркарий при помощи гуанидинизотиоцианата.

2.2.4 Выделение плазмидной ДНК.

2.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях.

2.4 Трансформация плазмидной ДНК в клетки E.coli.

2.5 Подготовка компетентных клеток Е. coli для электропорации.

2.6 Элюция ДНК из агарозного геля.

2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и олигонуклеотиды.

2.8 Компьютерный анализ последовательностей ДНК.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini.

3.2 Филогеография О, felineus.,.

3.3 Филогения видов сем. Opisthorchiidae.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Митохондриальные геномы.

4.2 Филогеография O.felineus.

4.3 Филогения видов сем. Opisthorchiidae.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование генетического разнообразия эпидемиологически значимых видов описторхид»

Семейство Opisthorchiidae (кл. Trematoda, тип Platyhelminthes) включает в себя паразитов почти всех классов позвоночных, главным образом млекопитающих и птиц. Тремя представителями этого семейства -Opistorchis felineus, Clonorchis sinensis и О. viverrini — заражены около 30 млн человек в мире (King, Scholtz, 2001) и примерно 300 млн человек находится в группе риска. О. felineus является важным паразитом человека на территории России и республик бывшего СССР - Украины, Белоруссии, Казахстана и стран Прибалтики (Беэр, 2005). С. sinensis поражает людей в Китае, Корее, Японии, Лаосе, Вьетнаме и на Дальнем Востоке России (Посохов, 2004; Lun et al, 2005). О. viverrini распространен в Таиланде, Лаосе, Вьетнаме и Камбодже.

В то время как важность трех вышеупомянутых видов не вызывает сомнения, существуют данные, что в некоторых случаях человека могут поражать ряд других видов описторхид. Pseudamphistomum truncatum считается настолько же патогенным для человека, как и О. felineus (Ромашов с соавт., 2005; Скрябин, Петров, 1950). Есть сообщения, что Metorchis bilis и М. xanthosomus также могут быть опасны для человека (Сидоров, 1983). Это дает некоторым'' авторам основания полагать, что в некоторых географических районах заболеваемость может вызываться сразу несколькими видами опистохид (Ромашов с соавт., 2005), причем особенности симптоматики и лечения смешанных заболеваний пока не известны. •

Как сем. Opisthorchiidae, так и кл. Trematoda в целом с молекулярной точки зрения изучены слабо. Различные представители кл. Trematoda значительно отличаются друг от друга по жизненному циклу, в котором различные стадии трематод могут иметь от одного до четырех хозяев, обычно двух или трех. Стадий размножения тоже несколько: на стадии мариты происходит половое размножение, а подробности размножения спороцисты и редии в деталях неизвестны; по наиболее распространенному мнению оно представляет собой бесполое клональное размножение (Гинецинская, 1968).

Больше всего молекулярных исследований проведено на кровяных двуустках, которые значительно отличаются от прочих трематод, в особенности наличием полового диморфизма (все прочие трематоды гермафродитны). Следующими по количеству работ идут фасциолиды {Fasciola hepatica, Fasciola gigantica и Fasciolopsis buski) и Paragonimus westermani. У первых отсутствует стадия метацеркарии; церкария превращается в адолескарий, который напрямую попадает в окончательного хозяина. У P. westermani вторые промежуточные хозяева - ракообразные, которые отличаются от рыб - вторых промежуточных хозяев описторхид -по тем расстояниям, на которые они способны мигрировать, а, следовательно, эпидемиологически P. westermani и описторхиды могут значительно отличаться.

Описторхиды отличаются от фасциолид и парагонимид не только наличием в жизненном цикле второго промежуточного хозяина, но и иным соотношением плодовитости на бесполой и половой стадиях, что оказывает влияние и на популяционные характеристики. Таким образом, возможно, что для каждой изучаемой группы трематод следует подбирать подходящие именно этой группе генетические маркеры.

До сих пор работы на описторхидах по прямому исследованию изменчивости ДНК не предоставили большого количества информации, главным образом, из-за недостаточной вариабельности используемых маркеров. В этой связи перед исследователями в первую очередь стоит задача подбора маркеров с оптимальной вариабельностью, что является непростой задачей для малоизученных на молекулярном уровне организмов со сложным биологическим циклом.

Наибольшее число исследований меж- и внутривидового разнообразия трематод проводится при использовании последовательностей рибосомального кластера и некоторых митохондриальных генов (coxl, ndl). В то время как единообразие используемых разными авторами маркеров удобно при сравнении результатов разных авторов, у такого подхода есть и недостатки. Эти последовательности могут оказаться недостаточно вариабельными для решения некоторых задач. Кроме того, в ряде случаев использование только одного маркера может привести к неверным выводам (Zhang, Hewitt, 2003). Некоторые авторы рекомендуют использовать маркеры из различных геномов (ядерные и митохондриальные), мультигенный анализ и анализ разных по своей функциональности последовательностей (белок-кодирующие последовательности, интроны, межгенные промежутки).

Одной из главных мишеней для решения филогенетических и филогеографических вопросов у животных является митохондриальный геном. Он содержит набор генов, среди которых белок-кодирующие последовательности, рибосомальные и транспортные РНК, а также некодирующие районы. Это дает возможность для выбора маркеров с разной скоростью эволюции; кроме того, используются и такие структурные признаки, как последовательность и ориентация генов, особенности вторичной структуры функциональных РНК.'

Нашей целью было исследовать меж- и внутривидовое разнообразие описторхид по последовательностям различного происхождения: внутренним транскрибируемым спейсерам рибосомального кластера, экзонным и интронным участкам ■ ядерных4 генов, митохондриальным последовательностям.

Одной из задач, которую предстоит решить молекулярными методами - это ревизия систематики семейства. В настоящее время она основывается на морфологии взрослой стадии; главные проблемы ее - это неопределенность относительного веса признаков. при оценке взаимоотношений видов, большая зависимость морфологии паразита от средовых факторов (вида окончательного хозяина и интенсивности инвазии) и наличие переходных форм у многих признаков (Скрябин, Петров, 1950). Альтернативный подход основывается на морфологии церкарий, которые считаются некоторыми исследователями рекапитуляцией предковых форм (King, S.choltz, 2001); результаты его часто конфликтуют с традиционной систематикой.

Важной задачей является также исследование параметров внутривидовой изменчивости описторхид. Препятствием, тормозящим развитие этих исследований, является недостаток таких работ в целом по классу. Если в случае позвоночных или членистоногих исследователь может сравнить свои данные с данными других авторов по близкородственному виду, то в случае трематод - в лучшем случае с представителем другого семейства или отряда. Работы по изучению внутривидовой изменчивости необходимы для понимания закономерностей эволюции беспозвоночных в целом. Кроме того, эти результаты могут быть важны для понимания эпидемиологии описторхидозов.

Цель и задачи исследования

Основной целью данного исследования было определение меж- и внутривидовой изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК О. felineus и близкородственных видов - С. sinensis, О. viverrini, М. bilis и М. xanthosomus.

В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus, С. sinensis и О. viverrini и их анализ.

2. Исследование филогенетических взаимоотношений между О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. triincatum при помощи митохондриальных и ядерных маркеров.

3. Исследование внутривидовой структуры О. felineus на территории России при помощи митохондриальных маркеров.

Научная новизна

Разработаны новые ядерные (9й интрон гена парамиозина и гистон HI) и митохондриальные (сохЗ и atp6) маркеры описторхид. Усовершенствованы системы использования ранее использовавшихся маркеров coxl и ITS2. По данным маркерам получены нуклеотидные последовательности образцов О. felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum и реконструированы филогенетические отношения между этими видами. Впервые проведена реконструкция полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома О. viverrini. Проведено масштабное исследование генетической изменчивости О. felineus на молекулярном уровне.

Практическая значимость работы

Полученные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов и ядерных маркеров найдут применение в эпидемиологических исследований в качестве маркеров видов и популяций, а также в медицинских диагностических наборов на основе ДНК.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.А. Мордвинову и академику РАН Н.А. Колчанову за чуткое и внимательное руководство работой. Особые слова благодарности автор выражает к.б.н. А.В. Катохину, S. Konkow и К.П. Романову за неоценимую помощь в выполнении экспериментальных исследований, а также всему коллективу лаборатории функциональной геномики ИЦиГ СО РАН за помощь и советы по выполнению работы. Автор крайне признателен д.б.н. Н.И. Юрловой, к.б.н. Е.А. Сербиной, к.б.н. С.Н. Водяницкой, д.б.н. К.П. Федорову, д.б.н. В.В. Беспрозванных, д.б.н. F. Ohyama, д.б.н. P. Sithithaworn, д.б.н. Б.В. и В.А. Ромашовым, д.б.н. В.Б. Локтеву и д.б.н. О.А. Морозовой за предоставленные образцы описторхид. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. Л.И. Гундериной и д.б.н. Ю.Г. Матушкину за любезно предоставленную возможность воспользоваться их лабораторным оборудованием, а также всех сотрудников Межинститутского Центра Секвенирования СО РАН за проведение капиллярного электрофореза реакции секвенирования и анализ полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность Е.А. Иванкиной, д.б.н. С.А. Демакову, к.б.н. Т.Д. Колесниковой, к.б.н. Н.В. Володько, к.б.н. П.Н. Меныыанову и к.б.н. Ю.Ю. Илинскому за неоценимую помощь и советы по выполнению работы. Отдельно хотелось бы поблагодарить к.б.н. О.Э. Костерина, к.б.н. А.Г. Блинова и к.б.н. Н.С. Юдина за ценные замечания, высказанные при чтении рукописи данной работы.

Публикации

1. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. The complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opistorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda) // Parasitology International. 2010. V. 59. P. 100103.

2. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Romanov K.V., Besprozvannykh V.V, Fedorov K.P. , Yurlova N.I., Serbina E.A., Sithithaworn P., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) // Parasitology Research. 2009. V. 106 P. 293-297.

3. Катохин A.B., Шеховцов C.B., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина E.A., Водяницкая C.H., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama F., Махнева Т.В., Пельтек С.Е., Мордвинов В.А. Оценка генетических отличий

Opistorchis felineus от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis no ITS2- и CO 1-последовательностям // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421. № 4. С. 549-552.

4. Мордвинов В.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Шеховцов С.В., емаков С.А., Катохин А.В., Колчанов Н.А., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома возбудителя описторхоза, Opisthorchis felineus // Живые системы. № 1. С. 95100.

5. Патент на изобретение № 2332456. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Шеховцов С.В., Пельтек С.Е. Фрагмент FR316 митохондриального гена ndl, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза. Приоритет изобретения 05 декабря 2006 г.

6. Шеховцов С.В., Катохин А.В., Конков С., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Беспрозванных В.В., Охияма Ф., Сититаворн П., Локтев В.Б., Мордвинов В.А. Исследование генетического разнообразия описторхид - О. felineus, О. viverrini, С. sinensis и М. bilis // «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С.223-226.

7. Katokhin A., Shekhovtsov S., Konkow S., Yurlova N., Serbina E., Vodianitskaia S., Fedorov K., Besprozvannykh V., Ohyama F., Peltek S., Mordvinov V. Analysis of Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda, Digenea, Opisthorchiidae) ITS2 and COl Sequences Variations // XX International Congress of Genetics. Berlin. 2008. p 235.

8. Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Konkow S., Yurlova N.I., Serbina E.A,, Vodianitskaia S.N., Fedorov K.P., Besprozvannykh V.V., Ohyama F., Sithithaworn P., Loktev V.B., Mordvinov V.A. Comparative phylogenetic analysis of opisthorchiid species based on nuclear and mitochondrial sequences // Proceedings Of The Sixth International Conference On Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure. 2008. p. 735.

9. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Романов К.В., Брусенцов И.И., Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Федорова 15-20 сентября 2009 г. Новосибирск. ООО Компания "Талер-Пресс" 2009. С. 121-123.

10. Шеховцов С.В. Изменчивость митохондриального генома у кошачьей двуустки на территории России // Матер1али IV М1ждународши конференицп молодих науковщв «Бюлогия: вщ молекули до бюсфери». Харюв. 2009 г. С. 153-154.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Шеховцов, Сергей Викторович

выводы

1. Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini имеют стандартный для трематод набор генов и порядок их следования, совпадающий с таковым у F. hepatica. Обнаружены альтернативные структуры для TPHK-Ser(AGN) О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Выявлено отсутствие DHU-петли у тРНК-Cys О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. Впервые для трематод обнаружено перекрывание стоп-кодона с последующим геном тРНК.

2. Обнаружено отсутствие в контрольных районах митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis тандемных повторов и шпильек; кроме того, не выявлено сходства нуклеотидных последовательностей некодирующих регионов этих видов между собой. Это позволяет заключить, что ни консервативные мотивы, ни тандемные повторы, ни особенности вторичной структуры не являются необходимыми для функционирования контрольного региона описторхид.

3. Данные филогенетического анализа подтверждают предположения о синонимичности родов Clonorchis и Opisthorchis.

4. Показано, что схема филогенетических отношений О. viverrini с другими описторхидами, полученная по митохондриальным маркерам, не совпадает с таковой по ядерным маркерам и по морфологическим признакам. Это, предположительно, является следствием ускоренной эволюции мтДНК у данного вида или интрогрессии митохондриального генома от другого вида.

5. При помощи филогенетического анализа наряду с представителями видов М. bilis и М. xanthosomus обнаружен еще один криптический вид рода Metorchis.

6. Анализ изменчивости митохондриальной последовательности, включающей в себя частичную последовательность гена сохЗ, межгенного спейсера и гена TPHK-His, у 123 образцов из 13 популяций О. felineus из трех речных систем (Дон, Урал и Обь-Иртышская система) показал отсутствие достоверных различий между этими популяциями. Данные позволяют выдвинуть гипотезу о происхождении популяций О. felineus на территории России от одной небольшой популяции вследствие ее экспансии во время микулинского межледниковья.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шеховцов, Сергей Викторович, 2010 год

1. Бэер С.А. Биология возбудителя описторхоза // Москва: Товарищество научных издательств КМК. 2005.336 с.

2. Виноградов Л.И. Циркуляция возбудителя описторхоза (Opisthorchis felineus) в условиях Семипалатинской области // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1970, Алма-Ата.

3. Динамика ландшафтных компонентов и внутренних морских бассейнов северной Евразии за последние 130000 лет. Атлас-монография. Под ред. А.А. Величко. Москва: ГЕОС. 2002. 296 стр.

4. Кануникова Е.А., Соловых Т.Н. Типизация очагов описторхоза в Оренбуржье // Мед. Паразитология 2007 №3 11-14.

5. Малков С.Н. Описторхоз в бассейнах Вятки и верховья Камы // Ветеринария 1991, Т 4. С. 39-41. .

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярной клонирование// Москва: Мир. 1984.

7. Размашкин Д.А. Видовая принадлежность метацеркарий рода Metorchis (Trematoda, Opisthorchiidae) из, рыб. Западной Сибири // Паразитология 1978 Т 12.68-78.

8. Ромашов Б.В. Природно-очаговые гельминтозы в Центральном Черноземье (Воронежская область) // «Паразитология в XXI веке -проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С. 96-100.

9. Посохов П.С. Клонорхоз в Приамурье // Хабаровск: Издательство Дальневосточного государственного медицинского университета. 2004. 187с. ' . •••

10. Сергиев В.П. Регистрируемая и истинная распространенность паразитарных болезней // Мед. Паразитология 1991 Т 2. 3-5.

11. Сидоров Е.Г. Природная очаговость описторхоза // Алма-Ата: Наука.1983,240с. / , ;,,:,.

12. Скрябин К.И., Петров A.M. Трематоды животных и человека // Т.4 Москва: Наука. 1950.

13. Филимонова JI.B. Таксономический обзор двух подсемейств {Opisthorchiinae Looss, 1899 и Plotnikoviinae Skrjabin,1945) семейства Opisthorchiidae (Looss, 1899) фауны России // в: "Актуальные проблемы паразитологии". Москва: Наука. 2000.

14. Хедрик Ф. Генетика популяций // Москва: Техносфера. 2003. 592 с.

15. Adlard, R. D., Barker, S. C., Blair, D., and Cribb, Т. H. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) form populations and species of Fasciolidae (Digenea) // International Journal for Parasitology. 1993 V.23 P. 423-425.

16. Agatsuma, Т., Arakawa, Y., Iwagami, M., Honzako, Y., Cahayaningsih, U., Kang, S-Y., and Hong, S-J. Molecular evidence of natural hybridization between Fasciola hepatica and F. gigantica II Parasitology International. 2000 V. 49 P. 231-238.

17. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. Basic local alignment search tool // Journal of Molecular Biology. 1990 V.215 P. 403410.

18. Ando, K., Sithithaworn, P., Nuchjungreed, C., Tesana, S., Srisawangwong,

19. Т., Limviroj, W., and Chinzei, Y. Nucleotide sequence of mitochondrial COI andt 'ribosomal ITSII of Opisthorchis viverrini in Northeast Thailand. // The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 2001 V.32 P. 17-22.

20. Avise, J. C. Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press. 2000.

21. Bailey, T. L. and Gribskov, Й. Combining evidence using p-values: application to sequence homology searches // Bioinformatics. 1998 V. 14 P. 48-55.

22. Beheregaray, L. B. Twenty years of phylogeography: the state of the field and the challenges for the:Southern Hemisphere,// Molecular Ecology. 2008 V.17 P. 3754-3774.

23. Behura, S. K. Molecular marker systems in insects: current trends and future avenues//Molecular Ecology. 2006 V. 15 P. 2087-3113.

24. Benson, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences // Nucleic Acids Research. 1999 V.27 P. 573-580.

25. Bessho, Y., Ohama, Т., and Osawa, S. Planarian Mitochondria II. The Unique Genetic Code as Deduced from Cytochrome с Oxidase Subunit I Gene Sequences // Journal of Molecular Evolution. .1992 V.34 P. 331-335.

26. Boore, J. L. Animal mitochondrial genomes // Nucleic Acids Research. 1999 V.27 P. 1767-1780.35.: Boore, J. L., Macey, J. R., and Medina, M. Sequencing and Comparing Whole Mitochondrial Genomes of Animals. // Methods in Enzymology 2005. P. 311-348.

27. Braun, M. DieTierischen Parasiten Des Menschen. Leipzig. 1925.

28. Brinkman, F. S. L., Leipe, D. D. Phylogenetic Analysis // Baxevanis, A. D., Ouellette, B. F. F. Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. 2001. P. 323-358.

29. Brown, W. M., George, M., and Wilson, A. C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proceedings of the National Academic Society. 1979 V.76 P. 1967-1979. ■

30. Brunhoff, C., Galbreath, К. E., Fedorov, V. В., Cook, J. A., and Jaarola, M. Holarctic phylogeography of the* root vole (Microtus oeconomus): implications for late Quaternary biogeography of high latitudes // Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 957-968.

31. Chenuil, A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical aspects // Genetica. 2006 V.127 P. 101-120.

32. Cho, P. Y., Lee, M. J., Kim, Т. I., Kang, S., and Hong, S. Expressed sequence tag analysis of adult Clonorchis sinensis, the Chinese liver fluke // Parasitology Research. 2006 V.99 P. 602-608.

33. Cho, P. Y., Kim, Т. I., Whang, S. M., and Hong, S. Gene expression profile of Clonorchis sinensis metacercariae // Parasitology Research. 2007 V.

34. Cho, S-H., Lee, K-Y., Lee, B-C., Cho, P. Y., Cheun, H-I., Hong, S-T., Sohn, W-M., and Kim, T-S. Prevalence of Clonorchiasis in Southern Endemic Areas of Korea in 2006 // Korean Journal of Parasitology. 2008 V.46 P. 133-137.

35. Choi, В. I., Han, J. K., Hong, S. Т., and Lee, К. H. Clonorchiasis and Cholangiocarcinoma: Etiologic Relationship and Imaging Diagnosis // Clinical Microbiology Reviews. 2004 V.l7 P. 540-552.

36. Coleman, A. W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure // Nucleic Acids Research. 2007 V.35 P. 3322-3329.

37. Curtis, J., Fraga, L. A., De Souza, C. P., Correa-Oliveira, R., and Minchella, D. J. Widespread heteroplasmy in schistosomes makes an mtVNTR marker "nearsighted" // Journal of Heredity. 2001 V.92 P. 248-253.

38. Davidova, M., Ondrackova, M., Jurajda, P., and Gelnar, M. Parasite assemblages of European bitterling (Rhodeus amarus), composition and effects of habitat type and host body size // Parasitology Research. 2007 V.102 P. 10011011.

39. Denver, D. R., Morris, K., Lynch, M., Vassilieva, L. L., and Thomas, W. K. High direct estimate of the mutation rate in the mitochondrial genome of Caenorhabditis elegans I I Science. 2000 V.289 P. 2342-2344.

40. Despres, L., Imbert-Establet, D., Combes, C., Bonhomme, F., and Monnerot, M. Isolation and polymorphism in mitochondrial DNA from Schistosoma mansoni //Molecular and Biochemical Parasitology. 1991 V.47 P. 139-142.

41. Ellegren, H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution I I Nature Reviews Genetics. 2004 V.5 P. 435-445.

42. Erhardt, A., Germer, W. D., and Hoerning, B. Die Opisthorchiasis, hervorgerufen durch den Katzenleberegel Opisthorchis felineus (Riv.). Jena , Veb Gustav Fischer Verlag. 1962.

43. Fedorov, V. В., Goropashnaya, A. V., Jaarola, M., and Cook, J. A. Phylogeography of lemmings (Lemmus): no evidence for postglacial colonization of Arctic from the Beringian refugium // Molecular Ecology. 2003 Y.12 P. 725731.

44. Fedorov, V. В., Goropashnaya, A. V., Boeskorov, G. G., and Cook, J. A. Comparative phylogeography and demographic history of the wood lemming

45. Myopus schisticolor): implications for late Quaternary history of the taiga species in Eurasia I I Molecular Ecology. 2008 V.17 P. 598-610.

46. Goropashnaya, A. V., Fedorov, V. В., Seifert, В., and Pamilo, P. Limited phylogeographical structure across Eurasia in two red wood ant species Formicapratensis and F. lugubris (Hymenoptera, Formicidae) // Molecular Ecology. 2004 V.13P. 1849-1858.

47. Gyllensten, U., Wharton, D., Josefsson, A., and Wilson, A. C. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice //Nature. 1991 V.352 P. 255-257.

48. Haynes, S., Jaarola, M., and Searle, J. B. Phylogeography of the common vole (Microtus arvalis) with particular emphasis on the colonization of the Orkney archipelago I I Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 951-956.

49. Iwagami, M., Ho, L. Y., Su, K., Lai, P. F., Fukushima, M., Nakano, M., Blair, D., Kawashima, K., and Agatsuma, T. Molecular phylogeographic studies on Paragonimus westermani in Asia // Journal of Helminthology. 2000 V.74 P. 315322.

50. Iwagami, M., Rajapakse, R. P. V. J., Paranagama, W., and Agatsuma, T. Identities of two Paragonimus species from Sri Lanka inferred from molecular sequences // Journal of Helminthology. 2003 V.77 P. 239-245.

51. Iwagami, M., Rajapakse, R. P. V. J., Paranagama, W., Okada, T., Kano, S., and Agatsuma, T. Ancient divergence of Paragonimus westermani in Sri Lanka // Parasitology Research. 2007 V.102 P. 845-852.

52. Jannotti-Passos, L. K., Souza, C. P., Parra, J. C., and Simpson, A. J. G. Biparental Mitochondrial Dna Inheritance In The Parasitic Trematode Schistosoma Mansoni II Journal of Parasitology. 2001 V.87 P. 79-82.

53. Jeon, H.-K., Kim, K.-H., and Eom, K. S. Complete sequence of the mitochondrial genome of Taenia saginata: Comparison with T. solium and T. asiatica II Parasitology International. 2007 V.56 P. 243-246.

54. Johnston, D. A., Blaxter, M. L., Degrave, W. M., Foster, J., Ivens, A. C., and Melville, S. E. Genomics and the biology of parasites // BioEssays. 1999 V.21 P. 131-147.

55. Kaewkes, S. Taxonomy and biology of liver flukes // Acta Tropica. 2003 V.83 P. 177-186.

56. Kaewpitoon, N., Kaeqpitoon, S. J., and Pengsaa, P. Opisthorchiasis in Thailand: Review and current status // World Journal of Gastroenterology. 2008 V.14P. 2297-2302.

57. King, S. and Scholz, T. Trematodes of the family Opisthorchiidae: a minireview // The Korean Journal of Parasitology. 2001 V.39 P. 209-221.

58. Kondo, R., Satta, Y., Matsuura, E. Т., Ishiwa, H., Takahata, N., and Chigusa, S. I. Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila// Genetics. 1990 V.126 P. 657-663.

59. Kotlan, A. Helminthologie. Budapest. 1960.

60. Krone, O., Sternberg, Т., Kenntner, N., Tataruch, F., Koivusaari, J., and Nuuja, I. Mortality factors, helminth burden, and contaminant residues in whitetailed sea eagles (Haliaeetus albicilla) from Finland // Ambio. 2006 V.35 P. 98104.

61. Kvist, L., Martens, J., Ahola, A., and Orell, M. Phylogeography of a Palaearctic sedentary passerine, the willow tit (Parus montanus) II Journal of Evolutionary Biology. 2001 V.14 P. 930-941.

62. Kvist, L., Martens, J., Nazarenko, A. A., and Orell, M. Paternal leakage of mitochondrial DNA in the great tit (Parus major) // Molecular Biology and Evolution. 2003 V.20 P. 243-247.

63. Kvist, L., Martens, J., Higuchi, H., Nazarenko, A. A., Valchuk, O. P., and Orell, M. Evolution and genetic structure of the great tit (Parus major ) complex // Proceedings of the Royal Society of London B. 2003 V.270 P. 1447 -1454.

64. Ladoukakis, E. D. and Zouros, E. Direct evidence for homologous recombination in Mussel (Mytilus galloprovincialis) mitochondrial DNA // Molecular Biology and Evolution. 2001 V.18 P. 1168-1175.

65. Laha, Т., Pinlaor, P., Mulvenna, J., Sripa, В., Sripa, M., Smout, M. J., Gasser, R. В., Brindley, P. J., and Loukas, A. Gene discovery for the carcinogenic human liver fluke, Opisthorchis viverrini II BMC Genomics. 2007 V.8 P.

66. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Mitochondrial DNA sequences of human schistosomes: the current status // International Journal for Parasitology. 2000 V.30 P. 283-290.

67. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Complete DNA sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the liver fluke, Fasciola hepatica L. (Platyhelminthes; Trematoda)//Parasitology. 2001 V.123 P. 609-621.

68. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. A leucine zipper protein of mitochondrial origin // Biochimica et Biophysica Acta. 2001 V.1546 P. 435-443.

69. Le, Т. H., Blair, D., and McManus, D. P. Mitochondrial genomes of parasitic flatworms // Trends in Parasitology. 2002 V.18 P. 206-213.

70. Le, Т. H., McManus, D. P., and Blair, D. Codon usage and bias in mitochondrial genomes of parasitic platyhelminthes // Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 159-167.

71. Lee, S-U. and Huh, S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese isolates of Clonorchis sinensis I I Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 145-148.

72. Lee, S-U., Chun, H-C., and Huh, S. Molecular phylogeny of parasitic Platyhelminthes based on sequences of partial 28 S rDNA D1 and mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I // Korean Journal of Parasitology. 2007 V.45 P. 181-189.

73. Li, Y,-C., Korol, А. В., Fahima, Т., Beiles, A., and Nevo, E. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review // Molecular Ecology. 2002 V.ll P. 2453-2465.

74. Lis, J. T. and Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol // Nucleic Acids Research. 1975 V.2 P. 383389.

75. Littlewood, D. T. J., Rohde, K., and Clough, K. A. The interrelationships of all major groups of Platyhelminthes: phylogenetic evidence from morphology and molecules // Biological Journal of the Linnean Society. 1999 V.66 P. 75-114.

76. Lowe, Т. M. and Eddy, S. R. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence // Nucleic Acids Research. 1997 V.25 P. 955-964.

77. Lun, Z., Gasser, R. В., Lai, D., Li, A., Zhu, X., Yu, X., and Fang, Y. Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China // Lancet Infectious Diseases. 2005 V.5 P. 31-41.

78. Lee, S-U. and Huh, S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese isolates of Clonorchis sinensis II The Korean Journal of Parasitology. 2004 V.42 P. 145-148.

79. McManus, D. P., Le, Т. H., and Blair, D. Genomics of parasitic flatworms // International Journal for Parasitology. 2004 V.34 P. 153-158.

80. Morgan, J. A. T, Dejong, R. J., Adeoye, G. O., Ansa, E. D. O., Barbosa, C. S., Bremond, P., Cesari, I. M., Charbonell, N., Correa, L. G., Coulibaly, G.,

81. Mueller, В., Schmidt, J., and Mehlhorn, H. Sensitive and species-specific detection of Clonorchis sinensis by PCR in infected snails and fishes // Parasitology Research. 2006.

82. Nakao, M., Abmed, D., Yamasaki, H., and Ito, A. Mitochondrial genomes of the human broad tapeworms Diphyllobothrium latum and Diphyllobothrium nihonkaiense (Cesfoda: Diphyllobothriidae) // Parasitology Research. 2006 V.

83. Oliveira, P., Pires, M. A., Rodrigues, P., Ginja, M., Pires, M. J., Pires, I., Cardoso, L., Antunes, L., and Rodrigues, M. Opisthorchis felineus in cat: case report // Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 2005 V.57 P. 556-558.

84. Oshida, Т., Abramov, A., Yanagawa, H., and Masuda, R. Phylogeography of the Russian flying squirrel (.Pteromys volans): implication of refugia theory in arboreal small mammal of Eurasia // Molecular Ecology. 2005 V.14 P. 1191-1196.

85. Park, G-M. Genetic comparison of liver flukes, Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini, based on rDNA and mtDNA gene sequences // Parasitology Research. 2006 V.100 P. 351-357.

86. Pavlova, A., Zink, R. M., Drovetski, S., and Rohwer, S. Pleistocene evolution of closely related sand martins Riparia riparia and R. diluta II Molecular Phylogenetics and Evolution. 2008 V.48 P. 61-73.

87. Репа, H. В., De Souza, C. P., Simpson, A. J., and Pena, S. D. Intracellular promiscuity in Schistosoma mansoni nuclear transcribed DNA sequences are part of a mitochondrial minisatellite region I I Proceedings of the National Academic

88. Society. 1995 V.92 P. 915-919.iii

89. Perez, Т., Albornoz, J., and Dominguez, A. An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature // Molecular Ecology. 1998 V.7 P. 1347-1357.

90. Pick, D. Untersuchungen zur Praevalenz und Phylogenie des Leberegels Metorchis sp. in piscivoren Voegeln. Universitaet Rostock. 2005.

91. Posada, D. and Crandall, K. A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution//Bioinformatics. 1998 V.14P. 817-818.

92. Robin, E. D. and Wong, R. Mitochondrial DNA Molecules and Virtual Number of Mitochondria per Cell in Mammalian Cells // Journal of Cellular Physiology. 1998 V.136 P. 507-513.

93. Rozas, J., Sanchez-DelBarrio, J. C., Messeguer, X., and Rozas, R. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics. 2003 V. 19 P. 2496-2497.

94. Rozen, S. and Skaletsky, H. J. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Krawetz, S. and Misener, S. Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ, Humana Press. 2000. P. 365-386.

95. Rychlik, W. and Rhoads, R. E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA //Nucleic Acids Research. 1989 V.17 P. 8543-8551.

96. Saeed, I., Maddox-Hyttel, C., Monrad, J., and Kapel, С. M. O. Helminths of red foxes (Vulpes vulpes) in Denmark I I Veterinary Parasitology. 2006 V.139 P. 168-179.

97. Schwartz, M and Vissing, J. Parental inheritance of mitochondrial DNA // The New England Journal of Medicine. 2000 V.347 P. 576-580.

98. Selig, C., Wolf, M., Muller, Т., Dandekar, Т., and Schultz, J. The ITS2 Database II: homology modelling structure for molecular systematics // Nucleic Acids Research. 2008 V.36 P. D337-D380.

99. Semyenova, S. K., Morozova, E. V., Chrisanfova, G. G., Gorokhov, V. V., Arkhipov, I. A., Moskvin, A. S., Movsessyan, S. O., and Ryskov, A. P. Genetic differentiation in eastern european and western asian populations of the liver fluke,

100. Fasciola hepatica, as revealed by mitochondrial nadl and coxl genes // Journal of Parasitology. 2006 V.92 P. 525-530.

101. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the wolf (Canis lupus Linnaeus, 1758) in Belorussian Polesie // Parasitology Research. 2000 V.86 P. 163-164.

102. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the American mink (Mustela vison Schreber, 1777) in Belorussian Polesie // Parasitology Research. 2001 V.87P. 886-887.

103. Shimalov, V. V. and Shimalov, V. T. Helminth fauna of the red fox (Vulpes vulpes Linnaeus, 1758) in southern Belarus // Parasitology Research. 2003 V.89 P. 77-78.

104. Shrivastava, J., Qian, B. Z., McVean, G., and Webster, J. P. An insight into the genetic variation of Schistosoma japonicum in mainland China using DNA microsatellite markers // Molecular Ecology. 2005 V.14 P. 839-849.

105. Shustov, A. V., Kotelkin, А. Т., Sorokin, A. V., Ternovoi, V. A., and Loktev, V. B. The Opisthorchis felineus paramyosin: cDNA sequence and characterization of its recombinant fragment // Parasitology Research. 2002 V.88 P. 724-730.

106. Sripa, В., Kaewkes, S., Sithithaworn, P., Mairiang, E., Laha, Т., Smout, M., Pairojkul, C., Bhudhisawasdi, V., Tesana, S., Bethony, J. M., Loukas, A., and Brindley, P. J. Liver Fluke Induces Cholangiocarcinoma // PLoS Medicine. 2007 V.4P. 1148-1155.

107. Stothard, P. The Sequence Manipulation Suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences // Biotechniques. 2000 V.28 P. 1102-1104.

108. Swofford, D. L. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (* and Other Methods). Sinauer Associates, Sunderland MA. 2002.

109. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., and Kumar, S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007 V.24 P. 1596-1599.

110. Tatusova, T. A. and Madden, T. L. Blast 2 sequences a new tool for comparing protein and nucleotide sequences // FEMS Microbiology Letters. 1999 V.174P. 247-250.

111. Telford, M. J., Herniou, E. A., Russel, R. В., and Littlewood, D. T. J. Changes in mitochondrial genetic codes as phylogenetic characters: Two examples from the flatworms // Proceedings of the National Academic Society. 2000 V.97 P. 11359-11364.

112. Thaenkham, U., Visetsuk, K., Dung, D. Т., and Waikagul, J. Discrimination of Opisthorchis viverrini from Haplorchis taichui using COI sequence marker // Acta Tropica. 2007 V.103 P. 26-32.

113. Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. ClustalW: Improving the sensitivity of penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Research. 2004 V.22 P. 4673-4680.

114. Thyagarajan, В., Padua, R. A., and Campbell, C. Mammalian mitochondria possess homologous DNA recombination activity // Journal of Biological Chemistry. 1996 V.271 P. 27536-27543.

115. Tsaousis, A. D, Martin, D. P., Ladoukakis, E. D., Posada, D., and Zouros, E. Widespread recombination in published animal mtDNA sequences // Molecular Biology and Evolution. 2005 V.22 P. 925 -933.

116. Upatham, E. S. and Viyanant, V. Opisthorchis viverrini and opisthorchiasis: a historical review and future perspective I I Acta Tropica. 2003 V.88 P. 171-176.

117. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, Т., Homes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., and Zabeau, M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Research. 1995 V.23 P. 44074414.

118. Wernersson, R. Virtual Ribosome a comprehensive DNA translation tool with support for integration of sequence feature annotation // Nucleic Acids Research. 2006 V.34 P. W385-W388.

119. Wiley, E. O. Phylogenetics: the theory and practice of phylogenetic systematics. 1981.

120. Zane, L., Bargeloni, L., and Patarnello, T. Strategies for microsatellite isolation: a review // Molecular Ecology. 2002 V.l 1 P. 1-16.

121. Zhang, D.-X. and Hewitt, G. M. Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations: practice, problems and prospects // Molecular Ecology. 2003 V.12 P. 563-584.

122. Zink, R. M., Rohwer, S., Drovetski, S., Blackwell-Rago, R. C., and Farrell, S. L. Holarctic phylogeography and species limits of three-toed woodpeckers // Condor. 2002 V.104 P. 167-170.

123. Zink, R. M., Drovetski, S., and Rohwer, S. Phylogeographic patterns in the great spotted woodpecker Dendrocopos major across Eurasia // Journal of Avian Biology. 2002 V.33 P. 175-178.