Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат медицинских наук Журавлева, Марина Михайловна

• Журавлева, Марина Михайловна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Журавлева, Марина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРОЕНИЯ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ.

I 1 1 Классификация

I 1 2 Строение вирусной частицы

I 1 3 Структура генома вируса гриппа А

I 1 4 Репликация вируса гриппа

I 1 5 Белки вируса гриппа и их функциональные особенности

1.1.5.1 РНК-полимеразный комплекс.

1.1.5.2 РВ1.

1.1.5.3 РВ2.

1.1.5.4 РА.

1.1.5.5 Гемагглютинин.

1.1.5.6 Нуклеопротеин.

1.1.5.7 Нейраминидаза.

1.1.5.8 Матриксный (М1) и трансмембранный белок (М2).

1.1.5.9 Неструктурные белки: NS1 и NS2.

1.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА А ПОДТИПА H1N1.

I 2 1 Происхождение пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm

122 Эпидемиологические особенности вируса гриппа А подтипа H1N

123 Клиническая картина пандемического гриппа A(H1N1)pdm

1.3 ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА.

I 31 Арбидол

I 3 2 Амантадин и римантадин

I 3 3 Занамивир и озельтамивир

I 3 4 Чувствительность пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm2009 к противовирусным лекарственным препаратам

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

11.1 Сбор клинического материала для исследования.

11.2 Выделение РНК.

11.3 Реакция обратной транскрипции.

11.4 Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах.

11.5 Проведение полимеразной цепной реакции.

Н.6 Клонирование фрагментов концевых областей генома.

II 6 1 Получение рекомбинантных плазмид

II 6 2 Приготовление компетентных клеток

II 6 3 Трансформация клеток плазмидной ДНК

II 6 4 Селекция плазмид, несущих последовательности фрагментов гена гемагглютинина

II 6 5 Выделение плазмидной ДНК

11.7 Электрофорез ДНК.

11.8 Приготовление ДНК для секвенирования.

11.9 Секвенирование ДНК.

11.10 Построение алайнментов и филогенетический анализ.

11.11 Анализируемые штаммы из базы данных GenBank.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

111.1 ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТКОВ ГЕНОВ.

III 1 1 Молекулярно-генетический анализ участка гена НА 73 III 1 2 Анализ последовательностей участка гена НА и выявление дополнительных мутаций 81 III 1 3 Молекулярно-генетический анализ участка гена NA 84 III 1 4 Анализ последовательностей участка гена NA на предмет выявления потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным лекарственным препаратам 89 III 1 5 Молекулярно-генетический анализ участка гена М 91 III 1 6 Анализ последовательностей участка гена М на предмет выявления потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным лекарственным препаратам

111.2 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА A(H1N1)pdm2009.

III 2 1 Анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса пандемического гриппа A(H1N1)pdm

III 2 2 Филогенетические взаимоотношения исследуемых вирусов

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

V. ВЫВОДЫ.

VI. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг.»

Грипп остаётся одной из наиболее актуальных проблем последнего столетия. Вирус гриппа типа А является одним из наиболее распространённых вирусов, имеет широкий круг хозяев и, за счёт своей уникальной способности к антигенной изменчивости в результате мутационного - «дрейф» и реассортантного - «шифт» процессов, отличается значительной вариабельностью [7].

В связи с тем, что вирус гриппа в процессе эволюции приобретает значительные изменения, молекулярно-генетеческие методы являются основным звеном методов диагностики заболевания. Проведение ПНР и дальнейшего секвенирования позволяют не только определить наличие генетического материала вируса в исследуемой пробе, но и детектировать принадлежность вируса к тому или иному подтипу, а также проследить эволюционную изменчивость, циркулирующего штамма.

В апреле 2009 года в Мексике и США были зарегистрированы случаи инфицирования человека ранее не описанным вирусом гриппа А(НШ1)рёт2009, подобному свиному [39]. На протяжении следующих нескольких месяцев произошёл подъём заболеваемости в вышеупомянутых странах, а также распространение нового вируса гриппа А в страны Европы, Азии и Австралию. 21 мая 2009 года из носоглоточного смыва больного, прибывшего из США в Россию, была выделена РНК вируса гриппа, и методом ПЦР в реальном времени был детектирован пандемический вариант вируса гриппа А(Н1Ш)рс1т2009. Это был первый лабораторно подтверждённый случай инфицирования на территории Российской Федерации [18].

Изучение нового варианта вируса гриппа А(НШ1)рс1т2009 молекулярно-генетическими методами показало наличие в геноме вируса уникальных комбинаций генов различного происхождения. Было доказано, что вирус пандемического гриппа А(НШ1)рёш2009 мигрировал из популяции свиней и является тройным реассортантом [68] Также генетический анализ показал, что гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и белки (1МР, N8), произошли от вирусов классического гриппа свиней, нейраминидаза (ИА) и ген М, кодирующий два белка, - от вирусов гриппа свиней евроазиатской линии, полимеразные белки РВ2 и РА - от вирусов гриппа птиц, а белок РВ1 - от вирусов гриппа человека [68].

Современные методы анализа нуклеотидной последовательности участка гена НА (рецепторсвязывающего сайта гемагглютинина) позволяют получить данные об изменении сродства исследуемого вируса к сиаловым рецепторам а2'3 или а2'6.

Анализ нуклеотидной последовательности участка гена М, кодирующего трансмембранный белок М2 штамма А/ПУ-Мо8со\у/01/2009(Н1Ш)8ш1, выявил резистентность вируса к римантадину, а молекулярно-генетический анализ частичной нуклеотидной последовательности гена ЫА - чувствительность к озельтамивиру.

Современные методы позволяют получить полную нуклеотидную последовательность из клинического материала без предварительной подготовки. Данные полученные таким способом являются наиболее значимыми, поскольку в случае подготовки образцов для получения полноразмерных геномов вирус пассируют на клетках МБСК или РКЭ, что ведёт к накоплению мутаций.

Изучение молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса гриппа, циркулирующих на территории Российской Федерации, является основным звеном системы мониторинга эволюционных изменений вируса на территории нашей страны за определённый период.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении изменчивости штаммов пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулирующих на территории Российской Федерации в период 2009-2011гг.

Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена НА пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, провести сравнительный анализ и выявить аминокислотные замены, способные влиять на рецепторную специфичность.

2. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена NA, провести сравнительный анализ и проверить чувствительность штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к озельтамивиру.

3. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена М, кодирующего трансмембранный белок М2 и проверить чувствительность штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к препаратам адамантанового ряда.

4. Определить полную нуклеотидную последовательность 7 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг. и провести сравнительный анализ с первым появившимся в России пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm2009.

Научная новизна.

Впервые были выявлены и проанализированы аминокислотные замены в трёх белках (М2, NA и НА) пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm 2009-2011 гг. на большой выборке проб из Российской Федерации.

Впервые были подобраны праймеры и разработана собственная схема амплификации, позволяющая получить фрагменты трёх генов для детекции маркеров чувствительности к противовирусным препаратам (для генов М и 8 ~

NA) и рецепторной специфичности (для гена НА) пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, а также получать полные нуклеотидные последовательности всех 8 сегментов генома вируса. Следует отметить, что разработанная схема амплификации позволяет использовать не только пробы вируса с высоким титром, но и РНК, выделенную из клинического материала.

Впервые был проведён сравнительный анализ рецепторсвязывающего сайта гемагглютинина в первичной пробе (носоглоточный смыв) и в пробе, взятой после смерти на примере двух случаев заболевания.

Впервые в международную базу GenBank были заложены реперные штаммы для дальнейшего анализа изменчивости вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 на территории России.

Впервые в России проведена исследовательская работа по сравнению полных геномов вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, выделенных из разных органов одного человека.

Практическая значимость.

Разработанная схема амплификации и определения нуклеотидной последовательности участков генов, кодирующих синтез трансмембранного белка М2 и фермента нейраминидазы, используется для мониторинга чувствительности пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к противовирусным препаратам: блокаторам белка М2 и ингибиторам нейраминидазы. Полученные данные следует учитывать при составлении рекомендаций по лечению больных, инфицированных пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm2009.

Мониторинг аминокислотных замен в генах М, NA и НА штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории Российской Федерации на протяжении 2009-2011гг., позволяет определить направление изменчивости вируса и использовать полученные данные при составлении рекомендаций по составу гриппозных вакцин, а также диагностических препаратов.

Полные нуклеотидные последовательности штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009, исследуемые в работе, были депонированы базу данных GenBank. Также данные молекулярно-генетического исследования были учтены при депонировании штаммов пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Последовательности данных штаммов могут быть использованы как реперные точки для мониторинга направления изменчивости вируса на территории России.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Популяция пандемического вируса, циркулировавшего на территории Российской Федерации в период 2010-2011гг. более вариабельна, чем в период 2009-2010.

2. Проанализированы частичные нуклеотидные последовательности гена НА 546-ти образцов клинического материала пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 для оценки изменения рецепторной специфичности вируса.

3. На протяжении двух пандемических сезонов сохраняется резистентность вируса A(HlNl)pdm2009 к противовирусным препаратам римантадин и амантадин и чувствительность к озельтамивиру.

4. Проведён сравнительный анализ 8 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг. с первым появившимся в России штаммом A(HlNl)pdm2009 по полной нуклеотидной последовательности геномов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Журавлева, Марина Михайловна

V. выводы.

1. Молекулярно-генетический анализ штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг., показал увеличение вариабельности вирусов сезона 2010-2011гг. по сравнению с вирусами, циркулирующими в сезоне 20092010гг.

2. У всех пациентов с лёгким и среднетяжёлым течением заболевания в 222-м положении рецепторсвязывающего сайта белка гемагглютинина выявлена аспарагиновая кислота. В тяжёлых случаях заболевания и у пациентов с летальным исходом в 222 положении были выявлены аминокислотные замены на аспарагин, глицин и глутаминовую кислоту.

3. Наличие в 275 позиции белка нейраминидазы аминокислоты гистидин подтверждает чувствительность штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 к противовирусному препарату озельтамивир. Выявлены дополнительные аминокислотные замены в гене NA V241I и N369K, которые не встречались у вирусов, циркулировавших в пандемический период 2009-2010гг.

4. Наличие в 31 позиции трансмембранного белка М2 аминокислоты аспарагин подтверждает устойчивость штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 к препаратам адамантанового ряда. Выявление дополнительных мутаций в гене М (R12K, S13R, D21G, Т43А, Y52H, R54H) свидетельствует об увеличении изменчивости вируса.

5. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, изолированных из разных органов одного больного, показал идентичность всех генов, кроме гена НА, где была обнаружена единичная аминокислотная замена K136N (нумерация по НА0).

Благодарности.

Благодарю своих научных руководителей: заведующего лабораторией к.б.н. Прилипова А.Г. и д.м.н, профессора Дерябина П.Г. за всестороннюю помощь и внимание к работе. Выражаю благодарность и признательность директору ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России академику РАМН Львову Д.К. за предоставленную возможность проведения исследований и руководство данной работой. Отдельную благодарность автор выражает д.м.н. Бурцевой Е.И. за помощь и сотрудничество при выполнении работы, а также ценные замечания и рекомендации при оформлении диссертации. Автор приносит благодарность своим коллегам: Самохвалову Е.И., Альховскому C.B., Колобухиной J1.B. и Щелканову М.Ю., а также всему коллективу лаборатории молекулярной генетики, в тесном сотрудничестве с которым была выполнена данная работа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Журавлева, Марина Михайловна, 2011 год

1. Букринская А.Г. // Вирусология.// Москва. Изд. «Медицина». -1986, С. 274288.

2. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. и др. // Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 г.г. // Вопросы вирусологии.-2007.-№2.-С. 24-29.

3. Гагаринова В.М., Игнатьева Г.С., Синицкая Л.В. и др. // Новый химиопрепарат арбидол: профилактическая эффективность во время эпидемии гриппа. // ЖМЭИ. 1993. - №5. - С. 40 - 43.

4. Глушков Р.Г., Фадеева Н.И., Ленева И.А. и др. // Молекулярно -биологические особенности действия арбидола нового противовирусного препарата. // Хим. - фарм. журн. - 1992. - №2. - С. 8 - 15.

5. Гуськова Т.А., Глушков Р.Г. // Арбидол (иммуномодулятор, индуктор интерферона, антиоксидант) // УХЛС — ВНИХФИ. М.,-2001. С.28.

6. Жданов В. М. // Эволюция вирусов.// М.: Медицина, -1990. - С.356.(2).

7. Каверин Н.В., Львов Д.К. // Ортомиксовирусы (Orthomyxoviridae).// Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008. - С.176 - 183.

8. Карпухин Г.И., Швецова Е.Г., Малышева A.M. // Итоги многолетнего опыта изучения эффективности экстренной профилактики гриппа ремантадином в эпидемиологических наблюдениях. // Проблемы гриппа и ОРЗ. — Л., -1979. — С. 24-28.

9. Колобухина Л.В., Львов Д.К., Бурцева Е.И. // Грипп.// Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008, - С.382 - 393.

10. Кубарь О.И., Степанова Л.А., Сафонова Л.С. и др. // Клиническая аппликация иммуномодулирующих свойств арбидола при ОРВИ. // Тезисы доклада IV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», 1997. -С.269.

11. Ленева И.А., Глушков Р.Г., Гуськова Т.А. Лекарственные средства для химиотерапии и химиопрофилактики гриппа: особенности механизма действия, эффективность и безопасность (обзор)//Химико-фармацевтический журнал.-2004. -Т.38. -№11. -С.8-14.

12. Ленева И.А., Гуськова Т.А. //Арбидол эффективный препарат для лечения и профилактики гриппа и ОРВИ: обзор результатов клинических исследований// Рус.мед.жерн.-2008.-Т.16,№29. - С. 1972-1976.

13. Ленева И.А., Федякина И.Т., Еропкин М.Ю. и др. // Изучение противовирусной активности отечественных противогриппозных химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных // вопр. Вирусологии // -2010г., №3, С. 19-27.

14. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Колобухина Л. В., Прилипов А. Г., Щелканов М. Ю. // Новая пандемия 2009 года и её контроль. // Вопросы вирусологии -2009, №3 С.54-56.

15. Львов Д.К. // Рождение и становление вирусологии. // Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008. - С. 15 - 20.

16. Малый В.П., Романцов М.Г., Сологуб Т.В. // Грипп, пособие для врачей // -2007, С. 84.

17. Минздравсоцразвития РФ // Письмо от 30 июня 2009. // Интернет ресурс №240/10/1-4053http://base.consultant.ru/cons/cgi/online. cgi?req=doc;base=EXP;n=467562

18. Обросова-Серова Н. П., Бурцева Е. И., Невский И. М. и др. // Изучение защитного действия арбидола во время подъема респираторных заболеваний в 1990 г. // Вопросы вирусол. 1991. - № 5. - С.380 - 381.

19. Онищенко Г.Г., Шестопалов A.M., Терновой В.А., Евсеенко В.А., Дурымацов

20. A.Г., Рассадкин У.Н., Зайковская А.В., Золотых С.И., Юрлов А.К., Михеев

21. B.Н., Нетесов С.В., Дроздов И.Г. // Изучение высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 изолированных от больных и мертвых птиц в Западной Сибири. // Микробиол. Эпидемиол. и Биотехнол. -2006, №5, С. 47-54.

22. Чучалин А.Г. // Опыт лечения пневмоний в эпидемический сезон заболевания гриппом A/H1N1. // Внебольничная пневмония у взрослых. Под ред. Чучалина А.Г., Синопальникова А.И. М.: Атмосфера,- 2010.

23. Abed Y., Baz М., Bovin G. // Impact of neuraminidase mutations conferring influenza resistance to neuraminidase inhibitors in the N1 and N2 genetic backgrounds. // Antivir. Ther. 2006. - Vol. 11.- P.971 - 976.

24. Ali A., Avalos R.T., Ponimaskin E. et al. // Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of Ml protein. // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 8709-8719.

25. Area E., Martín-Benito J., Gastaminza P., Torreira E., Valpuesta J.M., Carrascosa J.L., Ortín J. // 3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains. // Proc Natl. Acad. Sci. -2004, Vol. 101, P. 308-313.

26. Biswas S.K, Nayak D.P. // Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1. // J Virol -1994; Vol. 68(3), P. 1819-1826.

27. Blaas D., Patzelt E., Kuechler E. // Identification of the cap binding protein of influenza virus. //Nucleic Acids Res. -1982, Vol.10, P.4803-4812.

28. Braam J, Ulmanen I, Krug R.M. // Molecular model of a eucaryotic transcription complex: functions and movements of influenza P proteins during capped RNA-primed transcription.// Cell. -1983, Vol.34, P.609-618.

29. Brand C.M., Skehel J.J. // Crystalline antigen from the influenza virus envelope. // -Nat. New Biol. -1972, Vol.238, P.145-147.

30. Bukrinskaya A.G., Vorkunova N.K., Kornilayeva G.V. // Influenza virus uncoating in infected cells and effect of rimantadine.// J. Gen. Virol. 1982. - Vol.60. - P. 49 -59.

31. Chen G. and Shih S. // Genomic Signatures of Infl uenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus, Emerging Infectious Diseases. // -2009, Vol. 15, No. 12, P. 1897-1903.

32. Chen W, Calvo P.A, Malide D, et al. // A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. //Nat Med -2001; Vol. 7(12), P. 1306-1312.

33. Colman P.M. // Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. // Protein Sci. -1994, Vol.3, P.1687-1696.

34. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. // Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. // J. Virol. -1972, Vol. 10, P.795-800.

35. Cross K. J., Burleigh L. M., Steinhauer D. A. // Mechanism of cell entry by influenza viruses // Expert review in molecular medicine. 2001. Available at http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk.

36. Crumpacker C. // Antiviral therapy. // In: Knipe D.M., Howley P.M., eds. Fields virology.4th ed.Philadelphia: Lippincott Williams&Williams, 2001

37. Dawood F.S., Jain S., Finelli L., et all. // Emergence of a novel swine-original influenza A(H1N1) virus in humans. // N. Engl. J. Med. -2009.-Vol.360. P.2605-2615.

38. Deng T., Sharps J., Fodor E., Brownlee G.G. // In vitro assembly of PB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A virus polymerase subunits into a functional trimeric complex. // J. Virol. -2005, 79, P.8669-8674.

39. Deyde V.M., Xu X., Bright R.A. et al. // Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2) and A(H1N1) viruses isolated worldwide // J. Infect. Dis.- 2007. -Vol. 196.-P.249-257.

40. Dias A., Bouvier D., Crepin T., McCarthy A.A., Hart D.J., Baudin F., Cusack S., Ruigrok R.W. // The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit. // Nature. -2009, Vol.458, P.914-918.

41. Dowdle W.R. //Influenza A virus recycling revisited. // Bull. World Health Organ. -1999. Vol.77.-P.820- 8.

42. Fauquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., et al. // Virus taxonomy, eighth report // Elsevier. 2005. - P. 681 -693.

43. Fodor E., Smith M. // The PA subunit is required for efficient nuclear accumulation of the PB1 subunit of the influenza A virus RNA polymerase complex. // J. Virol. -2004, Vol.78, P.9144-9153.

44. Fräser C., Donnelly C.A., Cauchemez S. et all // Pandemic potential of a strain of influenza A(H1N1): early findings. // Science.-2009. Vol.324. P. 1557-1561.

45. Gambarian F.,yamnikova S., Lvov D. et all Receptor specificity of influenza virus from birds and mammalians: new data in involvement of the inner fragments of the carboxylate chain //Virology. 2005. Vol.3334 -P.276-283.

46. Gerhard W., Yewdell J., Frankel M. In. //Structure and Variation in Influenza Virus.//N. Y. Elsevier. 1980, P.273-280.

47. Gibbs M.J., Gibbs A.J.// Molecular virology: was the 1918 pandemic caused by a bird flu // Nature. 2006. - Vol. 440. P. 9-10.

48. Goldsmith C. S., Balish A.// CDC Atlanta //(http://www.cdc.gov/media/subtopic/library/diseases.htm.

49. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A., Portela A. //Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding.// J. Virol. 2000, Vol. 7, 11538-11547.

50. Gonzalez S., Ortin J. //Characterization of influenza virus PB1 protein binding to viral RNA: two separate regions of the protein contribute to the interaction domain.// J. Virol. 1999, Vol. 73, P.631-637.

51. Hagen M., Chung T.D., Butcher J.A., Krystal M. //Recombinant influenza virus polymerase: requirement of both 5'and 3' viral ends for endonuclease activity.// J. Virol. 1994, Vol. 68, P.1509-1515.

52. Harper D. //Influenza. Online Etymology Dictionary // 2001.Available at http://www.etymonline.com/index.php?search=influenza&searchmode=none

53. Hay den F. //WHO guidelines on the use of vaccines and antivirals during influenza Annex 5-Considerations of the use of antivirals during influenza pandemic.// Geneva 2002, 2-40ct.

54. Hirsch A. //Handbook of Geographical and Historical Pathology.// London: New Sydenham Society, 1883.http://www.etymonline.com/index.php?search=influenza&searchmode=none

55. Hoffman F. -La Roche Ltd. //Product Monograph: Tamiflu.// Ontario (Canada), 2004.

56. Huang R.T., Wahn K., Klenk H.D., Rott R. //Fusion between cell membrane and liposomes containing the glycoproteins of influenza virus. //Virology. 1980, Vol. 104, P.294-302

57. Huarte M., Falcon A., Nakaya Y., Ortin J., Garcia-Sastre A., Nieto A. //Threonine 157 of influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious viruses. //J. Virol. 2003, Vol. 77, P.6007-6013.

58. Hurt AC, Holien JK, Parker M, Kelso A, Barr IG. //Zanamivir-Resistant Influenza Viruses with a Novel Neuraminidase Mutation. //J Virol. 2009; Vol. 83:10366-73.

59. Ilyushina N. A, Khalenkov A. M., Seilerl J. P, Forrest H. L., Bovin N. V., Jefferson T., Deeks J.J., Demicheli V. //Amantadine and rimantadine for preventing and treating influenza A in adults. // Cochrane Database Syst. Rev. 2006. - Vol.2.

60. Kawaoka Y., Webster R.G. //Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, Vol. 85, 324-328.

61. Kell W., Niemann H., Schwars R.T., Klenk H.D. //Carbohydrates of influenza virus. V. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plaque virus. //Virology. 1984, Vol. 133, P.77-91.

62. Kingsford C., N.Nagarajan, S.L. Salzberg. //2009 Swine-Origin Influenza A (H1N1) Resembles Previous Influenza Isolates.// -2009, Vol. 4, Is. 7.

63. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagama Y. et al. //Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study // Lancet.- 2004.-Vol.364, P.759-765.

64. Klenk H.D., Compans R.W., Choppin W.P. //An electron microscopic study of the presence or absence of neuraminic acid in enveloped viruses. //Virology. 1970, Vol. 42,P. 1158-1162.

65. Klenk H.D., Garten W. //Host cell proteases controlling virus pathogenicity.// Trends. Microbiol. 1994, Vol. 2, 39-43.

66. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Biodorn J. //Activation of influenza A viruses by trypsin treatment. //Virology. 1975, Vol. 68, 426-439.

67. Klumpp K., Ruigrok R.W.H., Baudin F. //Roles of the influenza virus polymerase and nucleoprotein in forming a functional RNP structure // The EMBO Journal. -1997.- Vol.16.-P.1248-1257.

68. Krug R.M., Etkind P.R. //Cytoplasmic and nuclear virus-specific proteins in influenza virus-infected MDCK cells. //Virology. 1973, Vol. 56, P.334-348.

69. Krug R.M., Soeiro R. //Studies on the intranuclear localization of influenza virus-specific proteins. //Virology. 1975, Vol. 64, P.378-387.

70. Lamb R.A., Choppin P.W. //The gene structure and replication of influenza virus. //Ann. Rev. Biochem. 1983, Vol. 52, P.467-506.

71. Lamb R.A., Krug R.M. //Orthomyxoviridae. In: Fields Virology. Section 2, Specific Virus Families. //Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, P.1091-1137.

72. Lamb R.A., Lai C.J. //Conservation of the influenza virus membrane protein (Ml) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment 7 encoding a second protein (M2) in H1N1 and H3N2 strains. //Virology. 1981, Vol. 112, P.746-751.

73. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G. //Mechanism of antigenic drift in influenza virus. Amino acid sequence changes in an antigenically active region of Hong Kong (H3N2) influenza virus hemagglutinin. //J. Mol. Biol. 1981, Vol. 145, P.339-361.

74. Lazarowitz S.G., Compans R.W., Choppin P.W. //Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes.// Virology. 1971, Vol.46, P.830-843.

75. Li M.L., Ramirez B.C., Krug R.M. //RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites. //EMBO J. 1998, Vol. 17, P.5844-5852.

76. Li M.L., Rao P., Krug R.M. //The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits. //EMBO J. 2001, Vol. 20, P.2078-2086.

77. Lu Y., Qian X.Y., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein: a novel inhibitor of pre-mRNA splicing.// Genes. Dev. 1994, Vol. 8, P. 1817-1828.

78. Maeda Y., Horimoto T., Kawaoka Y. //Classification and genome structure of influenza virus. //Nippon Rinsho. 2003, Vol.61, P. 1886-1891.

79. Marjuki H., Barman S., Webster R. G. and Webby R. J. //Adaptation of Pandemic H1N1 Influenza Viruses in Mice// JOURNAL OF VIROLOGY, 2010.P. 86078616.

80. Marra F., Marra C.A., Stiver H.G. //A case for rimantadine to be merketed in Canada for prophylaxis of influenza A virus infection. // Can. Respir. J. 2003. -Vol. 10(7).- P. 381 -388.

81. Martin K., Helenius A.// Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import. //Cell. 1991, Vol. 67, P.117-130.

82. Meindl P., Bodo G., Palese P. et.al. //Inhibition of neuraminidase activity by derivatives of 2-deoxy-2,3-dehydro-A^-acetylneuraminic acid. // Virology. 1974. -Vol.58(2). - P. 457-463.

83. Monto A.S., McKimm-Breschin J., Macken C. et al. //Detection of influenza viruses resistant to neuraminidase inhibitors in global surveillance during the first 3years of their use//Antimocbob. Agents Chemother.-2006.-Vol.50(7).-P.2395-2402.126 ~

84. Mosley V. M., and Wycoff R. W. G. //Electron microscopy of the virus of influenza // Nature. 1946. - Vol. 157. - P. 263.

85. Naffakh N., Massin P., van der Werf S. //The transcription/ replication activity of the polymerase of influenza A viruses is not correlated with the level of proteolysis induced by the PA subunit. //Virology 2001, Vol. 285, P.244-252.

86. Nakajima K. //Influenza virus genome structure and encoded proteins. //Nippon Rinsho. 1997, Vol. 55, P.2542-2546.

87. Oxford J.S., Lambkin R. //Targeting influenza virus neuraminidase a new strategy for antiviral therapy // Drug Discover Today. - 1998. - N 3. - P. 448-456.

88. Ozawa M., Basnet S., Burley L. M., Neumann G., Hatta M. and Kawaoka Y.

89. Impact of Amino Acid Mutations in PB2, PB1-F2, and NS1 on the Replication127 ~and Pathogenicity of Pandemic (H1N1) 2009 Influenza Viruses// J. OF VIROLOGY -2011, Vol. 85, № 9, P. 4596-4601.

90. Palache A.M. //Influenza vaccines. A reappraisal of their use // Drugs. 1997. -V. 54,-N6.-P. 841-856.

91. Palese P., Tobita K., Ueda M., Compans R.W. //Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. //Virology. 1974, Vol.61, P.397-410.

92. Paul M.V., Estelle Martin-Granel //500-year Evolution of the Term Epidemic // Emerging Infectious Diseases.- 2006.-Vol. 12.-P.976-980.

93. Pinto L., Holsinger L.J., Lamb R.A. //Influenza virus M2 protein has ion channel activity. // Cell. 1992. - Vol.69. - P. 517 - 528.

94. Pinto L.H., Lamb R.A. //Controlling influenza virus replication by inhibiting its proton channel.//Mol.BioSyst.- 2007,- Vol.3.- P. 18-23.

95. Potdar V. A., Chadha M. S., Jadhav S. M., Mullick J.,. Cherian S. S, Mishra A. C.// Genetic Characterization of the Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus Isolates from India// www.plosone.org, -2010.V. 5,1. 3.

96. Potter C.W. //A history of influenza.//Journal of Applied Microbiology.-2001.-Vol.91.-P.572-579.

97. Privalsky M.L., //Penhoet E.E. The structure and synthesis of influenza virus phosphoproteins. //J. Biol. Chem. 1981, Vol. 256, P.5368-5376.

98. Pyle G.F. //The Diffusion of Influenza: Patterns and Paradigms.// New Jersey: Rowan & Littlefield, 1986.

99. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. //Two functional domains of theinfluenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA.

100. J. Virol. 1994, Vol.68, P.2433-2441.128 ~

101. Qiu Y., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A). //J. Virol. 1994, Vol.68, P.2425-2432.

102. Qiu Y., Nemeroff M., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein binds to a specific region in human U6 snRNA and inhibits U6-U2 and U6-U4 snRNA interactions during splicing. // RNA. 1995, Vol. 1, P.304-316.

103. Saito R., Sakai T., Sato I. et al. // Frequency of amantadine-resistant influenza A viruses during two seasons featuring cocirculation of H1N1 and H3N2. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, P.2164-2165.

104. Sakaguchi T., Laser G.P., Lamb R.A. // The ion channel activity of the influenza virus M2 protein affects transport through the Golgi apparatus. // J. Cell Biol. 1996. - Vol.133. - P. 733 - 747.

105. Sanz-Ezquerro J.J., de la Luna S., Ortin J., Nieto A. // Individual expression of influenza virus PA protein induces degradation of coexpressed proteins. // J. Virol. 1995, Vol. 69, P.2420-2426.

106. Schmitt A.P., Lamb R.A. //Influenza virus assembly and budding at the viral budozone. // Adv. Virus. Res. 2005. Vol. 64. - P. 383-416.

107. Schulman J.L., Palese P. // Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. //J Virol. 1977, Vol. 24, P.170-176.

108. Shinde V, Bridges CB, Uyeki TM, Shu B, Balish A, et al. (2009) // Triple-Reassortant Swine Influenza A (HI) in Humans in the United States, 2005-2009. // N Engl J Med -2009; Vol.360, P.2616-2625.

109. Skehel J.J. // Polypeptide synthesis in influenza virus-infected cells. //Virology. 1972, Vol. 49, P.23-36.

110. Skehel J.J., Waterfields M.D. // Studies on primary structure of the influenza virus hemagglutinin. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975, Vol. 72, P.93-97.

111. Smith W., Andrewes C.H., Laidlaw P.P. // A virus obtained from influenza patients.//Lancet. -1933.-Vol. 1 -P.266-68.

112. Sreta D, Kedkovid R, Tuamsang S, Kitikoon P, Thanawongnuwech R // Pathogenesis of swine influenza virus (Thai isolates) in weanling pigs: an experimental trial. // Virol J 2009, Vol. 6.

113. Sugiura A., Ueda M. // Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains. // Virology. 1980, Vol. 101, P.440-449.

114. Taubenberger J.K., Reid A.H., Krafft A.E. et al. // Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. //Science 1997.-Vol.275.-P.1793-1796.

115. Taubenberger J.K., Reid AH, Lourens R.M., Wang R. et.al. // Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes.// Nature. 2005. - Vol.437. - P.889-893.

116. Update: Novel influenza A (H1N1) virus infections world-wide, May 6, -2009. // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). // -2009. -Vol. 58, N 17. P.453-457.

117. Varghese J.N., Laver W.G., Colman P.M. // Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution.// Nature. 1983, Vol. 303, P.35-40.

118. Veit M., Kretzschmar E., Kuroda K., Garten W., Schmidt M.F., Klenk H.D.,

119. Rott R. // Site-specific mutagenesis identifies three cysteine residues in the130 ~cytoplasmic tail as acylation sites of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1991, Vol. 65, P.2491-2500.

120. Walsh E.E., Cox C., Falsey A.R. // Clinical features of influenza A virus infection in older hospitalized persons. // J. Am. Geriatr. Soc. 2002. - Vol.50. - P. 1498 - 1503.

121. Wang C., Lamb R. A., Pinto L. H. // Activation of the M2 ion channel of influenza virus: a role for the transmembrane domain histidine residue. // Biophys. J. 1995.-Vol. 69. - P.1363-1371.

122. Weaver E. A, Rubrum A. M., Webby R. J., Barry M. A. // Protection against Divergent Influenza H1N1 Virus by a Centralized Influenza Hemagglutinin// -2011, Vol. 6, Is. 3.

123. Wiley D.C., Wilson I.A., Skehel J.J. // Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation. //Nature. 1981, Vol. 289, P.373-378.

124. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. // Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. // Nature. 1981, Vol. 289, P.366-373.

125. World Health Organization. // Fact sheet Avian Influenza. 2006 February; Available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avianinfluenza/en/

126. World Health Organization. // Fact sheet №211// March 2003, document available at. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/

127. World Health Organization. // WHO consultation on priority public health interventions before and during an influenza pandemic.//WHO, Geneva, March 2004, document available at http ://www. who. int/csr/disease/avianinfluenza/ final .pdf

128. Yen H., Herlocher L.M., Hoffman E. et al. // Neuraminidase inhibitor-resistant influenza viruses may differ substantially in fitness and transmissibility//Antimicro. Agents and Chemother.-2005.-Vol.49(10).-P.4075-4084.

129. Zhang Y., Lin X., Zhang F., Wu J., Tan W., Bi Sh, Zhou J, Shu Y., Wang Y. //Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics// Virology.-2010, Vol.5 (2).

130. Zhirnov O.P. // Isolation of matrix protein Ml from influenza viruses by acid -dependent extraction with nonionic detergent. // Virology. 1992. - Vol.186. - P. 324-330.

131. Zhou NN, Senne DA, Landgraf JS, Swenson SL, Erickson G, et al. // Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. // J Virol 1999, Vol. 73, P. 8851-8856.