Моделирование структурно-функциональных особенностей кожи пациентов с врожденным буллезным эпидермолизом с использованием пациент-специфических клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бейлин Аркадий Константинович

• Бейлин Аркадий Константинович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Бейлин Аркадий Константинович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и современное состояние проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна исследования

Практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Методы исследования

Степень достоверности и апробация работы

Перечень публикаций

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Врожденный буллезный эпидермолиз

1.1 Классификация типов врожденного буллезного эпидермолиза

1.2 Генетика врожденного буллезного эпидермолиза

1.3 Распространенность буллезного эпидермолиза

1.4 Диагностика буллезного эпидермолиза

1.5 Ранозаживление, фиброз и рубцевание при буллезном эпидермолизе

1.6 Нарушения коллагена VII типа при дистрофическом буллезном эпидермолизе

1.7 Нарушение сети кератиновых филаментов при простом буллезном эпидермолизе

2. Разрабатываемые варианты терапии буллезного эпидермолиза

2.1 Белковая терапия

2.2 Клеточная терапия

2.3 Редактирование генома

3. Модельные системы буллезного эпидермолиза

4. Стратификация эпидермиса

5. Эквиваленты кожи

6. Иммортализация кератиноцитов

6.1 Существующие иммортализованные линии кератиноцитов

6.2 Системы иммортализации кератиноцитов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

8.1 Методы генетического клонирования

8.1.1 Метод A/T-клонирования

8.1.1.1 Амплификация геномной ДНК

8.1.1.2 Лигирование

8.1.1.3 Химическая трансформация клеток E. coli и скрининг клонов

8.1.2 Клонирование гидовых РНК для Cas9

8.1.3 Анализ наличия инсерций и делеций

8.2 Методы культивирования эукариотических клеток

8.2.1 Общие методы культивирования эукариотических клеток

8.2.1.1 Используемые культуры

8.2.1.2 Заморозка клеток

8.2.2 Получение биопсий кожи и образцов крови

8.2.3 Выделение первичных фибробластов человека

8.2.4 Выделение первичных кератиноцитов человека

8.2.5 Условия культивирования использованных клеточных культур

8.2.5.1 Условия культивирования кератиноцитов

8.2.5.2 Условия культивирования фибробластов

8.2.5.3 Условия культивирования HaCaT

8.2.5.4 Условия культивирования HeLa и 3T3

8.2.6 Реконструкция эпидермиса человека in vitro

8.3 Методы генетической модификации культур клеток

8.3.1. Липофекция

8.3.2 Электропорация

8.3.3 Редактирование генома с помощью системы CRISPR/Cas9

8.3.4 Получение моноклональных линий клеток

8.3.5 Использованные в работе плазмиды

8.4 Пробоподготовка материалов эукариотических клеток

8.5 Методы цитологии и гистологии

8.5.1 Получение криосрезов

8.5.2 Окраска гематоксилин-эозином

8.5.3 Иммунохимическая окраска гистологических срезов

8.5.4 Иммуноцитохимическая окраска клеточных культур

8.5.5 Микроскопия

8.5.5.1 Световая микроскопия

8.5.5.2 Фазово-контрастная микроскопия

8.5.5.3 Флуоресцентная микроскопия

8.5.5.4 Конфокальная микроскопия

8.5.5.5 Анализ изображений

8.5.6 Проточная цитометрия и клеточный сортинг

8.5.7 Цитогенетический анализ

8.5.8 STR типирование

8.6 Функциональные тесты и процедуры для клеточных культур

8.6.1 Стрессовое воздействие на сеть кератиновых филаментов

8.6.2 Тест на ранозаживление

8.6.3 МТТ-тест

8.6.4 Оценка морфологии фибробластов и кератиноцитов

8.6.5 Полуколичественный анализ экспрессии при иммунофлуоресцентной окраске

8.6.6 Оценка контракции коллагенового геля фибробластами

8.6.7 Тест на туморогенность

8.6.8 Определение активности ß-галактозидазы

8.6.9 Определение пролиферации

8.6.10 Вырезание hTERT с помощью Cre

8.6.11 Анализ на микоплазму

8.7 Статистический анализ

8.8 Программное обеспечение

РЕЗУЛЬТАТЫ

9.1 Получение и анализ модели буллезного эпидермолиза простого типа на базе линии иммортализованных кератиноцитов человека HaCaT с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9

9.1.1 Геномное редактирование HaCaT и анализ полученных мутаций

9.1.2 Анализ нарушения сети кератиновых филаментов в клетках HaCaT

9.1.3 Исследование влияния фосфорилирования на агрегацию сети кератинов в клетках HaCaT

9.1.4 Миграционная активность клеток HaCaT, мутантных по кератину

9.2 Характеристика пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом

9.2.1. Описание экспериментального материала

9.2.2. Состояние здоровья и генетика РДБЭ пациентов

9.2.3. Анализ выявленных мутаций в гене col7a1 63 9.2.4 Экспрессия коллагена VII типа в коже РДБЭ пациентов

9.3 Реконструкция эпидермиса человека in vitro

9.4 Оценка иммортализации первичных кератиноцитов и фибробластов

9.4.1 Особенности использованных генетических конструкций

9.4.2 Иммуноцитохимический анализ экспрессии hTERT и BMI-1 в иммортализованных линиях клеток

9.5 Характеристика первичных и иммортализованных фибробластов, полученных от пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом

9.5.1 Характеристика линий фибробластов

9.5.2 Анализ экспрессии маркеров фибробластами

9.5.3 Анализ морфологии фибробластов

9.5.4 Анализ контракции коллагенового геля фибробластами

9.5.5 Анализ окрашивания фибробластов на ассоциированную со старением активность ß-галактозидазы

9.5.6 Анализ последствий Сге-опосредованного удаления трансгенов

9.6 Характеристика первичных и иммортализованных кератиноцитов полученных от

пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом

9.6.1 Характеристика линий кератиноцитов

9.6.2 Анализ экспрессии маркеров кератиноцитами

9.6.3 Анализ морфологии кератиноцитов

9.6.4 Анализ стратификации иммортализованных линий кератиноцитов in vitro

9.6.5 Определение пролиферативно-возрастного статуса кератиноцитов

9.6.6 Анализ туморогенности иммортализованных кератиноцитов in vivo

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

10.1 Моделирование буллезного эпидермолиза простого типа

10.2 Роль выявленных мутаций в структуре и функционировании гена col7a1

10.3 Свойства клеток, полученных от пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом

10.4 Подтверждение иммортализации клеточных культур

10.5 Сге-опосредованное удаление трансгенов

10.6 Свойства иммортализованных кератиноцитов и их стратификация

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование структурно-функциональных особенностей кожи пациентов с врожденным буллезным эпидермолизом с использованием пациент-специфических клеток»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и современное состояние проблемы

Врожденный буллезный эпидермолиз (ВБЭ) - это группа тяжелых наследственных генодерматозов. Лечение ВБЭ в настоящее время носит лишь симптоматический характер [1]. В то же время генетический характер заболеваний и современное развитие генно-инженерных и клеточных технологий требует от исследователей в области регенеративной медицины разработки современных модельных систем для изучения патогенеза и создания методов специфического воздействия на мутации. Это свидетельствует об актуальности и фундаментальной значимости проблемы, лежащей в основе исследования, и подходов к изучению механизмов ВБЭ на основе клеточного моделирования.

В России молекулярно-генетический анализ мутаций, определяющих развитие ВБЭ, проводится мало, нет официальной статистики по распространенности разных типов заболевания, в то время как на фоне общей гетерогенности популяций и этнического разнообразия существует, по всей видимости, обширное разнообразие генетических мутаций. В настоящее время во всем мире создаются базы данных, содержащие информацию о мутациях, их наследовании и патогенезе. Изучение особенностей мутационного разнообразия ВБЭ может существенным образом расширить имеющиеся мировые базы данных. Например, по данным исследования, проведенного в Краснодарском крае, частота встречаемости простых и дистрофических с полидиспластическими форм буллезного эпидермолиза за последние 10 лет увеличилась, в 2 и 7 раз, соответственно, в сравнении с данными предыдущих исследований [2; 3], что, однако, может быть связано с улучшением учета пациентов и диагностики.

Основным методами диагностики ВБЭ являются иммунофлюоресцентное картирование антигенов (ИКА) и просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), определяющие основной поврежденный белок и уровень образования пузырей в коже [4; 5]. Однако быстрое развитие методов высокопроизводительного секвенирования позволяет надеяться на то, что в будущем генетический анализ с определением типа мутации, ее локализации и типа наследования станет доступным для медицинской практики не только за рубежом, но и на территории России. Из опубликованных данных известно, что в результате секвенирования может быть уточнен или даже изменен диагноз, например, в сложных случаях смешанных форм ВБЭ [6].

Помимо диагностики и развития методов функциональной терапии существует проблема недостаточной изученности клеточных механизмов, тех искажений в нормальном функционировании каскадов реакций в клетках, которые возникают в результате мутаций ВБЭ. Больные ВБЭ часто оказываются подвержены онкологическим заболеваниям кожи, для

некоторых форм ВБЭ - это карцинома кожи, встречаются меланомы и плоскоклеточный рак. Для простой формы ВБЭ показана связь между нарушениями в кератиновой сети и способностью клеток к апоптозу - мутации в генах кератинов приводят к искажению в ответе клетки на повреждения ДНК, активации в клетках экспрессии анти-апоптотических генов [7]. Для дистрофической формы ВБЭ влияние некоторых ключевых факторов в этом процессе лишь предполагается, но еще не показано или изучено недостаточно, в частности активация TGF-P (transforming growth factor beta) сигнального пути [8]. Больные с этим типом заболевания имеют наиболее тяжелые клинические проявления и часто страдают от возникновения плоскоклеточного рака кожи. Молекулярные механизмы, приводящие к предрасположенности клеток к онкологической трансформации, также недостаточно изучены.

Цели и задачи исследования

Целью исследования являлось создание новых клеточных моделей ВБЭ, воспроизводящих основные структурно-функциональные особенности кожи пациентов с ВБЭ, что необходимо для разработки новых подходов к лечению, в частности с использованием редактирования генома клеток пациентов. Задачи:

1. Разработать и охарактеризовать модель простого буллезного эпидермолиза (ПБЭ) на базе клеточной линии HaCaT с использованием системы редактирования генома CRISPR/Cas9.

2. Получить и провести характеристику первичных культур фибробластов и кератиноцитов от пациентов с дистрофическим буллезным эпидермолизом (ДБЭ).

3. Охарактеризовать полученные иммортализованные линии фибробластов и кератиноцитов в качестве модельных объектов.

4. Создать и охарактеризовать трехмерные модели кожи на основе полученных иммортализованных линий кератиноцитов и фибробластов и подтвердить воспроизведение структурно-функциональных особенностей кожи ДБЭ.

Научная новизна исследования

Была получена и охарактеризована новая модель ПБЭ на базе клеточной линии НаСаТ с использованием системы редактирования генома CRISPR/Cas9. Получены и охарактеризованы новые клеточные линии от пациентов с ДБЭ, несущие уникальные мутации. Были охарактеризованы новые иммортализованные линии кератиноцитов, полученные с помощью новых методов иммортализации, которые позволили сохранить свойства клеток близкими к первичным, что позволит использовать данные клеточные линии как замену первичным кератиноцитам в модельных системах. Были получены новые трехмерные модели кожи, моделирующие ВБЭ, в том числе из иммортализованных клеток.

Практическая значимость

Полученные в работе модели ВБЭ позволяют обойти ограничения и недостатки, связанные с первичными культурами клеток [9-11] и животными моделями [12] ВБЭ в контексте изучения механизмов заболевания и разработки новых видов терапии. На данных моделях возможно тестирование различных новых методов лечения ВБЭ, таких как воздействие низкомолекулярных веществ [13], ретровирусной терапии [14; 15], терапии с использованием аденоассоциированных вирусов [16], генетического редактирования [17], транс-сплайсинга РНК [18].

Полученные клеточные линии с возможностью к обратимой иммортализации [19] могут быть использованы в качестве альтернативы индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам (иПСК) для генетической модификации и создания клеточного продукта для аутологичной трансплантации, что ранее было применено для клеток предшественников миобластов [20].

Положения, выносимые на защиту

1. Внесенные генетические изменения в клетки НаСаТ с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 моделируют клеточные процессы, наблюдаемые при ПБЭ.

2. Кератиноциты и фибробласты, полученные от пациентов с РДБЭ, отличаются от здоровых клеток по экспрессии специфических маркеров и морфологии.

3. Полученные иммортализованные линии кератиноцитов и фибробластов от пациентов с РДБЭ и здоровых доноров не имеют существенных отличий от первичных культур и сохраняют особенности, характерные для клеток РДБЭ.

Методы исследования

Для внесения мутаций в ген krt5 использовали систему редактирования генома CRISPR/Cas9, включающую молекулярное клонирование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), трансфекцию, клеточный сортинг, клонирование клеток, Т7Е1 анализ, секвенирование. Для характеристики первичных и иммортализованных клеточных линий использовали методы секвенирования, ПЦР, прижизненной фазово-контрастной микроскопии, иммунного окрашивания клеток и тканей, криотомии, классической гистологической окраски, светлопольной микроскопии, флуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии, цейтраферной съемки, проточной цитометрии, цитогенетического анализа, STR-типирования, функционального анализа (осмотический и тепловой стрессы, ранозаживление, контракция коллагенового геля, стратификация в составе трехмерного эквивалента кожи, активность Р-галактозидазы, опухолеобразование, скорость пролиферации) и компьютерной обработкой полученных изображений с помощью программного пакета FiJi с дальнейшей статистической обработкой полученных данных.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность полученных результатов обеспечивается использованием стандартизированных методик и протоколов, качественных реактивов и материалов. Все эксперименты проведены со всеми надлежащими техническими контролями и биологическими повторами. Полученные данные обрабатывались соответствующими статистическими методами.

Основные материалы, изложенные в диссертации, были доложены и обсуждены на 8 конференциях:

1. A.K. Beilin, N.V. Andreeva, N.G. Gurskaya, E.A. Vorotelyak. Development of a model system for epidermolysis bullosa simplex in HaCaT cells by mutagenesis of keratin 5 with CRISPR/cas9 technology. The second international conference "Cell technologies at the edge: from research to practice" (CTERP) "Translational research in cell therapy". Москва, 13 апреля 2018 г.

2. Н.В. Андреева, А.К. Бейлин. Создание модели болезни буллезного эпидермолиза простого типа на культуре клеток HaCaT. Международная (XXII Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых. Москва, 15 марта 2018 г.

3. Н.В. Андреева, Н.Г. Гурская, А.К. Бейлин, Е.А. Воротеляк. Создание модели болезни буллезный эпидермолиз простого типа на культуре клеток HaCaT с использованием

системы редактирования генома CRISPR/Cas9. Международный конгресс CRISPR-2018. Новосибирск, 10-14 сентября 2018 г.

4. Nadya G.Gurskaya, Arkady K Beilin, Natalya V Andreeva, Ekaterina A Vorotelyak. Modelling epidermolysis bullosa simplex with CRISPR/Cas9 system. Cold Spring Harbor Laboratory Meetings& Courses Program, Genome engineering: the CRISPR-Cas revolution. Нью-Йорк, США, 22-25 августа 2018 г.

5. A. Beilin, N. Gurskaya, E. Vorotelyak. Establishing a model of epidermolysis bullosa simplex via CRISPR/Cas9 editing in HaCaT cells. 44th FEBS Congress. Краков, Польша, 6-11 июля 2019 г.

6. A Beilin, N Evtushenko, N Murashkin, K Savostyanov, A Fisenko, E Ambarchian, E Vorotelyak and N Gurskaya. The new cell cultures from dystrophic epidermolysis bullosa patients in Russia. ESDR 2019 Annual Meeting. Бордо, Франция, 18 - 21 сентября 2019 г.

7. Н. Гурская, А. Бейлин, Н. Евтушенко, К. Азимов, Н. Мурашкин, К. Савостьянов, Э. Амбарчян, А. Фесенко, Е. Воротеляк, А. Васильев. Новые подходы к терапии врожденного буллезного эпидермолиза (вбэ): получение пациент-специфических клеточных линий, несущих мутации в гене, кодирующим col7a1, перспективы использования модельных систем для изучения механизмов заболевания и генетической терапии. II объединенный научный форум VI съезд физиологов СНГ VI съезд биохимиков россии IX российский симпозиум «белки и пептиды». Сочи, 1-6 октября 2019 г.

8. N.G.Gurskaya A.Beilin N.Evtushenko E.Vorotelyak. Inherited epidermolysis bullosa: creation a desease model with CRISPR/Cas9 system. European Biotechnology Congress 2019. Прага, Чехия, 15 ноября 2019 г.

Перечень публикаций

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях, входящих в международные реферативные базы данных и систем цитирования (WoS, Scopus) и соответствуют Перечню ВАК, тезисов докладов и материалов конференций 8. Список публикаций:

1. Бейлин А.К., Гурская Н.Г., Воротеляк Е.А. Методы генной терапии для лечения врожденного буллезного эпидермолиза // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. 2018. Т. 73. № 4. С. 233-241. DOI: 10.3103/S0096392518040016

2. Бейлин А.К., Гурская Н.Г., Евтушенко Н.А., Алпеева Е.В., Косых А.В., Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Иммортализация кератиноцитов человека с помощью каталитической субъединицы теломеразы // Доклады Российской Академии Наук. Науки О Жизни. - 2021. - Т. 496. - № 1. DOI: 10.31857/S2686738921010042

3. Beilin, A.K.; Evtushenko, N.A.; Lukyanov, D.K.; Murashkin, N.N.; Ambarchian, E.T.; Pushkov, A.A.; Savostyanov, K.V.; Fisenko, A.P.; Rogovaya, O.S.; Vasiliev, A.V.; Vorotelyak, E.A.; Gurskaya, N.G. Signatures of dermal fibroblasts from RDEB pediatric patients // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1792. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22041792

4. Nadezhda A. Evtushenko, Arkadii K. Beilin, Erdem B. Dashinimaev, Rustam H. Ziganshin, Anastasiya V. Kosykh, Maxim M. Perfilov, Alexandra L. Rippa, Elena V. Alpeeva, Andrey V. Vasiliev, Ekaterina A. Vorotelyak and Nadya G. Gurskaya. hTERT-driven immortalization of RDEB fibroblast and keratinocyte cell lines followed by Cre-mediated transgene elimination // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22(8), 3809. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22083809

Личный вклад автора

Формирование общего направления исследований в выбранной тематике работы, выбор моделей и методов исследования, руководство проведением экспериментальных работ осуществлялись Гурской Н.Г. и Воротеляк Е.А. Дизайн экспериментов по иммортализации клеточных линий дермальных фибробластов и кератиноцитов разработан Гурской Н.Г.

Культивирование клеток НаСаТ, проведение процедуры редактирования и селекция мутантных клонов проводились совместно с Евтушенко Н.А. Эксперименты с фосфатазой РТР1В проводились совместно с Петрусенко Ю.С. Анализ скорости заживления раны, МТТ-тест, эксперименты со стрессом сети кератинов и воздействием кофеина, иммуноцитохимическая окраска и микроскопия клеток НаСаТ проводились лично автором.

Работа с пациентами, получение биопсий кожи и образцов крови осуществлялись в НМИЦ Здоровья детей Амбарчаном Э.Т. Секвенирование осуществляли Савостьянов К.В., Фисенко А.П. и Евтушенко Н.А. Анализ FASTQ для пациентов д1, д2 и д3 был выполнен Савостьяновым К.В. в НМИЦ Здоровья детей, анализ других FASTQ проводился Гурской Н.Г. Иммунофлуоресцентный анализ (криотомия, окраска и микроскопия) биопсий кожи пациентов и здоровых доноров производился лично автором.

Выделение культур первичных дермальных фибробластов и кератиноцитов производилось совместно с Евтушенко Н.А. Селекция и культивирование иммортализованных клеток после трансдукции проводились совместно с Евтушенко Н.А. Разработка протоколов культивирования и криоконсервации кератиноцитов была осуществлена лично автором. Анализ экспрессии маркеров, анализ морфологии клеток, определение контракционной активности клеток, количественный анализ активности SA-P-gal, анализ пролиферативной активности, клеточный сортинг и проточная цитометрия, микроскопия (световая, фазово-контрастная, флуоресцентная, конфокальная и цейтраферная съемка) осуществлялись лично автором.

Разработка протокола и получение эквивалентов кожи, а также иммунофлуоресцентный анализ (криотомия, окраска и микроскопия) осуществлялся лично автором. Иммуногистохимический анализ, классическая гистология и световая микроскопия эквивалентов кожи производились совместно с Риппой А.Л.

Трансплантация клеток в семенники мышей проводилась совместно с Роговой О.С., Косых А.В. и Гурской Н.Г. Иммунофлуоресцентный анализ опухолей (криотомия, окраска и микроскопия) осуществлялись лично автором.

Пробоподготовка к цитогенетическому анализу и STR-профилированию, а также определение наличия микоплазмы осуществлялись в Коллекции клеточных культур ИБР РАН.

Методы количественного анализа морфологии фибробластов и кератиноцитов на фазово-контрастных микроскопических изображениях и количественной оценки активности Р-галактозидазы на световых микроскопических изображениях были разработаны лично автором. Анализ микроскопических изображений производился лично автором. Статистический анализ данных и подготовка изображений осуществлялись лично автором.

Все разделы диссертации были написаны лично автором или при его непосредственном участии. Правка осуществлялась Воротеляк Е.А. и Гурской Н.Г.

Структура и объем диссертации

Текст диссертации приведен на 131 странице, содержит 32 рисунка, 3 таблицы и дополнен 1 приложением. В работе процитированы 246 литературных источника.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Врожденный буллезный эпидермолиз

ВБЭ - это гетерогенная группа редких генодерматозов, при которых наблюдается высокая чувствительность к небольшим механическим воздействиям. Клинически заболевание проявляется в виде появления пузырей и эрозий, возникающих на коже и слизистых оболочках после незначительной травмы или даже без нее. Эти поражения возникают вследствие генетически обусловленных дефектов структурных белков кожи, обеспечивающих интраэпидермальные или дермоэпидермальные связи [5].

1.1 Классификация типов врожденного буллезного эпидермолиза

Морфологическая классификация ВБЭ делит его на 3 основных типа: ПБЭ, пограничный буллезный эпидермолиз (ПоБЭ), ДБЭ. Отдельно выделен синдром Киндлера [4; 21]. Разделение происходит в зависимости от уровня образования пузырей в слоях кожи на ультраструктурном уровне. При ПБЭ пузыри образуются в верхних слоях эпидермиса, при пограничном - на уровне светлой пластинки (lamina lucida) базальной мембраны, при ДБЭ - в верхней части сосочкового слоя дермы, ниже темной (плотной) пластинки (lamina densa) базальной мембраны. При синдроме Киндлера образование пузырей может быть на разных уровнях. Каждый основной тип ВБЭ подразделяется на подтипы, которых описано более 30, на основании фенотипа, характера наследования и генотипа [22].

1.2 Генетика врожденного буллезного эпидермолиза

Для каждого из типов заболевания были выявлены гены, мутации в которых ответственны за приобретение фенотипа ВБЭ. ВБЭ наследуется по аутосомно-доминантному и аутосомно-рецессивному типу. Описаны различные виды мутаций - миссенс-мутации, нонсенс-мутации, делеции, мутации рамки считывания, инсерции, мутации сайта сплайсинга. В настоящее время известно, как минимум, 18 генов структурных белков кожи и более 1000 мутаций в них, ассоциированных с развитием клинических проявлений того или иного типа ВБЭ (Рисунок 1.1 Г) [23-25].

При ПБЭ обнаруживаются мутации в генах krt5 и krt14, примерно в 75% случаев, а также в генах tgm5, dsp, pkp1, jup, plec, dst, itgb4 и col17a1 в остальных случаях [26-28; 37]. В последние

годы появились данные о том, что частота ПБЭ обусловленного мутацией гена plec может быть значительно больше, чем предполагалось ранее [29].

При ПоБЭ чаще всего мутации обнаруживаются в генах lamb3 (70 % случаев), lama3 (9%), lamc2 (9%), col17a1 (10%). У ряда пациентов описаны мутации в генах itga6, itgb4 и itga3. В большинстве случаев заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу, однако, описаны случаи соматического мозаицизма и однородительской дисомии [30-32; 37].

При ДБЭ описаны мутации в гене col7a1, в 95% случаев доминантного и рецессивного типов ВБЭ [33-37].

При синдроме Киндлера во всех случаях детектируется мутация в гене fermtl. Наследуется только по аутосомно-рецессивному типу [38; 39].

Рисунок 1.1. А. Пример состояния кожи пациента с РДБЭ (д3). Б. Схема основных структур кожи. В. Схема основных структур эпидермиса. Для слоев кератиноцитов указаны специфические белковые маркеры Г. Схема области базальной мембраны эпидермиса с основными компонентами, пораженными различными типами ВБЭ.

1.3 Распространенность буллезного эпидермолиза

Частота встречаемости различных типов ВБЭ варьирует от 1:30000 до 1:1000000 и зависит от популяции [22]. Последние данные из Национального регистра ВБЭ указывают на общую популяционную частоту ВБЭ в 1:90000 и частоту новорожденных с ВБЭ в 1:51000. Не было найдено связи между частотой встречаемости ВБЭ и полом или этнической группой [4]. Общее количество больных в мире оценивается в примерно 500000 [40]. Известны данные о распространенности ВБЭ на территории 70 из 85 субъектов Российской Федерации: от 0 до 19,73 случаев на миллион населения, в среднем - 3,64 случая на миллион населения [41; 42]. Оценивается, что популяционная частота врожденного ВБЭ в России составляет 1:500001:300000, а прогнозируемое ежегодное количество больных ВБЭ - 14-34 случаев на 1,7 млн. новорожденных [41-44].

1.4 Диагностика буллезного эпидермолиза

Подход к пациентам с потенциальным диагнозом ВБЭ включает получение в анамнезе симптомов, сопутствующих заболеваний и семейного анамнеза с последующим целенаправленным клиническим обследованием для определения ключевых результатов, которые могут подтвердить или опровергнуть первоначальное впечатление, полученное из анамнеза, а также общую оценку степени тяжести. Для исключения других возможных диагнозов следуют дополнительные диагностические исследования. В случае ВБЭ компонентами этого процесса являются специализированные диагностические методы, включая ПЭМ и ИКА пораженной кожи, а также анализ мутаций ДНК [45]. Гистологическая оценка под световой микроскопией - рутинная практика анализа биопсий кожи, не относящихся к ВБЭ, не имеет достаточного разрешения для определения плоскостей расхождения в коже ВБЭ. Вместо этого ПЭМ и / или ИКА [46] кожи являются ключевыми в постановке диагноза ВБЭ.

Диагностические ключи к определенным типам ВБЭ включают следующее: образование пузырей и кератодермия, ограниченная ладонями и стопами, указывает на локализованный ПБЭ. Сливающаяся ладонно-подошвенная кератодермия и скопления дугообразных герпетиформных пузырей свидетельствуют о тяжелом ПБЭ. Хриплый крик при рождении, образующаяся после обильная грануляционная ткань в периоральной, подмышечной и шейной областях, а также дефекты зубной эмали с или без патологического ногтевого ложа, свидетельствуют о ПоБЭ. Микростомия, псевдосиндактилия, контрактуры и рубцы с образованием милиумов

свидетельствуют о тяжелом ДБЭ. Наконец, светочувствительность и пойкилодермия свидетельствуют о синдроме Киндлера.

Мутационный скрининг предполагаемых генов-кандидатов определяется структурными аберрациями, выявленными при биопсии кожи. Скрининг всех вовлеченных генов ВБЭ на предмет патогенетических вариантов до недавнего времени считался непрактичным и неэффективным, в основном из-за лежащей в основе генетической гетерогенности, но также из-за большой мультиэкзонности нескольких генов. Однако успехи в технологии секвенирования привели к более быстрым и менее дорогостоящим тестам с улучшенными показателями мутационного обнаружения, так что генетические скрининги с использованием панелей, специфичных для ВБЭ, теперь вводятся в качестве первичного исследования [47-49]. Более того, секвенирование всего экзома и секвенирование всего генома ускорили расширение базы данных мутаций ВБЭ [50-52].

Молекулярная диагностика подтверждает диагноз, лежит в основе генетического консультирования [53] и пренатальной диагностики [54] и, в конечном итоге, определяет оптимальное лечение. Это стандартная практика (если возможно) для определения родительского генетического статуса, что позволяет обнаруживать патогенетические мутации, мутации de novo, мозаицизм зародышевой линии и однопародительскую изодисомию. Ее ценность особенно проявляется в случаях локализованного рецессивного ДБЭ (РДБЭ) и локализованного доминантного ДБЭ (ДДБЭ), которые могут быть клинически похожими. В отсутствие установленной родословной молекулярная диагностика дает ключевую информацию, относящуюся к способу наследования (то есть различению двухаллельной мутации от новой доминантной мутации) и будущему риску передачи. Она также может быть необходима для диагностики в случаях нечетких симптомов, при котором анализ ПЭМ не позволяет однозначно выявить ультраструктурные аномалии. Однако в контексте генетического консультирования чувствительность к скринингу генов варьируется.

Частота обнаружения мутаций зависит как от метода скрининга, так и от места мутации. Например, широко используемые методы, зависимые от ПЦР, не обнаруживают дупликаций или больших делеций более чем в одном экзоне или с участием всего гена [55]. Аналогичным образом мутации в некодирующих регуляторных элементах или глубоких интронных последовательностях обычно не проверяются, а сиквенс, полученный в результате целевого захвата (targeted capture), ограничивается кодированием экзонов и фланкирующих сайтов сплайсинга. В то время как секвенирование по Сэнгеру традиционно представляло собой золотой

стандарт генетической диагностики, стратегии секвенирования нового поколения (next-generation sequencing; NGS) предлагают для ВБЭ возможность скрининга на множественные вариации сиквенса. Более того, несмотря на низкую несогласованность в показателях обнаружения между двумя методами, массивы и панели целевого NGS (targeted NGS) значительно дешевле. Для сравнения, секвенирование всего экзома генерирует огромные объемы сложных данных, которые требуют интенсивного исследования, что в настоящее время может, напротив, приводить как следствие к более низким показателям обнаружения мутаций [56].

1.5 Ранозаживление, фиброз и рубцевание при буллезном эпидермолизе

Заживление ран является основным объектом внимания при ВБЭ, учитывая обширные поражения кожи при болезни. Происходящее в четырех хорошо скоординированных перекрывающихся фазах, заживление ран включает гемостаз, воспаление, пролиферацию и ремоделирование, последние три из которых сильно нарушаются при ВБЭ. Чувствительность кожи и последующее повторное образование пузырей (особенно на легко травмируемых участках) вызывают стойкое воспаление, замедленную реэпителизацию и незаживающие язвы, которые легко инфицируются и еще больше задерживают процесс заживления. Хроническая инфекция обнаженной кожи (например, видами Staphylococcus и Streptococcus) может играть роль в возникновении хронического воспаления раны через активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа, хотя, вероятно, что это может модулироваться кожными комменсалами. Уменьшение микробного разнообразия является признаком незаживающих ран и, как было показано, возникает при РДБЭ [57]. Однако точная природа воспаления и влияние микробиома кожи ВБЭ еще предстоит полностью изучить.

При ПБЭ и ПоБЭ миграция кератиноцитов нарушена, в то время как в контексте дефицита коллагена VII типа (collagen type VII; С7) присутствует стареющий, провоспалительный и профибротический фенотип фибробластов, проявляющийся как утолщенный и рубцовый фенотип. Было показано, что TGF-ß1 является ключевым фактором этих провоспалительных профибротических изменений, а также в большом количестве экспрессируется различными типами клеток во время заживления ран. Передача сигналов TGF-ß увеличивается в условиях дефицита С7 из-за последующего увеличения доступности тромбоспондина 1 (thrombospondin 1; TSP1), который, в свою очередь, активирует TGF-ß посредством высвобождения лиганда TGF-ß из комплекса LAP (latency associated peptide) / LTBP (latent transforming growth factor ß binding proteins) в матрикс [58].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бейлин Аркадий Константинович, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Elluru R.G. Management of manifestations of epidermolysis bullosa / R.G. Elluru, J.M. Contreras, D.M. Albert // Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. -2013. - Т. 21. - № 6. - С. 588-593.

2. Peculiarities of up-to-day running and epidemiology of the epidermolysis bullosa in the Krasnodar Territory / A.A. Kubanova [и др.] // Vestnik dermatologii i venerologii. - 2011. -Т. 87. - № 1. - С. 59-65.

3. Мурашкин Н.Н. Современные особенности клинического полиморфизма, эпидемиологических и медико-социальных характеристик дерматозов с хроническим течением в детском возрасте ( на примере Краснодарского края) / Н.Н. Мурашкин. -Москва, 2011.

4. Epidermolysis bullosa / A. Bardhan [и др.] // Nature Reviews. Disease Primers. - 2020. - Т. 6. - № 1. - С. 78.

5. Has C. The genetics of skin fragility / C. Has, L. Bruckner-Tuderman // Annual Review of Genomics and Human Genetics. - 2014. - Т. 15. - С. 245-268.

6. Next generation sequencing identifies double homozygous mutations in two distinct genes (EXPH5 and COL17A1) in a patient with concomitant simplex and junctional epidermolysis bullosa / H. Vahidnezhad [и др.] // Human Mutation. - 2018. - Т. 39. - № 10. - С. 1349-1354.

7. Keratin gene mutations influence the keratinocyte response to DNA damage and cytokine induced apoptosis / T. Zupancic [и др.] // Archives of Dermatological Research. - 2017. -Т. 309. - № 7. - С. 587-593.

8. Cohn H.I. Advancement in management of epidermolysis bullosa / H.I. Cohn, J.M.C. Teng // Current Opinion in Pediatrics. - 2016. - Т. 28. - № 4. - С. 507-516.

9. Li L.N. Skin toxicity determined in vitro by three-dimensional, native-state histoculture. / L.N. Li, L.B. Margolis, R.M. Hoffman // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1991. - Т. 88. - № 5. - С. 1908-1912.

10. Towards the development of a simplified long-term organ culture method for human scalp skin and its appendages under serum-free conditions / Z. Lu [и др.] // Experimental Dermatology. -2007. - Т. 16. - № 1. - С. 37-44.

11. Cancer cells mimic in vivo spatial-temporal cell-cycle phase distribution and chemosensitivity in 3-dimensional Gelfoam® histoculture but not 2-dimensional culture as visualized with realtime FUCCI imaging / S. Yano [и др.] // Cell Cycle (Georgetown, Tex.). - 2015. - Т. 14. -№ 6. - С. 808-819.

12. Surgical approaches to create murine models of human wound healing / V.W. Wong [и др.] // Journal of Biomedicine & Biotechnology. - 2011. - Т. 2011. - С. 969618.

13. Gentamicin induces functional type VII collagen in recessive dystrophic epidermolysis bullosa patients / D.T. Woodley [и др.] // The Journal of Clinical Investigation. - 2017. - Т. 127. -

№ 8. - С. 3028-3038.

14. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes / M.C. Latella [et al.] // Journal of Investigative Dermatology. - 2017. - Vol. 137. - № 4. - P. 836844.

15. Safety and Wound Outcomes Following Genetically Corrected Autologous Epidermal Grafts in Patients With Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa / Z. Siprashvili [и др.] // JAMA. -2016. - Т. 316. - № 17. - С. 1808-1817.

16. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant / S.P. Melo [и др.] // Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. - 2014. - Т. 22. - № 4. - С. 725-733.

17. Ex Vivo COL7A1 Correction for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Using

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

CRISPR/Cas9 and Homology-Directed Repair / A. Izmiryan [и др.] // Molecular Therapy. Nucleic Acids. - 2018. - Т. 12. - С. 554-567.

Current and Future Perspectives of Stem Cell Therapy in Dermatology / C.M. Prodinger [и др.] // Annals of Dermatology. - 2017. - Т. 29. - № 6. - С. 667-687.

Both Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells / T. Kiyono [и др.] // Nature. - 1998. - Т. 396. - № 6706. - С. 84-88. Reversible immortalisation enables genetic correction of human muscle progenitors and engineering of next-generation human artificial chromosomes for Duchenne muscular dystrophy / S. Benedetti [и др.] // EMBO Molecular Medicine. - 2018. - Т. 10. - № 2. -

C. 254-275.

Inherited epidermolysis bullosa: updated recommendations on diagnosis and classification / J-

D. Fine [и др.] // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2014. - Т. 70. -Inherited epidermolysis bullosa. - № 6. - С. 1103-1126.

БУЛЛЕЗНЫЙ ЭПИДЕРМОЛИЗ / Г.В. Еремина [и др.] // Медицинская сестра. - 2017. -№ 4. - С. 11-16.

Mutations in KLHL24 Add to the Molecular Heterogeneity of Epidermolysis Bullosa Simplex / J.Y.W. Lee [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2017. - Т. 137. - № 6. -С. 1378-1380.

McGrath J.A. Recently Identified Forms of Epidermolysis Bullosa / J.A. McGrath // Annals of Dermatology. - 2015. - Т. 27. - № 6. - С. 658-666.

Progress toward Treatment and Cure of Epidermolysis Bullosa: Summary of the DEBRA International Research Symposium EB2015 / J. Uitto [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2016. - Т. 136. - Progress toward Treatment and Cure of Epidermolysis Bullosa. - № 2. - С. 352-358.

Lethal acantholytic epidermolysis bullosa due to a novel homozygous deletion in DSP: expanding the phenotype and implications for desmoplakin function in skin and heart / M.C. Bolling [и др.] // The British Journal of Dermatology. - 2010. - Т. 162. - Lethal acantholytic epidermolysis bullosa due to a novel homozygous deletion in DSP. - № 6. - С. 1388-1394. Epidermolysis bullosa simplex in Scotland caused by a spectrum of keratin mutations / E.L. Rugg [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2007. - Т. 127. - № 3. - С. 574580.

Epidermolysis bullosa simplex in Japanese and Korean patients: genetic studies in 19 cases / K. Yasukawa [и др.] // The British Journal of Dermatology. - 2006. - Т. 155. - Epidermolysis bullosa simplex in Japanese and Korean patients. - № 2. - С. 313-317. Plectin mutations underlie epidermolysis bullosa simplex in 8% of patients / M.C. Bolling [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2014. - Т. 134. - № 1. - С. 273-276. Complete paternal uniparental isodisomy of chromosome 1 resulting in Herlitz junctional epidermolysis bullosa / H. Fassihi [и др.] // Clinical and Experimental Dermatology. - 2005. -Т. 30. - № 1. - С. 71-74.

Analysis of the COL17A1 in non-Herlitz junctional epidermolysis bullosa and amelogenesis imperfecta / H. Nakamura [и др.] // International Journal of Molecular Medicine. - 2006. -Т. 18. - № 2. - С. 333-337.

Laminin-5 mutational analysis in an Italian cohort of patients with junctional epidermolysis bullosa / P. Posteraro [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2004. - Т. 123. -№ 4. - С. 639-648.

Expanding the COL7A1 mutation database: novel and recurrent mutations and unusual genotype-phenotype constellations in 41 patients with dystrophic epidermolysis bullosa / J.S. Kern [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2006. - Т. 126. - Expanding the COL7A1 mutation database. - № 5. - С. 1006-1012.

Differences in recurrent COL7A1 mutations in dystrophic epidermolysis bullosa: ethnic-

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

specific and worldwide recurrent mutations / T. Murata [и др.] // Archives of Dermatological Research. - 2004. - Т. 295. - Differences in recurrent COL7A1 mutations in dystrophic epidermolysis bullosa. - № 10. - С. 442-447.

Epidermolysis bullosa. II. Type VII collagen mutations and phenotype-genotype correlations in the dystrophic subtypes / R. Varki [и др.] // Journal of Medical Genetics. - 2007. - Т. 44. -№ 3. - С. 181-192.

Genotype-phenotype correlation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa: when missense doesn't make sense / V. Wessagowit [и др.] // The Journal of Investigative Dermatology. -2005. - Т. 124. - Genotype-phenotype correlation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. - № 4. - С. 863-866.

Дрождина М.Б. Клинико-морфологические и молекулярные особенности буллезного эпидермолиза, подходы к классификации / М.Б. Дрождина // Педиатрия. Журнал Им. Г.н. Сперанского. - 2019. - Т. 98. - № 3.

Kindler T. Congenital poikiloderma with traumatic bulla formation and progressive cutaneous atrophy / T. Kindler // The British Journal of Dermatology. - 1954. - Т. 66. - № 3. - С. 104111.

Loss of Kindlin-1, a Human Homolog of the Caenorhabditis elegans Actin-Extracellular-Matrix Linker Protein UNC-112, Causes Kindler Syndrome / D.H. Siegel [и др.] // The American Journal of Human Genetics. - 2003. - Т. 73. - № 1. - С. 174-187. Rashidghamat E. Novel and emerging therapies in the treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa / E. Rashidghamat, J.A. McGrath // Intractable & Rare Diseases Research. - 2017. - Т. 6. - № 1. - С. 6-20.

Prevalence of hereditary epidermolysis bullosa in the Russian Federation / A.A. Kubanov [и др.] // Vestnik dermatologii i venerologii. - 2015. - Т. 91. - № 3. - С. 21-30. Рахматов А.Б. Буллезный эпидермолиз: диагностика, лечение и профилактика / А.Б. Рахматов // Украинский Журнал Дерматологии, Венерологии, Косметологии. - 2019. -Буллезный эпидермолиз. - № 1 (72).

Альбанова В.И. Буллезный эпидермолиз у детей первого года жизни / В.И. Альбанова //

Российский Вестник Перинатологии И Педиатрии. - 2010. - Т. 55. - № 3.

Альбанова В.И. Лечение буллезного эпидермолиза / В.И. Альбанова, В.А. Гольченко //

Российский Журнал Кожных И Венерических Болезней. - 2013. - № 4.

Clinical practice guidelines for laboratory diagnosis of epidermolysis bullosa / C. Has [и др.] //

The British Journal of Dermatology. - 2020. - Т. 182. - № 3. - С. 574-592.

Has C. Research Techniques Made Simple: Immunofluorescence Antigen Mapping in

Epidermolysis Bullosa / C. Has, Y. He // The Journal of Investigative Dermatology. - 2016. -

Т. 136. - Research Techniques Made Simple. - № 7. - С. e65-e71.

Mutation-based prenatal diagnosis of Herlitz junctional epidermolysis bullosa / A.M.

Christiano [и др.] // Prenatal Diagnosis. - 1997. - Т. 17. - № 4. - С. 343-354.

Whole-exome sequencing improves mutation detection in a diagnostic epidermolysis bullosa

laboratory / T. Takeichi [и др.] // The British Journal of Dermatology. - 2015. - Т. 172. - № 1.

- С. 94-100.

Amplicon-based next-generation sequencing: an effective approach for the molecular diagnosis of epidermolysis bullosa / E. Tenedini [и др.] // The British Journal of Dermatology. - 2015. -Т. 173. - Amplicon-based next-generation sequencing. - № 3. - С. 731-738. Localised Dominant Dystrophic Epidermolysis Bullosa with a Novel de Novo Mutation in COL7A1 Diagnosed by Next-generation Sequencing [Электронный ресурс]. - URL: http://www.medicaljournals.se/acta/content/html/10.2340/00015555-2019 (дата обращения: 06.04.2021).

Multigene Next-Generation Sequencing Panel Identifies Pathogenic Variants in Patients with Unknown Subtype of Epidermolysis Bullosa: Subclassification with Prognostic Implications /

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

H. Vahidnezhad [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2017. - T. 137. -Multigene Next-Generation Sequencing Panel Identifies Pathogenic Variants in Patients with Unknown Subtype of Epidermolysis Bullosa. - № 12. - C. 2649-2652. Dystrophic Epidermolysis Bullosa: COL7A1 Mutation Landscape in a Multi-Ethnic Cohort of 152 Extended Families with High Degree of Customary Consanguineous Marriages / H. Vahidnezhad [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2017. - T. 137. -Dystrophic Epidermolysis Bullosa. - № 3. - C. 660-669.

Life with Epidermolysis Bullosa (EB): Etiology, Diagnosis, Multidisciplinary Care and Therapy. Life with Epidermolysis Bullosa (EB) / eds. J.-D. Fine, H. Hintner. - Wien: SpringerVerlag, 2009.

Prenatal diagnosis for recessive dystrophic epidermolysis bullosa in 10 families by mutation and haplotype analysis in the type VII collagen gene (COL7A1) / A.M. Christiano [h gp.] // Molecular Medicine (Cambridge, Mass.). - 1996. - T. 2. - № 1. - C. 59-76. Monoallelic Large Intragenic KRT5 Deletions Account for Genetically Unsolved Cases of Epidermolysis Bullosa Simplex / C. Has [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. -

2017. - T. 137. - № 10. - C. 2231-2234.

ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing / H.L. Rehm [h gp.] // Genetics in Medicine: Official Journal of the American College of Medical Genetics. - 2013. -T. 15. - № 9. - C. 733-747.

Reduced Microbial Diversity Is a Feature of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa-Involved Skin and Wounds / I. Fuentes [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. -

2018. - T. 138. - № 11. - C. 2492-2495.

Thrombospondin-1 Is a Major Activator of TGF-ß Signaling in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Fibroblasts / V.S. Atanasova [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2019. - T. 139. - № 7. - C. 1497-1505.e5.

Pathomechanisms of Altered Wound Healing in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa / F. Cianfarani [h gp.] // The American Journal of Pathology. - 2017. - T. 187. - № 7. -C. 1445-1453.

Stromal microenvironment in type VII collagen-deficient skin: The ground for squamous cell carcinoma development / L. Guerra [h gp.] // Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. - 2017. - T. 63. - Stromal microenvironment in type VII collagen-deficient skin. - C. 1-10.

Losartan ameliorates dystrophic epidermolysis bullosa and uncovers new disease mechanisms / A. Nyström [h gp.] // EMBO Molecular Medicine. - 2015. - T. 7. - № 9. - C. 1211-1228. Anchoring fibrils contain the carboxyl-terminal globular domain of type VII procollagen, but lack the amino-terminal globular domain / G.P. Lunstrum [h gp.] // The Journal of Biological Chemistry. - 1987. - T. 262. - № 28. - C. 13706-13712.

Large complex globular domains of type VII procollagen contribute to the structure of anchoring fibrils. / G.P. Lunstrum [h gp.] // Journal of Biological Chemistry. - 1986. - T. 261. - № 19. - C. 9042-9048.

Type VII collagen is a major structural component of anchoring fibrils / L.Y. Sakai [h gp.] // The Journal of Cell Biology. - 1986. - T. 103. - № 4. - C. 1577-1586. Type VII collagen forms an extended network of anchoring fibrils // The Journal of Cell Biology. - 1987. - T. 104. - № 3. - C. 611-621.

Palade G.E. A special fibril of the dermis / G.E. Palade, M.G. Farquhar // The Journal of Cell Biology. - 1965. - T. 27. - № 1. - C. 215-224.

Tidman M.J. Evaluation of anchoring fibrils and other components of the dermal-epidermal junction in dystrophic epidermolysis bullosa by a quantitative ultrastructural technique / M.J. Tidman, R.A. Eady // The Journal of Investigative Dermatology. - 1985. - T. 84. - № 5. -C. 374-377.

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

Collagen VII plays a dual role in wound healing / A. Nystrom [h gp.] // The Journal of Clinical Investigation. - 2013. - T. 123. - № 8. - C. 3498-3509.

Bauer E.A. A perspective on the role of collagenase in recessive dystrophic epidermolysis bullosa / E.A. Bauer, M. Tabas // Archives of Dermatology. - 1988. - T. 124. - № 5. - C. 734736.

Bruckner-Tuderman L. Biology of anchoring fibrils: lessons from dystrophic epidermolysis bullosa / L. Bruckner-Tuderman, B. Hopfner, N. Hammami-Hauasli // Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. - 1999. - T. 18. - Biology of anchoring fibrils.

- № 1. - C. 43-54.

Premature termination codons in the type VII collagen gene (COL7A1) underlie severe, mutilating recessive dystrophic epidermolysis bullosa / A.M. Christiano [h gp.] // Genomics. -1994. - T. 21. - № 1. - C. 160-168.

Identification and characterization of genes that are required for the accelerated degradation of mRNAs containing a premature translational termination codon / Y. Cui [h gp.] // Genes & Development. - 1995. - T. 9. - № 4. - C. 423-436.

Epidermolysis bullosa: Molecular pathology of connective tissue components in the cutaneous basement membrane zone / C. Has [h gp.] // Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. - 2018. - Tt. 71-72. - Epidermolysis bullosa. - C. 313-329. Some, but Not All, Glycine Substitution Mutations inCOL7A1 Result in Intracellular Accumulation of Collagen VII, Loss of Anchoring Fibrils, and Skin Blistering* / N. Hammami-Hauasli [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - Vol. 273. - № 30. -P. 19228-19234.

Hatta N. Spontaneous disappearance of intraepidermal type VII collagen in a patient with dystrophic epidermolysis bullosa / N. Hatta, M. Takata, H. Shimizu // The British Journal of Dermatology. - 1995. - T. 133. - № 4. - C. 619-624.

Deletions within COL7A1 exons distant from consensus splice sites alter splicing and produce shortened polypeptides in dominant dystrophic epidermolysis bullosa / A. Sakuntabhai [h gp.] // American Journal of Human Genetics. - 1998. - T. 63. - № 3. - C. 737-748. Mutation analysis of the entire keratin 5 and 14 genes in patients with epidermolysis bullosa simplex and identification of novel mutations / P.H.L. Schuilenga-Hut [h gp.] // Human Mutation. - 2003. - T. 21. - № 4. - C. 447.

Identification of novel and known mutations in the genes for keratin 5 and 14 in Danish patients with epidermolysis bullosa simplex: correlation between genotype and phenotype / C.B. S0rensen [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 1999. - T. 112. -Identification of novel and known mutations in the genes for keratin 5 and 14 in Danish patients with epidermolysis bullosa simplex. - № 2. - C. 184-190.

Primers for exon-specific amplification of the KRT5 gene: identification of novel and recurrent mutations in epidermolysis bullosa simplex patients / K. Stephens [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 1997. - T. 108. - Primers for exon-specific amplification of the KRT5 gene. - № 3. - C. 349-353.

Novel sporadic and recurrent mutations in KRT5 and KRT14 genes in Polish epidermolysis bullosa simplex patients: further insights into epidemiology and genotype-phenotype correlation / K. Wertheim-Tysarowska [h gp.] // Journal of Applied Genetics. - 2016. - T. 57.

- Novel sporadic and recurrent mutations in KRT5 and KRT14 genes in Polish epidermolysis bullosa simplex patients. - № 2. - C. 175-181.

A novel keratin 5 mutation (K5V186L) in a family with EBS-K: a conservative substitution can lead to development of different disease phenotypes / M. Liovic [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2001. - T. 116. - A novel keratin 5 mutation (K5V186L) in a family with EBS-K. - № 6. - C. 964-969.

Chemical chaperones protect epidermolysis bullosa simplex keratinocytes from heat stress-

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

induced keratin aggregation: involvement of heat shock proteins and MAP kinases / J.C. Chamcheu [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2011. - T. 131. - Chemical chaperones protect epidermolysis bullosa simplex keratinocytes from heat stress-induced keratin aggregation. - № 8. - C. 1684-1691.

Sawant M.S. Consequences of Keratin Phosphorylation for Cytoskeletal Organization and Epithelial Functions / M.S. Sawant, R.E. Leube // International Review of Cell and Molecular Biology. - 2017. - T. 330. - C. 171-225.

Identification of Novel Principles of Keratin Filament Network Turnover in Living Cells / R. Windoffer [h gp.] // Molecular Biology of the Cell. - 2004. - T. 15. - № 5. - C. 2436-2448. Principles of Molecular Medicine / eds. M.S. Runge, C. Patterson. - 2. - Humana Press, 2006. Snider N.T. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions / N.T. Snider, M.B. Omary // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. - 2014. -T. 15. - Post-translational modifications of intermediate filament proteins. - № 3. - C. 163177.

Snider N.T. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization / N.T. Snider, H. Park, M.B. Omary // The Journal of Biological Chemistry. - 2013. - T. 288. - № 43. - C. 3132931337.

Ku N.-O. Keratins Turn over by Ubiquitination in a Phosphorylation-Modulated Fashion / N.-O. Ku, M.B. Omary // The Journal of Cell Biology. - 2000. - T. 149. - № 3. - C. 547-552. Onset of re-epithelialization after skin injury correlates with a reorganization of keratin filaments in wound edge keratinocytes: defining a potential role for keratin 16 / R.D. Paladini [h gp.] // The Journal of Cell Biology. - 1996. - T. 132. - Onset of re-epithelialization after skin injury correlates with a reorganization of keratin filaments in wound edge keratinocytes. -№ 3. - C. 381-397.

Correction of junctional epidermolysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells / F. Mavilio [h gp.] // Nature Medicine. - 2006. - T. 12. - № 12. -C. 1397-1402.

Intravenously Administered Recombinant Human Type VII Collagen Derived from Chinese Hamster Ovary Cells Reverses the Disease Phenotype in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Mice / Y. Hou [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2015. - T. 135. -№ 12. - C. 3060-3067.

Injection of Recombinant Human Type VII Collagen Corrects the Disease Phenotype in a Murine Model of Dystrophic Epidermolysis Bullosa / J. Remington [h gp.] // Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. - 2009. - T. 17. - № 1. -

C. 26-33.

Intravenously Injected Recombinant Human Type VII Collagen Homes to Skin Wounds and Restores Skin Integrity of Dystrophic Epidermolysis Bullosa / D.T. Woodley [h gp.] // The Journal of investigative dermatology. - 2013. - T. 133. - № 7. - C. 1910-1913. Immune reactivity to type VII collagen: implications for gene therapy of recessive dystrophic epidermolysis bullosa / V. Pendaries [h gp.] // Gene Therapy. - 2010. - T. 17. - Immune reactivity to type VII collagen. - № 7. - C. 930-937.

Identification of the skin basement-membrane autoantigen in epidermolysis bullosa acquisita /

D.T. Woodley [h gp.] // The New England Journal of Medicine. - 1984. - T. 310. - № 16. -C. 1007-1013.

HB-EGF induces COL7A1 expression in keratinocytes and fibroblasts: possible mechanism underlying allogeneic fibroblast therapy in recessive dystrophic epidermolysis Bullosa / N. Nagy [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2011. - T. 131. - HB-EGF induces COL7A1 expression in keratinocytes and fibroblasts. - № 8. - C. 1771-1774. Fibroblast cell therapy enhances initial healing in recessive dystrophic epidermolysis bullosa

98.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

wounds: results of a randomized, vehicle-controlled trial / G. Petrof [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2013. - T. 169. - Fibroblast cell therapy enhances initial healing in recessive dystrophic epidermolysis bullosa wounds. - № 5. - C. 1025-1033. A phase II randomized vehicle-controlled trial of intradermal allogeneic fibroblasts for recessive dystrophic epidermolysis bullosa / S.S. Venugopal [h gp.] // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2013. - T. 69. - № 6. - C. 898-908.e7.

Potential of fibroblast cell therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa / T. Wong [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2008. - T. 128. - № 9. - C. 2179-2189. Reduced Toxicity Conditioning and Allogeneic Hematopoietic Progenitor Cell Transplantation for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa / M.B. Geyer [h gp.] // The Journal of Pediatrics. - 2015. - T. 167. - № 3. - C. 765-769.e1.

Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa / J.E. Wagner [h gp.] // The New England Journal of Medicine. - 2010. - T. 363. - № 7. - C. 629-639. Replenishment of type VII collagen and re-epithelialization of chronically ulcerated skin after intradermal administration of allogeneic mesenchymal stromal cells in two patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa / P. Conget [h gp.] // Cytotherapy. - 2010. - T. 12. - № 3. - C. 429-431.

Treatment of dystrophic epidermolysis bullosa with bone marrow non-hematopoeitic stem cells: a randomized controlled trial / M. El-Darouti [h gp.] // Dermatologic Therapy. - 2016. -T. 29. - Treatment of dystrophic epidermolysis bullosa with bone marrow non-hematopoeitic stem cells. - № 2. - C. 96-100.

Perdoni C. Preconditioning of mesenchymal stem cells for improved transplantation efficacy in recessive dystrophic epidermolysis bullosa / C. Perdoni, J.A. McGrath, J. Tolar // Stem Cell Research & Therapy. - 2014. - T. 5. - № 6. - C. 121.

Potential of Systemic Allogeneic Mesenchymal Stromal Cell Therapy for Children with Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa / G. Petrof [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2015. - T. 135. - № 9. - C. 2319-2321.

Human COL7A1-corrected induced pluripotent stem cells for the treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa / V. Sebastiano [h gp.] // Science Translational Medicine. -2014. - T. 6. - № 264. - C. 264ra163.

Shinkuma S. Site-specific genome editing for correction of induced pluripotent stem cells derived from dominant dystrophic epidermolysis bullosa / S. Shinkuma, Z. Guo, A.M. Christiano // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2016. - T. 113. - № 20. - C. 5676-5681.

Patient-specific naturally gene-reverted induced pluripotent stem cells in recessive dystrophic epidermolysis bullosa / J. Tolar [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2014. -T. 134. - № 5. - C. 1246-1254.

Induced pluripotent stem cells from human revertant keratinocytes for the treatment of epidermolysis bullosa / N. Umegaki-Arao [h gp.] // Science Translational Medicine. - 2014. -T. 6. - № 264. - C. 264ra164.

Genetically corrected iPSCs as cell therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa / D. Wenzel [h gp.] // Science Translational Medicine. - 2014. - T. 6. - № 264. - C. 264ra165. Long-term stability and safety of transgenic cultured epidermal stem cells in gene therapy of junctional epidermolysis bullosa / L. De Rosa [h gp.] // Stem Cell Reports. - 2014. - T. 2. -№ 1. - C. 1-8.

Long-term type VII collagen restoration to human epidermolysis bullosa skin tissue / Z. Siprashvili [h gp.] // Human Gene Therapy. - 2010. - T. 21. - № 10. - C. 1299-1310. Sense from nonsense: therapies for premature stop codon diseases / L. Bidou [h gp.] // Trends in Molecular Medicine. - 2012. - T. 18. - Sense from nonsense. - № 11. - C. 679-688. Trans-splicing improvement by the combined application of antisense strategies / U. Koller [h

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

gp.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2015. - T. 16. - № 1. - C. 1179-1191. Antisense-mediated exon skipping to reframe transcripts / S. Turczynski [h gp.] // Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). - 2012. - T. 867. - C. 221-238. Gene Editing for the Efficient Correction of a Recurrent COL7A1 Mutation in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Keratinocytes / C. Chamorro [h gp.] // Molecular Therapy. Nucleic Acids. - 2016. - T. 5. - C. e307.

Sadelain M. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome / M. Sadelain, E.P. Papapetrou, F.D. Bushman // Nature Reviews. Cancer. - 2011. - T. 12. - № 1. - C. 51-58. A hypomorphic mouse model of dystrophic epidermolysis bullosa reveals mechanisms of disease and response to fibroblast therapy / A. Fritsch [h gp.] // The Journal of Clinical Investigation. - 2008. - T. 118. - № 5. - C. 1669-1679.

A new mouse model of junctional epidermolysis bullosa: the LAMB3 628G>A knockin mouse / J. Hammersen [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2015. - T. 135. - A new mouse model of junctional epidermolysis bullosa. - № 3. - C. 921-924. Targeted inactivation of the type VII collagen gene (Col7a1) in mice results in severe blistering phenotype: a model for recessive dystrophic epidermolysis bullosa / S. Heinonen [h gp.] // Journal of Cell Science. - 1999. - T. 112 ( Pt 21). - Targeted inactivation of the type VII collagen gene (Col7a1) in mice results in severe blistering phenotype. - C. 3641-3648. Molecular identification of collagen 17a1 as a major genetic modifier of laminin gamma 2 mutation-induced junctional epidermolysis bullosa in mice / T.J. Sproule [h gp.] // PLoS genetics. - 2014. - T. 10. - № 2. - C. e1004068.

Zebrafish type XVII collagen: gene structures, expression profiles, and morpholino «knockdown» phenotypes / S.H. Kim [h gp.] // Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. - 2010. - T. 29. - Zebrafish type XVII collagen. - № 7. - C. 629-637. Li Q. Zebrafish as a model system to study skin biology and pathology / Q. Li, J. Uitto // The Journal of Investigative Dermatology. - 2014. - T. 134. - № 6. - C. 1-6. A Drosophila Model of Epidermolysis Bullosa Simplex / J. Bohnekamp [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2015. - T. 135. - № 8. - C. 2031-2039. Proteome alteration induced by hTERT transfection of human fibroblast cells / G.D. Mazzucchelli [h gp.] // Proteome Science. - 2008. - T. 6. - C. 12.

Long-term skin regeneration from a gene-targeted human epidermal stem cell clone / B. Duarte [h gp.] // Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. - 2014. -T. 22. - № 11. - C. 1878-1880.

Topical application of recombinant type VII collagen incorporates into the dermal-epidermal junction and promotes wound closure / X. Wang [h gp.] // Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. - 2013. - T. 21. - № 7. - C. 1335-1344. Gostynski A. Successful therapeutic transplantation of revertant skin in epidermolysis bullosa / A. Gostynski, A.M.G. Pasmooij, M.F. Jonkman // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2014. - T. 70. - № 1. - C. 98-101.

Potten C.S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell / C.S. Potten // Cell and Tissue Kinetics. - 1974. - T. 7. - The epidermal proliferative unit. - № 1. -C. 77-88.

Slack J.M. Stem cells in epithelial tissues / J.M. Slack // Science (New York, N.Y.). - 2000. -T. 287. - № 5457. - C. 1431-1433.

Fuchs E. Getting under the skin of epidermal morphogenesis / E. Fuchs, S. Raghavan // Nature Reviews. Genetics. - 2002. - T. 3. - № 3. - C. 199-209.

Watt F.M. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation / F.M. Watt // The EMBO journal. - 2002. - T. 21. - № 15. - C. 3919-3926. Kulukian A. Spindle orientation and epidermal morphogenesis / A. Kulukian, E. Fuchs // Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. -

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

2013. - T. 368. - № 1629. - C. 20130016.

Blanpain C. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin / C. Blanpain, E. Fuchs // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. - 2009. - T. 10. - Epidermal homeostasis. -№ 3. - C. 207-217.

Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture / E.S. Chermnykh [h gp.] // Histochemistry and Cell Biology. - 2010. - T. 133. - № 5. - C. 567-576. Proliferation of K19+ human epidermal keratinocytes in vitro / E.S. Chermnykh [h gp.] // Doklady biological sciences: proceedings of the Academy of Sciences of the USSR, Biological sciences sections. - 2007. - T. 416. - C. 406-408.

Hair Follicle Reconstruction and Stem Cells / E.P. Kalabusheva [et al.] // Hair and Scalp Disorders / eds. Z. Kutlubay, S. Serdaroglu. - InTech, 2017.

Rognoni E. Skin Cell Heterogeneity in Development, Wound Healing, and Cancer / E. Rognoni, F.M. Watt // Trends in Cell Biology. - 2018. - T. 28. - № 9. - C. 709-722. Takeo M. Wound healing and skin regeneration / M. Takeo, W. Lee, M. Ito // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. - 2015. - T. 5. - № 1. - C. a023267. Terskikh V.V. Label retaining cells and cutaneous stem cells / V.V. Terskikh, A.V. Vasiliev, E.A. Vorotelyak // Stem Cell Reviews and Reports. - 2012. - T. 8. - № 2. - C. 414-425. Cultured human keratinocytes retaining label for a long time / E.A. Vorotelyak [h gp.] // Doklady biological sciences: proceedings of the Academy of Sciences of the USSR, Biological sciences sections. - 2005. - T. 402. - C. 221-223.

Ex-vivo gene therapy restores LEKTI activity and corrects the architecture of Netherton syndrome-derived skin grafts / W.-L. Di [h gp.] // Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. - 2011. - T. 19. - № 2. - C. 408-416. Efficient Gene Reframing Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa with CRISPR/Cas9 / S. Takashima [et al.] // Journal of Investigative Dermatology. - 2019. -Vol. 139. - № 8. - P. 1711-1721.e4.

Gene Editing-Mediated Disruption of Epidermolytic Ichthyosis-Associated KRT10 Alleles Restores Filament Stability in Keratinocytes / O.P. March [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2019. - T. 139. - № 8. - C. 1699-1710.e6. Injection of recombinant human type VII collagen restores collagen function in dystrophic epidermolysis bullosa / D.T. Woodley [h gp.] // Nature Medicine. - 2004. - T. 10. - № 7. -C. 693-695.

Evaluation of Aminoglycoside and Non-Aminoglycoside Compounds for Stop-Codon Readthrough Therapy in Four Lysosomal Storage Diseases / M. Gomez-Grau [h gp.] // PloS One. - 2015. - T. 10. - № 8. - C. e0135873.

Gentamicin induces LAMB3 nonsense mutation readthrough and restores functional laminin 332 in junctional epidermolysis bullosa / V. Lincoln [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2018. - Vol. 115. - № 28. - P. E6536-E6545. Effect of Readthrough Treatment in Fibroblasts of Patients Affected by Lysosomal Diseases Caused by Premature Termination Codons / L. Matalonga [h gp.] // Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. - 2015. - T. 12. - № 4. - C. 874-886.

Impaired Tight Junctions in Atopic Dermatitis Skin and in a Skin-Equivalent Model Treated with Interleukin-17 / T. Yuki [et al.] // PLOS ONE. - 2016. - Vol. 11. - № 9. - P. e0161759. The development and characterization of an in vitro model of psoriasis / C.L. Barker [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2004. - T. 123. - № 5. - C. 892-901. A 3D in vitro model of the dermoepidermal junction amenable to mechanical testing / J.P. Jung [h gp.] // Journal of Biomedical Materials Research. Part A. - 2018. - T. 106. - № 12. -C. 3231-3238.

Increased expression of integrins and decreased apoptosis correlate with increased melanocyte

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

retention in cultured skin substitutes / V.B. Swope [h gp.] // Pigment Cell Research. - 2006. -T. 19. - № 5. - C. 424-433.

Functional melanocytes derived from human pluripotent stem cells engraft into pluristratified epidermis / X. Nissan [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2011. -Vol. 108. - № 36. - P. 14861-14866.

Reactivity of Langerhans cells in human reconstructed epidermis to known allergens and UV radiation / V. Facy [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2005. - Vol. 19. - № 6. - P. 787-795. Human Melanoma Progression in Skin Reconstructs: Biological Significance of bFGF / F. Meier [et al.] // The American Journal of Pathology. - 2000. - Vol. 156. - Human Melanoma Progression in Skin Reconstructs. - № 1. - P. 193-200.

Reepithelialization in focus: Non-invasive monitoring of epidermal wound healing in vitro / L. Kiesewetter [h gp.] // Biosensors & Bioelectronics. - 2019. - T. 142. - Reepithelialization in focus. - C. 111555.

The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm: an evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport / F. Netzlaff [h gp.] // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics: Official Journal of Arbeitsgemeinschaft Fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. - 2005. - T. 60. - The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm. - № 2. - C. 167-178. Keratinocyte-driven contraction of reconstructed human skin / K.H. Chakrabarty [h gp.] // Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. - 2001. - T. 9. - № 2. - C. 95-106.

Use of human reconstituted epidermis Episkin for assessment of weak phototoxic potential of chemical compounds / P. Portes [h gp.] // Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. - 2002. - T. 18. - № 2. - C. 96-102.

Chaplin A.V. The Human Microbiome / A.V. Chaplin, D.V. Rebrikov, M.N. Boldyreva // Bulletin of Russian State Medical University. - 2017. - № 2.

Epidermal-skin-test 1,000 (EST-1,000)--a new reconstructed epidermis for in vitro skin corrosivity testing / J. Hoffmann [h gp.] // Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. - 2005. - T. 19. - № 7. - C. 925-929. KeraSkinTM-VM: A novel reconstructed human epidermis model for skin irritation tests / K.-M. Jung [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2014. - Vol. 28. - KeraSkinTM-VM. - № 5. - P. 742-750. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing / T. do N. Pedrosa [et al.] // Toxicology in Vitro. - 2017. - Vol. 42. - P. 31-37.

The Human Papillomavirus Type 16 E6 and E7 Oncoproteins Dissociate Cellular Telomerase Activity from the Maintenance of Telomere Length * / H. Stoppler [h gp.] // Journal of Biological Chemistry. - 1997. - T. 272. - № 20. - C. 13332-13337.

Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM 1) / H.P. Baden [h gp.] // In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. - 1987. - T. 23. - № 3. - C. 205-213.

Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line / P. Boukamp [h gp.] // The Journal of Cell Biology. - 1988. - T. 106. - № 3. - C. 761-771. Normal Growth and Differentiation in a Spontaneously Immortalized Near-Diploid Human Keratinocyte Cell Line, NIKS / B.L. Allen-Hoffmann [et al.] // Journal of Investigative Dermatology. - 2000. - Vol. 114. - № 3. - P. 444-455.

p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines / T.A. Lehman [h gp.] // Carcinogenesis. - 1993. - T. 14. - № 5. - C. 833-839.

Kogut I. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into a keratinocyte lineage / I. Kogut, D R. Roop, G. Bilousova // Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). - 2014. -T. 1195. - C.1-12.

Choi M. Immortalization of Primary Keratinocytes and Its Application to Skin Research / M.

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

Choi, C. Lee // Biomolecules & Therapeutics. - 2015. - Т. 23. - № 5. - С. 391-399. Human Keratinocytes That Express hTERT and Also Bypass a p16INK4a-Enforced Mechanism That Limits Life Span Become Immortal yet Retain Normal Growth and Differentiation Characteristics / M.A. Dickson [et al.] // Molecular and Cellular Biology. -2000. - Vol. 20. - № 4. - P. 1436-1447.

Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models / J.P.H. Smits [и др.] // Scientific Reports. - 2017. - Т. 7. - № 1. - С. 11838. Telomerase expression in human somatic cells does not induce changes associated with a transformed phenotype / X.R. Jiang [и др.] // Nature Genetics. - 1999. - Т. 21. - № 1. -С.111-114.

Inactivation of p16INK4a (inhibitor of cyclin-dependent kinase 4A) immortalizes primary human keratinocytes by maintaining cells in the stem cell compartment / R. Maurelli [и др.] // FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2006. - Т. 20. - № 9. - С. 1516-1518.

HPV16 E7 protein and hTERT proteins defective for telomere maintenance cooperate to immortalize human keratinocytes / J. Miller [и др.] // PLoS pathogens. - 2013. - Т. 9. - № 4. -

C.e1003284.

Efficient immortalization of primary human cells by p16INK4a-specific short hairpin RNA or Bmi-1, combined with introduction of hTERT / K. Haga [и др.] // Cancer Science. - 2007. -Т. 98. - № 2. - С. 147-154.

Ozbun M.A. Using Organotypic (Raft) Epithelial Tissue Cultures for the Biosynthesis and Isolation of Infectious Human Papillomaviruses / M.A. Ozbun, N.A. Patterson // Current Protocols in Microbiology. - 2014. - Vol. 34. - № 1. - P. 14B.3.1-14B.3.18. Comparison of Three Isolation Techniques for Human Peripheral Blood Mononuclear Cells: Cell Recovery and Viability, Population Composition, and Cell Functionality / H.W. Grievink [и др.] // Biopreservation and Biobanking. - 2016. - Т. 14. - Comparison of Three Isolation Techniques for Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. - № 5. - С. 410-415. Tissue-engineered biological dressing accelerates skin wound healing in mice via formation of provisional connective tissue / E.S. Chermnykh [et al.] // Histology and Histopathology. -2018. - Vol. 33. - № 11. - P. 1189-1199.

Fiji: an open-source platform for biological-image analysis / J. Schindelin [и др.] // Nature Methods. - 2012. - Т. 9. - Fiji. - № 7. - С. 676-682.

Wound Healing Tool - ImageJ-macros - MRI's Redmine [Электронный ресурс]. - URL: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/W ound_Healing_Tool (дата обращения: 30.03.2021).

GitHub - nicjac/PHANTAST-FIJI: Repository for the FIJI/ImageJ implementation of the phase contrast microscopy segmentation toolbox (PHANTAST) [Электронный ресурс]. - URL: https://github.com/nicjac/PHANTAST-FIJI (дата обращения: 29.12.2020). Legland D. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ / D. Legland, I. Arganda-Carreras, P. Andrey // Bioinformatics. - 2016. - Т. 32. -MorphoLibJ. - № 22. - С. 3532-3534.

Meyer F. Morphological segmentation / F. Meyer, S. Beucher // Journal of Visual Communication and Image Representation. - 1990. - Vol. 1. - № 1. - P. 21-46. Teratoma Formation Assay for Assessing Pluripotency and Tumorigenicity of Pluripotent Stem Cells / S. Miyawaki [и др.] // Bio-protocol. - 2017. - Т. 7. - № 16. - С. e2518-e2518. Ruifrok A.C. Quantification of histochemical staining by color deconvolution / A.C. Ruifrok,

D.A. Johnston // Analytical and Quantitative Cytology and Histology. - 2001. - Т. 23. - № 4. -С. 291-299.

NHEJ-Mediated Repair of CRISPR-Cas9-Induced DNA Breaks Efficiently Corrects Mutations in HSPCs from Patients with Fanconi Anemia / F.J. Román-Rodríguez [и др.] // Cell Stem

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

Cell. - 2019. - T. 25. - № 5. - C. 607-621.e7.

Integrated design, execution, and analysis of arrayed and pooled CRISPR genome-editing experiments / M C. Canver [et al.] // Nature Protocols. - 2018. - Vol. 13. - № 5. - P. 946-986. Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients: genetic and functional analyses / P.A. Coulombe [h gp.] // Cell. - 1991. - T. 66. - Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients. - № 6. - C. 1301-1311. Fine J.D. Inherited blistering diseases of the skin / J.D. Fine, L.B. Johnson, J.T. Wright // Pediatrician. - 1991. - T. 18. - № 3. - C. 175-187.

Epidermolysis Bullosa Simplex (Dowling-Meara Type) Is a Genetic Disease Characterized by an Abnormal Keratin-Filament Network Involving Keratins K5 and K14 / A. Ishida-Yamamoto [et al.] // Journal of Investigative Dermatology. - 1991. - Vol. 97. - № 6. - P. 959-968. Disease severity correlates with position of keratin point mutations in patients with epidermolysis bullosa simplex. / A. Letai [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - Vol. 90. - № 8. - P. 3197-3201.

Treatment of keratinocytes with 4-phenylbutyrate in epidermolysis bullosa: Lessons for therapies in keratin disorders / M. Spörrer [h gp.] // EBioMedicine. - 2019. - T. 44. -Treatment of keratinocytes with 4-phenylbutyrate in epidermolysis bullosa. - C. 502-515. Pfendner E.G. Dystrophic Epidermolysis Bullosa / E.G. Pfendner, A.W. Lucky // GeneReviews® / peg. M.P. Adam [h gp.]. - Seattle (WA): University of Washington, Seattle, 1993.

The inversa type of recessive dystrophic epidermolysis bullosa is caused by specific arginine and glycine substitutions in type VII collagen / P.C. van den Akker [h gp.] // Journal of Medical Genetics. - 2011. - T. 48. - № 3. - C. 160-167.

High frequency of the 425A-->G splice-site mutation and novel mutations of the COL7A1 gene in central Europe: significance for future mutation detection strategies in dystrophic epidermolysis bullosa / M. Csikos [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2005. -T. 152. - High frequency of the 425A-->G splice-site mutation and novel mutations of the COL7A1 gene in central Europe. - № 5. - C. 879-886.

Characterization of patients with dystrophic epidermolysis bullosa for collagen VII therapy / E.S. Gorell [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2015. - T. 173. - № 3. - C. 821823.

Analysis of the COL7A1 gene in Czech patients with dystrophic epidermolysis bullosa reveals novel and recurrent mutations / B. Jerabkova [h gp.] // Journal of Dermatological Science. -2010. - T. 59. - № 2. - C. 136-140.

Dystrophic epidermolysis bullosa inversa with COL7A1 mutations and absence of GDA-J/F3 protein / P. Kahofer [h gp.] // Pediatric Dermatology. - 2003. - T. 20. - № 3. - C. 243-248. Forty-two novel COL7A1 mutations and the role of a frequent single nucleotide polymorphism in the MMP1 promoter in modulation of disease severity in a large European dystrophic epidermolysis bullosa cohort / J.S. Kern [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2009. - T. 161. - № 5. - C. 1089-1097.

Identical glycine substitution mutations in type VII collagen may underlie both dominant and recessive forms of dystrophic epidermolysis bullosa / N. Almaani [h gp.] // Acta Dermato-Venereologica. - 2011. - T. 91. - № 3. - C. 262-266.

The epitope for anti-type VII collagen monoclonal antibody (LH7:2) locates at the central region of the N-terminal non-collagenous domain of type VII collagen / T. Tanaka [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 1994. - T. 131. - The epitope for anti-type VII collagen monoclonal antibody (LH7. - № 4. - C. 472-476.

Woodley D.T. Autoimmunity to Type VII Collagen: Epidermolysis Bullosa Acquisita / D.T. Woodley, J. Remington, M. Chen // Clinical Reviews in Allergy & Immunology. - 2007. -Vol. 33. - Autoimmunity to Type VII Collagen. - № 1. - P. 78-84.

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

Immunohistological detection of proliferating cells in normal and psoriatic epidermis using Ki-67 monoclonal antibody / M. Ando [et al.] // Journal of Dermatological Science. - 1990. -Vol. 1. - № 6. - P. 441-446.

The Role of Integrins in the Development and Homeostasis of the Epidermis and Skin Appendages / A.L. Rippa [et al.] // Acta Naturae. - 2013. - Vol. 5. - № 4. - P. 22-33. Kim N.W. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP) / N.W. Kim, F. Wu // Nucleic Acids Research.

- 1997. - Vol. 25. - № 13. - P. 2595-2597.

Keratin 5/14-mediated cell differentiation and transformation are regulated by TAp63 and Notch-1 in oral squamous cell carcinoma-derived cells / S.S. Srivastava [h gp.] // Oncology reports. - 2018. - T. 39. - № 5. - C. 2393-2401.

Epidermal differentiation and basement membrane formation by HaCaT cells in surface transplants / D. Breitkreutz [h gp.] // European Journal of Cell Biology. - 1998. - T. 75. - № 3.

- C. 273-286.

Pfendner E. Epidermolysis bullosa carrier frequencies in the US population / E. Pfendner, J. Uitto, J.D. Fine // The Journal of Investigative Dermatology. - 2001. - T. 116. - № 3. -C. 483-484.

Mutations in KRT5 and KRT14 cause epidermolysis bullosa simplex in 75% of the patients / M C. Bolling [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2011. - T. 164. - № 3. - C. 637644.

Density-dependent modulation of synthesis of keratins 1 and 10 in the human keratinocyte line HACAT and in ras-transfected tumorigenic clones / C.M. Ryle [h gp.] // Differentiation; Research in Biological Diversity. - 1989. - T. 40. - № 1. - C. 42-54.

Conserved segments 1A and 2B of the intermediate filament dimer: their atomic structures and role in filament assembly / S.V. Strelkov [h gp.] // The EMBO Journal. - 2002. - T. 21. -Conserved segments 1A and 2B of the intermediate filament dimer. - № 6. - C. 1255-1266. Wilson A.K. The roles of K5 and K14 head, tail, and R/K L L E G E domains in keratin filament assembly in vitro / A.K. Wilson, P.A. Coulombe, E. Fuchs // The Journal of Cell Biology. - 1992. - T. 119. - № 2. - C. 401-414.

Inherited Epidermolysis Bullosa: creation a desease model with CRISPR/Cas9 system / N.G. Gurskaya [et al.] // Journal of Biotechnology. - 2019. - Vol. 305. - Inherited Epidermolysis Bullosa. - № S.

Generation and characterization of epidermolysis bullosa simplex cell lines: scratch assays show faster migration with disruptive keratin mutations / S.M. Morley [h gp.] // The British Journal of Dermatology. - 2003. - T. 149. - Generation and characterization of epidermolysis bullosa simplex cell lines. - № 1. - C. 46-58.

Pregnancy after PGD for recessive dystrophic epidermolysis bullosa inversa: genetics and preimplantation genetics / X. Vendrell [et al.] // Journal of Assisted Reproduction and Genetics.

- 2011. - Vol. 28. - Pregnancy after PGD for recessive dystrophic epidermolysis bullosa inversa. - № 9. - P. 825-832.

Identification of two splicing mutations in the collagen type VII gene (COL7A1) of a patient

affected by the localisata variant of recessive dystrophic epidermolysis bullosa. / R. Gardella [h

gp.] // American Journal of Human Genetics. - 1996. - T. 59. - № 2. - C. 292-300.

March O.P. Context-Dependent Strategies for Enhanced Genome Editing of Genodermatoses /

O.P. March, T. Kocher, U. Koller // Cells. - 2020. - T. 9. - № 1.

Analyzing Effects of Naturally Occurring Missense Mutations / Z. Zhang [h gp.] //

Computational and Mathematical Methods in Medicine. - 2012. - T. 2012.

Comparative mutation detection screening of the type VII collagen gene (COL7A1) using the

protein truncation test, fluorescent chemical cleavage of mismatch, and conformation sensitive

gel electrophoresis / N.V. Whittock [h gp.] // The Journal of Investigative Dermatology. -