МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Пашковский, Павел Павлович

• Пашковский, Павел Павлович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пашковский, Павел Павлович

Глава 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Задачи исследования.

1.3. Научная новизна проведенных исследований.

1.4. Практическая ценность.

1.5. Апробация работы.

Глава 2.

2.1. Супероксиддисмутаза как один из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительного стресса.

2.2. Регуляция активности СОД на различных уровнях организации.

2.3. РНК-интерференция и косупрессия.

2.4. Малые РНК растений.

2.5. б1РНК растений.

2.5.1. Механизм продукции и функции з!РНК.

2.5.2. Биологическая роль з1РНК.

2.6. МиРНК растений.

2.7. Процессинг миРНК растений.

2.8. Эволюция растительных МИР генов.

2.9. Применение РНК-интерференции.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследований.

3.2. Проведение молекулярных анализов.

3.2.1. Выделение тотальной РНК из растительного материала фенол-хлороформным методом для определения уровня экспрессии микроРНК

3.2.2. Нозерн-блот анализ для детекции коротких РНК с ДНК-олигонуклеотидом.

3.2.3. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК для проведения ОТ-ПЦР.

3.2.4. Обратная транскрипция.

3.2.5. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации.

3.2.6. Условия проведения ПЦР-анализа.

3.2.7. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов.

3.3. Проведение вестерн-блот анализа.

3.3.1. Экстракция белков из тканей растения.

3.3.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле.

3.4. Математическая обработка данных.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Разработка методических подходов для исследования экспрессии miR398.

4.2. Анализ уровня экспрессии семейства miR398 у 77г. salsuginea при действии NaCl, света высокой интенсивности и UV-B облучения.

4.2.1. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии NaCl.

4.2.2. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии света высокой интенсивности.

4.2.3. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии UV-B облучения.

4.3. Исследование экспрессии miR398 в каллусной культуре.

77г. salsuginea.

4.4. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Тк ваЬщтеа на экспрессию генов МИР 398, С5Х>/ и ССЭ

4.5. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на содержание белков CSD1 и CCS1.

4.6. Исследование экспрессии генов Argonaute, DCL1, DDR1, SPL7, связанных с процессингом miR398 в растении Th. salsuginea.

4.7. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «МикроРНК опосредованная регуляция экспрессии генов Cu/Zn-СОД в растении Thellungiella salsuginea при стрессе»

Изучение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды остается одним из важных направлений физиологии растений. На сегодняшний день, очевидно, что существует сеть метаболических реакций, формирующих способность растений адаптироваться к изменяющимся условиям. Однако наименее изученным аспектом в проблеме устойчивости остается вопрос о регуляторных механизмах, позволяющих координировать функционирование всего комплекса реакций защитного ответа. Регуляция стрессорного ответа может осуществляться на генном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях организации. Одним из важных элементов посттранскрипционной регуляции активности генов является механизм умолкания генов, обусловленный РНК-интерференцией (РНКи). Обнаружение феномена РНКи в опытах на нематоде в 1998 году позволило выявить новый пласт регуляторных процессов, которые вовлечены в регуляцию экспрессии генов у большинства эукариот. В настоящее время механизм РНКи стал важным инструментом функциональной геномики, позволяющий специфически регулировать активность генов. В последнее время стало ясным, что в* основе механизмов РНКи лежат процессы умолкания генов, который обусловлен экспрессией малых РНК.

В растениях Arabidopsis thaliana L. было обнаружено два основных класса малых РНК размером 21-23 нк., участвующих в подавлении экспрессии генов: siPHK (small interfering РНК) (Baulcombe, 1999), миРНК (micro РНК) (Olsen et al, 2001). Природная роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции (Wang et al., 2008), в то время как миРНК закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (пре-миРНК), и регулируют активность генов в цитоплазме и в ядре (Bartel, 2004).

Недавние исследования показали, что миРНК способны регулировать целый комплекс биологических процессов в, растениях, такие как: гормональный контроль, иммунный ответ, полярный рост органов и адаптация к различным стрессам (Jones-Rhoades et al., 2004, Sunkar et al., 2006). Все больше появляется данных о том, что в условиях стресса изменяется как экспрессия миРНК, так и экспрессия мРНК - генов мишеней, а также активность миРНК-белковых комплексов. Например, у растений А. thaliana миРНК miR393, miR397b и miR402, играют важную роль в адаптации к засолению и засухе. Предполагается, что генами - мишенями для этих миРНК могут служить гены, ответственные за общие механизмы адаптации (Martin et.al., 2010).

Биогенез siPHK и миРНК протекает практически по идентичному механизму и контролируется общими генами. siPHK, как и миРНК, в составе комплекса с белками Argonaute (Ago) способны вызывать посттранскрипционное эндонуклеазное разрезание мРНК-мишени, при обнаружении участка нуклеотидной последовательности комплементарного малым РНК. Не полная комплементарность коротких РНК и участка мРНК-мишени приводит к трансляционному подавлению экспрессии гена или к эндонуклеазной деградации мРНК.

Снижение уровня экспрессии miR398, одной из консервативных миРНК (Bonnet et al., 2004; Bartel, 2004; Sunkar et al., 2006), было отмечено y A. thaliana под действием абиотических стресс-факторов и при бактериальном поражении (Sunkar et al., 2006; Jagadeeswaran et al., 2009). После проведения биоинформационного анализа было выдвинуто предположение о возможной посттранскрипционной miR398 опосредованной регуляции генов цитозольной CSD1, хлоропластной CSD2 Cu/Zn-СОД и субъединицы митохондриальной цитохром С оксидазы COX5b-l (Bonnet et al., 2004; Jones-Rhoades et al., 2004; Sunkar, 2006). Участие miR398 в регуляции гена CSD1 было показано Sunkar et al. 2006 на трансгенных растениях A. thaliana с устойчивой к действию miR398 формы гена CSD1. Такие растения проявляли большую устойчивость к окислительному стрессу, вызываемому различными абиотическими факторами.

В работах Yamasaki (Yamasaki et al., 2007) сообщалось, что изменение содержания меди в питательной среде растений влияет на экспрессию как минимум двух из трех МИР генов, кодирующих miR398 (miR398 b, с). При этом также изменялся уровень мРНК генов CSD, что указывало на посттранскрипционные механизмы их регуляции в условиях изменения концентрации меди в питательной среде. Несмотря на это, точный молекулярный механизм данного процесса остается пока не ясным.

Из всего вышесказанного становится очевидным, что изучение явления РНКи открывает большие перспективы для понимания механизмов миРНК опосредованной посттранскрипционной регуляции экспрессии генов в растениях, а также возможность создания трансгенных растений нового поколения, позволяющих максимально использовать адаптивный потенциал растений.

Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы исследовать роль микроРНК в посттранскрипционной регуляции генов CSD и CCS в растении Thellungiella salsuginea P. (Th. salsuginea) при действии стрессоров различной физической природы.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Пашковский, Павел Павлович

выводы

1. Установлены мишени действия miR398 в растении Th. salsuginea, в качестве которых выступают мРНК цитозольной Cu/Zn-СОД (CSD1) и мРНК шаперона меди CCS1, доставляющего ионы меди к апобелкам супероксиддисмутаз, имеющим цитозольную (CSD 1), хлоропластную (CSD2) и пероксисомальную (СБОЗУлокализацию.

2. Продемонстрировано наличие обратной связи между интенсивностью экспрессии генов CSD и CCS, с одной стороны, и уровнем miR398 в условиях стресса, с другой, что свидетельствует о функционировании механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии генов супероксиддисмутазы и металлошаперона меди.

3. Уровень экспрессии miR398 в растении Th. salsuginea определяется доступностью меди. Снижение концентрации меди в питательной среде сопровождается стимуляцией экспрессии miR398, снижением уровня мРНК цитоплазматической СОД, а также miR398 опосредованной регуляции CCS1 и усилением экспрессии транскрипционного фактора SPL7.

4. miR398 опосредованная регуляция экспрессии гена CSD1 не является орга-носпецифичной, а экспрессия miR398 в корнях и листьях имеет обратную зависимость.

5. Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии механизма miR398 опосредованной регуляции экспрессии стресс-зависимых генов у Th. salsuginea в условиях действия повреждающих абиотических факторов, а также о наличии у данной микроРНК множественных генов-мишеней, что позволяет одновременно контролировать протекание различных физиологических процессов.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карташов A.B., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Радюкина H.JL, Кузнецов Вл.В. (2007) Исследование ранней индукции защитных систем растений подорожника большого (Plantago major L.) под действием NaCl. В сб: Тезисы VI Съезда Общества физиологов растений. Сыктывкар, с. 176 — 177.

2. Карташов A.B., Радюкина П.Л., Пашковский П.П., Кузнецов

Вл.В. (2008) Роль систем антиоксидантной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516-522.

3. Пашковский ПЛ., Рязанский С.С, Кузнецов Вл.В. (2009) Экспрессия малых РНК под действием абиотических факторов у растений Thellungiella halophila. В сб: 13-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, с. 131 — 132.

4. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Радюкина Н.Л., Кузнецов

Вл.В. (2009) Влияние абиотических факторов на экспрессию малых РНК miR398 у растений Thellungiella halophila. В сб: Тезисы докладов Годичного собрания ОФР «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера», Апатиты, с. 260 — 261.

5. Иванов Ю.В., Карташов A.B., Радюкина Н.Л., Пашковский П.П., Юренков A.A. (2009) Участие пролина в защитном ответе растений на действие абиотических стрессоров. В сб: Тезисы докладов IX Международной конференции молодых учёных «Леса Евразии - Польские леса», Курник (Польша), с. 181 - 184.

6. Пашковский П.П., Рязанский С.С., Кузнецов Вл.В. (2010) МикроРНК опосредованная регуляция гена цитозольной Cu/Zn-СОД у растений Thellungiella halophila под действием абиотических стрессов. В сб:

14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, с. 321 - 322.

7. Пашковский II.IL,. Рязанский С.С., Радюкина H.JL, Гвоздев В.А., Кузнецов Вл.В., (2010) miR398 и регуляция экспрессии* гена цитоплазматической Gu/Zn-СОД в растениях Thellungiella halophila в, условиях-стресса. Физиология растений, 57, 707-714.

8. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Kuznetsov V. (2010) Cu/Zn superoxide dismutase* mRNA levels in Thellungiella halophila opposite correlate with expression of MIR398 under abiotic stresses. In: Abstr. Am. Soc. Plant Biol. Can. Soc. Plant Physiol., № P07023, p. 98.

9. Pashkovskiy P., Ryazansky S., Radyukina N., Kuznetsov V. (2010) Expression' of small microRNA MIR398 under abiotic stress in Thellungiella halophila plants. In: Abstr. FESPB-2010, p. 112.

10: Пашковский П.П., Радюкина H.JL (2010) МикроРНК и гены антиоксидантной защитной системы у растений Thellungiella halophila при стрессе. В сб: Всероссийский симпозиум "Растение и стресс", Москва, с. 269 -270.

11. Пашковский П.П., (2011) МикроРНК опосредованная? регуляция мРНК шаперона меди CCS1 и Cu/Zn СОД CSD1, 2 в растениях Thellungiella salsuginea. В сб: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология -наука XXI века". Пущино, с. 20 — 21.

12. Парфенов И.А., PeBHHaiT.A., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т. А. (2011) Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле. Прикладная биохимия и микробиология, 47,1-5.

13. Radyukina, N.L., Ivanov Yu.V., Pashkovskiy P.P., Kartashov A.V., Shevyakova N.I., Kuznecov VI.V. (2011) Regulation of gene expression governing proline metabolism in Thellungiella salsuginea by NaCl and paraquat. Russian Journal of Plant Physiology, 58, 643 - 652 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенных нами исследованиях было показано, что у Th. salsuginea интенсивность экспрессии miR398 изменяется не только при засолении, но и при действии света высокой интенсивности, UV-B облучения и в условиях различных концентраций меди в питательной среде. Это указывает на стресс-зависимость такого механизма регуляции, функционирующего как в устойчивых, так и в чувствительных растениях. Уровень экспрессии miR398 у Th. salsuginea в ответ на действие стрессора носит дозозависимый характер, что1 особенно четко проявляется в условиях засоления, а также действия5 различных концентраций меди. При этом наблюдалось отсутствие органоспецифичности. Можно полагать, что в основе этого явления» лежит интенсивность образования АФК, генерация которых возрастает при. усилении повреждающего воздействия стрессора. Нельзя исключать, что АФК, индуцирующие синтез антиоксидантных ферментов, одновременно ингибируют экспрессию miR398, что повышает эффективность функционирования клеточной антиоксидантной системы.

Анализ динамики уровней miR398 у растений Th. salsuginea в ответ на UV-B облучение и свет высокой интенсивности свидетельствует о том, что облучение листьев сопровождается чрезвычайно быстрым изменением экспрессии miR398 в корнях, которые непосредственно не подвергались стрессорному воздействию. Эти данные находятся в соответствии с ранее установленным фактом, согласно которому не только > листья, но и корни' вовлекаются в формирование защитного ответа на действие UV-B облучения. Результаты экспериментов позволяют высказать предположение, согласно которому экспрессия? miR398 находится под контролем сигналов» межорганного действия, которые инициируются^ в листе и передаются в корневую систему. Изучение роли miR398 в регуляции экспрессии CSD1 показало, что у галофита Th. salsuginea существует обратная зависимость между экспрессией генов CSD1 и miR398.

Из экспериментов по влиянию различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea следует, что изменение экспрессии miR398 может зависеть от содержания меди в клетках растений и являться своего рода маркером ее доступности из питательной среды. При внесении 1 мкМ< CuS04 наблюдалось снижение экспрессии miR398. Снижение экспрессии miR398 приводит к ослаблению посттранскрипционной регуляции мРНК, в З'-НТО областях которых были обнаружены сайты связывания с miR398. В результате этого наблюдалось увеличение содержания белков CCS1 и CSD1. Галофит Th. salsuginea проявляет значительную устойчивость к действию тяжелых металлов. В условиях отсутствия меди у Th. salsuginea происходило увеличение уровня-экспрессии двух обнаруженных генов Fe-СОД. Возможно, это было частью компенсаторного механизма при снижении содержания белка Cu/Zn-СОД и его активности. Анализ экспрессии гена шаперона меди CCS1 и содержания белка CCST в условиях действия различных, концентраций меди позволил предположить,, что miR398 способна регулировать Cu/Zn-СОД не только прямо, но и косвенно через регуляцию шаперона меди, доставляющего медь к апобелкам СОД.

Результаты данной работы внесли некоторую определенность в miR398 опосредованную регуляцию генов CSD при действии-стрессов на взрослых растениях Th. salsuginea. Суммируя все вышесказанное, можно» сделать вывод о том, чтов. растениях есть, определенная группа ферментов и белков, отвечающих на- стресс или онтогенетическое развитие, мРНК которых подвержены посттранскрипционной трансформации со1 стороны миРНК. Так как миРНК-RISC комплексы связываются с нетранслируемыми областями, они по сути позволяют разобщить в пространстве и во времени синтез белка и его регуляцию, позволяя тем самым, более быстро и адекватно реагировать на изменяющиеся условия внешней среды и заблаговременно принимать действия для экономии энергии и мобилизации защитных систем^ для выживания в новых условиях. Подводя итог проведенным исследованиям, мы предлагаем возможную схему функционирования механизма миРНК опосредованной регуляции в условиях действия на растения стрессоров различной природы, а также при различных концентрациях меди в питательной среде у растений Th. salsuginea (рис. 28).

Рис. 28 Схема возможной гш11398 опосредованной регуляции генов Сш^п-СОД в растении при стрессе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пашковский, Павел Павлович, 2011 год

1. Бараненко В.В. (2006) Супероксидцисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

2. Зайцев Г.Н. (1984) Математическая статистика в эксперементальной ботанике. М.: Наука 424 с.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование, под ред. акад. A.A. Баева. М.: Мир. 479 с.

4. Омельянчук H.A., Кузнецова Т.Н., Катохин A.B. (2005) МикроРНК растений. В сб: Информационный вестник ВОГиС, с. 440-450.

5. Остерман Л.А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 288 с.

6. Пешкова Г.А., Малышев Л.И. (1994) Флора Сибири. Т. 7. Н.:Наука, 159 с.

7. Радюкина Н.Л., Шашукова A.B., Мапелли С., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2010) Пролин регулирует уровень полиаминов в растениях шалфея в нормальных условиях и при UV-B облучении. Физиология растений, 57, 422-429.I

8. Радюкина Н.Л., Карташов A.B., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2007) Функционирование защитных систем у галофитов и гликофитов в условиях прогрессирующего засоления. Физиология растений, 54, 806-815.

9. Радюкина Н.Л., Карташов A.B., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл. В. (2007) Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления. Физиология растений, 54, 902-912.

10. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Бурьянов Я.И. (2010) Применение РНК-интерференции в метаболической инженерии растений.98

11. Биоорганическая химия, 36, 146-156.

12. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. (2008) Короткие РНК и канцерогенез. Биохимия,1Ъ, 640-655.

13. Abdel-Ghany S.E., Pilon М. (2008) MicroRNA-mediated,Systemic Down-regulation of Copper Protein Expression in »Response to,Low Copper availability in Arabidopsis.J. Biol.Chem., 283, 15932-15945:

14. Addo-Quaye C., Eshoo T.W., Bartel D.P., Axtell M.J. (2008) Endogenous siRNA and miRNA targets identified by sequencing of the Arabidopsis degradome. Curr.Biol, 18, 758-762.

15. Aleman L.M., Doench J., Sharp P.A. (2007) Comparison of siRNA induced off-target RNA and protein effects. RNA, 13, 385-395.

16. Ambros V., Lee R.C., Lavanway A., Williams P.T., Jewell D. (2003) MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans . Curr. Biol., 13, 807818.

17. Anantharaman V., Koonin E., Aravind L. (2002) Comparative genomics and evolution of proteins involved in RNA metabolism. Nucleic Acids Res., 30, 1427-1464.

18. Arteaga-Vazquez M., Caballero-Perez J., Vielle-Calzada J. (2006) A Family of microRNAs present in plants and animals. The Plant Cell, 18, 33553369.

19. Axtell M.J., Jan C., Rajagopalan R., Bartel D.P. (2006) A two-hit trigger for siRNA biogenesis in plants. Cell, 127, 565-577.

20. Bartel В., Bartel D.P. (2003) MicroRNAs: At the Root of Plant Development? Plant Physiology, 132, 709-717.

21. Bartel D. (2004) MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 281-297.

22. Bellaire B.A., Carmody J., Braud J., Gossett D., Banks S., Lucas M.,

23. Fowler T.E. (2000) Involvement of abscisic acid-dependent' and- -independent pathways in the upregulation of antioxidant enzyme activity during NaCl stress in cotton callus tissue. Free Radic. Res., 33, 531-545.

24. Beauchamp C.O., Fridovich I. (1973) Isozymes of superoxide dismutase from wheat germ. Biochim. biophys., 317, 50-64.

25. Bieza K., Lois R. (2001) An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol, 126, 1105-1115.

26. Birchler J;A., Bhadra M.P., Bhadra U. (2000) Making noise about silence: re-pression of repeated genes in animals. Curr. Opin: Genet., 10, 211-216.

27. Blokhina O.B., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen depravation stress. Review. Ann. Bot., 91, 179-194.

28. Bohnsack MiT., Czaplinski K., Gorlich D. (2004) Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA, 10, 185-191.

29. Bonnet E., Wuyts J., Rouze P., Van de Peer Y.(2004) Evidence that microRNA precursors, unlike other non-coding RNAs, have lower folding free energies than random sequences. Bioinformatics, 17, 2911-2917.

30. Buchon N., Vaury C. (2006) RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements. Heredity, 96, 195-202.

31. Burkhead J.L., Reynolds K.A., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Pilon M.2009) Copperhomeostasis. New Phytologist, 182, 799-816;

32. Carthew R.W., Sontheimer E.J. (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 136, 642-655.

33. Gasano B.Mi, Martin M;, Sabater B; (1994) Sensitivity to superoxide;dismutase transcript; levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves. Plant Physiol., 106, 1033-1039:

34. Cerutti H., Casas-Mollano J. (2006) On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man: Curr Genet, 50, 81-99.

35. Chapman E.J., Carrington J.C. (2007) Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways; Nat. Rev. Genet., 8, 884—896.

36. Cogoni C., Macino, G. (1999) Homology-dependent; gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Curr. Opin. Microbiol., 2, 657-662.

37. Dunoyer P., Lecellier C.Hi,. Parizotto E.A., Himber C., Voinnet O.2004) Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing: Plant Cell, 16, 1235-1250.

38. Eulalio A.,,Rehwinkel J., Strieker M., Huntzinger E., Yang S.F., Doerks

39. T., Dorner S., Bork P., Boutros M., Izaurralde E. (2007) Target-specific requirements for enhancers of decapping in miRNA-mediated gene silencing. Genes Dev., 21; 2558-2570.

40. Dugas D.V., Bartel B. (2008) Sucrose Induction of Arabidopsis miR398 represses two Cu/Zn superoxide dismutases. Plant Mol. Biol., 67,403-417.

41. Fahlgren N., Howell M:D., Kasschau K.D., Chapman E.J., Sullivant

42. G.M:, Gumbie J:S., Givan S.A., Law T.F;, Grant S.R., Dangl J;L., Carrington.

43. J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. Plos one, 10,1371-1376.

44. Fang Y., Spector D.L. (2007) Identification of nuclear dicing bodies containing proteins for microRNA biogenesis in living Arabidopsis plants. Curr. Biol., 17, 818-823.

45. Forstemann K., Horwich M.D., Wee L., Tomari Y., Zamore P.D: (2007> Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct Argonaute protein complexes after production by Dicer-1. Cell, 130, 287-297.

46. Franco-Zorrilla J.M., Valli A., Todesco M., Mateos L, Puga M.I., Rubio-Somoza I., Leyva A., Weigel D., Garcia J.A., Paz-Ares J. (2007) Targetmimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nat.1. Genet., 39, 1033-1037.

47. Fujii H., Chiou T.J., Lin S.I., Aung K., Zhu J.K. (2005) A miRNA involved in phosphate-starvation response in Arabidopsis. Curr. Biol., 15, 20382043.

48. Garcia D. (2008) A miRacle in plant development: Role of microRNAs in cell differentiation and patterning. Semin. Cell Dev. Biol., 19, 586-595

49. Goeres D.G., Van Norman'J.M., Zhang W., Fauver N.A., Spencer M.L., Sieburth L.E. (2007) Components of the Arabidopsis mRNA decapping complex are required for early seedling development. Plant Cell, 19, 1549-1564'.

50. Golden D.E., Gerbasi V.R:, Sontheimer E.J. (2008) An inside job for siRNAs. Mol. Cell, 31; 309-312.

51. Goldstein S., Meyerstein D., Czapski G. (1993) The Fenton reagents: Free Radical Biology and Medicine, 15,435-445.

52. Gregory B.D:, O'Malley R:C., Lister R., Urich M.A., Tonti-Filippini J., Chen H., Millar A.H., Ecker J.R. (2008) A link between RNA metabolism and silencing affecting Arabidopsis development. Dev. Cell, 14, 854-866.

53. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kobayashi.RI, Hannon G.J.2001)' Argonaute2, a link between genetic and biochemical analysis of RNAi. Science, 293, 1146-1150.

54. Hernandez JjA., Jimenes A., Mullineaux P., Sevilla F. (2000) Tolerance of pea (Pisum sativum L.) to long-term salt stress is associated with the induction of antioxidant defences. Plant Cell Environ., 23, 853-862.

55. Hidema J., Kumagai T. (2006) Sensitivity of rice to ultraviolet-B radiation Ann. Bot, 97, 933-942.

56. Horwich M.D., Li C., Matranga C., Vagin V., Farley G., Wang P., Zamore P.D. (2007) The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl,modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. Curr. Biol, 17, 1265-1272.

57. Hutvagner G., Zamore P.D. (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 297, 2056-2060.

58. Huntzinger E., Izaurralde E. (2011) Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet., 12, 99-110.

59. Jagadeesvvaran G., Saini A., Sunkar R. (2009) Biotic and abiotic stress down regulate miR398 expression. Planta, 229,1009-1014.

60. Jithesh M. N., Prashanth S.R., Sivaprakash K.R., Parida A.K. (2006)

61. Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in stress defense, India Journal of Genetics, 85, 237-254.

62. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. (2004) Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 14, 787-799.

63. Jones L., Hamilton A.J., Voinnet O., Thomas C.L., Maule A.J., Baulcombe D.C. (1999) RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing. The Plant cell, 11, 2291-2301.

64. Jover-Gil S., Candela H., Ponce M. (2005) Plant microRNAs and development Int. J. Dev. Biol., 49, 733-744.

65. Kaminaka H., Morita S., Tokumoto M., Masumura T., Tanaka K.1999) Differential gene expression of rice superoxide dismutase isoforms tooxidative and anvironmental stresses. Free Radic. Res., 31, 219-225.

66. Katiyar-Agarwal S., Morgan R., Dahlbeck D., Borsani O., Villegas A.,

67. Zhu J.K., Staskawicz B.J., Jin H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. PNAS, 103, 18002-18007.

68. Kennedy S., Wang D., Ruvkun G. (2004) A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature, 427, 645-649.

69. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S.D. (2003) Functional siRNAs and« miRNAs exhibit strand bias. Cell, 115, 209-216.

70. Kim V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, 376-385.

71. Kiriakidou M., Tan G.S., Lamprinaki S., Planell-Saguer M., Nelson P.T., Mourelatos Z. (2007) An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell, 129, 1141-1151.

72. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. (1998) Superoxide dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiol, 118, 637-650.

73. Kurepa J., Herouart D., Montagu V.M., Inze D. (1997) Differential expression of Cu/Zn- and Fe-superoxide dismutase genes of tobacco during development, oxidative stress and hormonal treatment. Plant Cell Physiol38, 463-470.

74. Kurihara Y., Takashi Y., Watanabe Y. (2006) The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. RNA, 12, 206-212.

75. Laemmli U.K.(1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

76. Lee Y., Kim M., Han J., Yeom K.H., Lee S., Baek S.H., Kim V.N. (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23,4051-4060.

77. Li J., Yang Z., Yu B., Liu J., Chen X. (2005) Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3"-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr. Biol, 15, 1501-1507.

78. Liu C.G., Calin G.A., Meloon B., Gamliel N., Sevignani C., Ferracin M., Dumitru C.D., Shimizu M., Zupo S., Dono M. (2004) An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl Acad Sci., 101, 9740-9744.

79. Liu Q., Feng- Y., Zhu Z. (2008) Dicer-like (DCL) proteins in plants. Functional & Integrative Genomics, 9, 277-286.

80. Liu Z., Xiao H., Zheng X., Qiao X., Wang H. (2011) Silencing effect of shRNA expression vectors with stem length of 21, 27 or 29 bp. African Journal of Biotechnology, 10, 1073-1080.

81. Madamanchi N., Donahue J., Cramer C., Alscher R., Pederson K.1994) Differential response of Cu/Zn superoxide dismutase in.two pea cultivars during a short term exposure to sulfur dioxide. Plant Mol. Biol, 26, 95-103.

82. Mallory A.C., Reinhart B.J., Bartel D.P., Vance V.B., Bowman L.H.2002) A viral suppressor of RNA silencing differentially regulates the accumulation of short interfering RNAs and microRNAs in tobacco. PNAS, 99, 15228-15233.

83. Martin R.C., Liu P., Goloviznina N. A., Nonogaki H. (2010) microRNA, seeds, and Darwin?: diverse function, of miRNA in seed biology and plant responses to stress. Journal of Experimental Botany, 61, 2229-2234.

84. Martinez J. (2002) Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 110, 563-574.89i Martinez J., Tuschl T. (2004) RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev., 18? 975-980.*

85. Masclaux F.,.Charpenteau M.,,Takahashi T., Pont-Lezica R:, Gnlaud

86. J.P. (2004). Gene silencing using a heat-inducible RNAi system in Arabidopsis. Biochem Biophys Res Commun., 321, 364-369.

87. Matzke M., Matzke A.J., Kooter J.M. (2001) RNA: guiding gene silencing. Science, 293, 1080-1083.

88. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D.P., Zamore P.D. (2005) Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell, 123, 607-620:

89. Matts J., Jagadeeswaran G., Roe B.A., Sunkar R. (2010) Identification of microRNAs and their targets in switchgrass, a model biofuel plant species. J Plant Physiol., 167, 896-904.

90. Meaux J., Hu J.Y., Tartler U., Goebel U. (2008) Structurally different alleles,of the ath-MIR824 microRNA precursor- are maintained at high frequency in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 8994-8999.

91. Meng Y., Ma X., Chen D., Wu P., Chen M. (2010) MicroRNA-mediated signaling involved in plant, root development. Biochemical and Biophysical Research Communications, 393, 345-349.

92. Miyoshi K, Okada T.N, Siomi HI, Siomi M.C. (2009) Characterization of the miRNA-RISC loading complex and miRNA-RISC formed in the DrosophilamiRNA pathway. RNA, 15; 1282-1291.

93. Molnar A., Schwach F., Studholmc D.J., Thuenemann E.C., Baulcombe

94. Obbard D., Jiggins F., Halligan D., Littler T. (2006) Naturals selection drives extremely rapid evolution in.antiviral RNAi genes. Carr Biol:, 16, 580-585:

95. Okamura K., Ishizuka A., Siomi H., Siomi M.C. (2004) Distinct roles for Argonaute proteins in small» RNA-directed RNA. cleavage pathways. Genes & Dev., 18, 1655-1666.

96. OIsen P.H., Ambros V. (1999) The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation^ of translation. Dev. Biol., 216, 671- 680.

97. Palatnik J.F., Wollmann H., Schommer. C., Schwab R., Boisbouvier J., Rodriguez Ri, Warthmann N., Alien E., Dezulian T., Huson D. (2007) Sequence and expression differences underlie functional specialization of

98. Arabidopsis microRNAs miR159 and miR319. Dev. . Cell, 13, 115-125.i

99. Park M.Y., Wu G., Gonzalez-Sulser A., Vaucheret H., Poethig R.S.2005) Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3691-3696

100. Reinhart B.X, Slack F.J., Basson M., Pasquinelli A.E., Bettinger J.C., Rougvie A.E., Horvitz H;R., Ruvkun G. (2000) The 21-nucleotide letr7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans. JV«/Mre, 403, 901-906:

101. Scandalios J.G. (1997) Molecular genetics of superoxide* dismutase in p\mts.ln:.Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defensesy,

102. J. G. Scandalios. (ed.) New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, pp. 527-568.

103. Schwarz D.S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P.D.2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell, 115, 199208.

104. Slesak I., Karpinska B., Surowska E., Miszalski Z., Karpinski S. (2003)

105. Redox changes in the chloroplasts and hydrogen peroxide are essential forregulation of C3-CAM transition and photooxidative stress responses in theffacultative CAM plant Mesembtyanthenum crystallinum L. Plant Cell Physiol., 44, 573-581.

106. Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A., Green A.G., Waterhouse P.M. (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407,319-320.

107. Smith, P.K. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical. Biochem., 150, 76-85.

108. Sunkar R., Kapoor A., Zhu J.K. (2006) Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by down-regulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell, 18, 2051-2065.

109. Sunkar R., Chinnusamy V., Zhu J., Zhu J.K. (2007) Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends Plant1. Sci., 12, 301-309.

110. Talmor-Neiman M., Stav R., Frank W., Voss B., Arazi T. (2006) Novel micro-RNAs and intermediates of micro-RNA biogenesis from moss. Plant J., 47, 25-37.

111. Tobin, H., Staehnil T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 16,4350-4354.

112. Tomari Y., Du T., Zamore P.D. (2007) Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell, 57, 299-308.

113. Timmons L, Fire A. (1998) Specific interference by ingested. dsRNA. Nature, 29; 6705-6854.

114. Van der Krol A.R., Mur L.A., de Lange P., Mol J:N., Stuitje A.R. (1990) Inhibition of flower, pigmentation by antisense CHS genes: promoter and minimal sequence requirementsdfor the antisense effect. Plant Mol: Biol., 14,457-466:

115. Vazquez F.*, Vaucheret HI, Raj ago pa Ian R., Lepers C., Gasciolli V., Mallory A.C,. Hilbert J.L., Bartel D.P., Crete P. (2004) Endogenous transacting siRNAs regaulte the acccumulation of Arabidopsis mRNAs. MolCell, 16, 69-79.

116. Vazquez F., Blevins T., Ailhas J., Boiler T., Meins F. (2008) Evolution of Arabidopsis MIR genes generates novel microRNA classes. Nucleic Acids Res., 36, 6429-6438.

117. Vaucheret H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci., 13, 350358.

118. Vionnet O. (2009) Origin; biogenesis, and activity of plant microRNAs. Review. Cell, 136; 669-687.

119. Voinnet, O. (2008). Use, tolerance and avoidance of amplified' RNA silencing by plants. Trends Plant Sci., 13,317-328.

120. Wang P., Liang Z., Zeng J., Li W., Sun X., Miao Z., Tang K. (2008) Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels, via RNA silencing approaches. JBiosci., 33, 177-184.

121. Wang J.F., Zhou H., Chen Y.Q., Luo Q.J., Qu L.H. (2004) Identification of 20 microRNAs from Oryza sativa. Nucleic Acids Res., 32, 1688-1695.

122. Wang J.W., Schwab R., Czech B., Mica E., Weigel D. (2008) Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 20,1231-1243.

123. Williamson Jf D^, Scandalios J.G. (1992) Differential response of maize catalases and superoxide dismutases to the photoactivated fungal toxin cercosporin. Plant J., 2, 351-358.

124. Xie Z., Allen E., Fahlgren N., Calamar A., Givan S.A., Carrington J.C.2005) Expression of Arabidopsis MI RNA Genes. Genetics, genomics, and molecular evohitiom Plant Physiology, 138, 2145-2154.

125. Xie Z., Kasschau K.D., Carrington J.C. (2003) Negative feedback regulation of Dicer-Likcl in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Curr.Biol., 13,784-789.

126. Yamamoto Y.Y., Sieburth L., Voinnet O. (2008) Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs. Science, 320, 1185-1190.

127. Yamasaki H., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Kobayashi Y., Shikanai T., Pilon M. (2007) Regulation of copper homeostasis by micro-RNA in Arabidopsis J. Biol Chem., 282, 16369-16378.

128. Yamasakia Hi, Hayashib M., Fükazawab M., Kobayashia Y., Shikanaic

129. T. (2009) SQUAMOSA Promoter, Binding Protein-Like7 is a central regulator for Copper Homeostasis in Arabidopsis; The Plant Cell, 21, 347-361.

130. Yang Z., Ebright Y.W., Yu B., Chen X. (2006) HEN1 recognizes 21-24 nt small RNA duplexes and deposits a methyl group onto the X OH of the 3'. terminal nucleotide. Nucleic Acids Res., 34, 667-675.

131. Yi R., Qin Y., Macara I.G., Cullen B.R. (2003) Exportin-5 mediates thenuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev., 17, 30113016.

132. Zamore P.D., Haley B. (2005) Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 309, 1519-1524.

133. Zhang B., Pan X., Cannon C.H., Cobb G.P., Anderson T.A. (2006) Conservation and divergence of plant microRNA genes. Plant J., 46, 243-259.

134. Zhang B., Pan X., Stellwag E.J. (2008a) Identification of soybean microRNAs and their targets. Planta, 229,161-182.

135. Zhang Z., Wei L., Zou X., TaoY., Liu Z., Zheng Y. (2008b) Submergence-responsive, microRNAs are potentially involved in the regulation of morphological and metabolic adaptations in maize root cells. Ann. Bot., 102, 509519.

136. Zeng Y., Yi R., Cullen B.R. (2005) Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha. The EMBO Journal, 24, 138-148.

137. Zhu D., Scandalios J.G. (1994) Differential accumulation of manganese-superoxide dismutase transcripts in maze in response to abscisic acid and high osmoticum. Plant Physiol., 106, 173-178.

138. Zhou X., Wang G., Zhang W. (2007) UV-B Responsive microRNA genes in Arabidopsis thaliana. Mol. Syst. Biol., 3,1-16.

139. Zhu C., Ding Y., Liu H. (2011) miR398 and plant stress responses. Physiol Plantarum, 142, 63-71.