Секреция белков у дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук в форме науч. докл. Циоменко, Арнольд Борисович

• Циоменко, Арнольд Борисович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Циоменко, Арнольд Борисович

Актуальность проблемы. Способность секретировать разнообразные микро- и макромолекулы - непременное свойство всех г живых клеток. Изучение этого свойства занимает одно из центральных мест в современной биологии. Впечатляющие успехи в данной области, безусловно, стали возможными лишь благодаря комплексному исследованию большинства существующих здесь проблем, что подразумевает использование наиболее прогрессивных идей и подходов из смежных областей биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии и генетики.

Секреторный процесс интегрирован многообразными связями в общий клеточный метаболизм, выделяясь при этом своей особой предназначенностью. Используя сложные регуляторные механизмы, позволяющие контролировать не только синтез, но и строго детерминированную адресованную доставку секретируемых компонентов к месту их функционирования, этот процесс обеспечивает биогенез обширной группы макромолекул и надмолекулярных структур, составляющих вместе уникальное клеточное образование, называемое секреторной системой.

Функции секреторной системы чрезвычайно разнообразны. Вместе с тем, наиболее специфические из них эволюционно консервативны и присущи как прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. В обоих случаях, экспрессия на клеточной поверхности и экспорт из клеток белков и других биополимеров является основой механизма передачи химических сигналов, определяет характер межклеточных взаимодействий и, в целом, обеспечивает возможность адаптации клеток к сложным условиям среды обитания.

Нельзя не отметить еще одну, пожалуй, наиболее очевидную и одновременно особенно важную роль секреторной системы в построении и функционировании клеточной поверхности эукариотических клеток, к каковым относятся и дрожжи. Так, дрожжевая клетка удваивает площадь своей поверхности в течение одного клеточного цикла. При этом формируется новая клеточная арэлочка и практически все её компоненты, в том числе и белки, которые синтезируются и созревают в секреторной системе, а затем -депортируются к месту конечной локализации. Исследования механизмов секреции белков развиваются быстро и плодотворно. Их начало было положено более двух десятилетий тому назад работами Паллада [1], определившими генеральную схему .--.--движения секретируемых полипептидов от места их синтеза к месту ""конечной локализации в клетках животных. В то время трудно было предположить, что дрожжи, как экспериментальная модель, вскоре займут, если не лидирующую, то, по крайней мере, одну из центральных позиций в изучении механизмов секреции [2,3].

До недавнего времени устройство секреторной системы дрожжевой клетки представлялось весьма упрощенно и базировалось во многом на аналогии с секреторной системой животных и растительных клеток. Считалось , что низшие эукариоты, к каковым относят дрожжи, располагают редуцированным вариантом секреторной системы высших эукариот. Не существовало прямых доказательств, но допускалось наличие у дрожжей аппарата Гольджи (АГ), равно как и разнообразных везикул, осуществляющих межорганелльный перенос белков. Однако, по мере накопления экспериментальных данных дрожжевая секреторная система приобретала очертания близкие, если не идентичные, секреторной системе высших эукариот.

На сегодняшний день секреторная система дрожжевой клетки представляется состоящей из нескольких индивидуальных органелл (компартментов), связь между которыми осуществляется посредством мембранных везикул [4] . Последние, в зависимости от типов связываемых ими компартментов называются либо транспортными, либо секреторными везикулами.

Все секреторные белки начинают свой путь к месту конечной локализации из цитозоля со свободных рибосом, и после непродолжительного временного интервала (инициация трансляции, синтез сигнального пептида и прикрепление рибосомы к мембране), транслоцируются уже с мембраносвязанных рибосом в люменальное пространство эндоплазматич.еского ретикулюма (ЭР), если белки растворимые, или встраиваются в мембрану ЭР, если белки имеют соответствующее предназначение. Дальнейший транспорт и все модификации секреторных белков происходят в составе мембранных органелл секреторной системы.

Принято считать, что до определенного момента транспорт всех секреторных белков дрожжей происходит совместно, по общему (конститутивному) пути секреции. На уровне АГ белки, предназначенные для попадания в вакуоль, (аналог лизосом клеток высших- эукариот), отсортировываются й транспортируются в эту органеллу с помощью специальных везикул [5]. Остальные белки продолжают свое движение на периферию клетки в клеточную оболочку в составе секреторных везикул.

Наиболее слабым звеном в представлениях о механизме секреции белков у дрожжей является терминальная стадия, в результате которой белки попадают в клеточную оболочку, а некоторые из них пересекают её и экспортируются в окружающую среду. Последнее (экспорт) вообще долго не воспринималось как нормальная способность дрожжевой клетки, а считалось результатом нарушений проницаемости клеточной стенки, вызванных неблагоприятными внешними и внутренними факторами [6].

Сейчас понятно, что белки и другие биополимеры, составляющие клеточную оболочку, попадают в нее секреторным путем . Существует несколько экспериментально обоснованных попыток представить организацию дрожжевой оболочки (ее архитектонику) в виде мультикомпонентной поверхностной структуры , главной особенностью которой является наличие непроницаемого для макромолекул внешнего маннопротеинового слоя, центральной глюкановой сети, составляющих вместе клеточную стенку и прилегающего к плазмалемме периплазматического пространства С7).

Механизмы , с помощью которых компоненты оболочки попадают в эти субкомпартменты и образуют строго упорядоченную структуру , пока не совсем ясны. Не существует четкого представления о том, каким образом белки проходят сквозь оболочку и экспортируются из клетки. Неясно, в какой степени периплазма изолирована от внешней среды клеточной стенкой. Иными словами, имеют ли периплазматические белки возможность свободного, или опосредованного выхода во внеклеточное пространство? Существуют ли секреторные белки предназначенные исключительно (или в основном) для функционирования вне клетки? Какие типы везикул участвуют в доставке белков в клеточную оболочку и в экспорте их из клетки? Как реагирует секреторная система на внешние стрессовые факторы?

Цель и задачи исследования. Пытаясь ответить на эти и другие вопросы, мы предприняли исследование, целью которого являлось изучение механизмов секреции собственных и чужеродных белков из дрожжевых клеток . В связи с этим особое внимание было уделено таким вопросам как: способность интактных клеток дрожжей экспортировать белки в культуральную среду, механизмы межорганельного переноса (АГ-» плазмалемма) и прохождения белков через клеточную оболочку, существование секреторных белков, адресуемых преимущественно во внешнюю среду, связь между типом сигнального пептида и эффективностью экспорта белков из клеток, роль гликозилирования в секреции белков, иммуноцитохимическая локализация секреторных белков . Специальное место в исследовании занимает вопрос об участии секреторной системы в реакции дрожжевых клеток на стрессовые факторы.

Для достижения поставленных целей мы использовали сочетание биохимических, молекулярно-биологических и цитологических подходов, полагая таким путем решить следующие основные задачи:

1. Охарактеризовать процесс секреции белков во внешнюю среду (экспорт) у интактных дрожжевых клеток.

2. Изучить взаимосвязь между проницаемостью клеточных стенок и экспортом белков из клеток.

3. Найти доказательства существования белков, относящихся к типично экспортным, основным местонахождением которых является внешняя среда.

5. Провести сравнительное изучение свойств экспортных белков у дрожжей, принадлежащих к различным видам и родам.

5. Сконструировать векторы экспрессии/секреции, позволяющие оценить роль И-концевых сигнальных пептидов в эффективности экспорта белков.

6. Определить характер реакции секреторной системы на внешние стрессовые факторы ( на примере влияния повышенной температуры).

7. Показать возможный механизм прохождения экспортируемых белков через клеточную оболочку.

Научная новизна. Результаты, приведенные в работе, получены впервые. Показано, что секреторные белки, движущиеся по общему секреторному пути, на поздней стадии секреции разделяются на два потока - периферийный и экспортный. Последний определяет способность интактной дрожжевой клетки экспортировать некоторые белки в окружающую среду . Прохождение белков сквозь клеточную оболочку осуществляется через микроучастки аномальной проницаемости. При этом экспортируемые белки не попадают в периплазму.

Обоснованно продемонстрирована зависимость эффективности экспорта белков от природы И-концевой сигнальной последовательности. Получены данные, свидетельствующие о том, что роль просегмента дрожжевого феромона - сх-фактора заключается в адресовке связанных с ним белков в экспортный поток. При этом, эффективность экспорта белков, направляемых просегментом, не зависит, в изученных пределах, от размеров этих белков.

Обнаружено, что среди секретируемых белков имеются такие, которые предназначены преимущественно для экспорта из клетки. Их основным местом сосредоточения является окружающая клетку среда. К таким белкам относятся секреторные белки теплового шока, представляющие новое семейство стрессовых белков. В условиях теплового шока они быстро и практически полностью экспортируются из клетки. В этом состоит одна из реакций секреторной системы дрожжевой клетки на внешний стресс.

В дополнение к тому, что дрожжи располагают типичными элементами секреторной системы (ЭР, АГ), показано, что среди секреторных везикул существует популяция, отличная по свойствам от везикул конститутивного пути секреции. Эти везикулы нового типа функционируют в экспортном потоке.

Совокупность полученных результатов позволила дополнить схему дрожжевой секреторной системы элементом, позволяющим ей выполнять функции коммуникаций между внутри- и внеклеточной средой. Все это в значительной степени расширяет наши представления о секреторной системе клеток эукариотических микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интактные клетки дрожжей способны экспортировать белки, предназначенные для функционирования в окружающей клетку среде. Транслокация экспортируемых белков осуществляется через микроучастки аномальной проницаемости клеточной стенки, которые локализованы по всему периметру дрожжевой клеточной оболочки.

2. В ответ на тепловой шок дрожжи синтезируют и экспортируют в окружающую среду новый тип стрессовых белков - секреторные белки теплового шока. Последние широко распространены среди аскомицетных дрожжей. По способности реагировать на тепловой шок дрожжи делятся на три группы с различной способностью к синтезу и экспорту стрессовых белков.

3. Препросегмент дрожжевого с(-фактора адресует большую часть слитых с ним гетерологичных и гомологичных белков в специальный экспортный поток, предназначенный для транспорта секреторных белков из клеток во внешнюю среду. Эффективность экспорта не зависит, в определенных пределах от молекулярной массы белка.

Научно-практическое значение. Проведенные исследования подтвердили преимущества дрожжевой клетки в качестве модели для изучения секреции белков. В серьезной мере углубились наши представления о механизме экспорта белков из клетки в окружающую среду. Из этого логически вытекает практическая значимость представленной работы.

Известно, что множество ферментов и других физиологически активных белков и пептидов, используемых в различных сферах человеческой деятельности, вырабатываются с помощью микроорганизмов, в том числе благодаря их способности к секреции этих веществ. Важная биотехнологическая задача состоит в получении с помощью микроорганизмов целевых продуктов как для технических целей, так и совместимых с человеческим организмом. Дрожжи, как наиболее безопасные и веками используемые в практике, представляют идеальный объект для производства таких продуктов. Однако, до сих пор нет окончательной ясности в вопросах получения, например, гетерологичных белков, в интактном немодифицированном виде. Кроме того существует много проблем в плане эффективности дрожжевых клеток, как продуцентов целевых белков.

Современные генноинженерные методы позволяют создать практически любую конструкцию и использовать биосинтетическую машину дрожжевой клетки для синтеза белка, а затем вывести его из клетки в высокоочищенном и функционально активном виде. Однако, эффективность этого процесса зависит от того, насколько верно выбрана стратегия конструирования. Полученные в настоящей работе данные о существовании экспортного потока и особенностях гликозилированйя( гетерологичных белков в дрожжевой клетке, позволят усовершенствовать технологии производства физиологически активных белков и пептидов с помощью дрожжевых клеток.

Апробация работы. V-Всесоюзный биохимический съезд, Киев, 1986; III-Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмов", Пущино-Кобулети, 1986; Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1986; 7-th German-Soviet Symp. "Organization and function of the eucaryotic genome", Heidelberg, FRG, 1987; VI-Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмов, Ташкент, 1988; 4-th Int. Congr. Cell Biology, Montreal, Canada, 1988; Всесоюзная конференция "Изучение и применение лектинов", Тарту, 1989; Всесоюзная конференция "Актуальные проблемы биохимии эукариотов и прокариотов", Пущино, 1990; I - IV Рабочие совещания "Секреция белков у микроорганизмов", Пущино, 1988-1991; 15-th Int. Symp. Yeast, Riga, 1991; V Russian-Swedish symposium on ptiysi со-chemical biology, Moscow-Pushchino, 1992. Семинары в лаборатории проф. G. Waters, Принстонский университет (Princeton, USA, 1995) и в лаборатории проф. R. Füller, Мичиганский университет (Ann-Arbor, USA, 1995).

Публикации. По теме диссертации* опубликовано 30 печатных работ.

Благодарности. Благодарю всех коллег, участвовавших в той или иной степени в исследованиях, легших в основу данной работы. Особую признательность выражаю моим ближайшим помошникам и коллегам, внесшим серьезный вклад в решение проблемы экспорта гомологичных и гетерологичных белков из дрожжевых клеток: В. В. Лупашину, М. А. Эльдарову, С. В. Кононовой, И. В. Карпычеву, Г. П. Туйметовой , Е. Н. Ратнеру и П. Г. Плеханову.

Цитированная литература

1. Palade G. 1975. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science, 189, 347-358.

2. Schekman R. 1985. Protein localization and membrane traffic in yeast. Ann.Rev.Cell Biol., 1, 115-143.

3. BotsteinD., Fink G.R. 1988. Yeast: An experimental organism for modern biology. Science, 240, 1439-1443.

4. Kaiser Ch.A., Gimeno R.E., Shaywitz D. A. 1997. Protein secretion, membrane biogenesis, and enctocytosis. In: The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Cell cycle and cell biology, 91-227. Eds. J.R.Pringle, J. R. Broach, E.W.Jones. CSHL.

5. Rothman J.E. 1994. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature, 372, 55-63.

6. Sentandreu R., Herrero E., Martinez-Garcia J.P., L r iba G. 1984. Biogenesis of the yeast cell wall. In: Subcell. Biochem. 10, 193-235. Ed. D. B. Roodyn, Plenum Press, NY, London.

7. Ballou C.E. 1982. Yeast cell wall and cell surface. In: Mol. Biol. Yeast Saccharomyces, 335-360. Eds. Strathern J. N. et al. CSHL.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Микроорганизмы и условия их выращивания. В работе использованы прототрофные и ауксотрофные штаммы дрожжей рода Saccharomyces, а также представители других родов аскомицетных и базидиомицетных дрожжей. Всего изучено более ста штаммов, характеристики которых приведены в соответствующих разделах работы. За исключением специально оговоренных случаев, дрожжи выращивали на жидкой среде YPD (дрожжевой экстракт - пептон -2%, глюкоза - 2% ), при температуре 29° , на механической качалке, 150 об/мин. Для хранения культур использовали косяки со средой YPD+2% агар.

1.2. Основные методы. 1.2.1. Импульсное мечение дрожжевых белков проводили в 10 мл суспензии клеток, находящихся в экспоненциальной фазе роста. После 15 минут инкубации в присутствии [14С]-казамино кислот (0,5 мКи), клетки осаждали, промывали свежей средой , ресуспендировапи в 100 мл той же среды и инкубировали 60 мин. Белковый синтез останавливали внесением циклогексимида (10 мкг/мл). Далее, клетки отделяли центрифугированием (3000xg, 10 мин.), а супернатант концентрировали перед дальнейшим анализом.

1.2.2. Тепловой шок. Условия теплового шока создавали путем быстрого переноса суспензии клеток, находящихся при нормальной температуре в предварительно подогретую до шоковой температуры среду. Слежение за динамикой индукции синтеза и секреции белков в условиях теплового шока проводили с помощью электрофоретического анализа клеточных лизатов и препаратов культуральной среды с последующим иммуноблоттингом, либо прямым окрашиванием гелей азотнокислым серебром.

1.2.3. Субклеточное фракционирование проводили по Боузер и Новик [1], секреторные везикулы получали по методу, описанному Волвортом и Новик [2]. Вакуоли из сферопластов получали гипотоническим способом [3].

1.2.4. Выделение и характеристика секреторных белков теплового шока (СБТШ). Источником выделения СБТШ являлась культуральная среда, так как в клетках эти белки практически не накапливались. Перед окончательным выбором условий выделения индивидуального белка проверяли несколько вариантов накопления СБТШ в культуральной среде. В нормальных физиологических условиях V'V. i," í v

СБТШ синтезируются в небольших количествах конститутивно. В течение 12 часов в культуральной среде накапливается для разных СБТШ от 2 до 10 мг/л белка. В то же время, такое же количество СБТШ, как правило, можно накопить инкубируя клетки в свежей среде в течение часа при шоковой температуре. Разница между этими вариантами состоит в том, что во втором случае препарат содержит минимальное количество балластных белков. Поэтому , там где это было оправдано, выделение СБТШ проводили из освобожденной от клеток культуральной среды, полученной вторым способом. Наилучшие результаты были получены при прямом осаждении суммарных белков сульфатом аммония.

В экспериментах по слежению за динамикой, секреторные белки осаждали из культуральной среды (2 мл) добавлением дезоксихолата натрия и трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 0,015 % и 6% соответственно

Гомогенные препараты СБТШ получали сочетанием методов гельфильтрации, ионообменной хроматографии и полупрепаративного электрофореза белков, полученных либо высаливанием супернатанта культуральной среды сульфатом аммония , либо ультрафильтрацией. Полосу, соответствующую СБТШ, после разделения в геле, вырезали и белок извлекали электроэлюцией как описано в работе Шаггера [4]. Полученный электрофоретически гомогенный препарат СБТШ использовали для дальнейшего анализа и для выработки кроличьих поликлональных антител

Субъединичный состав СБТШ определяли электрофоретически в нативных и денатурирующих условиях [5].

0 наличии углеводов в молекулах СБТШ судили по взаимодействию с конканавалин. А-сефарозой и с помощью реакции Шиффа.

1.2.5. Электронно-микроскопическая иммуноцитохимия.

Фиксирование, обезвоживание и включение дрожжевых клеток в смолу Spurr проводили как описано в работе [6]. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме "U1tratóme IV" фирмы LKB (Швеция) с помощью алмазных ножей "Jumdi" (LKB, Sweden) и помещали на никелевые сеточки с формваровой пленкой-подложкой. Иммуноцитохимическое окрашивание g использованием в качестве первичных кроличьих поликлональных антител, коньюгата белок A-золото или коньюгата вторичных антител и пероксидазы проводили по известному методу [7]. Препараты просматривали без докрашивания или с докрашиванием уранил-ацетатом и цитратом свинца в электронном микроскопе Jem 100В

Специфичность иммуноцитохимической реакции проверяли с помощью дополнительных контролей : 1) анализ ультратонких срезов, обработанных коньюгатом белок А-золото без предварительной реакции с антителами; 2) иммуноцитохимическое окрашивание срезов обработанных - а) преиммунной сывороткой, б) антителами против белксз, неспецифичных для исследуемых дрожжей.

1.2.6. Другие методы. Электрофорез в ДсИа-ПААГпроводили по Леммли [8], иммуноблоттинг по Тоубину [9]. Кроличьи поликлональные антитела против гомогенных белков или их субъединиц получали стандартным методом. Перед использованием иммунную сыворотку инкубировали трижды по 60 мин с интактными дрожжевыми клетками при 4° для удаления антител, взаимодействующих с углеводной частью гликопротеинов. Аффинно очищенные антитела получали по методу Мадара с соавторами [10]. Механическое разрушение клеток осуществляли с помощью стеклянных шариков (300 -500 мкм) в дезинтеграторе "Mikro-Dismembrator" (FRG). Электрофорез и выделение фрагментов ДНК из агарозных и акриламидных гелей, присоединение синтетических линкеров проводили стандартными методами [11]. Секвенирование плазмидных ДНК выполняли по методу Сенгера с некоторыми модификациями [12].

Трансформацию дрожжей проводили, с использованием интактных клеток, обработанных солями лития [13].

Объем периплазматического пространства определяли по методу Конвея в модификации [14], позволяющей судить о проницаемости клеточной стенки. Величины молекулярных радиусов Сахаров и декстранов взяты из работы Герхардта [15].

Цитированная литература

1. Bowser R., Novick P. 1991. Secl5 protein, an essential component of the exocytotic apparatus, is associated with the plasma membrane and with soluble 19,5 S particle. J. Cell Biol., 112, 1117-1131.

2. Walworth N.C., Novick P. 1987. Purification and characterization of constitutive secretory vesicles from yeast. J.Cell Biol., 105, 163-174.

3. Wiemken A. 1975. Isolation of vacuoles from yeasts. In: Methods cell biol.," 12, 99-103.

4. Schagger H. 1994. Electrophoretic isolation of membrane proteins from acrylamide gels. Appl. Biochem. Biotech., 48, 185-203.

- И

5. Parekh В. S., Mehta H. В., WestM.D., Montelaro R.C. 1985. Preparative elution of proteins from nitrocellulose membranes after separation by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem., 148, 87-92.

6. Spurr A.R. 1969. A low-viscosity epoxy resin embidding medium for electron microscopy. J. Ultrastruct. Res., 26, 31-43.

7. Varndell I.M., Polak J.M. 1987. Electron microscopy in molecular biology, 179-200. Sommerville and Scheer eds., IRL Press, Oxford-Washington DC.

8. Laemmly U.K. 1970. Cleavege of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophag T4. Nature, 227, 680-685.

9. TowbinH., Staehelin Т., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354.

10. MadaraP. J., Banghart L. R., Jack L. J., et al. 1990. Affinity purification of polyclonal antibodies from antigene immobilized in situ in sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gels. Anal. Biochem., 187, 246-251.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.1984, Молекулярное клонирование. 480 стр., "Мир", М.

12. Hattory М., Sekaki Y. 1986. Dideoxy sequencing method using denatured plasmid templates. Anal.Biochem., 152, 232-240.

13. I to H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol., 153, 163-168.

14. Arnold W.N.,. Lacy J.S. 1977. Permeability of the yeast envelope and osmotic behavier in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 131, 564-571.

15. Gerhardt P., Judge J. 1964. Porosity of isolated cell walls of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus megaterium. J. Bacteriol., 87, 945-951.

Глава 2. Секреция белков интактными клетками дрожжей.

Экспорт белков в культуральную среду.

Термин секреция (от лат. бесгеНо - отделение от ч.л.), в применении к дрожжевым клеткам, означает не только доставку белков в различные клеточные компартменты, но и, в особенности, их экспорт из клетки в окружающую среду.

Как ни парадоксально, но способности экспортировать белки до сих пор не уделяется должного внимания, как одной из важных физиологических функций дрожжевой клетки. За небольшим исключением (секреция половых феромонов и киллер-токсинов), экспорт белков исследовался лишь в плоскости практического использования этого феномена [1,2]. Выход белков в культуральную среду долгое время принято было связывать с нарушениями целостности клеточной стенки, возникающих под влиянием различных факторов [3]. Именно поэтому для изучения закономерностей секреции белков использовали не интактные дрожжевые клетки, а сферопласты или протопласты. Лишь в одной работе на способность интактных клеток выделять фермент инвертазу впервые было обращено должное внимание и был поставлен вопрос о проницаемости дрожжевой оболочки для макромолекул [4].

2.1. Сахаромицетные дрожжи. В самом начале исследований мы обнаружили, что накопление некоторых белков в культуральной среде зависит от условий культивирования дрожжевых клеток и, главным образом, от состава питательной среды. Действительно, если сахаромицетные дрожжи росли в незабуференной минеральной среде с сульфатом аммония в качестве источника азота, то нам не удавалось обнаружить в культуральной среде белки, в том числе и такие типичные внеклеточные ферменты, как инвертаза, кислая фосфатаза (КФ) и глюканаза . Однако, если в качестве источника азота использовали пептон, казаминокислоты или другие легкоусваемые источники азота, то в среде обнаруживались от 8 до 25 полипептидных полос (рис. 1) и все вышеназванные ферменты (табл.1). Доля последних составляла от 10 до 30% . суммарной активности и значительно варьировала в зависимости от штамма. Некоторые из исследованных штаммов, например, Д-15, были использованы нами в качестве продуцентов секретируемых ферментов - инвертазы и КФ.

Таблица 1.

Накопление некоторых ферментов в культуральной среде сахаромицетных дрожжей*

Активность, мЕ/мл

Штамм КФ Инвертаза Глюканаза

1. сегеугэгае ИБФМ У-350 80-90 500-100 1

2. Б. сеге^гэгае Д-15 120-150 2000 2

3. Б. сегеугэгае ИБФМ У-332 90 130

4. Б. сег^гзгае Д-14 100 200 н. о.

5. Э. сегеу1э1ае Д-19 120 370 3

6. Э. сегеугэгае ССУ-21-4

7. Б. сеге^гэгае ШР-188 30-40 700

8. Б. саг1зЪегдепэ1& Д-2 10-15 100

9. Б. сапгзЬе^епзгэ ССУ-48-76 100 200

10. Б. £еггез4ггв ИБФМ У-869 100 1000 н. о.

Дрожжи выращивали на рреде УРБ в течение 48 часов.

В дальнейшем было выявлено, что не только состав питательной среды, но и концентрация ионов водорода влияет на экспорт белков. В конечном счете было определено, что оптимальным условиям отвечает богатая среда с близким к нейтральному значением рН.

Рис. 1. Спектры секретируемых полипептидов дрожжей 5. сегеугзгае. Штаммы: 1- ВКМ У-350; 2- АН216; 3- Д32.

Доказательством активной природы экспорта белков служили следующие факты. Прежде всего, в среде культивирования, вплоть до середины стационарной фазы роста, не обнаруживались внутриклеточные активности, что свидетельствовало об отсутствии лизиса дрожжевых клеток. Скорость накопления КФ и инвертазы в среде была максимальной во время логарифмической фазы роста, то есть в период максимальной метаболической активности клеток. Интенсивное перемешивание культуры, которое могло бы вызвать механическое "слущивание" ферментов с клеточной поверхности, не

3 кДа увеличивало удельной доли экспортируемых белков. Не изменяло картину и введение в среду культивирования неионных детергентов (Твин-20, Твин-60; Тритон Х-100) в концентрации до 0,05%.

Об активной природе экспорта белков свидетельствовали и результаты по влиянию ингибиторов белкового и углеводного синтеза на этот процесс. На примере КФ было показано, что наиболее эффективно синтез и экспорт подавлялся циклогексимидом (ЦГИ), причем, прекращение поступления белка в клеточную оболочку и в среду роста происходило одновременно. Этот факт показывал абсолютную зависимость процесса экспорта от состояния белоксинтезирующей системы. Ингибитор гликозилирования 2-дезокси-Д-глюкоза (2ДГ), также подавлял экспорт КФ, однако его действие проявлялось только после некоторого лаг-периода (~30 мин), что в определенной степени напоминало характер действия 2ДГ на секрецию КФ дрожжевыми сферопластами [5].

2.2 Базидиомицетные дрожжи. Сходная с сахаромицетами ситуация наблюдалась и у базидиомицетных дрожжей, одного из представителей которых сарзиНёетт ВКМ У-2623) мы изучили штамма, как эффективного продуцента внеклеточной й-амилазы, предшествовала проверка большого ряда дрожжей (89 штаммов) на способность к секреции белков в культуральную среду. Было обнаружено, что все исследованные штаммы накапливают умеренное количество белка (50-200 мг/л) и полисахарида (100-400 мг/л) в среде, но резко различаются качественным набором секретируемых полипептидов. Последнее показано на рис. 2, где приведены несколько типичных случаев, демонстрирующих вышесказанное Рис. 2. Спектры секретируемых полипептидов базидиомицетных дрожжей й!гойо4оги1а тис1^{поза. Штаммы: 1-ВКМ У-87; 2-ВКМ У-88; 3-ВКМ У-1115; 4- ВКМ У-17. подробно. Выбору этого

1 2 3 4 кДа

В целом же, базидиомицетные дрожжи не выделялись какой-либо особенностью по сравнению с аскомицетными дрожжами. Характер накопления секретируемых белков был типичным для дрожжей, а уровень их экспорта зависел, главным образом, от состава питательной среды. В результате проведенного скрининга был отобран вышеуказанный штамм, выгодно отличающийся от всех других минимальным набором экспортируемых полипептидов и максимальной активностью й-амилазы (аРс), выбранной нами в качестве модельного белка для дальнейшего изучения.

Уровень активности этого фермента достигал 3 Е/мл в начале стационарной фазы при росте культуры на среде с пептоном или казаминокислотами. При использовании минеральной среды фермент обнаруживался лишь в следовых количествах.

С целью дальнейшей характеристики и выработки антител фермент был выделен и очищен до гомогенного состояния (рис. ЗА). Кроме того были изучены основные биохимические свойства аРс. По своей природе она оказалась гликопротеином. На долю её углеводной части приходилось 4% массы молекулы, которая составляла 56 кД (мономерный белок). Проверка полученных к аРс антител показала, что они реагируют с единственной полипептидной полосой при электрофоретическом анализе культуральной среды различных штаммов Р. capsuligenum , которая соответствует аРс (рис. 3 Б).

6629- '

Рис. 3. Электрофоретический анализ аРс. А: 1-очищенный препарат аРс; 2-суммарный препарат белков культуральной среды. Б - иммуноблоттинг аРс различных штаммов Р. сарэиИдепиж 1- ВКМ У-1439; 2- ВКМ У-1513; 3- ВКМ У-2623; 4- очищенный препарат аРс.

Вывод, сделанный нами на основании результатов начального этапа исследований состоял в том, что выход белков в культуральную среду не является пассивным процессом, происходящим в результате деградации клеточной стенки. Напротив, это активный, тесно коррелирующий с ростом процесс, физиологическое значение которого у. дрожжей до конца не ясно.

Помимо сказанного, нам удалось отработать условия изучения секреции белков на интактных клетках, что давало существенные преимущества, по сравнению с использованием сферопластов.

В дальнейшем мы попытались разобраться в способе, посредством которого белки экспортируются из дрожжевой клетки.

2.3. Проницаемость клеточной стенки и экспорт белков в культуральную жидкость. В результате реализации строго определенной последовательности реакций, секреторные полипептиды вступают во взаимодействие с уникальным аппаратом первоначального вовлечения в секреторный путь, а затем движутся через мембранные компартменты секреторной системы, претерпевая при этом необходимые модификации. Подавляющая часть белков, как растворимых, так и мембраносвязанных, двигаясь по общему секреторному пути достигает клеточной оболочки, где и заканчивает свое дальнейшее движение [6].

Таким образом, клеточная оболочка представляет собой конечный пункт, в котором заканчивается транспорт большинства секреторных белков, или, иными словами, реализуется терминальная стадия секреции.

Под терминальной стадией секреторного процесса мы подразумеваем передвижение секреторных везикул от транс-цистерн АГ к периферии клетки и последующее их взаимодействие (слияние) с плазмалеммой. В результате слияния содержимое везикул, в том числе и белки, распределяются между субкомпартментами клеточной оболочки (плазмзшеммой, периплазмой и клеточной стенкой), а мембрана везикул вместе с её белками становится частью плазмалеммы. Некоторая доля белков, направлявшаяся к оболочке, может, однако , оказаться вне клетки, в окружающей среде.

Ту часть терминальной стадии, которая состоит в слиянии везикул с плазмалеммой и прохождении определенной доли содержащихся в них белков сквозь клеточную оболочку с последующим их выходом из клетки, мы называем экспортом белков.

На представителях аскомицетных и базидиомицетных дрожжей нами была показана возможность экспорта кислой фосфатазы, инвертазы, в-глюканазы, с(-амилазы и некоторых других белков. Однако, как было сказано выше, экспорт этих белков наблюдался лишь в случае замены минерального источника азота ка органический. В связи с этим можно было предположить, что этому способствует увеличение проницаемости клеточной стенки, происходящее при культивировании клеток на среде с органическим источником азота. Чтобы проверить это предположение было предпринято сравнение проницаемости клеточных стенок у клеток, находившихся в двух функционально различных состояниях, характеризующихся тем, что в одном из них клетки экспортировали белки (+экс), а в другом - выхода белков в культуральную жидкость не наблюдалось (-экс).

2.4. Проницаемость для декстранов. На рис. 4 А показано обусловленное экспортом накопление КФ в культуральной жидкости клеток двух штаммов дрожжей в процессе их роста на среде УРБ, содержащей пептон.

КФ, Е/мл

Ю10 кл

ВКМ-У

ВКМ-У

40 час

8 12 кДа

Рис. 4. А - Динамика экспорта КФ в процессе роста дрожжей о. сегеугзгае на среде с пептоном. Б - Проницаемость клеточной стенки для различных декстранов у тех же штаммов, росших на среде с пептоном (1, 3) и на среде с сульфатом аммония (2, 4).

Выбор кислой фосфатазы в качестве модельного белка в этих экспериментах объяснялся исключительно простотой её обнаружения и высокой чувствительностью реакции. Аналогичные результаты были получены нами и для другого фермента - инвертазы. . На минеральной среде с сульфатом аммония в качестве источника азота клетки обоих штаммов практически не. экспортировали КФ , и вся активность фермента оставалась связанной с клетками и могла быть определена на интактных клетках.

Сравнение проницаемости клеточных стенок +экс и -экс клеток были выполнены нами с использованием в качестве маркеров серии декстранов с различными молекулярными массами. Результаты измерения предела свободного проникновения для этих полимеров, характеризующего проницаемость клеточной стенки, приведены на рис. 4 Б.

Сопоставление кривых зависимости проницаемости от молекулярной массы декстранов у +экс и -экс клеток штамма Б.сегеугэгае Д32 показывает, что они имеют единственный перегиб (экстремум) в области . которого лежит предел проницаемости исследуемых полимеров. При этом его значение практически совпадает у +экс и -экс клеток и равно 2-3 кД.

О характере кривых, полученных для другого штамма . (Б. сегеугэгае ИБФМ У-350), можно сказать то же самое, за исключением абсолютного значения проницаемости, которое в данном случае приблизительно в два раза меньше и равно 0,6-1,5 кД. Отметим, что такое различие не имеет значения для проницаемости макромолекул, так как максимум свободного проникновения, выявленный для штамма Д32, на два порядка ниже молекулярного радиуса белковых молекул среднего размера (молекулярная масса КФ и инвертазы около 250 кДа). •

2.5. Проницаемость для экзогенных белков. Дополнительно, для оценки проницаемости клеточных стенок у +экс и -экс клеток мы попытались использовать различные белки. Однако, четкой корреляции между способностью клеток поглощать белки и размерами белковых молекул нами обнаружено не было. В условиях определения проницаемости, взаимодействие белков с клетками носило сложный характер, зависящий от таких факторов, как концентрация вносимого белка, ионная сила и рН раствора, а также температура и время инкубации. Это обстоятельство затрудняло возможность достоверной оценки процесса физического прохождения белков сквозь клеточную стенку, если таковой был возможен.

Тем не менее, интересно отметить, что сравнение содержания экзогенной щелочной фосфатазы (60 кДа) в клеточной суспензии при разных температурах показало убыль значительной доли добавленного фермента после его инкубации с клетками в питательной среде при температуре 30° . Только .55% от первоначально внесенной активности можно было обнаружить вне клеток после инкубации в течение 60 мин, тогда как в контроле после удаления клеток, при 30° или с клетками, но при 0-2° она сохранялась полностью. Следовательно, снижение активности экзогенной щелочной фосфатазы нельзя было отнести за счет протеолиза или температурной инактивации. Наиболее подходящим объяснением наблюдаемой потери фермента является, на наш взгляд, способность интактных дрожжевых клеток поглощать экзогенные белки путем эндоцитоза. Добавим, однако, что при этом они должны каким-то образом пройти сквозь клеточную стенку.

Дополнительные доказательства возможности прохождения экзогенных белков сквозь клеточную стенку и их взаимодействия с плазмалеммой были получены также и в опытах с пероксидазой (40 кДа). Пероксидаза вызывает нарушение проницаемости плазмалеммы для метйленового синего, а это возможно не иначе, как путем прямого контакта фермента с мембраной. Обработка +экс- и -экс-клеток пероксидазой (90 мин, 30°) приводила к нарушению их проницаемости в обоих случаях.

Таким образом, для некоторых белков нам удалось показать возможность их проникновения сквозь барьер клеточной стенки, который теоретически непроницаем для молекул такого размера. Наблюдаемый парадокс (малый размер пор и реально идущее проникновение макромолекул) побудил нас воспользоваться еще одной возможностью для его демонстрации.

2.6. Эксперименты с использованием конканавалина А. Ранее нами было установлено, что фитолектин - конканавалин А (кон А), не влияет на синтез секреторных белков, но ингибирует их экспорт в среду инкубации дрожжевых сферопластов [7]. Отработав условия изучения экспорта белков на интактных клетках, мы решили выяснить, каким образом кон А влияет на этот процесс у +экс клеток. Прежде всего было установлено, что лектин в широких пределах его концентраций не влиял на рост. В то же время, подобно тому, как это. наблюдалось у сферопластов, кон А тормозил экспорт КФ, вызывая её накопление внутри клеток (рис. 5 А).

Полное прекращение экспорта фермента наступало при концентрации кон А 400 мкг/мл. Отмсти,'-.;, что даже пои полном подавлении экспорта КФ при указанной концентрации и выше кон А не вызывал изменения активности КФ в клеточной оболочке.

КФ, /

КФ, Я

200 • о——V— v—(F—V

200 400 600 Кон А, мкг/мл

9—V--XT—V

-О V

Рис. 5. А - Зависимость экспорта КФ от концентрации КонА. 1 -внутриклеточная КФ, 2 - КФ в клеточной оболочке, 3 -экспортируемая КФ . Б- Накопление КФ внутри клеток, обусловленное КонА (400 мкгАш). 1 -внутриклеточная КФ -КонА, 2-то же +КонА, 3-внесение с(-метилманнозида (0, 5М) и циклогексимида (10 мкг/мл).

Детальное рассмотрение характера действия кон А приведено на рис. 5 Б. Так, если клетки росли при концентрации лектина, тормозящей экспорт, вся активность КФ, предназначенная для выхода о культуральную жидкость, накапливалась внутри клеток. Возможность со выхода могла быть создана путем внесения ингибитора связывания лектина - а-метилманнозида. При э~ом одновременное внесение циклогексимида не мешало выходу фермента, указывая на то, что вышедший белок не синтезируется de novo. Выход фермента можно было предотвратить, однако, путем обработки клеток азидом натрия перед внесением а-метшганнозида, что свидетельствовало об энергозависимости этого процесса. Таким образом, кон А избирательно тормозил экспорт КФ из клеток, но не её поступление в клеточную оболочку. Одновременно, не вышедший из клеток фермент накапливался внутри клеток. Это, очевидно, происходило в результате проникновения лектина сквозь клеточную стенку, его связывания с участками плазмалеммы, через которые осуществляется экспорт, что и являлось причиной нарушения выхода белка в культурапьную среду.

Учитывая, что молекулярная масса конА равна 100 кДа, мы получили еще - одно убедительное свидетельство возможности прохождения макромолекул. через внешний маннопротеиновый слой клеточной стенки. Следовательно, обнаруженное несоответствие между диаметром пор клеточной стенки дрожжей и размером молекул выходящих из клетки или входящих в нее явилось основным результатом данной части работы.

На основании этих результатов мы составили предварительное представление о возможном механизме экспорта белков у дрожжей . В его основе лежит предположение о том, что общий секреторный путь не является уникальным, а делится на несколько, в определенной мере независимых потоков. По одному из них секретируемые белки доставляются в клеточную оболочку или, другими словами, на периферию клетки. Поэтому мы называем этот поток периферийным. В литературе ему соответствует, так называемый, конститутивный путь секреции.

Периферийный или конститутивный путь не объясняет каким образом белки экспортируются из клетки. Отметим сразу же, что прохождение их через клеточную оболочку способом, предполагаемым до сих пор, а именно

АГ -> Секреторные Плазмалемма -> Периплазма -> Клеточная -» Внешняя везикулы стенка среда выглядит неправдоподобным, по крайней мере, по двум существенным причинам. Во первых, проницаемость дрожжевой клеточной стенки ограничена. Она способна пропускать молекулы массой не выше 3 кДа. Во-вторых, если допустить возможность прохождения макромолекул, в том числе и белков, через клеточную стенку, то теряется смысл самого существования периплазмы, которая попросту в этом случае отсутствует, а клетка открыта для любого, в том числе и вредного воздействия извне, что противоречит реально наблюдаемой ситуации. Поэтому, можно предположить существование другого, тем или иным образом обособленного секреторного потока, по которому белки выходят из клетки минуя периплазму. Это экспортный поток.

Переходы белков из одного компартмента секреторной системы в другой осуществляются путем везикулярного транспорта. При этом известно, что в каждом из существующих направлений (ЭР -> АГ, АГ Вакуоль, АГ -> Плазмалемма ) движутся транспортные везикулы разного типа [8]. Определенное затруднение состоит в необходимости объяснения того, каким образом экспортируемые белки попадают во внешнюю среду, а не в периплазму. В этой связи существование экспортного потока требует нескольких допущений. Это и разделение общего секреторного пути на два потока -периферийный и экспортный, а также наличие хотя бы двух, качественно различных транспортных средств, переносящих белки на периферию клетки и выносящих белки из клетки. То есть, наряду с везикулами периферийного потока должны существовать экспортные везикулы, загруженные экспортными белками.

Исходя из этого, направление наших дальнейших исследований в значительной мере определялось необходимостью доказательства или опровержения высказанных предположений.

Цитированная литература

1. Wickerham, L.J. 1958. Evidence of production of extracellular invertase by certain strains of yeasts. Arch. Biochem. Biophys., 76, 439-448.

2. Bitter, G. A. 1986. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient secretion of heterologous proteins. Microbiology 1986, 330-334.

3. De Nobel, J.D., Barnett J. A. 1991. Passage of molecules through yeast cell walls: a brief essay-review. Yeast, 7, 313-323.

4. Юркевич В.В.1954. Выделение инвертазы дрожжевыми клетками. ДАН СССР, 94,329-332.

5. Рязанова J1. П., Циоменко А. Б., Вагабов В. М., Кулаев И. С. 1984. Синтез и секреция кислой фосфатазы сферопластами дрожжей Saccharomyces cerevisiae в присутствии 2-дезокси-Д-глюкозы. Образование модифицированной формы фермента. Биохимия, 49, 1986-1996.

6. Novick, P., Ferro, S., Schekman R. 1981. Order of ivents in the yeast secretory pathway. Cell, 25, 461-469.

7. Циоменко А. Б., Рязанова Л. П., Вагабов В. М., Кулаев И. С. 1983. Разобщение биосинтеза и секреции кислой фосфатазы у сферопластов Saccharomyces cerevisiae. ДАН СССР, 271, 1000-1002.

8. Kaiser С.A., Schekman R. 1990. Distinct sets of SEC genes govern transport vesicle formation and fusion early in the secretory pathway. Cell, 61, 723-733.

Глава 3. Идентификация и характеристика новых секреторных белков, экспортируемых из дрожжевых клеток. Секреторные белки теплового шока.

Важным итогом предыдущих исследований стало предположение о существовании в дрожжевой клетке, одновременно с периферийным секреторным потоком, направляющим белки в клеточную оболочку , другого - экспортного потока, по которому белки выходят из клетки в окружающую среду . Разделение экспортного и периферийного потоков может происходить на стадии прохождения белков через АГ, очевидно, на уровне транс-Гольджи, подобно тому, как это происходит с белками, адресуемыми в вакуоль [1].

Напомним, что качественный и количественный состав полипептидов, обнаруживаемых в культуральной среде дрожжей значительно варьирует в зависимости от многих факторов и может составлять, на основании визуальной оценки, от нескольких единиц до нескольких десятков. Однако, это чрезвычайно малая доля от того количества белков, которые либо являются резидентными, либо выступают в качестве "пассажиров", следующих определенным маршрутом в секреторной системе. Так, современные расчеты показывают, что в адресованную доставку секреторным путем в клетках пекарских дрожжей вовлечено до 6000 белков. Идентифицированы 277 генов, кодирующих растворимые и мембранные белки органелл секреторной системы и клеточной оболочки [2]. В целом, допускается, что с секрецией связано от 10 до 20% всех клеточных белков 5.сеге^гвгае.

Поэтому, такие известные секреторные белки , как половые феромоны, киллер-токсины, барьерный белок, КФ, инвертаза и некоторые другие, представляют лишь малую тблику экспортного пула белков идентифицированных и охарактеризованных к настоящему моменту.

Задачей следующей части работы был поиск новых экспортных белков, их характеристика и использование в качестве специфических маркеров для изучения экспортного потока дрожжей.

3.1. Обнаружение нового секреторного белка - ГП400 дрожжей Б.сегеи1з1ае. Импульсное мечение дрожжевых клеток и последующий анализ меченых продуктов секреции показали , что белки, доставляемые в клеточную оболочку и экспортируемые в культуральную среду существенно различались, как в качественном, так и в количественном отношениях . С помощью электрофореза в денатурирующих условиях было установлено, что в течение короткого промежутка времени в среде роста 5. сегеугзгае ДЗ2 накапливаются два полипептида - 115 и 135 кДа (рис.6 А). Анализ показал, что эти полипептиды не разделяются при хроматографии и электрофорезе в нативных условиях и являются субъединицами олигомерного белка, названного нами ГП400 (рис. 6 Б).

С целью дальнейшего изучения ГП400 был выделен из культуральной среды и очищен до гомогенного состояния с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-Сефарозе и гельфильтрации на Сефакриле 5-300.

КДа Б кДа

116 .^^

ШI з]

Рис. 6. А- Авторадиограмма препаратов культуральной среды (1) и периплазмы (2) после импульсного мечения клеток Б! cerevisiae Д32. Б- Анализ субъединичного состава ГП400. 10% ДсМа-ПААГ. 1-средняя субъединица, 2- малая субъединица, 3- ГП400. В- Дегликозилированный ГП400.

3.2. Индукция синтеза и секреции ГП400 в условиях гипертермии. Белки, аналогичные ГП400 у дрожжей ранее обнаружены не были. Наши попытки определить какую-либо известную для секреторных белков ферментативную активность или агглютинирующие свойства у ГП400 не дали позитивных результатов. Поиски возможных функций привели нас, однако, к выявлению одного из существенных моментов регуляции биосинтеза ГП400 - его индукции тепловым шоком.

В условиях теплового шока общий биосинтез белка, а также секреция некоторых периплазматических ферментов подавлялись. В то же время, стимулировались синтез и экспорт ГП400 из клеток в культуральную среду (рис. 7). На основании индуцируемости в условиях теплового шока ГП400 был отнесен к новому типу стрессовых белков - секреторным белкам теплового шока (СБТШ).

А Б 24*0 37 с 24°С.■37С

5 10 20 40 90 5 10 20 40 OG МИН 5 :О 20"40 90 Ь il sliф ^^И»

Рис. 7. Индукция экспорта ГП400 в культуральную среду в| условиях теплового шока (А) клеток S.cerevisiae Д32. Экспорт КФ (Б) в тех же условиях. Электрофорез в 10% ДсИа-ПААГ с последующим иммуноблоттингом. Использованы аффинно-очищенные кроличьи поликлональные антитела к средней субъединице ГП400 (А) и КФ (Б).

3.3. Распространение секреторных белков, иммуногомологичных ГП400 у аскомицетных дрожжей. С целью изучения распространения белков гомологичных ГП400 нами было проанализировано 45 штаммов 41 вида принадлежащих 31 роду аскомицетных дрожжей. Иммунореактивные белки с молекулярной массой идентичной массе субъединиц ГП400 были обнаружены в культуральной среде всех штаммов, принадлежащих роду Saccharomyces sensu stricto (рис. :8, треки 1-8). Количество субъединиц варьировало, в зависимости от штамма, от 1 до 3, однако молекулярная масса нативного олигомера оставалась приблизительно постоянной (рис. 9 ).

Виды S. unisporus , S. kluyveri, S. dairensis, S. exiguus (рис. 8 ¡, треки 9-12) и представители некоторых других родов содержали иммунореактивные белки с иной молекулярной массой нежели ГП400. Наиболее интенсивная реакция с антителами к ГП400 наблюдалась у представителей Arxiozyma и Pachytichospora (рис. 8, треки 15,16). Нативные олигомеры К. potysporus и 1. rouxii имели массу близкую ГП400 (рис. 9., треки 8,9).

У представителей родов Ambrosiozyma, Arthroascus, Pachysoten, Saccharomycodes, Saccharomycopsis,

Schizosaccharomyces, Sporopachydermia, Wickerhamia, Wingea и Yarrowia иммуногомологов ГП400 в культуральной среде обнаружить не удалось.

Тем не менее, полученные результаты говорили, о широком распространении иммуногомологов ГП400 у аскомицетных дрожжей. Перекрестная реакция указывала на наличие в обнаруженных белках общих антигенных детерминант, что могло быть следствием их структурного сходства и, возможно, близкой функциональной роли. Последнее подтверждалось тем, что многие, из обнаруженных иммуногомологов, подобно ГП400, положительно реагировали на тепловой шок, то есть, в условиях гипертермии их синтез и экспорт в культуральную среду стимулировался.

3 4 5 6,

10 1'

66 -45

24 25 26 I7 25 29 30. 31 32 33 3435 .36 37 3S 3S 40 41 42 43 44,

Рис. 8. Иммуноблоттинг секреторных белков аскомицетных дрожжей. Электрофорез в 10% ДсИа-ПААГ. Для выявление иммунореактивных полос использовали афинно-очищенные антитела против средней (135 кДа! субъединицы ГП400. Т - типовые штаммы. 1. Saccharomyces cerevisiae D-32, 2. S. cerevisiae VKM Y-2609, 3. S. cerovisiac VKM Y-375T, 4. S. bayanus VKM Y-1146 ,5. S. bayanus VKM Y-349T, 6. S. paradoxus VKM Y-2472, 7. S. paradoxus VKM Y-483, 8. S. pastorianus VKM Y-507T, 9. S. unisporus VKM Y-597T , 10. S. kluyveri VKM Y-1295T, 11. S. dairensis VKM Y-412T, 12. S. exiguus VKM Y-1147T, 13. Torulaspora delbrueckiiVKM Y-706 , 14. Zygosaccharomyces rouxii VKM Y-866T ,15. Arxiozyna telluris VKM Y-1021 , 16. Pacytichispora transvaalensis VKM Y-521, 17. Kluyveronyces polysporus VKM Y-1524T, 18. Dekkera bruxettensis

VKM Y-20 , 19. Wickerhamiella domercqiae VKM Y-724, 20. Yarrowia lipo*lytica VKM Y-47, 21. Debaryomyces hansenii VKM Y-116T, 22. Guilliermondeila selenospora VKM Y-131T, 23. Citeromyces matritensis VKM Y-1247, 24. Hanseniaspora valbyensis VKM Y-138T, 25. Sporopachydermia lactativora VKM Y-1647, 26. Pachysolen tannophilus VKM Y-274T, 27. Nematospora coryli VKM Y-271T, 23. Winged robertsii VKM Y-1500T, 29. Lipomyces starkeyi VKM Y-219T, 30. Wickerhamia fluorescens- VKM Y-1465T, 31. Lipomyces Xipofer VKM Y-218T , 32. Stephanoascus ciferrii VKM Y-1440, 33. Issatchenkia orientalis VKM Y-184, 34. Pichia membranaefaciens VKM Y-299T, 35. Arthroaacus javanensis VKM Y-2156T , 36. Lodderomyces elongispprus VKM Y-426T, 37. ■Ambrosiozyma monospora VKM Y-2202T, 38. Wadsonia elongata var. fulvescens VKM Y-2532T, 39. Saccharomycodes ludwigii VKM Y-626, 40. Metschnikowia australis VKM Y-2670T, 41. Schwanniomyces occidentalis VKM Y-673T, 42. Saccharomycops-is capsularis VKM Y-1066, 43. Pichia guilliermondii VKM Y-1256T, 44. P. angusta VKM Y-2559T, 45. Schizosaccharomyces pombe VKM Y-658T.

Рис. 9 . Иммуноблоттинг секреторных белков дрожжей после электрофореза в нативном ПААГ (градиент 5-20%). Для выявления иммунореактивных полос использовали аффинно-очищенные антитела против средней (135 кД) субъединицы ГП400. 1. Saccharomyces cerevisiae D-32, 2. S. eerevisiae BKM Y-2609, 3. S. cerevisiae BKM Y-375T, 4 S. paradoxus BKM Y-483, 5. S. bayanus BKM Y-1146, 6. S. pastorianus BKM Y-507T, 7. Torulaspora delbrueckii BKM 706, 8. Zygosaccharomyces rouxii BKM Y-866T, 9. Kluyveromyces polysporus BKM Y-1524T.

3.4. Три типа реакций дрожжевых клеток на тепловой шок. При проверке клеток различных штаммов дрожжей на их способность синтезировать и экспортировать в культуральную среду белки, иммуногомологичные ГП400 было обнаружено , что не все дрожжи, образующие иммунореактивные белки, одинаково реагируют увеличением их экспорта в ответ на повышение температуры культивирования. По характеру ответа на тепловой шок, изученные дрожжи можно разделить на три группы. К первой группе мы относим штаммы, у которых в стрессовых условиях наблюдается резкое накопление СБТШ в культуральной среде (рис. 10-1). Во вторую группу входят штаммы с отрицательной реакцией, то есть те, у которых в ответ на тепловой шок содержание иммунореактивных белков в культуральной среде снижается (рис. 10-П). И, наконец, третью группу составляют штаммы с неопределенной , практически нулевой, реакцией на тепловой шок (рис. 10-Ш).

Предложенное нами деление весьма условно и требует дальнейшей доработки. Можно ожидать, что при более тщательном изучении, а именно, при точном определении оптимальной и стрессовой температуры для каждого из взятых штаммов, может произойти перегруппировка, в особенности у штаммов с нулевой реакцией.

В то же время, обнаруженное разнообразие реакций на одно и то же воздействие (тепловой шок), а также видимое отсутствие СБТШ у некоторых дрожжей, вряд ли служит в пользу их участия в определении устойчивости дрожжевых клеток к температурному стрессу, как было предположеночдля 5.сегеугэгае [3]. Заметим, что наши попытки найти разницу в отношении к температуре культивирования у клеток дикого штамма и штамма с нефункциональным геном, кодирующим ГП400 не имели успеха. К этому же можно присовокупить отсутствие прямой корреляции между температурным оптимумом роста дрожжей (например, для термотолерантных - Н.роХутогрка - 37° и мезофильных -5. сегеугзгае - 29°) и содержанием СБТШ. По нашей оценке максимальное содержание СБТШ у й.роХутогрка приблизительно в три раза ниже содержания ГП400 у Б.сегергэгае В32. i it in

К Ш КШКШКШКШ КШКШКШКШ к Ш К Ш К Ш К ш

1 2 3 4 5 6 7 а

Рис. 10. Три типа реакций дрожжевых клеток на тепловой шок. I. 1 - Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-2609. 2 - S. cerevisiae ВКМ Y-375T. 3 - S. bayanus ВКМ Y-349T. 4 - S. unisporus ВКМ Y-597T. 5 - Hansenuta polymorpha ВКМ Y-2559T. II. 6 - S. bayanus ВКМ Y-1146. 7 - 'S. pastorianus BKM Y-507T. 8 - S. exiguus BKM Y-1147T. 9 - Pichia guilliermondii BKM Y-1256T. III. 10 - S. paradoxus BKM Y-2472. 11 - S. paradoxus BKM Y-483. 12 - S. dairensis BKM Y-412T, 13 - S. kluyveri BKM Y-1295T. К - 24° (контроль), Ш - 37° (тепловой шок). Электрофорез с последующим иммуноблоттингом. Поликлональные антитела против ГП400.

3.5. Биохимическая характеристика СБТШ . Как было отмечено выше, секреторные белки подобные ГП400 до нас обнаружены не были. Позже были идентифицированы гены белков, чей синтез и секреция стимулировались тепловым шоком [3, 4]. Однако, только в работе [5], был охарактеризован сам белок Р150 дрожжей S.cervisiae. Изучение биохимических свойств ГП400 и его гомологов было начато нами сразу после их обнаружения.

3.5.1. СБТШ ГП400 дрожжей S.cerevisiae. Определение биохимических свойств ГП400 показало , что он является 440 кДа гликопротеином (нативная форма) из чего следует, что в его состав могут входить три субъединицы в различном сочетании. Дегликозилированные субьединицы имели мол. массу 41 и 52 кД (табл. 2, рис. 6 В).

Углеводная часть ГП400 составляла около 50% массы молекулы и

Таблица 2.

Свойства ГП400 дрожжей S.cerevisiae Д32.

Молекулярная масса нативного белка (кДа) Изоэлектрическая точка (рН) Субъединичное строение Дегликозилированные субъединицы Тип гликозирования Содержание углеводов Преобладающие аминокислоты, (%) Локализация

4,5-4,

Гетеротример ( 115,135,150* кДа)

41 и 52 кДа О-Маннозилирование ~ 50%

Thr - 13, 9; Ser - 9,0; Ala - 9, 9 > 90% в культуральной среде Субъединица 150 кДа обнаружена не у всех штаммов сахаромицетов. состояла из остатков маннозы, присоединенных к белковой части только 0-гликозидными связями. Последнее следовало из того, что: 1) N-ацетилглюкозамин в составе ГП400 отсутствовал; 2) обработка клеток туникамицином не влияла на молекулярную массу ГП400; 3) обработка препарата ГП400 эндогликозидазой H не изменяла молекулярной массы гликопротеина.

В аминокислотном составе ГП400 доминировали Ser и Thr , которые вместе с Ala и Glu/Gin составляли более 50 % белка (табл. 3). От других секреторных белков (КФ, инвертаза, глюканаза) ГП400 отличался выраженной гидрофобностью.

Субъединичный состав ГП400 у различных штаммов сахаромицетов варьировал (рис.11). У штамма Д32 обнаруживалась легкая (115 кДа) и средняя (135 кДа) субъединицы, тогда как у других штаммов преобладала тяжелая субъединица (150 кДа). Вариации в субъединичном составе не влияли существенным образом на электрофоретическую подвижность нативного белка

Методами перекрестного иммуноанализа и пептидного картирования была показана высокая степень гомологии между субъединицами ГП400.

Таблица 3.

Аминокислотный состав ГП400 дрожжей Б. сегеу!згае Д

Аминокислота % Аминокислота %

А1а 9,9 0,

Абп/Абр 7.6 Уа1 5,

Н1Б 0,7 Иу 3,

Б1п/а1и 12,7 Не 6,

Ьеи 3,5 ЬуБ 5,

Ме1 0,3 Рго з,

8ег 9,0 Туг 2,

Т11Г 13,9 Тгр н. о.

Р1ю 1,7 Суб(1/2) 0,

И СИ Ас 0,

Рис. И. Вариации субъединичного состава ГП400 у различных штаммов сахаромицетов: 1- Б. сегеугзгае 032, 2-"-" АН216, 3-"-"- Х2180-1 В, 4-"-"- ЬВ1-16А, 5- "-"- 24579, 6- "-"- 20В12, 7-3. 4еггез4ггз, 8-5. carlsbergensls.

3.5.2. Процессинг, внутриклеточный транспорт и локализация ГП400. С помощью аффинно очищенных антител к ГП400 нами было изучено его распространение среди сахаромицетных дрожжей и субклеточная локализация. Он был обнаружен в среде роста всех исследованных дрожжей рода ЗассНаготусев, независимо от их типа спаривания и плоидности . В гомогенате клеток диких штаммов сахаромицетов белки, реагирующие с антителами к ГП400 либо не выявлялись, либо обнаруживались в следовых количествах, что говорило как о высокой скорости секреции, так и, очевидно, о необычном способе внутриклеточного транспорта ГП400.

Проследить внутриклеточный путь, равно как и определить промежуточные молекулярные формы ГП400 оказалось возможным у температуро-чувствительных секреторных (эес) мутантов . С их помощью мы показали , что начальная стадия гликозилирования ГП400 осуществляется в ЭР. Это следовало из анализа клеток мутанта 5. сегергз1ае зес18, у которого секреция блокирована на уровне ЭР. ГП400 накапливался в клетках этого мутанта во фракции ЭР в виде не полностью гликозилированного предшественника с молекулярной массой субъединиц 95 кДа (рис. 12, дор. 2). — —! \--sec?- — '.

200 - £ , , 116-1 "* .*

97 - т

66 - 1;

§й|1йШ ШМ 200 " — - || М

-зес!---- !—5ЕС+

Рис. 12. Процессинг ГП400 у вес мутантов. 1, 5, 11, 15 -гомогенат, 24°; 2, 6, 12, 16 -/- 37°; 3, 7, 9, 13 - культуральная среда, 24°; 4, 8, 10, 14 -/- 37°. Контроль-8ЕС+ 5. сегеугэгае 032.

В клетках мутантов вес! и зесб, у которых блокировано взаимодействие секреторных везикул с плазмалеммой, обнаруживалась зрелая форма ГП400 (рис. 12, дор. 12).

Неожиданно мы обнаружили, что у мутанта эес7-1, накапливающего секреторные белки в цистернах АГ, экспорт ГП400 не блокировался (рис. 12, дор. 8). Этот факт явился прямым указанием существования иного способа выведения белка из дрожжевой клетки, по сравнению с конститутивным.

Учитывая важность обнаруженного факта мы тщательно проверили все доступные sec7 мутанты (RSY300 , sec7-4, й-тип спаривания и RSY301, secT-4, а-тип спаривания) на способность экспортировать ГП400 при рестриктивной температуре и дополнительно убедились в том , что выход ГП400 из клеток нечувствителен к указанной мутации. Все это создало возможность использования ГП400 в качестве специфического маркера экспортного потока дрожжей.

Как было сказано выше, в норме ГП400 не накапливался внутри клеток дикого типа. Однако, при блокировке секреции у мутантов seel или sec6 этот белок накапливался в секреторных везикулах. Необходимо было выяснить, является ли ГП400 компонентом ранее охарактеризованных везикул конститутивного пути или его транспорт осуществляется в везикулах другого типа.

С этой целью везикулы, накапливающиеся при 37° были получены препаративно и разделены двумя различными способами: равновесным центрифугированием в линейном градиенте плотности сахарозы и гель-фильтрацией на сефакриле S1ООО (рис. 13, 14).

Конститутивные секреторные везикулы идентифицировали по активности КФ и по наличию в них маркерного гликопротеина gpllO . Дополнительным , кроме ГП400, маркером экспортных везикул служил гормон роста человека (ГР), секрецию которого направлял препросегмент дрожжевого феромона - й-фактора.

Как видно из рис. 13, два маркерных белка - КФ и ГП400 были сосредоточены в разных мембранных фракциях, значительно различающихся по плотности.

Дополнительные доказательства существования двух популяций секреторных везикул были получены и с помощью второго метода -гель фильтрации (рис. 14) В этом случае достигалось более четкое разделение КФ и ГП400. Кроме того, конститутивные секреторные везикулы, несущие КФ были обогащены по gpllO (рис. 15), но не содержали ГП400.

Забегая немного вперед, отметим, что с популяцией везикул, содержащих ГП400 был ассоциирован ГР (рис. 14). Присутствие ГП400 и ГР в отдельной фракции везикул было показано нами и иммуноцитохимическим методом, о чем будет сказано в следующей главе, посвященной экспрессии/секреции ГР под контролем регуляторных элементов гена дрожжевого феромона - й -фактора. Здесь же заметим, что совместная локализация ГР и ГП400 говорила о возможной связи последнего с КЕХ2 компартментом, сосредоточенным в транс-АГ и содержащим максимальную активность

- 34 -А

Фракции

Рис. 13. Распределение ГП400 во фракциях после центрифугирования в. градиенте плотности сахарозы суммарной фракции везикул мутанта зесб. А - распределение ГП400 и КФ, Б -градиент сахарозы и содержание белка во фракциях, В иммуноблоттинг ГП400 во фракциях градиента, ь - исходный препарат.

-1 140 "

- 80 й 40 1ы -боЗ, 30 с -40*- 20 а. Е

О 30 о с: с-, со сл

ГП400 - |

Рис. 14. Профиль элюции мембранных везикул при гельфильграции на колонке с Сефакрилом БЮОО и распределение маркерных активностей.

КЕХ2 протёазы, участвующей в процессинге препро-ГР. Однако, мы не обнаружили какой либо зависимости процессинга и экспорта ГП400 от мутации по КЕХ2. Это могло указывать на то, что несмотря на предполагаемое наличие у ГП400 сайта процессинга КЕХ2 протеазой, он либо нефункционален, либо процессинг осуществляется другой, аспарагиновой протеиназой (YAP), присутствующей в том же компартменте [6].

Рис. 15. Белковый спектр везикул, после разделения на Сефакриле S1000 (рис. 14). 1- фракция 28, 2- фракция 22. Стрелки - ГП400 и gpllO соответ.

Таким образом, на основании результатов, изложенных выше, было сделано заключение о том, что ГП400 и, возможно, другие экспортируемые белки, транспортируются к плазмалемме специальными везикулами, отличными от везикул конститутивного пути секреции.

3.6. Биохимическая характеристика секреторного белка теплового шока - ГП280 термотолерантных дрожжей И. polymorpha. Дрожжи Н. polymorpha, относящиеся к термотолерантным , по своей способности синтезировать и секретировать СБТШ входят в 1-ю группу с положительной реакцией. То есть, в условиях повышенной температуры они накапливают в культуральной среде иммуногомолог ГП400 (см. рис. 10-1, 5-я пара дорожек).

Хотя для создания шоковой ситуации важно не абсолютное значение температуры, а ее перепад , изучение термотолерантных дрожжей в температурном диапазоне 24° - 37°, как это делалось для мезофильных сахаромицетов, было не совсем корректным, так-как температура 37° является оптимальной для роста Н. polymorpha. Поэтому в дальнейшем для шокирования клеток мы использовали перепад 37° - 49°. В этих условиях синтез и секреция "обычных" (не стрессовых) белков снижались, в то время как содержание СБТШ в культуральной среде увеличивалось (рис. 16 А, Б), что служило проявлением реакции клеток на тепловой шок. 0 том же свидетельствовало увеличение содержания белков с молекулярной массой "70 кДа (БТШ 70) внутри клеток (рис.16 В). Методом иммуноблоттинга иммунореактивных белковых полос в клеточных лизатах обнаружить не удавалось, что с учетом их накопления в среде указывало на чрезвычайно быстрое выведение СБТШ из клеток. ЧМНг ^^Ifr''- I щиилш!

Штт «пв.

StSS «ПК ш

Рис.16. Секреция белков у Н. polymorpha при различных температурах. Инкубация клеток в течение 60 мин. Электрофорез в 30% DsNa-ПААГ. А - окрашивание Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB), СБТШ не выявляется. Б - иммуноблоттинг с идентичного "А" геля. Стрелкой указана позиция СБТШ. Поликлональные антитела против ГП400. В - внутриклеточные белки. Окраска СВВ, стрелкой указана позиция БТШ70.

Выделить СБТШ возможно только из культуральной среды, так-как в клетках они не накапливаются. Использованные нами приемы для выделения ГП400 не вполне подходили для СБТШ Н.polymorpha, во первых потому, что его содержание в среде значительно ниже, чем ГП400 (в начале стационарной фазы роста максимальное содержание ГП400 - 10 мг/л , тогда как СБТШ Н.polymorpha - около 3 мг/л среды), во вторых, он заметно менее стабилен.и плохо выдерживает стандартные приемы ультрафильтрации, гельфильтрации, ионообменной и афинной хроматографии. Поэтому для его выделения мы применили сочетание электрофореза и электроэлюции. С помощью такого подхода мы получили 300 мкг/л электрофоретически гомогенного препарата, который, помимо характеристики, был использован и для получения поликлональных антител.

На рис. 17 показаны результаты электрофореза и иммуноблоттинга суммарного препарата белков культуральной среды и чистого белка, полученного с помощью электроэлюции. Расчет молекулярной массы по подвижности при электрофорезе в 10% ДсИа-ПААГ давл значение 135 кДа. При электрофорезе в

Рис.17. Выделение электрофоретически гомогенного препарата СБТШ ГП280 дрожжей Н. роХутогрНа. 1 - исходный суммарный препарат белков, секретируемых в культуральную среду, 2 - препарат ГП280, полученный путем электроэлюции. Иммуноблоттинг после разделения в 10% ДсИа- ПААГ Поликлональные антитела против ГП280. 3 - то же, что и 1, н :раска азотнокисл' серебром. Стрелкой указана позиция субъе,. (135 кДа) СБТШ ГП280. Числа справа - кДа. неденатурирующих условиях иммунореактивный белок двигался в виде сильно размытой зоны (рис. 18 Б), характерной для гликопротеинов, что затрудняло достоверную оценку молекулярной массы нативного белка. По нашим расчетам её среднее значение равно 280 кД . Это дает основание предположить, что нативный СБТШ содержит две идентичные субъединицы. По аналогии с ГП400, СБТШ Н.ро1утогрка на основании молекулярной массы нативного белка условно обозначен нами как ГП280.

Принадлежность к гликопротеинам следовала из способности ГП280 связываться с кон А и положительной реакции с реактивом Шиффа . Учитывая сходство строения гликопротеинов аскомицетных дрожжей, а именно, принадлежность большинства из них к смешанному типу , содержащих как И- , так и 0-связанные олигоманнозиды, мы проверили ГП280 на наличие в нем И-связанных олигоманнозидов. Для этого использовали ингибитор гликозилирования - туникамицин, препятствующий образованию И-ацетилхитобиозного мостика между аспарагином полипептидной цепи и олигоманнозидной цепью. При наличии М-типа связи электрофоретическая подвижность гликопротеина должна увеличиваться в результате уменьшения молекулярной массы образующегося неполностью гликозилированного белка. Однако, в нашем случае мы не наблюдали уменьшения молекулярной массы СБТШ ГП280 (рис. 18), что говорило об отсутствии в нем М-связанных олигоманнозидов.

Рис. 18. Действие туникамицина (ТМ) на секрецию СБТШ Н.роЬутогрка. Инкубация 60 мин. А - 102 ДсИа-ПААГ, окрашивание азотнокислым серебром. 1 - контроль, 2 - ТМ (10 мкг/мл), стрелкой указана позиция субъединицы (135 кДа) ГП280. Числа справа - кДа.

Б - иммуноблоттинг после электрофореза (10 % ПААГ) в нативных условиях: 1 - контроль, 2 - ТМ. Афинно-очищенные поликлональные антитела против ГП400.

3.7. Динамика индукции синтеза и секреции ГП280 тепловым шоком. При инкубации клеток й. роХутогрка в условиях гипертермии наблюдалось быстрое накопление ГП280 в культуральной среде на фоне торможения синтеза и секреции не стрессовых белков . Судя по результатам электрофореза, уже через 10 мин содержание СБТШ достигало насыщения (рис. 19 Б), тогда как в контроле накопление наблюдалось в течение всего периода инкубации (рис. 19 А).

Более тщательное наблюдение за динамикой экспорта ГП280 показало, что нарастание его содержания заканчивается уже примерно через 5 минут инкубации (рис. 19 В). Подобная картина характерна для многих термоиндуцируемых стрессовых белков и СБТШ в этом смысле не являются исключением.

По всей очевидности ГП280 также эффективно, как и ГП400, экспортируется из клеток в культуральную среду. Исследованный нами штамм й.роЬутогрЬа не накапливал СБТШ внутри клеток в с í

Рис. 19. Динамика индукции экспорта ГП280 в норме и при тепловом шоке. А - 37° (контроль), Б - 49° (тепловой шок), В -49°. 10% flcNa-nAA'r, окрашивание азотнокислым серебром. Стрелкой показана позиция ГП280. количествах, определяемых иммуноблоттингом. Скорость же накопления ГП280 в культуральной среде в условиях стресса чрезвычайно высока. Его выход из клеток можно зарегистрировать уже через минуту инкубации при повышенной температуре. Подобная картина характерна и для ГП400. Все это еще раз убеждает в существовании особого механизма внутриклеточного транспорта и прохождения СБТШ сквозь дрожжевую оболочку

ГП280 обладает и другими, сходными с ГП400 свойствами. Так, несмотря на различную молекулярную массу нативных молекул, масса субъединицы ГП280 (135 кДа) совпадает со средней субъединицей ГП400. Однако, в отличие от последнего, чей субъединичный состав имеет штаммовые вариации и может включать в себя три неидентичные субъединицы (115, 135 и 150 кДа), ГП280 состоит из двух идентичных полипептидов. Проверка другого штамма - Н.polymorpha DL1 (ауксотроф по лейцину ) - дала идентичные результаты.

По всей очевидности, ГП280 имеет сходный с ГП400 и другим известным СБТШ PI 50 [4] тип гликозилирования, у которых маннозильные остатки связаны только с остатками серина (треонина) полипептидной цепи 0-гликозидными связями. Такое заключение сделано на основании отсутствия эффекта ингибитора N-гликозилирования - туникамицина в отношении молекулярной массы ГП280. Пока не определена степень гликозилирования ГП280 . Известно, однако, что отношение белок/углевод в молекуле ГП400 и PI50 равно приблизительно единице. Мы полагаем , что не у всех

СБТШ это соотношение одинаково. Об этом говорит резкое различие .в компактности белковых зон у некоторых СБТШ при электрофорезе.

В настоящий .момент мы располагаем определенной информацией,. позволяющей говорить о том, что ГП400 идентичен открытому несколько позже СБТШ Р150 [4], кодируемому PIR2 геном [3]. Такое утверждение основано на результатах, полученных в лаборатории проф. В. Таннера (Регенсбургский ун-т, Германия), показавших, что антитела выработанные против ГП400, реагируют с продуктом гена PIR2 и белком Р150 (W. Tanner, персональное сообщение. Антитела к ГП400 были получены от нас). В указанной лаборатории успешно исследуются мутанты по О-гликозилированию и в этом отношении ГП400 является идеальным белком для изучения влияния О-гликозилирования на свойства белков и эффективность их экспорта из дрожжевых клеток [71.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Циоменко, Арнольд Борисович

ВЫВОДЫ

1. Интактные клетки дрожжей способны активно экспортировать в окружающую среду белки, размер которых выше размера пор клеточной стенки. Транслокация белков происходит через микроучастки аномальной проницаемости клеточной оболочки.

2. Обнаружены секреторные белки чей синтез и экспорт из клеток в окружающую среду стимулируются в условиях теплового шока. Эти белки широко распространены у аскомицетных дрожжей и представляют собой новый тип стрессовых белков. Основным местом их локализации является клеточная оболочка и окружающая среда.

3. По характеру ответа на тепловой шок, проявляющемуся в способности синтезировать и экспортировать секреторные белки теплового шока, дрожжи делятся на три группы: 1-е положительной, II - отрицательной и III - неопределенной реакцией на тепловой шок.

4. Секреторные везикулы переносящие белки между аппаратом Гольджи и плазмалеммой неоднородны. Среди них существует популяция, отличная по свойствам от везикул конститутивного типа. Эта популяция содержит стрессовые белки и функционирует в экспортном потоке.

Изучена роль препросегмента а-фактора в секреции гетерологичного - гормона роста человека и гомологичного - кислая фосфатаза , белков,Показано, что N-концевые сигнальные пептиды , сами по себе, не способны обеспечить эффективный экспорт этих белков. Только сочетание сигнального пептида и просегмента в качестве N-концевого фрагмента обеспечивает их экспорт . Интактность полиманнозидных цепей просегмента d-фактора имеет критическое значение для эффективного экспорта рекомбинантных белков.

7. Секреторные белки, движущиеся по общему секреторному пути, на поздней стадии секреции делятся на два потока -периферийный и экспортный. Последний определяет способность дрожжевой клетки реагировать на внешние факторы путей экспорта определенных белков, в чем проявляется одна из функций секреторной системы в обшей реакции дрожжевой клетки на действие внешних факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все живые клетки располагают специальными сенсорными, сигнальными и транспортными системами, с помощью которых, с одной стороны, они воспринимают, расшифровывают и реализуют информацию на молекулярном уровне, поступающую из окружающей среды, а с другой, сами выделяют вещества, влияющие на внешнее окружение. В результате происходит тонкая настройка клеточного метаболизма, регуляция роста и развития в постоянно изменяющихся условиях среды . обитания. . В число внешних факторов , влияющих на "молекулярную коммуникацию" в'ходят питательные вещества, другие разнообразные химические и физические факторы.

Внутриклеточные факторы, в частности белки и пептиды, обладающие той или иной биологической активностью . и способные экспортироваться из клеток, широко изучаются. Важно, однако, иметь ясное представление не только об их свойствах но и о механизмах их экспорта из клеток.

Микроорганизмы стали первыми, широко используемыми объектами в качестве фабрик для получения самых разнообразных белков в секретируемой форме [1,2]. По многим причинам дрожжи особенно привлекательны в этих целях. Прежде всего, это простота культивирования , огромный опыт их промышленного использования и наиболее полная генетическая изученность. Все это позволяет отнести дрожжи к легко доступным для всевозможных манипуляций эукариотам [3].

Отличительной чертой всех грибов, и дрожжей в частности, является наличие у них клеточной стенки. Традиционный взгляд на клеточную оболочку в целом, сформировался именно на основании работ, посвященных изучению структуры и свойств клеточной стенки. В результате укоренилось мнение о клеточной поверхности, отождествляемой с клеточной стенкой, как о механически прочном, имеющем ограниченную проницаемость, защитном барьере клетки. В то же время мы получили неоспоримые доказательства активного выхода некоторых белков из клетки , а также их входа внутрь оболочки через интактную клеточную поверхность. Такая возможность реализуется вследствие структурной неоднородности клеточной стенки. Ее большая часть непроницаема для макромолекул и осуществляет защитные функции. Другая, меньшая часть, представляет собой микроучастки с аномальной, по сравнению с основной долей стенки, проницаемостью . Эти микроучастки, определенным образом изолированные от периплазмы, образуют коммуникационные зоны, через которые осуществляется регулируемый обмен макромолекул между внутриклеточной и внешней средой. Изолированность микроучастков создаёт возможность прохождения белков через клеточную оболочку минуя периплазму.

Внутриклеточный транспорт белков происходит в мембранных контейнерах различного типа, различающихся поверхностными белками [4] . Однако до недавнего времени вопрос о существовании одного или нескольких типов секреторных везикул, участвующих в терминальной фазе секреции оставался открытым. Лишь в одной работе [5], появившейся гораздо позже наших исследований, были получены дополнительные свидетельства существования двух типов везикул - тяжелых и легких.

Считается, что транспорт растворимых секреторных белков на периферию дрожжевой клетки происходит по умолчанию, то есть, не требует наличия у них топогенных сигналов. Мы придерживаемся противоположного мнения, считая что экспорт белков из дрожжевой клетки процесс специфичный. Не любой секреторный белок, направляющийся к периферии, может быть "выброшен" из клетки. Большинство секреторных белков, оказавшись в периферийном потоке, попадают в клеточную оболочку и распределяются там в соответствии со своим предназначением. Существенная часть белков экспортируется из клетки. Как и для доставки в другие клеточные компартменты, для выхода в окружающую среду необходим специальный (экспортный) сигнал. У одних белков этот сигнал может содержаться в самой структурной последовательности. У других существует вспомогательная топогенная последовательность, направляющая их к месту функционирования. Как показано нами, такой последовательностью, является просегмент «-фактора.

Рис. 31. Схема дрожжевой секреторной системы. Я - ядро, В -вакуоль, ЭР - эндоплазматический ретикулюм, АГ - аппарат Гольджи, ВВ - везикулы вакуолярного потока, ВП - везикулы периферийного потока, ВЭ - везикулы экспортного потока, ЦПМ цитоплазматическая мембрана , ПП - периплазма, КС - клеточная стенка, КО - клеточная оболочка, МАП - микроучасток аномальной проницаемости.

За последние годы картина секреции белков у дрожжей значительно обогатилась благодаря открытию разветвлений общего секреторного потока, а также "неклассических путей" секреции [6, 7]. Выдвинутое нами и подтвержденное экспериментально существование экспортного потока, явилось серьезным вкладом в прогресс представлений о секреции белков у дрожжей. Полученные в работе результаты позволили дополнить существующую картину секреторного процесса у дрожжей. Схематически она представлена на рис. 31.

Функционирование экспортного потока дает возможность клетке, не теряя защитных свойств клеточной стенки, осуществлять взаимодействия с другими клетками, факторами внешней среды, модифицировать труднодоступные высокополимерные питательные субстраты путем экспорта соответствующих ферментов.

Наконец, еще одним достижением представленной работы является обнаружение нового семейства стрессовых белков - СБТШ. Интересно отметить, что белки теплового шока обнаружены практически в любом внутриклеточном компартменте. Совсем недавно была показана локализация БТШ70 в клеточной стенке дрожжей [8]„ Однако, мы впервые показали существование внеклеточных стрессовых белков. Пока окончательно неясна функция обнаруженных СБТШ, экспортируемых в ответ на тепловое воздействие. Судя по полученным нами результатам они демонстрируют рекордную скорость секреции, что предполагает их принадлежность к некой системе "быстрого реагирования" и подчеркивает возможную физиологическую значимость. На это указывают и упоминавшиеся выше работы, дающие основание отнести СБТШ к системе неспецифического, или общего ответа на стресс. Если . это так, то интерес к этому новому семейству стрессовых белков несомненно будет расти, так как устойчивость к стрессу, одна из наиболее острых проблем биологии в целом и биотехнологии дрожжей в частности [9].

Цитированная литература.

1. Несмеянова М. А. 1990. Молекулярные механизмы секреции белков у бактерий . ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Серия биотехнологии, 22, 1-187.

2. Kingsman S. M., Kingsman A. J., Mellor J. 1987. The production of mammalian proteins in Saccbaromyces cerevisiae. TIBTECH, 5, 53-57.

3. Brock biology of microorganisms. 1997. Eighth edition, part II,. pp. 774-777. Eds. M. T. Madigan, J. M. Martinko, J.Parker. Prentice Hall, NJ 07458.

4. Lupashin V. V., Waters M. G. 1997. t-SNARE activation through transient interaction with a Rab-like guanosine triphosphatase. Science, 276, 1255-1258.

5. Harsay E., Bretscher A. 1995. Parallel secretory pathways to the cell surface in yeast. J.Cell Biol., 131, 297-310.

6. Muesh A., Hartmann E., Rohde K., Rubartelli A., Sitia R., Rapoport T.A. 1990. A novel pathway for secretory proteins? TIBS, 15, 86-88.

7. Cleves A.E. 1997. Protein transport: The nonclassical ins and outs. Current Biol., 7, R318-R320.

8. Lopez .J. L., Chaff in W.LaJ. 1996. Members of the Hsp70 family of proteins in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J . Bacteriol., 178, 4724-4726.

9. Attfield P. V. 1997. Stress tolerance: The key to effective strains of industrial baker's yeast. Nature Biotechnology, 15, 1351-1357.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук в форме науч. докл. Циоменко, Арнольд Борисович, 1998 год

1. Кулаев И. С., Циоменко А. Б. Секреция белков у эукариотических микроорганизмов. Сб. Проблемы биохимии и физиологии микроорганизмов. Пущино, 176-183, 1985.

2. Эльдаров М. А., Морзунов С. П., Рубцов П. М., Парсаданян А. Ш., Циоменко А. Б., Кулаев И.С., Скрябин К.Г.,Баев А.А. Экспрессия и секреция в клетках дрожжей соматотропного гормона человека. Тез.V ВБС, т. 1, 149-150, 1985.

3. Eldarov М. А., Morzunov S. Р., Rubtsov Р. М., Tsioraenko

4. A. В., Parsadanyan A.S. ,Kulaev I. S., Skryabin K.G., Bayev A. A. Expression of the human growth hormone gene in yeast. Abstr. X Int. Symp. Yeast. Varna, Bulgaria, 81,1985.

5. Eldarov M. A., Karpychev I. V., Morzunov S. P., Tchernov

6. B.K.,Rubtsov P.M. .Tsiomenko A. B.,Kulaev I. S., Skryabin K. G., Bayev A. A. Synthesis and secretion of mammalian proteins in yeasts.Abstr.7-th German-Soviet Symp."Org. and function of the eucaryotic genome", 1, Heidelberg, FRG, 1987.

7. Tsiomenko A. B., Lupashin V. V., Kulaev I.S. Export of enzymes into culture medium by yeasts of Saccharomyces genus.In:"Extracellular enz.of microorg". Plenum Press, NY-London, 205-208, 1987.

8. Циоменко А.Б. ,Лупашин В. В., Дмитриев В. В., Кулаев И. С.Проницаемость клеточной стенки и экспорт белков в культуральную жидкость у Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 56,5,797-804, 1987.

9. Скрябин К. Г., Циоменко А. Б., Морзунов С. П., Карпычев И. В., Лупашин В. В. . Эльдаров М. А., Рубцов П. М,, Кулаев И. С., Баев А.А. Синтез и секреция гормона роста человека у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биотехнология, 3, 3, 312-318, 1987.

10. Intracellular distribution of heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae depends on the type of N-terminal signal peptide. Yeast, v. 4, S455, 1988.

11. Lupashin V. V., Stavitskaya Y. E., Karpychev I.V., Eldarov M. A., Tsiomenko A.B. Optimal conditions for gomologic and heterologyс protein export by Saccharomyces cerevisiae. 34-th Int.congr. of Biochem., v. 2, 70, Prague , 1988.

12. Лупашин В. В., Циоменко А. Б. ,Кулаев И. С. Действие конканавалина А на секрецию ферментов у клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Сб. "Изучение и применение лектинов", т. 2, 31-38, Тарту, 1989.

13. Циоменко А.Б. Секреторная система дрожжей и возможный механизм экспорта белков в окружающую среду. Сб. "Актуальные проблемы биохимии эукариотов и прокариотов", 74-90, Пущино, 1990.

14. Лупашин В. В., Кононова С. В., Ратнер Е. Н., Циоменко А. Б., Кулаев И.С. Новый секретируемый белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, стимулируемый тепловым шоком. ДАН СССР, 317, 5, 1257-1260, 1991.

15. Tsiomenko A.B. Biochemical and cytological approaches in the study of yeast protein secretion. Abstr. 15-th Int.Symp. on Yeast ,81, Riga, 1991.

16. Циоменко А.Б.,Мусаев Д. III., Лупашин В. В., Кулаев И. С. Секретируемая альфа-амилаза базидиомицетных дрожжей Filobasidium capsutigenum. Выделение, очистка и характеристика фермента. Биохимия, 57, 3, 444-451, 1992.

17. Lupashin V. V., Kononova S. V., Ratner E. N., Tsiomenko

18. A. B. ,Kulaev I.S. Identification of a novel secreted glycoprotein of the yeast Saccharomyces cerevisiae stimulated by heat shock. Yeast, 8, 3, 157-169, 1992.

19. Ушаков В. M., Циоменко А. Б., Туйметова Г.П.,Лупашин

20. B. В. ,Кулаев И. О. Способ извлечения инвертазы из дрожжевых клеток в процессе их культивирования. Биотехнология, 1, 43-45 ,1992.

21. Диеров Ж. X. ,Луста К. А., Циоменко А.Б.,Кулаев И. С. Электронно-иммуноцитохимическая идентификация субклеточных структур, участвующих в экзоцитозе липаз гриба Shizopus microsporus. Докл. РАН , 328, 6, 740-743, 1993.

22. Диеров 1. X., Циоменко А. Б., Давранов К. Д., Кулаев И. С. Гидрофобная хроматография и характеристика секретируемых липаз гриба Shizopus microsporus' УзЛТ-4В. Биохимия, 58, 7, 979-986, 1993.

23. Диеров Ж. X., Циоменко А. Б., Давранов К. Д., Кулаев И. С. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Shizopus microsporus. Биотехнология, 7,26-30, 1993.

24. Kononova S. V., Tsiomenko A. B., Golubev V. I. Extracellular glycoprotein specific for Saccharomyces sensu stricto. FEMS Microbiology Letters, 113, 77-80, 1993.

25. Циоменко А. Б., Туйметова Г. П., Зльдаров М. А., Королев

26. C. В. .Скрябин К. Г., Кулаев И. С. Просегмент дрожжевого й-фактора направляет гетерологичный белок (гормон роста человека) в культуральную среду Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 59,11, 1675- 1682, 1994.

27. Diyorov J. К., Lusta К. А., Tsiomenko А. В., Kulaev I.S. Molecular forms of lipases and their localization in the fungus Bhizopus microsporus by immuno-electron microscopy. World J. of Microbiol, h Biotechnol., v. 10, 367-373, 1994.

28. Циоменко А.Б., Туйметова Г. П. Секреторные белки теплового шока дрожжей: новое семейство стрессовых белков? Биохимия, 60, 6, 837-842, 1995

29. Циоменко А. Б., Плеханов П. Г, Туйметова Г. П., Кононова С. В. Секреторный белок теплового , шока термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha. Идентификация и сравнительная характеристика. Биохимия, 62, 2, 147-153, 1997.