Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Махова, Мария Александровна

• Махова, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Махова, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1. Особенности хеликобактерной инфекции.

1.1.1 .Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori.

1.1.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori.

1.1.2.1. Уреаза.

1.1.2.2. Продукт гена IceA.

1.1.2.3. Вакуолизирующий цитотоксин.

1.1.2.4. Остров патогенности Helicobacter pylori.

1.1.2.5. Другие факторы патогенности.

1.2. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori.

1.3. Лабораторная диагностика хеликобактериоза.

1.3.1. Бактериологический метод.

1.3.2. Морфологическая группа методов.

1.3.3. Быстрый уреазный тест.

1.3.4. Уреазные дыхательные тесты.

1.3.5. Серологический метод.

1.3.6. Молекулярно-генетические методы.

1.3.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методики подготовки клинических проб к проведению ПЦР.

2.1.1. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом кипячения.

2.1.3. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом, предложенным Марковой Г.А. и соавт. (1994) - полный вариант.

2.1.4. Способы выделения ДНК из клинического материала, основанные на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом.

2.1.4.1. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А».

2.1.4.2. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб Б».

2.1.5. Методика выделения ДНК из парафинизированных срезов.

2.2. Проведение ПЦР-амплификации фрагмента генома Helicobacter pylori.

2.2.1. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Helicobacter».

2.2.2. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520».

2.2.3. Проведение ПЦР-амплификации гена UreC Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Хеликопол II».

2.2.4. Проведение ПЦР-амплификации гена CagA Helicobacter pylori с помощью тест-системы «ДиаГен-Helicobacter».

2.2.5. Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA».

2.3. Пост-ПЦР обработка продуктов амплификации с помощью ураци л-ДНК-гл икозил азы.

2.4. Метод гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA Helicobacter pylori.

2.5. Методы регистрации результатов.

2.5.1. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле.

2.5.1.1. Приготовление агарозного геля.

2.5.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.5.1.3. Учет результатов.

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.2.1. Приготовление 10% полиакриламидного геля.

2.5.2.2. Проведение электрофореза в 10% полиакриламидном геле

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции.

3.1.1. Подбор оптимального приборного обеспечения амплификации.

3.1.2. Выбор метода обработки клинического материала.

3.1.3. Апробация экспериментальных отечественных тест-систем для ПЦР-детекции Helicobacter pylori.

3.1.4. Антиконтаминационная защита проведения

ПЦР-детекции Helicobacter pylori.

3.1.5. Введение внутреннего контроля ПЦР.

3.2. Выявление Helicobacter pylori в различных типах биологического материала: биоптате слизистой оболочки желудка, желудочном соке, фекалиях.

3.3. Сопоставление результатов диагностики, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами.

3.4. Выявление Helicobacter pylori у больных разных возрастных групп с различными формами гастродуоденальной патологии.

3.5. Разработка варианта ПЦР-детекции Helicobacter pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антихеликобактерной терапии.

3.6. Исследование возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori.

3.7. Исследование гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Helicobacter pylori методом гетеродуплексного анализа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции»

Актуальность проблемы.

Открытие этиологической и патогенетической роли бактерий рода Helicobacter при гастродуоденальных заболеваниях явилось одним из важнейших достижений современной микробиологии и гастроэнтерологии. В настоящее время не вызывает сомнения, что Helicobacter pylori является этиологическим фактором 70-80% гастритов (Аруин.Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П., 1993). Этот микроорганизм обнаруживается более чем у 95% больных, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ДПК), у 70-80% больных с язвенной болезнью желудка и в 60 - 70% случаев при раке желудка (Каргальцева Н.М., 1997; Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G., 1998). В развитых странах рак желудка стоит на четвертом месте среди причин смерти от злокачественных новообразований, а в развивающихся он прочно занимает первое место. Международное агентство по изучению рака Всемирной Организации Здравоохранения признало инфекцию Н. pylori канцерогенной для человека (Татаринов П.А., Грацианская А.Н., 1998; Аруин Л.И., 2001). Риск развития пептической язвы выше в 30 раз, а рака желудка — в 3-6 раз выше у хеликобактер-положительных индивидуумов по сравнению с лицами, не инфицированными этим возбудителем (Ивашкин В.Т., 1997).

В Российской Федерации по данным официальной статистики, ежегодно регистрируется более 1 млн. случаев заболеваний хроническими гастритами и язвенной болезнью, более 100 тыс. больных подвергается резекции желудка. Исключительно велика частота хеликобактериоза у детей — более 100 на 100 тыс. детского населения или более 10% всех заболеваний пищеварительного тракта (Сафонова Н.В., Жебрун А.Б., 1995).

В связи с осознанием роли Н. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, появились многочисленные работы по изучению Н. pylori, разработаны схемы для эрадикации Н. pylori, диагностические технологии. В настоящее время разработан целый ряд методов, позволяющих выявлять Н. pylori или последствия его персистирования в организме:

- бактериологический — основной метод лабораторной диагностики, включающий в себя выделение, идентификацию, культивирование возбудителя и определение его биологических свойств;

- биохимические методики - заключаются в обнаружении в исследуемой пробе (биоптате слизистой оболочки желудка) фермента уреазы, продуцируемого Н. pylori или в определении уровня аммиака в воздушной среде ротовой полости пациента (аэротест);

- морфологические методики - микроскопия окрашенных мазков-отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка (цитологический метод) или микроскопия парафинизированных срезов, окрашенных стандартными красителями (гистологический метод) или с использованием люминесцирующей сыворотки (гистоиммунохимический метод); серологические методики - наиболее часто используется иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на выявлении специфических антител, в основном класса Ig G к Н. pylori;

Современный подход к изучению инфекции Н. pylori состоит в использовании молекулярно-генетических методов исследования. Данные методы представляют собой различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). Достоинства ПЦР обусловлены практической простотой и скоростью, чувствительностью и специфичностью данного метода. В связи с этим крайне актуально освоение и активное внедрение в работу практических медицинских учреждений методов диагностики, основанных на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя. Указанные методы выявления инфицированности Н. pylori являются перспективными, высокая чувствительность, специфичность и относительная простота метода позволяет его использовать в скрининге больных. Применение метода ПЦР для диагностики хеликобактерной инфекции позволит значительно повысить эффективность антихеликобактерной терапии и сократить затраты на лечение.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: усовершенствование комплекса молекулярно-биологических методов детекции, внутривидового типирования Н. pylori, основанных на принципе полимеразной цепной реакции, разработка полуколичественного варианта полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальное материально-техническое обеспечение для детекции Н. pylori методом полимеразной цепной реакции. Адаптировать метод к практическому применению при диагностике хеликобактериоза.

2. Изучить особенности выявления Н. pylori методом полимеразной цепной реакции в различных биологических материалах: биоптатах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочном соке, фекалиях.

3. Провести сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori, полученных методом полимеразной цепной реакции и традиционными микробиологическими методами диагностики хеликобактерной инфекции.

4. Исследовать распространение Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах.

5. Разработать полуколичественный вариант полимеразной цепной реакции для детекции Н. pylori, позволяющий проводить оценку эффективности антихеликобактерной терапии.

6. Изучить возможность применения метода полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и разработать метод для типирования его изолятов.

Научная новизна работы:

На обширном контингенте больных с различными типами гастродуоденальной патологии установлена высокая степень инфицированности Н. pylori. Применение современных молекулярнобиологических методов диагностики позволило получить новую, объективную научную информацию о циркуляции Н. pylori.

Предложен полуколичественный вариант полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии, с его использованием проведены исследования по контролю за проведенным лечением.

Разработан метод, основанный на гетеродуплексном анализе фрагмента гена CagA, позволяющий дифференцировать изоляты Н. pylori.

Практическое значение работы:

Предложенный комплекс молекулярно-генетических методов выявления Н. pylori является перспективным для внедрения в практическую медицину. Высокая чувствительность, специфичность, относительная простота и невысокая стоимость метода позволяет широко использовать его как при первичной диагностике хеликобактерной инфекции, так и для оценки эффективности лечения. Использование полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и гетеродуплексного анализа дает возможность получить штаммовую характеристику ПЦР-изолятов возбудителя. Полученные данные могут быть использованы в системе эпиднадзора за хеликобактерной инфекцией. Применение предложенного комплекса методов позволит значительно улучшить диагностику инфекции Н. pylori, повысить ее эффективность, проводить своевременную терапию и сократить затраты на лечение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алгоритм обследования пациентов с гастродуоденальной патологией, основанный на методе полимеразной цепной реакции, разработанный в данной работе, позволяет выявлять Н. pylori с минимальной инвазивностью и оценивать эффективность антихеликобактерной терапии.

2. Метод полимеразной цепной реакции дает возможность получить более объективные данные о распространении Н. pylori у больных с различными типами гастродуоденальной патологии по сравнению с наиболее распространенными в практике морфологическими методами выявления хеликобактера.

3. Использование молекулярно-генетических методов (полимеразной цепной реакции, гетеродуплексного анализа) позволяет получать информацию о присутствии генов факторов патогенности Н. pylori, о различиях в нуклеотидных последовательностях этих генов, осуществлять эпидемиологический мониторинг за хеликобактериозом.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Н. pylori» (2001); III Российском научном форуме «Гастро-2001» (Санкт-Петербург, 2001); IV Российском научном форуме с международным участием «Гастро-2002» (Санкт-Петербург, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002); V, VI Нижегородских сессиях молодых ученых. (Н. Новгород, 2000, 2001); заседании Ученого совета и межлабораторных научных конференциях Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Махова, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован для практического применения комплекс молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить детекцию и дифференцировку Н. pylori за счет подбора реактивов, температурно-временных условий, материально-технического обеспечения.

2. Доказана целесообразность исследования методом полимеразной цепной реакции проб желудочного сока как информативного субстрата, не требующего инвазивной процедуры забора по сравнению с образцами биоптатов слизистой оболочки желудка.

3. Показана диагностическая ценность метода полимеразной цепной реакции при выявлении Н. pylori и его преимущества по сравнению с традиционными микробиологическими методами. Эффективность метода полимеразной цепной реакции в 2,5 раза выше, чем метода световой микроскопии.

4. Установлена высокая степень инфицированности Н. pylori детского (58,9%) и взрослого (82,9%) населения с различными типами гастродуоденальной патологии при обследовании обширного контингента больных (724 человека).

5. Показана возможность использования полуколичественного варианта полимеразной цепной реакции для оценки эффективности проведенной антихеликобактерной терапии.

6. Установлена высокая распространенность токсигенных штаммов среди популяции Н. pylori (76,4%). Предложен метод дифференцировки изолятов Н. pylori, основанный на гетеродуплексном анализе фрагментов гена CagA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время, в связи с признанием роли Н. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, разработка технологий диагностики хеликобактериоза является актуальной задачей здравоохранения. К настоящему моменту предложен целый ряд методов, позволяющий выявлять Н. pylori'. бактериологические, морфологические, биохимические, серологические. Наряду с достоинствами, каждая из перечисленных методик имеет также свои ограничения.

Перспективным направлением в изучении Н. pylori является разработка и внедрение в научные исследования и практическую медицину методов молекулярно-генетического комплекса и, в частности, ПЦР. Метод ПЦР уже нашел свое применение в диагностике целого ряда инфекционных агентов как бактериальной (хламидии, микоплазмы, представители сем. Enterobacteriacea и многие другие), так и вирусной природы (вирусные гепатиты А, В, С, D, G; вирусы сем. Herpeviridae; адено-, рото-, ретровирусы и др.). Достоинства ПЦР обусловлены практической простотой и скоростью, высокой чувствительностью и специфичностью.

В связи с этим важной задачей является освоение ПЦР и активное использование в работе практических медицинских учреждений данных, полученных с помощью методов, основанных на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя.

Исходя из цели данной работы, первая задача нашего исследования носила методический характер и заключалась в освоении и совершенствовании метода ПЦР для выявления возбудителя хеликобактерной инфекции и подборе оптимального варианта диагностикума на Н. pylori, используя отечественные реактивы и экспериментальные ПЦР тест-системы.

В рамках этой задачи были решены проблемы, позволяющие избежать недостоверных результатов при ПЦР-диагностике инфекционных агентов.

Нами подобрано оптимальное приборное обеспечение, в частности, приборы для синтеза ДНК - амплификаторы и система для визуализации результатов.

Среди широкого модельного ряда программируемых термостатов (амплификаторов), отечественный прибор «ТерцикМС2» показал наиболее оптимальные рабочие характеристики, что, наряду с его невысокой относительно импортных аналогов стоимостью, позволили рекомендовать его для научных и практических исследований.

Использование системы для визуализации изображения «Biotest» позволило свести к минимуму количество манипуляций с гелем, содержащим ампликоны, и упростило (по сравнению с фотографированием на пленки) процедуру фиксации результата, за счет сохранения видеоизображения геля с продуктами ПЦР в электронном виде в памяти персонального компьютера.

В ходе работы было проведено сравнение различных способов выделения ДНК из клинического материала: кипячения, фенольно-хлороформной депротеинизации, неферментативного лизиса. Наиболее технологичным был признан вариант, основанный на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом, который и был выбран нами для последующих экспериментов. Этот вариант выделения ДНК позволил увеличить эффективность выделения ДНК из пробы, отказаться от работы с токсичными веществами (фенол, хлороформ), сократить время первой стадии метода ПЦР - выделения ДНК.

Была проведена апробация и адаптация экспериментальных отечественных тест-систем, основанных на принципе ПЦР, для выявления Н. pylori, подобраны оптимальные температурно-временные режимы для проведения амплификации, концентрация компонентов реакционной смеси. Все это позволило добиться надежного синтеза специфических фрагментов и снижения, а в большинстве случаев и полного отсутствия амплификации неспецифических фрагментов.

При сравнительном исследовании отечественных ПЦР тест-систем для выявления Н. pylori, система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» производства Центрального НИИ эпидемиологии была признана наиболее чувствительной и удобной в работе. Она была рекомендована нами для проведения практических исследований (Мазепа В.Н. и соавт, 2000).

Для исключения ложноположительных результатов как одной из причин ошибок при ПЦР-диагностике нами была внедрена антиконтаминационная защита проведения ПЦР-исследования, основанная на использовании урацил-ДНК-гликозилазы и модифицированного уридинтрифосфата.

Во избежание ложноотрицательных результатов - для контроля за прохождением ПЦР, на стадии пробоподготовки в образцы вносили конкурентный внутренний контроль (был использован универсальный внутренний контрольный образец для урогенитальных инфекций производства Центрального НИИ эпидемиологии).

Традиционно для диагностики инфекции Н. pylori субстратом исследования является биоптат слизистой оболочки желудка, однако высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать менее обсемененные субстраты, такие как желудочный сок и фекалии.

Нами проведена оценка возможности использования желудочного сока, а также фекалий как возможного материала для ПЦР-детекции Н. pylori. Полученные результаты позволили рекомендовать исследование желудочного сока как менее инвазивного и более интегративного материала при обследовании пациентов. Кроме того, следует отметить, что при работе с желудочным соком не наблюдается неспецифического синтеза ДНК, что объясняется незначительным количеством эукариотической ДНК в данном материале.

Хотя наиболее доступным материалом для выявления Н. pylori являются фекалии, в ходе работы нами было установлено, что эффективность выявления Н. pylori в копроматериале составляет всего 35,3% от числа всех Н. ту/оп-положительных проб. Столь низкая выявляемость возбудителя в пробах копроматериала объясняется ингибированием ПЦР компонентами непереваренной пищи. К сожалению, доступных недорогих методов, позволяющих избавиться от ингибиторов, не имеется.

В настоящее время международным «золотым стандартом» лабораторной диагностики Н. pylori является комплексное обследование, включающее три метода: бактериологический, уреазный и гистологический. Для большинства отечественных практических лечебных учреждений такой диагностический комплекс дорог и не доступен.

Поскольку использованные в работе ПЦР тест-системы для детекции Н. pylori являются экспериментальными и не имеется достаточной информации об их применении в практической диагностике нами проведено сопоставление результатов полученных методом ПЦР с результатами традиционных микробиологических методов выявления Н. pylori, доступных медицинской практике.

Проведенные исследования показали, что метод ПЦР в 2,5 раза эффективнее выявляет Н. pylori, чем метод световой микроскопии.

При сравнении результатов, полученных методом ПЦР и микроскопией пристеночной слизи (brush-биопсия) установлено, что выявляемость Н. pylori методом ПЦР выше и составила 83,3% от числа всех Н. /ту/огг-положительных проб, при исследовании пристеночной слизи желудка этот показатель составил 70,8%.

Сравнительный анализ результатов, полученных при параллельном исследовании проб методом ПЦР и гистологическим методом, показал, что гистологический метод давал ложноположительные результаты и приводил к гипердиагностике.

В целом следует отметить субъективизм, характерный для методов, основанных на идентификации возбудителя в образце по морфологическим признакам.

В ходе работы нами доказана диагностическая ценность метода ПЦР при выявлении Н. pylori и его преимущества по сравнению с другими методами диагностики возбудителя хеликобактерной инфекции, доступными специализированным медицинским учреждениям г. Нижнего Новгорода: цитологическим (световая микроскопия, brush-биопсия), гистологическим.

Полученные в ходе работы методические разработки: реактивы, материально-техническое обеспечение, рекомендуемый субстрат для исследования, а также результаты, полученные при сравнении выявления Н. pylori различными методами - позволили рекомендовать метод ПЦР для практического использования.

Такие положительные стороны этого метода как высокая чувствительность и специфичность, наряду со снижением вероятности возникновения ложных результатов позволяют получить истинную картину инфицированности Н. pylori.

Одним из вопросов, касающихся инфекции Н. pylori, является вопрос о детской инфицированности. Нами проведено обследование 285 детей в возрасте от 8 до 17 лет с различными типами гастродуоденальной патологии. Материалом для исследования на Н. pylori у детей был выбран желудочный сок. Н. pylori был выявлен методом ПЦР 58,9% случаев.

В рамках проводимых исследований по выявлению инфекции Н. pylori методом ПЦР было обследовано 439 взрослых больных с разными типами гастродуоденальной патологии. Н. pylori был выявлен в 82,9%.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени инфицированности населения г. Нижнего Новгорода, которая во многом обеспечивается за счет раннего инфицирования детей. Перечисленные данные указывают на необходимость проведения эрадикационной терапии во избежание более тяжелых последствий персистирования Н. pylori в организме, таких как прободение, кровотечение желудка, развитие злокачественных новообразований.

В связи с этим актуальна разработка методических приемов, позволяющих проводить оценку степени инфицированности и эффективности проведенной терапии. К сожалению, большинство методов диагностики инфекции Н. pylori имеют ограничение, связанное с невозможностью раннего контроля излеченности. Для большинства методов контроль излеченности возможен по истечении 4 недель после окончания терапии, а при применении серологических методик - через 6 месяцев.

Актуальной задачей лабораторной диагностики хеликобактериоза является адаптация метода ПЦР для объективной оценки эффективности антихеликобактерной терапии. Высокая чувствительность и специфичность метода ПЦР позволяет избегать ложноотрицательной диагностики, выявлять кокковые формы. Кроме того, предложенный нами полуколичественный вариант ПЦР позволяет оценивать изменения степени обсемененности до и после лечения.

Нами был апробирован полуколичественный вариант ПЦР, проводимый с разведениями ДНК (в 10, 100, 1000 раз), выделенной из пробы желудочного сока. Производился забор тощаковой порции желудочного сока как наиболее усредненного интегративного субстрата для детекции Н. pylori. Проводили сравнительный анализ электрофореграмм продуктов ПЦР полученных из разведений желудочного сока, забранного от пациентов до лечения и через 1-2 недели после завершения терапии. При этом в ряде случаев (32,5%) не наблюдалось изменений концентрации возбудителя в пробах, забранных до лечения и после, что говорит о необходимости продолжения лечения с использованием других схем.

В 22,5 % случаев ДНК Н. pylori выявлялась во всех разведениях у больных до лечения, а после терапии - только в исходной пробе желудочного сока (наблюдалось слабое свечение специфического фрагмента). Детекция незначительных количеств специфического фрагмента может быть объяснена амплификацией остатков ДНК погибшего возбудителя. Данный результат, а также отрицательный результат после лечения у исходно инфицированных больных рассматривался нами как свидетельство эффективности проведенной терапии, что подтверждено эндоскопическими и клиническими улучшениями и отдаленными результатами. В течение 1-1,5 лет больные данной группы отмечали хорошее самочувствие, не обращались за медицинской помощью. В то время как некоторые больных без эффекта эрадикации Н. pylori имели рецидив язвенной болезни.

При анализе эффективности различных схем антихеликобактерной терапии было показано, что в большинство случаев с отсутствием эрадикации (86%) после проведенного лечения связано со схемами, в которые входил метронидазол.

Результаты показывают, что наряду с высокой чувствительностью и специфичностью и невысокой инвазивностью (за счет исследования желудочного сока, а не биоптата) метод ПЦР может быть рекомендован для оценки эффективности проведенной противохеликобактерной терапии уже через 1-2 недели после окончания курса. Использование полуколичественного варианта ПЦР имеет прогностическое значение при оценке предполагаемого эффекта от проведенной антихеликобактерной терапии.

Способность Н. pylori обусловливать развитие целого ряда гастродуоденальных заболеваний связана с наличием у него комплекса факторов патогенности. Одной из задач нашей работы являлась апробация отечественных ПЦР тест-систем, позволяющих выявлять гены одних из наиболее значимых факторов патогенности Н. pylori: гена токсигенности CagA- маркера острова патогенности и вакуолизирующего цитотоксина VacA.

В ходе работы была показана высокая степень инфицированности токсигенными штаммами Н. pylori (76,4%). При сопоставлении результатов ПЦР с диагнозом заболевания обследованных установлено, что большая часть гастродуоденальных заболеваний желудка ассоциирована с токсигенными штаммами Н. pylori (63,4%), в то время как при патологии ДПК чаще выявлялись CagA-отрицательные штаммы (82% от всех CagA-положительных изолятов).

В целом, апробированная ПЦР тест-система для выявления гена CagA «Диаген-Helicobacter» производства фирмы «Лагис» (г. Москва) зарекомендовала себя удобной в работе, не давала неспецифического синтеза и ложноположительных результатов.

В ходе работы по выявлению гена вакуолизирующего цитотоксина VacA - с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол VA», НПФ «Литех», мы столкнулись с рядом трудностей. Первая заключалась в том, что ген VacA может быть представлен несколькими аллельными вариантами двух вариабельных участков гена (s и т). В связи с этим для установления генотипа проводится 3 ПЦР-реакции. Во-вторых, в связи с не совсем удачным дизайном праймеров наблюдалось образование неспецифических фрагментов за счет амплификации с участков ДНК человека. Кроме того, в ряде случаев наблюдался синтез только с одного из определяемых аллельных вариантов (либо с s, либо с ш).

В результате ген VacA был выявлен в 63,8% исследованных образцов, полностью установлен генотип в 43,5% от числа всех VacA-положительных проб. Но сложность и нестабильность работы тест-системы «Хеликопол VA», возникающие затруднения с интерпретацией результатов не позволяют рекомендовать ее для проведения практических исследований.

Геном Н. pylori отличается высокой гетерогенностью. Данный факт может быть основой для разработки методов дифференциации этого микроорганизма Нами для оценки вариабельности нуклеотидной последовательности фрагмента гена CagA был использован метод гетеродуплексного анализа. Метод основан на электрофоретическом разделении денатурированных, а затем ренатурированных комплементарных и частично комплементарных цепей, имеющих единичные нарушения структуры двойной спирали за счет ошибочно связанных нуклеотидов и брешей. Это приводит к уменьшению подвижности ДНК в порах полиакриламидного геля и такой частично гомологичный фрагмент носит название гетеродуплекс. Контролем подвижности является полностью гомологичный фрагмент - гомодуплекс.

Проведенные исследования показали, что фрагменты гена CagA, полученные после амплификации с использованием ПЦР тест-системы «ДиаГен-Helicobacter» отличались между собой нуклеотидной последовательностью.

Перечисленные факты указывают на перспективность гена CagA как одного из возможных маркеров при изучении штаммового разнообразия Н. pylori.

Предложенный комплекс молекулярно-генетических методов выявления Н. pylori адаптирован для практических клинических исследований. Относительная простота, высокие чувствительность и специфичность и низкая инвазивность (при исследовании желудочного сока) позволяет использовать его при обследовании больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии как для первичной диагностики инфекции, так и для оценки эффективности специфической эрадикации Н. pylori. Использование ПЦР тест-систем на факторы патогенности и гетеродуплексного анализа вариабельных фрагментов гена CagA позволяет получить информацию о штаммовых особенностях ПЦР-изолятов.

Оптимальный алгоритм обследования больных с гастродуоденальной патологией на инфицированность Н. pylori методом ПЦР включает следующие этапы:

1. Проведение анализа на присутствие Н. pylori в пробах желудочного сока при поступлении больного в стационар (препарат нуклеиновых кислот, выделенных из желудочного сока сохраняется при минус 20°С до завершения лечения);

2. В случае назначения антихеликобактерной терапии, после ее завершения проведение повторного анализа желудочного сока на наличие Н. pylori-,

3. При положительном результате в контрольном необходимо проведение полуколичественного исследования образцов желудочного сока, забранных до и после проведения терапии;

4. В случае отсутствия эффекта эрадикации (концентрация Н. pylori в желудочном соке после лечения не изменилась или уменьшилась незначительно до 10-100 раз) целесообразно повторение терапии с использованием измененной схемы. После завершения второго этапа лечения также проводится контрольный анализ на присутствие Н. pylori.

После получения положительного результата на первой стадии целесообразно проведение полуколичественного исследования на Н. pylori и выявление гена CagA. Результаты титрования и определения токсигенности следует учитывать при назначении антихеликобактерной терапии. Как правило, высокие титры возбудителя (1/100, 1/1000) и наличие гена CagA являются показанием к проведению лечения. При обнаружении хеликобактера только в неразведенном желудочном соке и в его разведении 1/10, а также при отсутствии гена токсигенности CagA и серьезных клинических проявлений вопрос о проведении эрадикации Н. pylori однозначного решения не имеет. С одной стороны, такое состояние может рассматриваться как носительство, при котором нет необходимости в проведении терапии, а с другой стороны - как начальная, бессимптомная стадия развития хеликобактерной инфекции, и в этой ситуации своевременное профилактическое лечение позволит избежать формирования тяжелой гастродуоденальной патологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Махова, Мария Александровна, 2003 год

1. Анчукова Э.Л. Возможности цитологической диагностики Helicobacter pylori по материалу гастробиопсий. // Клин. лаб. диагностика. 1992. -№ 11-12. - С. 66-68.

2. Аруин Л.И. Helicobacter pylori в этиологии патогенезе язвенной болезни. // Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. -Н. Новгород, 1998. С. 6-10.

3. Аруин.Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам, 1993.-С. 151-161.

4. Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 243-255.

5. Бухарин О.В., Кириллов В.А. О некоторых механизмах персистенции Helicobacter pylori. // Журн. микробиол. 2002. - №2. - с.89- 94.

6. Волков А.И. Хронические гастродуодениты и язвенная болезнь у детей. // Рус. Мед. Жур. 1999. - Т. 7. - № 4. - С. 4-20.

7. Говорун в.М., Гущин А.Е., Исаков В.А., Кудрявцева Л.В., Семин С.Г., Щербаков П.Л. Молекулярная диагностика и генотипирование Helicobacter pylori в биопсиях слизистой оболочки желудка. III

8. Международный симпозиум «Диагносика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori». // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2000. - № 2. - С. 12-15.

9. Ю.Грефф М. Ятрогенный путь передачи инфекции Helicobacter pylori и стерилизация эндоскопического оборудования. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Д. М.: Триада-Х, 1999. - С. 21-28.

10. П.Григорьев Т.Я., Яковенко Э.П. Диагностика и лечение органов пищеварения. М.: Медицина, 1996. - С. 19-25.

11. Домарадский И.В. Молекулярно-биологические особенности изменчивости Helicobacter pylori. // Журн. микробиол. 2002. - № 3. - С. 79-84.

12. Дубинина И.Г., Щербо С.Н. Макаров В.Б. Метод ПЦР в лабораторной практике. // Клин. лаб. диагностика.- 1997. №7.- - С. 5 - 9.16.3игангирова Н.А. ПЦР в диагностике хеликобактериозов. // Жур. микробиол. 1991. - № 11. - С. 20 - 24.

13. Ивашкин В,Т. Helicobacter pylori и язвенная болезнь.// Клиническая фармакология и терапия. 1997. - Т. 6. - № 1. - С. 34-37.

14. Ивашкин В.Т., Никитина Е.И., Степанов Е.В., Миляев в.А., Зырянов13

15. П.В. Основы лазерного С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. -М.: Триада-Х, 1999. С. 122-130.

16. Каргальцева Н.М. Хеликобактериоз. Методическое пособие. Санкт-Петербургская академия постдипломного образования. СПб., 1997. -12 с.

17. Катышева А.В., Белоусов С.С., Махова М.А., Мазепа В.Н. Ранняя реабилитация больных после ушивания перфоративных гастродуоденальных язв. // Материалы III Российского научного форума «Гастро-2001». Гастробюллетень.- 2001. - №2-3. - С. 44-46.

18. Кишкун А. А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori. // Клин. лаб. диагностика. 2002. - № 8. - С.41-46.

19. Кононов А.В. и др. Экспрессия тканевых антигенов и лимфопролиферативный ответ при хеликобактер-ассоциированныхзаболеваниях желудка. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1997. - Т. VII. - №5. Прил. - С. 30-31.

20. Кононов А.В. Местный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori. И Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998. - С. 14-19.

21. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Хинтинская М.С., Катаева JI.A., Спирина Г.В., Кириллов М.Ю., Шобухова Т.С., Волкова Р.А., Постникова Т.М., Современные методы диагностики Helicobacter pylori у детей. // Пособие для врачей. М., 2000. - 19 с.

22. Корсунский А.А. Инфекция Helicobacter pylori в педиатрической практике. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 224-242.

23. Кудрявцева Л.В. Опыт изучения антибиотикорезистентных российских штаммов Helicobacter pylori. // Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998. - С. 11-14.

24. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики Helicobacter pylori. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л.-М., 1999.-С. 107-116.

25. Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии. М., 1993. -С. 9-25.

26. Мазепа В.Н., Бокарев А.А., Шипулин Г.А., Щелокова Е.И., Перфилова К.М., Деречинская Е.Л., Орлова К.А., Махова М.А. Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера. Пособие для врачей. Н. Новгород, 2000. - 8с.

27. Мазепа В.Н., Махова М.А. Гетеродуплексный анализ фрагментов гена CagA Helicobacter pylori, полученных из клинического материала методом ПЦР. Тезисы III съезда биохимического общества. СПб., 2002. - С. 298.

28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженериию Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - С. 175-179.

29. Маркова Г.А., Бошнаков Р.Х., Петров П.К., Кацаров К.В., Гинцбург A.JL Применение ПЦР для идентификации Helicobacter pylori в клиническом материале. // Молек. генетика, микробиол и вирусол. 1994. - № 1. - С. 10-15.

30. Махова М.А. Использование полимеразной цепной реакции для оценки эффективности противогеликобактерной терапии у больных с язвенной болезнью. // Сб. тезисов докладов VI Нижегородской сессии молодых ученых. Н. Новгород, 2001. - С. 171.

31. Махова М.А. Совершенствование метода полимеразной цепной реакции для выявления Helicobacter pylori у больных с гастродуоденальной патологией. // Сб. тезисов докладов V Нижегородской сессии молодых ученых. Н. Новгород, 2000. - С. 206.

32. Мельникова В.А., Арзуманян Н.О. Helicobacter pylori при желудочно-кишечных заболеваниях и у здоровых лиц. // Журн. микробиол. 2000. -№6.-С. 108-112.

33. Морозов И.А. Морфологическая диагностика хронического гастрита и инфекции Helicobacter pylori в желудке. // Материалы 7-й сессии

34. Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998.-С. 19-21.

35. Морозов И.А. Проблемы морфологической диагностики Helicobacter pylori. // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 117121.

36. Морозов И.А. Цитологическая диагностика инфекции Helicobacter pylori в желудке. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2000. -№2.-С. 7-10.

37. Нурмухаметова Е. Быстрый анализ крови на Helicobacter pylori. // Рус. Мед. журн. 1997. -Т.5. - № 18.-22-23.

38. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. М.: Мир, 1997. - С. 46, 65.

39. Пасечников В. Д. Полимеразная цепная реакция в диагностике Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori. Сб. научных статей. М., 1998. - С. 8-10.

40. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Значение геномной гетерогенности штаммов Helicobacter pylori в развитии ассоцированной патологии гастродуоденальной зоны. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2000. - № 3. - С. 7-11.

41. Пахарес-Гарсия Х.М. Уреазный дыхательный тест с мочевиной 11меченной С. Испанский опыт. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. -М.: Триада-Х, 1999.-С. 122-130.

42. Покровский В.В., Шипулин Г.А., Безруков В.М., Бектимиров Т.А., Блоха В.В., Куличенко А.Н. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях использующих метод ПЦР. М., 1995. -10 с.

43. Рекомендации по лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых при язвенной болезни желудка и ДПК. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998. - Т. 8. - № 1. - С. 82-83.

44. Рожавин М.А., Сологуб В.В., Микитюк И.Б. Диагностическое значение различных методов выявления Helicobacter pylori у больных с гастродуоденальной патологией. // Клин. мед. -1989. № 8. - С. 38-43.

45. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. // Анализ генома. Методы. Под. ред Дейвиса К. М.: Мир, 1990. - С. 176190.

46. Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактероз. СПб., 1995. - 40 с.

47. Серебрянская М.В. Прогностическая значимость выявления Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью. // Клин. Мед. 1994. - № 6. - С. 4042.

48. Спесивцев В.Н. Диагностические возможности иммунологического метода выявления Helicobacter pylori. // Клин. мед. 1992. - № 11-12. - С. 55-57.

49. Татаринов П.А., Грацианская А.Н. Helicobacter pylori: роль в арзвитии патологии желудочно-кишечного тракта, методы диагностики, подходы к лечению. // Педиатрия. 1998. - №2. - С. 92-97.

50. Чайка Н.А., Блейзер М. Дж., Буцлер Ж.-П., Бейер Т.В., Масловская Г.Я., Рыбальченко О.В., Сафонова Н.В., Стрелкова М.Р., Хазенсон Л.Б., Гуссенс Г., Ванг В. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988. С. 115135.

51. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. // Сб.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. М.: Мир,1999.-С. 404-406.

52. Щербаков П.Л. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 14-20.

53. Allaker R. P., Young K. A., Hardie J. M., Domizio P., Meadows N. J. Prevalence of helicobacter pylori at oral and gastrointestinal sites in children: evidence for possible oral-to-oral transmission. // J. Med. Microbiol.- 2002.-Vol. 51. №4.- P.312-317.

54. Andreson H., Loivukene K., Sillakivi Т., Maaroos H. I., Ustav M., Peetsalu A., Mikelsaar M. Association of cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori with gastric diseases in Estonia. // J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol.40. -№1.- P.298-300.

55. Ashton-Key M., Diss Т. C., Isaacson P. G. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy and resection specimens. // J. Clin. Pathol.- 1996.- Vol. 49. -№2.-P. 107-111.

56. Aspinall G., Moran A. Unique structural and biological features oh Helicobacter pylori lipopolisacharides. //Prog. Clin. Biol. 1998. - Vol. 397. -P. 37-49.

57. Atherton J.C. Non-endoscopic test in the diagnosis of Helicobacter pylori. // Aliment. Parmacol. Ther. 1997. - Vol. 11.- Suppl. 1. - P. 11-20.

58. Atherton J.C., Peek R.M. Jr., Tham K.T. Clinical and pathological importance of heterogenecity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori. // Gastroenterology. 1997. - Vol. 112. - P. 92-99.

59. Bauerfeind P., Garner R., Dunn B.E., Mobley H.L.T. Syntesis and activity of Helicobacter pylori urease and catalase at low pH. // Gut. 1997. - Vol. 40. -P. 25-30.

60. Blaser M. Helicobacter pylori: Cost of commensalisms. // 6-th United Europian Gastroenterology Week. 1997. - Abstract-on-disk.

61. Carmona Т., Minoz E., Del Mar Abad M. usefulness of antral brushing samples stained with Diff-Quik in the cytologic diagnosis of Helicobacter pylori. A coparative methodologic study. // Acta Cytol. 1995. - Vol. 39. -P. 669-672.

62. Catrenich C.E., Makin K.M. Characterization of the morthologic conversion of Helicobacter pylori from bacillary to coccoid forms. // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 26. - Suppl. 181. - P. 58-64.

63. Cellini L., Allocati N., Angelucci D., Iezzi N., Di-Camply E., Marzio L. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice. // Micribiol. Immunol. 1995. - Vol. 38. - P. 833-850.

64. Chan W.Y., Hui P.K., Leung K.M., Chow J., Kwok F., Ng C.-S. Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach. // Am. J. Clin . Pathol. -1994.-Vol. 102.-P. 503-507.

65. Chisholm S. A., Teare E. L., Patel В., Owen R. J. Determination of Helicobacter pylori vacA allelic types by single-step multiplex PCR. // Lett. Appl. Microbiol.- 2002.- Vol. 35. №1.- P.42-46.

66. Ciesielska U., Jagoda E., Marciniak Z. Value of PCR technique in detection of Helicobacter pylori in paraffin-embedded material. // Folia Histochem.Cytobiol.- 2002.- Vol.40, №2.- P.129-130.

67. Clayton C., Kleanthous K., Tabaqchali S. Detection and identification of Helicobacter pylori by the polymerase chain reaction. // J.Clin.Pathol.- 1991.-Vol. 44. №6.- P.515-516.

68. Cohen H., Laine L. Endoscopic methods for the diagnosis of Helicobacter pylori. // Aliment. Parmacol. Ther. 1997. - Vol. 11,- Suppl. 1. - P. 3-9.

69. Covacci A., Rappuoli R. Tirozine-phosphorylated bacterial proteins: Trojan horses for the host cell. // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 191. - P. 587-592.

70. Cover T.L., Blaser M.J. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 10570-10575.

71. Cover T.L., Dooley C.P., Blaser M.J. Characterization of and human serologic response to protein in Helicobacter pylori broth culture supernatants with vacuolizing cytotoxin activity. // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 603-610.

72. Crabtree J., Kersulyte D., Li S.D. Modulation of Helicobacter pylori-induced interleukin-8 sinthesis in gastric epilethelial cell mediated by cag PAI encoded VirD4 homologue. // J. Clin. Pathol. 1999. - Vol. 52. - P. 653657.

73. Dunn B.E., Vakil N.B., Schneider B.G., Miller M.M., Zitler J.B., Peutz Т., Phadnis S.H. Localization of Helicobacter pylori urease and heat shock protein in human gastric biopsies. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 65. - P. 1181-1188.

74. Eaton K.A. Animals models of Helicobacter gastritis. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 123-154.

75. Eaton K.A., Brooks C.L., Morgan D.R., Krakowska S. Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 2470-2475.

76. Eaton K.A., Catrenich C.E., Makin K.M., Krakowska S. Virulence of coccoid and bacillary forms of Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. // J. Infect. Dis.- 1995.-Vol. 171.-P. 459-462.

77. Farrell D. J. New developments in PCR-based diagnosis. Report of a session at the 11th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. // Expert. Rev.Mol. Diagn.- 2001,- Vol. 1 №1.- P.9-10.

78. Figura N. Helicobacter pylori exotoxins and gastroduodenal diseases associated with cytotoxic strain infection. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. -Vol. 10. - Suppl. 1.-79-96.

79. Fontham E.M., Ruiz В., Perez A. et al. Determinants of Helicobacter pylori infection and chronic gastritis. // Am. J. Gastroenterol. 1995. - Vol. 90. -№7.-P. 1094-1101.

80. Harris P. R., Mobley H. L., Perez-Perez G. I., Blaser M. J., Smith P. D. Helicobacter pylori urease is a potent stimulus of mononuclear phagocyte activation and inflammatory cytokine production. // Gastroenterology.-1996.- Vol. 111. -№2.-P.419-425.

81. Hulter K., Han S.W., Enroth H., Klein P.D., Opekun A.R., Gilman R.H., Evans D.G., Engstrand L., Graham D.Y., Elzaatari F. Helicobacter pylori in drinking water in Peru. // Gastroenterology. 1996. - Vol. 110. - P. 1031-1035.

82. Jeisong H., Megraud F. Evidence of the viability of non culturable coccoidal form of Helicobacter felis. // Gut. 1995. - Vol. 37. - Supll. 1. -P. 376.

83. Kabir S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and enzyme immunoassay. // J. Med. Microbiol.- 2001.- Vol. 50. №12.- P.1021-1029.

84. Kalantar J., Eslik G.D., Taller N.J. Chronic gastritis and nonulcer dyspepsia. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 31-46.

85. Keates S., Keates A.C., Varny M. Differential activation of mitogen-activated protein kinases in AGS gastric epithelial cells by cag+ and cag-Helicobacter pylori. // J. Immunol. 1999. - Vol. 163. - P. 5552-5559.

86. Kelly S.M., Pitcher M.C.L., Farmery S.M., Gibson G.R. Isolation of Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom. // Gastroenterology. 1994. - Vol. 107. - P. 1671-1674.

87. Kolk H., Maaroos H. Do dyspeptic patients under the age of 45 need to be investigated. // 6-th United Europian Gastroenterology Week. 1997. -Abstract-on-disk.

88. Kusters J.G., Gerrits M.M., Van Strijp J.A., Vandenbroucke-Grauls C.M. Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 36723679.

89. Li C., Musich P. R., На Т., Ferguson D. A. Jr., Patel N. R., Chi D. S., Thomas E. High prevalence of Helicobacter pylori in saliva demonstrated by a novel PCR assay. // J. Clin. Pathol.- 1995.- Vol. 48. №7.- P.662-666.

90. Lin Т. Т., Yeh С. Т., Wu С. S., Liaw Y. F. Detection and partial sequence analysis of Helicobacter pylori DNA in the bile samples. // Dig. Dis. Sci.- 1995,- Vol. 40. №10.- P.2214-2219.

91. Ling T.K.W., Cheng A.F.B., Sung J.J.Y. An increase in Helicobacter pylori strains resistant to metronidazole: a five-year study. // Helicobacter. -1996.-Vol. l.-P. 57-61.

92. Lingwood C.A., Wasfy G., Han H., Huesca M. Receptor affinity purification of a lipid-binding adhesin from Helicobacter pylori. // Infect. Immunol. 1993. - Vol. 61. - P. 2474-2478.

93. Maeda S., Yoshida H., Ogura K., Kanai F., Shiratori Y., Omata M. Helicobacter pylori specific nested PCR assay for the detection of 23 S rRNA mutation associated with clarithromycin resistance. // Gut.- 1998.- Vol. 43. -№3.-P.317-321.

94. Malaty H.M. Graham D.Y. Importance of childhood socioeconomic status on the current prevalence of Helicobacter pylori infection. // Gut.-1994.-Vol. 35.-P. 742-745.

95. Malaty H.M., Engstrand L., Pedersen N.L., Graham D.Y. Helicobacter pylori infection genetic and environmental influences. // Ann. Intern. Med. -1994. Vol. 120. - P. 982-986.

96. Mapstone N. P., Lynch D. A., Lewis F. A., Axon А. Т., Tompkins D. S., Dixon M. F., Quirke P. PCR identification of Helicobacter pylori in faeces from gastritis patients. //Lancet.- 1993b.- Vol. 341. №8842.- P.447.

97. Marais A., Monteiro L., Megraud F. Microbiology of Helicobacter pylori. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 103122.

98. Marshall В.J., Barret L.J., Prakash C., McCallum R.W., Guetrant R.L. Urea protects Helicobacter pylori from the bactericidal effect of acid. // Gastroenterology. 1990. - Vol. 99. - P. 687-702.

99. McGee D.J., Mobley H.T.L. Mechanisms of Helicobacter pylori infection: bacterial factor. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999.-P. 156-180.

100. Megraud F. How should Helicobacter pylori infection be diagnosed? // Gastroenterology. 1997. - Vol. 113. - Suppl. - P. 93-98.

101. Megraud F., Hirschl A.M. Diagnosis. // In: Helicobacter pylori: An Atlas.-1998.-P. 10-15.

102. Mitchell H.M. The epidemiology of Helicobacter pylori. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 11-30.

103. Mobley H. The role of Helicobacter pylori urease in the pathogenesis jf gastritis and peptic ulceration. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. - Vol. 10. -Suppl. l.-P. 57-64.

104. Monteiro L., Gras N., Vidal R., Cabrita J., Megraud F. Detection of Helicobacter pylori DNA in human feces by PCR: DNA stability and removal of inhibitors. // J. Microbiol. Methods.- 2001.- Vol. 45. №2.- P.89-94.

105. Moran A.P. Patogenic properties of Helicobacter pylori. // Scand. J. Gastroenterol. 1996. - Vol. 31. - Suppl. 215. - P. 22-31.

106. Moran A.P. The role of lipopolysaccharide in Helicobacter pylori pathogenesis. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. - Vol. 10. - Suppl. 1. - P. 39-50.

107. Moran A.P. Valkonen K., Wadstroom T. Identification of the lectin-like laminin-binding protein of Helicobacter pylori. // Gut. 1995. - Vol. 37. - Supll. l.-P. 1.

108. Morgan D.D., Clayton C., Kleanthous H. Molecular fingerprinting of Helicobacter pylori: an evaluation of methods. // In: Basic clinical aspects of Helicobacter pylori infection. Ed. by Gasbarini G., Pretolani S. Berlin: Springer, 1994. - P. 206-212.

109. Nguyen V.Q., Caprioli R.M., Cover T.L. Carboxy-terminal proteolitic processing of Helicobacter pylori vacuolating toxin. // Infect. Immun. 2001. -Vol. 69.-P. 543-546.

110. Nielsen P., Anderson L.P. Activation of human phagocytic oxidative metabolism by Helicobacter pylori. // Gastroenterology. 1992. - Vol. 103. -P. 1747- 1753.

111. Ning Leel, Kiu-kwong Chuo et al. The seroprevalence of Helicobacter pylori in expectant mothers and their newborns. // Helicobacter pylori: beginning the second decade. Houston, 1994. - Abstract-on-disk.

112. Nishiya D., Shimoyama Т., Fukuda S., Yoshimura Т., Tanaka M., Munakata A. Evaluation of the clinical relevance of the iceAl gene in patients with Helicobacter pylori infection in Japan. // Scand.J.Gastroenterol.-2000.- Vol. 35. №1.- P.36-39.

113. Nogueira C., Figueiredo C., Carneiro F. Helicobacter pylori genotypes may determine gastic histopathology. // Am. J. Pathol. 2001. - Vol. 158. -P. 647-654.

114. Odenbreit S., Puis J., Sedlmaier B. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cell by type IV secretion. // Science. 2000. -Vol. 287.-P. 1497-1500.

115. Osaki Т., Taguchi H., Yamaguchi H., Kamiya S. Detection of Helicobacter pylori in fecal samples of gnotobiotic mice infected with H. pylori by an immunomagnetic-bead separation technique. // J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36. №1.- P.321-323.

116. Pai R., Sasaki E., Tarnawski A.S. Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin (VacA) alters cytoskeleton-associated proteins and interferes with re-epitheliazation of wounded gastric epithelial monolayers. // Cell Biol. Int. -2000.-Vol. 24.-P. 291-301.

117. Pelicic V., Reyrat J.M., Sartori L. Helicobacter pylori VacA cytotoxin associated with the bacteria increases epithelial permeability independently of its vacuolating activity. // Microbiology. -1999. Vol. 145. - P. 2043-2050.

118. Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G. Epidemiology. // In: Helicobacter pylori: An Atlas. 1998. - P. 4-9.

119. Quina M. Historical perspective. // In: Helicobacter pylori: An Atlas-1998.-P. 1-3.

120. Roosendaal R., Kuipers E. J., van den Brule A. J., Pena A. S., Meuwissen S. G., Walboomers J. M., de Graaff J. Detection of Helicobacter pylori DNA by PCR in gastrointestinal equipment. // Lancet.- 1993.- Vol. 341.-№8849.- P.900.

121. Ruzsovics A., Molnar В., Unger Z., Tulassay Z., Pronai L. Determination of Helicobacter pylori cagA, vacA genotypes with real-time PCR melting curve analysis. // J. Physiol. Paris.- 2001.- Vol. 95. №1-6.-P.369-377.

122. Segal E., Cha J., lo J. Altered states: involvement of phosphorilated CagA in the induction of host cellular growth changes by Helicobacter pylori. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14559-14564.

123. Shimada Т., Ohtsuka Y., Endoh M., Yoshiura K., Yoneda M., Hiraishi H., Terano A. Diagnosis of H. pylori infection by PCR. // Nippon Rinsho.-2001.- Vol. 59. №2,- P.280-285.

124. Stein M., Rappuoli R., Covacci A. Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 1263-1268.

125. Szab I., Brutsche S., Tombola F. Formation of anion -selective chanal in the cell plasma membrane by the cytotoxin VacA Helicobacter pylori is required for its biological activity. // Embo. J. 1999. - Vol. 18. - P. 55175527.

126. Tomas J.E., Gibson G.R., Darboe M.K., Dale A., Weaver L.T. Isolation of Helicobacter pylori from human faeces. // Lancet. 1992. - Vol. 340.-P. 1194-1195.

127. Tytgat G.N.J. Endoscopic transmission of Helicobacter pylori. // Aliment. Pharmacol. Ther. 1995. - Vol. 9. - Suppl. 2. - P. 105-110.

128. Veldhuyzen van Zanten S.J.O., Lee A. The role of Helicobacter pylori infection in duodenal and gastric ulcer. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 47-56.

129. Wadstroom Т., Hirmo S., Boren T. Biochemical aspects of Helicobacter pylori colonization of the human gastric mucosa. // Aliment. Pharmacol. Ther. 1996.- Vol. 10. - Suppl. 1. - P. 17-28.

130. Warren J., Marshall B. Unindentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. // Lancet.- 1983.- Vol. 1. P 12731275.

131. Westblom T. U., Phadnis S., Yang P., Czinn S. J. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by means of a polymerase chain reaction assay for gastric juice aspirates. // Clin. Infect. Dis.- 1993.- Vol. 16. №3.- P.367-371.

132. Yamaoka Y., Kodama Т., Kita M., Imanishi J., Kashima K., Graham D. Y. Relationship of vacA genotypes of Helicobacter pylori to cagA status, cytotoxin production, and clinical outcome. // Helicobacter.- 1998.- Vol. 3. -№4.- P.241-253.