Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Северин, Федор Федорович

• Северин, Федор Федорович
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Северин, Федор Федорович

Актуальность проблемы.

Программируемая клеточная смерть (ПКС) является важным физиологическим процессом, необходимым многоклеточным организмам для онтогенеза, поддержания тканевого гомеостаза и иммунной защиты. Механизм запрограммированной смерти, клетки - фундаментальная> теоретическая- и практическая проблема. Дрожжи — примитивные эукариоты, а также классический объект генетических исследований. Наиболее базовые модули- каскада запрограммированной смерти клеток высших эукариот есть и у дрожжей, поэтому данные, полученные на дрожжах, могут служить отправной точкой для исследования аналогичных процессов в клетках высших организмов.

Поскольку ПКС означает самоубийство для одноклеточного организма, то не совсем ясно, почему и как данный механизм сохранился ,в процессе эволюции дрожжей. В последнее время появляется все больше данных, что многоклеточные организмы" имеют программу самоуничтожения1 (гипотеза феноптоза). Таким образом, исследование физиологического самоубийства дрожжевой клетки актуально в. формате изучения программ саморазрушения- у высших организмов. Данные, полученные в последние десятилетия, показывают, что запуск таковой программы у дрожжей направлен на увеличение приспособленности выживших клеток. Действительно, многие из вариантов естественных сценариев активации ПКС Saccharomyces cerevisiae, в том числе, гибель в стационарной культуре, в течение мейоза, при половом процессе, вызванная вирусами, зависят от плотности культуры клеток. Интересно, что и у высших организмов половой процесс также может вызывать гибель: самцы некоторых кальмаров умирают сразу же после спаривания, а самцы сумчатых крыс умирают через две недели после гона от избытка собственных феромонов. Как известно, многие виды лососевых рыб также умирают сразу после нереста.

Быстрая» запрограммированная смерть многоклеточных не обязательно сопряжена с размножением. Смерть больного организма ради выживания ■ окружающих может быть выгодна потому, что препятствует распространению инфекции. Оказалось, что у высших животных существует механизм, убивающий их в ответ на появление Грам-отрицательных бактерий в крови. Введенные в кровь экспериметальных животных липополисахариды (LPS) клеточной стенки бактерий токсичны. Эта токсичность резко снижается при. блокировании специализированного LPS-связывающего белка в крови, а также при ингибировании специализированных клеточных рецепторов LPS-белкового комплекса.

Недавно был предложен термин для описания этого явления на заключительной стадии жизненного цикла - быстрый феноптоз.

Кроме того, в терминах гипотезы феноптоза старение многоклеточных организмов (то есть возраст-зависимая дегенерация) — основная контр-продуктивная программа, «медленный феноптоз». Дрожжи являются удобной моделью для исследования старения. Они тоже стареют: материнская клетка может произвести ограниченное количество дочерних (20-30), после чего умирает. В процессе старения клетка накапливает маркеры окислительного стресса, мутации в ядерной и митохондриальной ДНК и другие повреждения. Интересно, что механизм старения дрожжей во многом схож с таковым у высших эукариот. Например, ортологи гена деацетилазы гистонов SIR2 присутствуют у всех эукариот включая дрожжи. У дрожжей он называется SIR2, у млекопитающих — SIRT1. Активность этого белка у высших животных ингибирутся инсулин-подобными гормонами. Подавление активности инсулинового каскада с помощью методов генной инженерии, голодания или фармакологического вмешательства (резвератрол) приводит к увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных (мыши, черви С. elegans, мухи-дрозфилы). Введения дополнительной копии этого гена в ДНК дрожжей достоверно увеличивает продолжительность жизни. По-видимому, молекулярной основой этого явления служит то, что при повреждении (разрыве) ДНК дрожжей SIR2 уходит со специфических для себя мест на хромосомах, перемещается в места разрыва и там каким-то образом поддерживает целостность хромосом. Интересно, что SIRT1 делает то же самое при повреждении ДНК культивируемых клеток животных.

Недавно группой Ангелики Амон (Amon) было показано, что гаметогенез или активация транскрипции поздних генов гаметогенеза ведет к «обнулению» репликативного возраста и увеличению продолжительности жизни. Следовательно, стареющие дрожжи, имея возможность избавится от возраст-зависимых повреждений, отнюдь не всегда ее используют. Этот факт легко объясним в рамках гипотезы феноптоза.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования было найти физиологический индуктор запрограммированной смерти дрожжевой клетки, а также исследовать механизм этого процесса, при этом наиболее детально - роль митохондрий и активных форм кислорода.

Задачи исследования:

1. Проверка гипотезы о том, что половой феромон может индуцировать запрограммированную смерть дрожжевой клетки.

2. Определение роли митохондрий в запрограммированной смерти дрожжей, вызванной избытком феромонов.

3. Доказательство возможности «мягкого разобщения» с помощью липофильных катионов на интактных клетках дрожжей.

4. Сравнительный анализ защитного и повреждающего действия активных форм кислорода при генотоксическом стрессе клеток дрожжей.

5. Изучение взаимосвязи образования белковых агрегатов и дефектов в функционировании циклосомы при индукции запрограммированной смерти дрожжей.

Научная новизна работы.

В работе впервые исследованы механизм физиологической клеточной смерти дрожжей вызванный избытком полового феромона. Установлено, что гиперполяризация митохондрий играет ключевую роль в этом процессе, а именно инициирует генерацию активных форм кислорода (АФК).

Показано, что искусственное снижении мембранного потенциала митохондрий с помощью разобщителей снижает эффективность индукции запрограммированной смерти дрожжей. На основе этого наблюдения разработана экспериментальная система для тестирования физиологического эффекта разобщителей.

Произведен сравнительный анализ обычных разобщителей и проникающих катионов типа БкС). Впервые показано, что проникающие катионы оказывают селективный протонофорный эффект на внутреннюю мембрану митохондрий, и при этом разобщение является «мягким», то есть его эффективность падает с падением потенциала на внутренней мембране.

Обнаружено, что АФК, которые генерирует клетка при генотоксическом стрессе, могут быть как защитными (при относительно небольшом(повреждении), так и способствовать гибели клетки при относительно сильном стрессе.

Показано, что накопление полиглутамин-зависимых белковых агрегатов в дрожжевой клетке вызывает задержку клеточного цикла и частично активирует каскад запрограммированной смерти. Выживание клетки в этих условиях можно улучшить с помощью генетического нокаута ряда белков-субстратов циклосомы.

Научно-практическое значение работы.

Проведенные исследования открывают физиологические закономерности принятия решения «жизнь или' смерть» на уровне одноклеточного организма, а также характеризуют роль митохондрий и АФК в принятии и исполнении этого решения. Данные, полученные в разработанной экспериментальной модели клеточной смерти, позволили разработать новые вещества — мягкие разобщители, которые в перспективе могут быть использованы для лечения широкого спектра заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Избыток полового феромона индуцирует запрограммированную смерть дрожжей путем повышения концентрации кальция в клетке.

2. Избыточный кальций вызывает гиперполяризацию митохондрий, что увеличивает генерацию активных форм кислорода и смерть клетки.

3. Проникающие катионы обладают разобщающим действием и при этом менее токсичны при передозировке, чем анионные протонофоры.

4. Активные формы кислорода являются защитными при слабом генотоксическом стрессе и повреждающими при относительно сильном стрессе.

5. Причина токсичности белковой агрегации в дрожжевой модели полиглутамин-зависимых заболеваний — неспособность клетки расщеплять субстраты циклосомы.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008-2010), европейской биоэнергетической конференции ЕВЕС (Москва 2006), конференции Гордона «Апоптоз» (2006), европейской конференции по клеточной смерти ЕСБО (2004, 2010), международной конференции по апоптозу дрожжей (Майами, 2005; Левен, 2008; Грац, 2009), конференции американского общества клеточной биологии (2007).

Публикации.

Основные положения диссертации опубликованы в 52 печатных работах (включая 7 обзоров) в журналах, рекомендованных ВАК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Половой феромон как индуктор смерти дрожжей

В последние десятилетия дрожжи стали популярным объектом для исследования запрограммированной клеточной смерти. Так, исследовалось появление маркеров апоптоза после жестких воздействий на дрожжевые клетки. Эти работы воспринимались с долей пессимизма исследователями апопотоза у высших организмов, которые считали этот феномен лабораторным артефактом. Действительно, не совсем очевиден биологический смысл самоубийства в ответ на перекись, уксусную кислоту или осмотический шок. Мы поставили цель найти «мягкий» индуктор физиологического самоубийства дрожжей. Мы исходили из предположения, что физиологическое самоубийство имеет смысл только в сообществе организмов: в этом случае смерть одной клетки может быть каким-либо образом скомпенсирована выигрышем в приспособленности ее ближайших родственников или клонов. Иными словами, искомый индуктор должен каким-то образом зависеть от плотности клеток в культуре. Концентрация полового феромона, который секретируется дрожжами, естественно зависит от их плотности. Гаплоидная дрожжевая клетка может обладать либо а, либо альфа типом спаривания, и секретировать либо а, либо альфа-фактор, соответственно. Оба феромона — схожие по структуре пептиды. Надо отметить, что в лабораторной практике альфа-фактор часто используется для синхронизации культуры в клеточном цикле. Под действием феромона клетки задерживаются в фазе G1 и отращивают отростки (так называемые шму). В методических указаниях по работе с дрожжевыми культурами отмечается, что передозировка альфа-фактора может быть токсична: в частности, она может замедлить выход из ареста после отмывки феромона.

Исходя из этих предпосылок, мы решили' проверить, вызывает ли альфа-фактор запрограммированную смерть дрожжевых клеток. В большинстве сценариев апоптической смерти генерация клетками АФК - это один из основных этапов каскада. Для детекции АФК использовался HiDCF-DA, это вещество становится флуоресцентным после окисления АФК. Оказалось, что после 90 мин. инкубации а-клеток с альфа-фактором примерно треть клеток становятся флуоресцентными, в то время как клетки без альфа-фактораt и клеткиj альфа-типа с альфа-фактором не флюоресцируют (Рис. 1а). Следовательно, альфа-фактор может вызывать генерацию АФК клетками а-типа. Мы оттитровали концентрацию альфа фактора и выяснили, что для индукции АФК необходимо примерно в 10 раз более высокая концентрация, чем для формирования шму - морфолгического маркера половой дифференцировки (данные не приводятся).

Еще одним признаком апоптоза является деградация ядерной ДНК. Мы протестировали количество ДНК в клетке с помощью проточной флуоцитометрии (FACS). Оказалось, что высокая концентрация альфа-фактора вызывает накопление клеток с меньшим количеством ДНК чем в нормальных клетках в фазе G1 (Рис. 16), что является маркером деградации. С помощью окрашивания витальным красителем Флоксином Б мы также установили, что такая обработка феромоном приводит к смерти примерно 30% клеток (Рис. 1в).

Рис. 1. Альфа-фактор вызывает запрограммированную клеточную смерть. Клетки выращивались в жидкой УРО до плотности 106/мл. Концентрация альфа-фактора - 0,1 мг/мл. А, детекция АФК с помощью красителя Н2ОСР-ОА (10 мкМ). Масштаб - 50 мкм Б, Определение содержания ДНК в клетах методом цитофлуориметрии. В, окраска мертвых клеток Флоксином Б (0,4 мг/мл, 5 мин. инкубации с последующим фотографированием). Масштаб - 10 мкм.

Для исследования пути развития этого каскада клеточной смерти мы прежде всего протестировали роль киназы 81е20. Эта киназа активирует МАП-киназную часть каскада феромонового ответа. Оказалось, что делеция 8ТЕ20 предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Надо отметить, что МАП-киназный каскад играет ключевую роль в апоптозе животных клеток. Таким образом, прослеживается параллель между каскадами клеточной смерти у дрожжей и высших организмов. Активация 81е20 индуцирует экспрессию ряда белков. Чтобы проверить является ли эта индукция необходимой для активации каскада клеточного самоубийства мы проверили эффект ингибирования синтеза белка. Оказалось, что циклогексемид предотвращает генерацию АФК и смерть клеток (Табл. 1). Последующие этапы апоптоза у клеток высших эукариот обычно опосредованы митохондриями. Оказалось, что потеря клетками дрожжей также митохондриальной ДНК полностью ингибирует феромон-зависимую смерть (Табл. 1), и при этом не влияет на образование шму (данные не показаны). Интересно, что клетки без функционального цитохрома ц (делеция гем-лиазы) генерировали АФК но не умирали в ответ на альфа-фактор (Табл. 1).

Таблица 1. Феромон вызывает зависимые от митохондрий генерацию АФК и смерть дрожжей. клетки добавки феромон другие эффекты клеток с А ФК % мертвых клеток а, реіке + + + циклогексимид

0,8±0,8 29,6±3,3 О О

33,5±12,7 0,5±0,6 24.3±4.0 не определено не определено не определено

0,9±1,

26,3±4,

2,б±1,

1,5±0,

2,6±3,

0,5±0,

5,8±1,

33,7±8,

1,4±0,

32,9±3, а, без цитохрома ц + а, Дз1е20 а+альфа а+альфа а хлорохин хлорохин хлорохин

Это показывает, что АФК в данном процессе (как и в апоптозе у животных) выполняют сигнальную функцию, а именно опосредуют выход цитохрома ц из митохондрий. Может ли феромон-зависимая смерть произойти в естественных условиях или является артефактом добавки неестественно большого количества феромона? Для проверки мы смешали клетки противоположных типов спаривания и покрасили смесь Флоксином Б. Примерно 1% клеток оказался Флоксин-содержащим (Рис. 1в). Такой низкий процент показал достаточно малую вероятность смерти при естественном спаривании, и это было вполне ожидаемым результатом. Следующим этапом мы повторили этот опыт в присутствии хлорохина — агента, не влияющего на вегетативный рост (Табл. 1) но ингибирующего последний этап слияния клеток, а именно гидролиз клеточных стенок. Оказалось, что примерно треть клеток в этом случае окрашивалось Флоксином Б (Рис. 1в). Таким образом, локальная концентрация феромонов в агглютинатах клеток при спаривании достаточно высока чтобы активировать каскад смерти, но слияние клеток предотвращает его развитие. Важно отметить, что хлорохин не влиял на смерть клеток а-типа по действием альфа-фактора (Табл. 1).

Таким образом, наши данные указывают, что смерть при спаривании является естественной частью процесса полового размножения дрожжей. Поскольку, у дрожжей нет комплекса АПАФ, неожиданной кажется роль цитохрома ц в этом процессе. В настоящее время мы ищем белки, взаимодействующие с цитохромом ц в каскаде дрожжевой смерти.

2. Исследование роли митохондрий в феромон-зависимом каскаде смерти ю К X

О 5 20 80 Амиодарон, мкМ а> jD cd t— альф а-фактор

Контр. NAC TOKoyspl

TUNELДНК 1 оо со I Sä к о

§

Рис. 2. Маркеры апоптоза и другие общие черты феромон- и амиодарон-зависимого каскада. А, амиодарон снижает количество колониия-образующих едениц в культуре. Б. альфа-фактор в концентрации 0,1 мг/мл обладает схожим с амиодароном эффектом. В, в пробы добавили 80 мкМ амиодарона. Другие добавки: 2 мкМ миксотиазола (миксо), 3 мМ нитропруссид натрия (нитро), 1 мМ фенил-тетраметилимидазол оксид (С-РТЮ), FCCP (F), 30 мМ NAC, 20 мкМ альфа-токоферол (токо). Г, выход цитохрома ц из митохондрий после 30 минут обработки 80 мкМ амиодароном. Клетки фиксировались 4% формальдегидом и окрашивались антителами к цитохрому ц. Фрагментация митохондрий в контроле -артефакт фиксации. Д, Е, детекция фрагментации ДНК после обработки амиодароном методами TUNEL и электрофореза. Ж, амиодарон, как и кальциевый ионофор, вызывает подъем [Са2+] в цитоплазме. Эффект амиодарона сильнее как показывает процент и показательные фотографии Fluo-3/АМ-положительных клеток.

Приведенные выше данные указывают на ключевую роль митохондрий в смерти дрожжей при спаривании. В то же время использованная модель не вполне удобна для детального изучения этой роли. Действительно, каскад смерти зависит от синтеза, белка de novo, что затрудняет анализ быстрой кинетики митохондриальных изменений. Поэтому мы начали поиск способ активировать каскад феромон-зависимой смерти после (downstream of) активации синтеза специфических белков. Известно, что подъем [Са2+] в цитоплазме является промежуточным этапом ответа на феромон. Более того, по литературным данным даже малые концентрации альфа-фактора токсичны для клеток с мутациями по кальмодулину. Исходя из этого, мы проверили кальциевые ионофоры и амиодарон (фармакологический агент, вызывающий вход кальция в цитоплазму дрожжевой клетки) в качестве индукторов клеточной смерти. Эффект от добавки амиодарона был качественно похож на эффект ионофоров, но развивался быстрее (даннные не приводятся), поэтому большинство экспериментов проводилось с использованием амиодарона. Прежде всего, мы повторили данные лаборатории Корчезне (Courchesne) о токсичности амиодарона (Рис. 2а): Данные, приведенные на Рис. 2 (б,в),показывают практически большое сходство между феромон-и амиодарон-зависимыми смертями. В обоих случаях выживание стимулировалось инактивацией митохондриальной ДНК (Рис. 2в, столбик «пет»), делецией фермента, ответственного за присоединение гема к цитохрому ц (Рис. 2в, сусЗ), добавкой ингибиторов дыхания (миксотиазол или KCN), добавкой небольших концентраций разобщителя FCCP, антиоксидантов или делецией гена YSP1 (см. далее). Мутации по Са2+ -кальмодулиновой системе способствовали смерти клеток под действием обоих индукторов. Мы также показали что, подобно феромону, амиодарон вызывает появлениемаркеров апоптоза в клетках: а именно выход цитохрома ц и фрагментацию ДНК (Рис. 2г,д,е). Мы также подтвердили, что амиодарон вызывает подъем концентрации Са2+ в цитозоле (Рис. 2ж).

Поскольку дыхательная цепь митохондрий явно вовлечена в амиодарон-зависимую смерть (данные по миксотиазолу и KCN), мы решили проверить эффект амиодарона на дыхание. Оказалось, что дыхание клеток выращенных на сбраживаемом субстрате относительно слабое, не снижается добавкой ингибитора АТФ-синтазы олигомицина и лишь кратковременно стимулируется разобщителем (FCCP, 1 мкМ). Важно отметить, что в животных клетках такие дозы разобщителя существенно стимулируют скорость дыхания — поскольку разность потенциалов противодействует работе дыхательной помпы. Значительно более высокие концентрации FCCP (ЮмкМ) вызывали стабильную стимуляцию дыхания. Добавка низких концентраций амиодарона ингибировала дыхание в присутствии олигомицина и стимулировала дыхание на фоне низкой (1 мкМ) концентрации FCCP (Рис. За). Высокие концентрации амиодарона (вызывающие смерть клеток) вызывали временную стимуляцию дыхание с последующим сильным ингибированием (Рис. За,б). Наши данные указывают, что низкие концентрации амиодарона усиливают энергетическое сопряжение и максимальную скорость дыхания. Возможно, эти эффекты опосредованы подъемом концентрации кальция в цитозоле. Что касается энергетического сопряжения, то, в дрожжах отсутствует классическая Са -зависимая транзиторная пора (типичная для клеток животных, данные лаборатории Р.А. Звягильской), и при этом подъем [Са2 ] в цитозоле снижает неселетивную прводимость митохондриальной мембраны (лаб. С. Урибе [ШЬе]). Ключевую роль [Са2+] подтверждает и тот факт, что амиодарон не действовал на изолированные митохондрии (данные не приводятся). дрожжи дрожжи

Рис.3 Эффект амиодарона на дыхание кіеток дрожжей. 0,6-107 клеток/мл; олигомицин (олиго), 10 мкг/мл; FCCP, 1 мкМ; амиодарон (амио); 7 мкМ миксотиазол (миксо).

Таким образом, посредством поднятия [Са2 ] в цитозоле амиодарон активирует дыхание и сопряжение митохондрий. Отражается ли это на уровне мембранного потенциала? Для ответа на этот вопрос мы использовали митотрекер Orange. Этот краситель накапливается в митохондриях в зависимости от величины дч* ч» на их внутренней мембране. Как показано на рис. 4 (а), в контрольных клетках окрашивание митохондрий заметно только при увеличенном контрасте микрофотографии. В то же время амиодарон в широком спектре концентраций вызывал заметное увеличение интенсивности окраски (Рис. 46). Важно отметить, что амиодарону требовалось около 5 минут чтобы вызвать такое контроль

Ayspl

1 1 \ ' ч ( V V>4 V

• • ф V 1 * Щ0 ^^ феромон феромон

0, иэкграстТ амиодарон, мкМ с АФК мертвые A-2)W

Рис. 4. Эффекты феромона и амиодарона на Ау/ митохондрий опосредованы подъемом [Са]. Для полуколичественного определения Д\|/ использовали митотрэкер Orange. А, 01 мг/мл альфа-фактор. Б, цифры под фотографиями указывают концентрацию амиодарона. В, Г, кальциевый ионофор А-23187 вызывает подъем А\|/, генерацию АФК (В, Г) и смерть клеток (Г). Масштаб - 10 мкМ. увеличение, в то время как альфа-фактор вызывал подобный эффект (Рис. 4а) не менее чем через 30 минут (данные не приводятся).

Известно, что аномально высокий митохондрий может вызвать формирование АФК, которые, в свою очередь, являются интермедиатом каскада апоптоза. Чтобы проверить подобное развитие событий в нашей системе мы протестировали кинетику формирования АФК после добавки амиодарона. Аналогично альфа-фактору, амиодарон вызывал резкий подъем скорости окисления FbDCF-DA, при этом эффект амиодарона был значительно быстрее эффекта альфа-фактора (Рис. 5а,б). Как и ожидалось, подъем Д¥ несколько опережал подъем уровня АФК (Рис. 5а). Более того, тот факт, что антиоксиданты (N-ацетилцистеин и альфа-токоферол) в несколько раз повышали выживание после обработки амиодароном, указывает на функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Достаточен ли вызванный амиодароном подъем [Ca ] в цитозоле для инициации клеточной смерти? Как показано на Рис. 4в,г, кальциевый ионофор А23187 также вызывал накопление АФК и клеточную смерть, но эффект амиодарона был сильнее (Рис. 2ж) Возможно, различие вызвано тем, что амиодарон вызывал значительно более быстрый подъем [Са2+] (данные не приводятся). Чтобы изучить роль ДЧ' на внутренней мембране митохондрий в каскаде клеточной смерти, мы предотвратили его подъем добавкой FCCP. Как и< ожидалось, подъем Д*Р и АФК были заингибированы. Что существенно, FCCP повышал в несколько раз выживание клеток (Рис. 2в). Следовательно, подъем AVP — не побочный эффект, а необходимый г этап, развития каскада. Как оказалось, 0,4 мкМ FCCP'было достаточно для этих влияний. Более высокий (6 мкМ) FCCP оказывал негативное влияние на выживание (Рис. 2в), и этот негативный эффект не является специфичным для FCCP, поскольку другой, разобщитель (SF6847) в относительно большой концентрации также снижал выживание (данные не приводятся).

Тот факт, что малые концентрации разобщителя снижают АФК, указывает на то, что они образуются в Q-цикле. Чтобы это проверить, мы использовали ингибиторы двух стадий ■ Q-цикла. Оказалось, что миксотиазол снижал образование АФК, а антимицин, наоборот, усиливал их генерацию (Рис. 2в). Эти факты полностью соответствуют, предположению о Q-цикле (Рис. 2в). Наконец, антиоксиданты N-ацетилцистеин и альфа-токоферол усиливали выживание (Рис. 2в), подтверждая функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Фрагментация митохондриальных филаментов часто сопровождает апоптоз клеток животных. Мы также замечали, что в моделях феромон- и амиодарон-зависимой смерти клетки также фрагментируют митохондрии (Рис. 4а,б). Ответом на вопрос, является ли эта фрагментация этапом каскада или побочным явлением, послужил предпринятый нами генетический скрининг. С помощью случайной инактивации генов мы искали

А мкготрэкер

АФК фаза

VI* л время (мин)

Рис. 5. Кинетика роста Л у и уровня АФК под действием альфа-фактора и амиодарона. А, Д\|/ и АФК после добавки 80 мкМ амиодарона. Б, накопление АФК-содержащих клеток после добавки 0,1 мг/мл альфа-фактора. АФК детектировались с помощью 50 мкМ Н2-Е)СР-ОА Масштаб - 10 мкм. делеционных мутантов, устойчивых к губительному действию альфа-фактора. Для этой мы мутировали дрожжи делеционной библиотекой (лаб. М. Снайдера). Потом мутированные клетки обрабатывались высокой дозой альфа-фактора, а после культура высевалась на твердую среду и выжившие мутанты вырастали в колонии. Кроме специфических мутантов по программе смерти, в первичном скрининге мы получали клетки с полностью инактивированным ответом на феромон (стерильные клетки, как мутант 51е20), а также клетки с потерянной респираторной функцией митохондрий (петиты). Чтобы исключить последние две категории мы протестировали полученных І V t>

З * З

Yipl -OFF митотрэкер Б дикий тип, дикий тил. ц > * •• -і» ч-7 «■*> А yipl.

20 мин

АсусЗ.

20 мин FCCP0.4wcM

20 мим дикий тип. И «

20 мин дикий ТИП. 5 W

ДИКИЙ ТИП.

0 мин дикий тип, üyspl, амиод»рон. МАС + *миод*рон

0 10' ІО' 10* »0* флуоресценция

Ду«рі. ЗО мм

FCCP 0,4 мкМ ЗО мим днш тип, ЗО мин дикий тип, 20 мин дикий псі. Омим ф/г/ор t сценция

Рис. 6. Локализация и функция Yspl. А, ко-локализация Yspl-GFP и митотрэкера Orange. Масштаб - 10 мкм. Вверху показана рассчитанная структура Yspl, содержит плекстриновый домен и два трансмембранных домена. Б, Yspl необходим для фрагментации митохондрий после обработки амиодароном. Изображения получали путем объединения 20 оптических срезов через клетку. Масштаб - 10 мкм. В, Определение AT и АФК в клетках методом FACS. Амиодарон (80 мкМ) был добавлен в момент времени 0 мин. мутантов на способность спариваться и на способность роста на несбраживаемом источнике углерода.

В результате мы нашли один ген, YHR155W, делеция которого не снижала концентрацию альфа-фактора, необходимую для индукции шму, и не препятствовала росту на глицерине (данные не показаны). Ген кодирует предположительно трансмембранный белок без выраженных гомологий с генами высших организмов и содержащий плекстриновый домен. Мы назвали белок Yspl (от yeast suicidal protein). С помощью микроскопии клеток, экспрессирующих Yspl слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP-Yspl) мы обнаружили, что конструкция ко-локализуется с митотракером (Рис. 6а), то есть с митохондриями. Как и ожидалось, инактивация YSP1 снижала смертность как в модели феромон-зависимой смерти (данные не приводятся), так и при обработке амиодароном (Рис. 2в). Как показано на рис. 66, амиодарон вызывает полную фрагментацию митохондриальных филаментов, а делеция YSP1 существенно снижает этот эффект. В то же время эта мутация не снизила подъем ДО (Рис. 4а,и*6в) и АФК (Рис. 6в), подтверждая, что амиодарон-зависимая генерация АФК как таковая не является летальной, но служит сигнальным этапом каскада смерти.

Поскольку амиодароновая модель клеточной смерти является схожей* и одновременно более быстрой и эффективной по сравнению с феромон-зависимой системой, мы предприняли попытку скрининга генов, ответственных за амиодарон-зависимую смерть.

Как и в случае с альфа-фактором был произведен случайный мутагенез клеток» делеционнош библиотекой, после чего мутанты тестировали на устойчивость к амиодарону. Мы ожидали, что устойчивость может возникать как от инактивации непосредственной программы смерти, так и от гипер-стабилизации гомеостаза кальция. Чтобы исключить мутантов второго типа, выжившие клетки тестировали на способность накапливать митотрэкер Orange в митохондриях после обработки амиодароном. Иными словами, искали мутантов, похожих по фенотипу на Ayspl. В результате было обнаружено, что инактивация гена YDR326c приводила к существенному (в 5 раз) увеличению выживания после обработки амиодароном- (Рис. 76), и при этом не предотвращала генерацию АФК (Рис. 7а). Как и в случае с YSP1, делеция YDR326c существенно ингибировала амиодарон-зависимую' фрагментацию митохондрий/ (Рис. 7в). Поскольку ген YDR326c к тому моменту был неохарактеризован, мы назвали его YSP2 (по аналогии с YSP1). Подобно» YSP1, YSP2 не имеет выраженных гомологии среди, генов высших организмов« и предположительно кодирует продукт с транс-мембранным доменом.

Интересно, что в этом скрининге мы г также выделили мутантов с делецией YSP1 (данные не приводятся), что еще раз указывает на сходство феромонового и амиодаронового каскадов смерти. Суммируя данные по этим двум каскадам, можно их объединить в одной схеме (Рис. 8). Схема предполагает, что феромон гипер-активирует МАР-киназный путь (этапы 2-4), что приводит к повышению концентрации кальция, достаточному для ,инициации митохондриальных изменений (этапы 5-9), приводящих в итоге к клеточной смерти.

В дикий тип йу*р ф V* «Г- - *! Ф — г"» «.V . /О .а ф * ^ Г контр Д(гр

Рис. 7. Локализация и функция Ул/?2. А, в контроле после добавки амиодарона АФК окрашивают всю клетку, а в Дувр2 АФК - в структурах, морфологически похожих на митохондрии. Б, делеиия УБР2 повышает устойчивость и предотвращает фрагментацию митохондрий (В) после обработки амиодароном. Г, Снижение рН в среде вызывает образование АФК только в присутствии ацетата. Как и в панели А, заметна У5Р2-зависимое различие в локализации АФК. Г, делеция У8Р2 повышает устойчивость к ацетату, рН=3. Масштаб - 5 мкм.

Используется ли рассмотренный выше каскад в других сценариях физиологического самоубийства дрожжей? Классическая экспериментальная система для изучения смерти дрожжей -хронологическое старение, т. е. старение в стационарной культуре. Этот вид смерти можно считать активным. Действительно, дрожжи, помещенные в воду, не теряют жизнеспособности в течении года, а дрожжи в стандартной питательной среде (УРЭ) умирают через 2-3 недели после достижения стационарной плотности. Большой объем публикаций указывает, что основная причина смерти в стационаре - закисление среды из-за накопления уксусной кислоты. Кроме того, известно, что уксусная кислота вызывает появление маркеров апоптоза и смерть дрожжей (см. работы и обзоры Ф. Мадео [Ма<1ео]).

Исходя из этих предпосылок, мы протестировали роль белка Увр2 в ацетат-зависимой смерти дрожжей. Оказалось, что делеция У8Р2 не снижает АФК, индуцированные уксусной кислотой (Рис. 7г), и в то же время (как и делеция гомолога про-апоптозной протеазы, гена ЫМАШ) в несколько раз увеличивает выживание (Рис. 7д). феромон рецептор

2) і т амиодарон подъем [Са] в цитоплазме синтез белка циклогекспмид подъем скорости дыхания ^ и уровня сопряжения подъем ДЧ*

7)1 I

Угр1, Узр2-зав н си мая фрагментация митохондрий падение выход цитохроыа низкий БССР миксотиазол

ИАС, токоферол

Дуфі. Дугр о X о смерть клетки

Рис. 8. Гипотетическая схема каскадов феромон- и амиодарон-зависимой смертег/. Пояснения — в тексте.

Где пересекаются пути амиодарон- и ацетат-зависимой смертей? Наши данные указывают, что закисление цитоплазмы причиной токсичности' ацетата. Известно; что ацетат может уравновешивать > рН по разные стороны липидной мембраны пересекая ее в протонированной форме и диссоциируя протон в более щелочном компартменте. Другие способы снижения рН в цитозоле (с помощью пропионата или комбинации НС1-нигерицин) также приводили к АФК- и Узр2-зависимой смерти дрожжей (данные не приводятся). Простейшим объяснением этого факта является то, что при низких значениях рН супероксид, основной АФК производимый в митохондриях, протонируется и становится значительно более реакционно-способным. Итак, с одной стороны, по литературным данным кальциевый гомеостаз никак не связан с устойчивостью дрожжей к ацетату. С другой стороны, и амиодароновый и ацетатный каскады смерти зависят от АФК и Увр2. Исходя из этой логики, можно предположить, что эти пути сливаются на уровне АФК (Рис. 8).

3. Мягкое энергетическое разобщение дрожжей

Как следует из предыдущего раздела, мягкое разобщение, т. е. контролируемое снижение уровня мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, может повысить выживание дрожжей после стресса. Позитивный эффект мягкого разобщения распространяется и на высшие организмы. Поскольку увеличение проводимости внутренней митохондриальной мембраны приводит к «холостому» сжиганию калорий, оно может служить заменой ограничению по калориям, а также быть полезным при гипотермии. Подобно случаю с дрожжами, мягкое разобщение может снизить уровень АФК в клетках высших эукариот и таким образом противостоять процессам старения и канцерогенеза.

Действительно, в лаборатории В.П. Скулачева было показано, что при гиперполяризации митохондрий небольшое (10%) снижение Д1Р вызывает 10-кратное снижение продукции АФК. Проблема заключается в том, что при передозировке разобщителя уровень A*F может упасть ниже критического для генерации АТФ с очевидными токсическими последствиями (см. ссылки в PNAS 2010. 107. 663-668).

Поэтому была поставлена задача найти вещество, которое избирательно снижает ДЧ* в митохондриях с высоким потенциалом. Мы обратились к липофильным проникающим катионов. Эти вещества (например, тэтрафенилфосфоний) способны »проходить через бислойнуЮ' мембрану поскольку их положительный заряд де-локализован по всей' молекуле. Так как митохондрия — единственная отрицательно-заряженная органелла в клетке, то такие катионы избирательно накапливаются в митохондриях. До начала экспериментов у нас были предварительные данные о возможной разобщающей активности таких катионов (не приводятся). В рамках биомедицинского проекта «Ионы Скулачева» разобщающая активность проникающих катионов SkQl и С12-ТРР (Рис.) была подтверждена методом динамического моделироваия, а также экспериментально на моделях бислойной мембраны, липосом и митохондрий in vitro (PNAS 2010, 107. 663-668). Поскольку эти липофильные катионы специфически накапливаются в митохондриях, можно было ожидать, что их протонофорное действие (в отличие от стандартных разобщителей), будет также митохондриально-направленным. Для проверки этого предположения мы использовали измерение дыхания дрожжей внейтральной и кислой.культуральных средах. Прежде всего, мы убедились, что закисление цитоплазмы, существенно тормозит скорость дыхания (данные не приводятся). Таким образом, в кислой (но- не в нейтральной) среде увеличение тока протонов через цитоплазматическую мембрану является ингибитором* дыхания. В то же время увеличение проводимости внутренней мембраны митохондрий — стимулятор дыхания (см. раздел по амиодарону). Как показано на рис. 9а, при рН = 3.0 (в отличии от рН = 5.5) в среде анионный разобщитель FCCP стимулировал дыхание только в очень узком диапазоне концентраций. Катионный разобщитель С12-ТРР проявлял стимулирующие свойства в более широком- окне концентраций, и график зависимости* не имел колокообразной формы как в случае с FCCP (Рис. 96). Таким образом, С12-ТРР является митохондриально-направленным протонофором. Более широкий, чем у РССР'диапазон стимулирующих концентраций С12-ТРР также указывает на потенциал-зависимость его действия. Чтобы подтвердить, что высокоо гл г.* ы U хл %л 1. de1'4 g i " ё й «л â M ¡ 4 ОД £ 0.

A M ЖЯ

• •MlU >4 M

-им »-» V^«« m

0 » «

I » « .«« 1в

FCCP],MKM

• 10 12 1« 1« 1«

С,2ТРР|.МКМ

Рис. 9. Стимуляция дыхания клеток дрожжей добавками РССР и С12-ГРР. Инкубационная среда: 50 мМ фосфат калия указанных значений рН (доводили Н3Р04), 0,5% глюкоза. энергизованные митохондрии наиболее подвержены действию новых разобщителей, мы сравнили их действие на обычные клетки и на клетки petite. Поскольку в случае petite митохондрий поддерживается не за счет дыхания а вследствии работы протонной АТФ-азы, его уровень значительно ниже такового в контрольных клетках. Следовательно, можно было ожидать, что превращение в petite вызовет устойчивость к катионам-разобщителям. Для проверки этого предположения мы использовали новую модификацию проникающего катиона - C12R1 (Рис. 10а). Дело в том, что разобщающее действие С12-ТРР происходит за счет симпорта этого иона с де-протонированной формой свободной жирной кислоты (PNAS 2010, 107. 663-668). Разобщитель C12R1 содержит протонируемую аминогруппу, и вследствии этого может оказывать протонофорное действие и в отсутствии свободных жирных кислот (J Biol Chem. 2011, 286. 1783117840). Возможно, именно из-за этого различия C12R1 менее опасен при передозировке. В частности, C12R1, в отличие от своего непротонируемого аналога C12R4, не вызывает набухания митохондрий (J Bioenerg Biomembr. 2011, 43,175-180) - потому что не так сильно в них накапливается.

Для сравнения действий C12R1 и анионного разобщителя (динитрофенола, DNP) мы прежде всего подобрали их концентрации, которые в одинаковой степени снижали скорость роста контрольных клеток (grande) на среде с глицерином (Рис. 106). Несбраживаемый субстрат был выбран для того, чтобы дыхание митохондрий было максимально активно. Когда эти же концентрации были протестированы на клетках petite, оказалось, что DNP был более токсичен, чем на grande. В отличие от DNP, выбранная концентрация C12R1 совершенно не влияла на скорость роста petite-формы дрожжей (Рис. 106). Таким образом, мы подтвердили, что действие in vivo нового класса разобщителей положительно зависит от величины мембранного потенциала митохондрий. литературные данные по субстратам поздней циклосомы в нейронах. Оказалось, что протеолиз ключевого регулятора гликолиза, фосфофруктокиназы 2 (Ффк-2), катализируется APC-Cdhl. В результате гликолиз подавляется, и биоэнергетика нейронов основывается на дыхании. Искусственное подавление APC-Cdhl в культуральных нейронах приводит к переходу на гликолиз и окислительному стрессу (Nature cell biology 2009, Ц, 747-752). С другой стороны, известно, что при упомянутых выше заболеваниях в нейронах активируют гликолиз, подавляется дыхание и развивается окислительный стресс. Таким образом, ингибирование Ффк-2 кажется перспективной стратегией для борьбы с агрегат-зависимыми нейродегенеративными заболеваниями. В настоящее время мы проводим поиск низкомолекулярных ингибиторов этого фермента.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Северин, Федор Федорович

Выводы

1. Половой феромон способен вызывать физиологическое самоубийство дрожжей. Количества феромонов, которые вырабатывают дрожжи при спаривании, достаточно для индукции смертельного каскада.

2. Промежуточным этапом этого каскада является повышение кальция в цитозоле, что вызывает гиперполяризацию митохондрий, приводя к генерации активных форм кислорода (АФК). АФК индуцируют фрагментацию митохондрий, которая приводит к смерти клетки.

3. Смертельный каскад можно прервать либо на уровне фрагментации митохондрий с помощью делеции генов У8Р1 и У8Р2, либо на уровне гиперполяризации митохондрий с помощью разобщителей.

4. Проникающие липофильные катионы класса БкС) обладают протонофорным эффектом. Этот эффект специфичен для митохондрий. Чем более поляризованной является митохондрия, тем выше разобщающий эффект таких катионов.

5. Активные формы кислорода являются защитным фактором при слабом генотоксическом стрессе и повреждающим при относительно сильном стрессе.

6. Причина токсичности белковых агрегатов в дрожжевой модели болезни Хантингтона -нарушение клеточного цикла, вызванное накоплением субстратов циклосомы. Ингибирование активности субстратов циклосомы - перспективная стратегия для терапии агрегат-зависимой дегенерации нейронов.

28. Pozniakovsky, A.I, Knorre, D.A, Markova, O.V, Hyman, A.A, Skulachev, V.P., Severin, F.F. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. // J Cell Biol -2005-V. 168, P.257-269.

29. Knorre, D.A, Smirnova, E.A., Severin, F.F. Natural conditions inducing programmed cell death in yeast Sacharomyces cerevisiae. // Biochemistry (Mose) — 2005 — V.70, P.264-266.

30. Sokolov, S.S., Severin, F.F., Agaphonov, M.O., Kalebina, T.S. The metilotrophic yeast Hansenula polymorpha as the model for screening for genes involved in apoptosis. // FEBS Journal - 2005 - V.272, P.44-44.

31. Hoepfner, S., Severin, F.F, Cabezas, A., Habermann, B., Runge, A., Gillooly, D., Stenmark, H., Zerial, M. Modulation of Receptor Recycling and Degradation by the Endosomal Kinesin KIF16B. // Cell -2005-V. 121, P. 437-450

32. Pal, A., Severin, F.F., Lommer, B., Schevchenko, A., Zerial, M. Huntingtin-HAP40 complex is a Novel Rab5 Effector that controls Early Endosome Motility and is upregulated in Huntington Disease. // J Cell Biol - 2006 - V. 172, P. 605-618

33. Sokolov, S.S., Pozniakovsky A.I., Bocharova, N.A., Knorre, D.A., Severin, F.F.

Expression of an expanded polyglutamine domain in yeast causes death with apoptotic markers. // Biophys. Biochem. Acta - 2006 - V.1757, P. 660-666.

34. Sokolov, S.S., Knorre, D.A, Smirnova, E., Markova, O.V., Pozniakovsky, A.I., Skulachev, V.P., Severin, F.F. Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or intracellular acidification. // Biophys. Biochem. Acta - 2006 - V.1757, P. 1366-1370.

35. Sandall, S., Severin, F F., McLeod, I., Yates 3rd, J., Oegema, K., Hyman, A., Desai, A. Complex of Slil5-Birl (INCENP-Survivin) Connects Centromeres to Microtubules and is the Likely Tension Sensor Controlling Aurora B Activation. // Cell - 2006 - V. 127, P. 1179-1191.

36. Elie-Caille, C., Severin, F.F., Helenius, J., Howard, J., Muller, D.J., Hyman, A.

Straight GDP-Tubulin Protofilaments Form in the Presence of Taxol. // Curr Biol - 2007 - V.17, P. 17651770.

37. Pal, A., Severin, F.F., Hopfner, S., Zerial, M. Regulation of endosome dynamics by Rab5 and its Huntingtin-HAP40 effector complex in physiological versus pathological conditions. // Methods in Enzymology- 2008 - V. 438, P. 239-257

38. Severin, F.F., Meer, M.V., Smirnova, E.A., Knorre, D.A., and Skulachev, V.P.

Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae. II Biochim Biophys Acta - 2008 - V.1783, P.1350-1353

39. Knorre, D.A., Saprunova, V.B., Ojovan, S.M., Sokolov, S.S., Bakeeva, L.E., Severin, F.F. Mitochondrial matrix fragmentation as a protection mechanism of yeast Saccharomyces cerevisiae. II Biochemistry (Mose) - 2008 - V.73, P. 1561-1568.

40. Bocharova, N.A, Chave-Cox, R, Sokolov, S.S, Knorre, D.A., Severin, F.F. Protein aggregation and neurodegeneration: clues from a yeast model of Huntington's disease. //

Biochemistry (Mose) - 2009 - V.74, P. 231-234.

41. Bocharova, N.A., Sokolov, S.S., Knorre, D.A., Skulachev, V.P., Severin, F.F. Unexpected link between anaphase promoting complex and the toxicity of expanded polyglutamines expressed in yeast. // Cell Cycle - 2008 - V.7, P.3943-3946.

42. Knorre, D.A., Krivonosova, T.N., Markova 0,V., Severin, F.F. Amiodarone inhibits multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae. // Arch Microbiol - 2009 - V.191, P. 675-679.

43. Severin, F. F., Skulachev, V. P. Programmed cell death as a target to interrupt the aging program. // Advances in Gerontology - 2009 - V. 22, P.37-48

44. Ожован, C. M., Кнорре, Д. А., Северин, Ф. Ф., Бакеева JI. E. Влияние амиодарона на ультраструктуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Цитология - 2009 -Т.51,С.911-916

45. Severin, F.F., Severina, I.I., Antonenko, Y,N„ Rokitskaya, T.I., Cherepanov, D.A., Mokhova, E.N., Vyssokikh, M.Y., Pustovidko, A.V., Markova, O.V., Yaguzhinsky, L.S., Korshunova, G.A., Sumbatyan, N.V., Skulachev, M.V., Skulachev, V.P. Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. //Proc Natl Acad Sei U S A - 2010 V.107, P. 663-668.

46. Skulachev, V.P., Antonenko, Y.N., Cherepanov, D.A., Chernyak, B.V., Izyumov, D.S., Khailova, L.S., Klishin, S.S., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Pletjushkina, O.Y., Roginsky, V.A.,Rokitskaya, T.I., Severin, F.F., Severina, I.I., Simonyan, R.A., Skulachev, M.V., Sumbatyan, N.V., Sukhanova, E.I., Tashlitsky, V.N., Trendeleva, T.A., Vyssokikh, M,Y., Zvyagilskaya, R.A. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs). // Biochim Biophys Acta - 2010

V. 1797, P. 878-889.

47. Knorre, D.A., Smirnova, E.A., Markova, O.V., Sorokin, M.I., Severin, F.F. Prooxidants prevent yeast cell death induced by genotoxic stress. // Cell Biol Int - 2011 - V.35, P. 431-435.

48. Knorre, D.A., Kulemzina, I.A., Sorokin, M.I., Kochmak, S.A., Bocharova, N.A., Sokolov, S.S., Severin, F.F. Sir2-dependent daughter-to-mother transport of the damaged proteins in yeast is required to prevent high stress sensitivity of the daughters. // Cell Cycle - 2010 - V.9, P. 4501-4505.

49. Kochmak, S.A., Knorre, D.A., Sokolov, S.S., Severin, F.F. Physiological Scenarios of Programmed Loss of Mitochondrial DNA Function and Death of Yeast. // Biochemistry (Moscow) — 2011 - V.76, P. 167-171.

50. Ojovan, S.M., Knorre, D.A., Markova, O.V., Smirnova, E.A„ Bakeeva, L.E., Severin, F.F. Accumulation of dodecyltriphenylphosphonium in mitochondria induces their swelling and ROS-dependent growth inhibition in yeast. // J Bioenerg Biomembr- 2011 — V.43, P. 175-180.

51. Antonenko, Y.N., Avetisyan, A.V., Cherepanov, D.A., Knorre, D.A., Korshunova, G.A., Markova, O.V., Ojovan, S.M., Perevoshchikova, I.V., Pustovidko, A.V., Rokitskaya, T.I., Severina, I.I., Simonyan, R.A., Smirnova, E.A., Sobko. A,A„ Sumbatyan, N.V., Severin, F.F., Skulachev, V.P. Derivatives of Rhodamine 19 as Mild Mitochondria-targeted Cationic Uncouplers. // J Biol Chem - 2011 - V.286, P. 17831-17840.

52. Skulachev, M.V., Antonenko, Y.N., Anisimov, V.N., Chernyak, B.V., Cherepanov, D.A., Chistyakov, V.A., Egorov, M.V., Kolosova, N.G., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Plotnikov, E.Y., Roginsky, V.A., Savchenko, A.Y., Severina, I.I., Severin, F.F., Shkurat, T.P., Tashlitsky, V.N., Shidlovsky, K.M., Vyssokikh, M.Y., Zamyatnin, A.A., Jr, Zorov, D.B., Skulachev, V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies. // Curr Drug Targets - 2011 - V.12, P. 800-826.