Методические подходы к быстрому картированию сайтов расщепления генома тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Гайнетдинов, Ильдар Ваисович

• Гайнетдинов, Ильдар Ваисович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гайнетдинов, Ильдар Ваисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ Й ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К

ИЗУЧЕНИЮ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение. Метилирование ДНК и возможные его функции

1.1 Способы определения общего количества 5-метил-цитозина

1.2 Применение метил-чувствительных рестрикционных эндонуклеаз

1.3 Секвенирование по Максаму-Гилберту

1.4 Бисулъфитное секвенирование

1.5 МВИ-аффинная колонка 25 Заключение

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

2.1 Создание и оптимизация нового метода

2.2 Компьютерная автоматизация обработки получаемых результатов и их картирования

2.2.1 Формирование списка всех 21 -нуклеотидныхрепрезентативных последовательностей, полученных в результате секвенирования конкатмеров

2.2.2 Создание базы данных всех присутствующих в исследуемом локусе 21-нуклеотидных фрагментов, фланкирующих сайты НраП; которые можно картировать с помощью МЗ&СС

2.2.3 Картирование имеющихся 21-нуклеотидных фрагментов по базе исследуемого локуса

2.3 Подходы к функциональному анализу получаемых результатов и их компьютерная реализация

2.3:1 Визуализация результатов картирования* 36 2.3.2 Нормализация и последующая визуализация нормализованных результатов

2.4 Получение распределения гипометилированных сайтов НраП в локусе В19Б208-СОХ7АТ19 хромосомы для нормальной легочной ткани человека

ГЛАВА III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

5.2. Методы 47 ВЫВОДЫ 56 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ; 57 БЛАГОДАРНОСТИ 66 ПРИЛОЖЕНИЯ >1«1>1 I., I I . . м ■■

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SINE - Short Interspersed Nuclear Elements (короткие диспергированные повторы); ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; ОФ-ВЭЖХ - обратно фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; SAM - S-аденозил-метионин, ПЦР - полимеразная цепная реакция; ERMA - enzyme regional methylation assay; ПДРФ - полиморфизм длин рестриктных фрагментов, LM-PCR - ligation mediated PCR (ПЦР с предварительным лиированием адаптерных последовательностей); ПДАФ -полиморфизм длин амплификационных фрагментов, MSAP - methylation sensitive amplification polymorphism; MSRF - methylation-sensitive restriction fingerprinting (метил-чувствительный рестрикционных фингерпринтинг); RLGS-M - restriction landmark genomic scanning using methylation-sensitive restriction endonucleases (метил-чувствительное геномное сканирование с использованием двумерного гель-электрофореза); MCA - methylated CpG island amplification (амплификация метилированных CpG островков); NGSCC - Non-methylated Genomic Sites Coincidence Cloning (клонирование совпадающих неметилированных последовательностей); URS — Unmethylated Restriction Sites (неметилированный сайт рестрикции); MSP - methylation-specific PCR (метил-специфический ПЦР); MS-SnuPe — methylation-sensitive single nucleotide primer extension (метил-чувствительная однонуклеотидная достройка праймера); COBRA - combined bisulfite restriction analysis (комбинированный' бисульфит-рестриктный анализ); SSCP - single stranded confo rmational pol ymorphism (одноцепочечный конформационный полиморфизм); MBD - methyl-CpG-binding domain (домен, связывающий метилированные CpG динуклеотиды); DMH - differential methylation hybridization (дифференциальная по метилированию гибридизация); ICEAMP - identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (идентификация CpG островков с различным профилем метилирования); SAGE - Serial Analysis of Gene Expression < (серийный анализ экспрессии генов); ПААГ

V, I , . I полиакриламидный гель; RIDGES - Rapid Identification of Genomic Splits (быстрое ь, ! и ■ i картирование сайтов расщепления генома); UCSC - University of California, Santa-Cruz (Калифорнийский Университет, Санта-Круз).

ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Введение. Метилирование ДНК и возможные его функции

Среди известных модификаций ДНК у высших эукариот наиболее изученной является метилирование, которое происходит по пятому углеродному положению пиримидинового кольца цитозина. Образующийся при этом 5-метил-цитозин выполняет эпигенетическую функцию, заключающуюся в наследуемой компартментализации генома, например, на транскрипционно активные и неактивные участки.

Важно отметить, что в подавляющем числе случаев (главным образом, это относится к позвоночным животным) метилируется лишь цитозин, входящий в состав симметричного динуклеотида^, Исторически принято обозначать его как

•! Н !

Срв или в случае модификации тСрО, отмечая тем самым, что оба основания принадлежат одной цепи ДНК. В случае же двухцепочечной молекулы возможны три? качественных состояния:

- неметилированное - ^^ mCpG Ср G.

- полуметилированное - QpC или Gpmc> mCp G

- полностью метилированное - Q^m^,

Возможность наследования метилирования в ряду клеточных поколений по полуконсервативному механизму (Bird, 1978) обусловлена именно симметричностью метилируемой последовательности и осуществляется благодаря наличию в ядре особых ферментов ДНК-метилтрансфераз (Bestor, 2000).

Среди возможных функций метилирования, нужно отметить, в частности, его способность участвовать в регуляции экспрессии тканеспецифических генов, регуляции транскрипции в процессе эмбриогенеза, поддержании стабильности хромосомного набора, канцерогенезе.

1.1 Способы определения общего количества 5-метил-цитозина

Изначально сведения о напитай в ДНК высших эукариот 5-метил-цитозина были получены в 1948 году Роллином Д. Хотчкиссом (Hotchkiss, 1948). Тогда, при фракционировании азотистых оснований и нуклеозидов, образующихся в результате гидролиза ДНК тимуса теленка соляной кислотой, ему удалось обнаружить "аномальное" основание, которое в силу сходства его спектра поглощения с цитозином было названо им "эпи-цитозином", а позже химически идентифицировано как 5-метилцитозин. Для подобного качественного анализа нуклеиновых кислот Хотчкисс использовал метод бумажной хроматографии в н-бутаноле. Почти одновременно очень схожий подход был предложен Эрнстом Вишером и Эрвином Чаргаффом (Vischer and Chargaff, 1948). Нужно отметить, что оба эти метода позволяют не только качественно, но также и количественно оценивать нуклеотидный состав ДНК.

Вслед за выше упомянутыми работами было предложено огромное количество различных модификаций метода хроматографического разделения азотистых оснований и их нуклеоз(т)идных производных (Vanyushin et al., 1968; Rubery and Newton, 1971). Все они. отличались от оригинальных как значительно возросшим разрешением, так и более надежными количественными", оценками: Также очень высокой чувствительностью обладает подход,, включающий предварительное радиоактивное мечение ДНК /л v/vo (Rubery and'Newton, 1973), в то же время это резко снижает точность количественной оценки; из-за возможного неравномерного включения метки (Harbers ei al., 1975). Нужно отметить также, что в случае некоторых, объектов (например, живые многоклеточные огранизмы) подобное мечение бывает • -Ii. ■.;• . О: невозможным.

Позже в связи с развитием усовершенствованных модификаций хроматографических методов были предложены новые способы, оценки содержания 5-метил-цитозина в ДНК. Среди них можно упомянуть газожидкостную (Razin and Sedat, 1977), ионообменную (Burtis,. 1970), а также высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ, Ehrlich, and Ehrlich,. 1979). При этом наибольшее распространение все же получила ВЭЖХ смеси мононуклеотидов, получаемой в результате либо химического (Catania et al., 1987; Eick et al., 1983), либо энзиматического гидролиза ДНК (нуклеаза PI, ДНКаза I, фосфодиэстераза яда змеи (Ehrlich et al., 1982) или же микрококковая нуклеаза вместе с щелочной фосфатазой (Leonard et al., 1993)). Последний обладает преимуществом, заключающемся в том, что он не сопровождается химической деградацией нуклеотидов (Kuo et al., 1980). Применение ВЭЖХ совместно с фотоспектрометрией позволяет определять наличие 5метил-цитозина в количествах исходного препарата от 2,5 мкг (Gama-Sosa et al, 1983). Чувствительность этого метода была увеличена до 180 фг 5-метил-цитозина в 10 пг смеси с немодифицированным основанием благодаря использованию массспектрометрии для детекции нуклеотидов, а в комбинации с радиоактивным мечением дала возможность определить фракции метил-цитозина в ДНК дрозофилы равные 0,05-0,1% (Gowher et al., 2000).

Развитие техники капиллярного электрофоеза позволило создать подход, имеющий ряд преимуществ по сравнению с ВЭЖХ: низкая стоимость, быстрота эксперимента, а также минимальное количество материала, требуемого для aHanH3a(Fraga et al., 2000). Получение смеси нуклеотидов из геномной ДНК может производиться как химическим, так и энзиматическим (нуклеаза Р1 и щелочная фосфатаза) способом. При этом химический гидролиз обычно сопровождается образованием сложных смесей полинуклеотидов и их производных,что снижает достоверность оценки. Примерно 0,5% модифицированного основания может быть обнаружено таким образом* в 1 мкг ДНК (Fraga et al., 2000). Дополнительное л' üi ' • • использование лазер-индуцированной флуоресценции и масс-спектрометрии увеличивает чувствительность до 10"5% (Sharma et al., 2000).

Для изучения метилирования ДНК применяли и фотометрические методы, основанные на тонких различиях спектров оснований и их производных. Но в виду своей очень низкой чувствительности они не получили широкого распространения (Vanyuchin et al., 1970).

Акцепторная способность ДНК в реакции энзиматического метилирования in vitro в присутствии меченого донора - [СНз- HJ-S-аденозил-метионина (SAM) - также позволяет оценивать степень метилирования ДНК (Sheid et al., 1968). Метод отличается относительной простотой исполнения, но требует наличия соответствующих i '.»i .,1,. ферментов (SssI ДНК метилтрансфераза) . При этом в первом приближении акцепторная способность препарата будет пропорциональна количеству неметилированных цитозиновых остатков. Выше описанный подход применяют в большинстве случаев лишь для получения качественных и относительных количественных оценок тотального статуса метилирования ДНК. Дополнительное же использование внутреннего стандарта (точного количества ДНК с известным статусом метилирования в сайтах, узнаваемых метил-трансферазой) позволяет перейти от относительной к абсолютной количественной оценке (Galm et al., 2002). Также особые модификации метода, включающие стадии обработки ДНК бисульфитом и последующей ПЦР со специфическими праймерами, позволяют ограничивать анализ определенными участками генома* (enzyme regional methylation assay, ERMA, Galm et al., 2002).

Также был предложен метод идентификации 5-метил-цитозина, основанный на реакции хлорацетальдегида с азотистыми основаниями, содержащими аминогруппу (Oakeley et al., 1999). Образующиеся при этом их производные можно детектировать методами флуорометрии. Для специфической идентификации метилированного цитозина предварительно проводят реакцию дезаминирования бисульфитом неметилированных оснований, а для освобождения г препарата от аденина, также способного к взаимодействию с хлорацетальдегидом, используют термическую кислотную апуринизацию. Чувствительность этого метода сравнима с таковой для ВЭЖХ, но не требует в отличие от последнего специального хроматографического оборудования, а также проводится, с использованием относительно недорогих и стабильных химических реагентов,

Методы гибридизации in situ также позволяют оценить общее содержание 5-метил-цитозина в геномной ДНК. В частности, иммунохимический подход, основанный на высокоаффинном взаимодействии антиген-антитело, позволяет с очень высокой степенью чувствительности1 («0,01%), а главное специфичности, идентифицировать 5-метил-цитозинт: суммарном препарате, его гидролизате, а также в отдельных клетках, в изолированных метафазных. хромосомах и в хроматине (таким образом, например, было установлено глобальное гипометилирование, неактивной X хромосомы (Bensaada et al., 1998)). Чаще всего применяют имму но ферментный (de Сароа et al., 1996) радиоиммунологический (Barbin et al., 1994) или флуоресцентный анализ ДНК (Miniou et al., 1994), иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране. Причем также возможно предварительное электрофоретическое фракционирование препарата, обработанного рестрикционной эндонуклеазой, в этом случае могут быть получены; ограниченные сведения; о распределении модифицированного основания; в анализируемом геноме (Tweedie et al., 1997). Подбор/моноклонального антитела для детекции является наиболее важным этапом в эксперименте. Зарекомендовавшим себя, .(•; .i. <■.< ¡iiii I. с> .".»t!j . . • • как взаимодействующее специфически, и количественно, явлется так. называемое антитело FMG9, дающее в сочетании с ELISA достаточно достоверные результаты (Mizugaki ef а/., 1996). - при этом все неметалированные цитозины подвергаются дезалишированию под действием бисульфита (см. ниже), а в процессе ПЦР амплификации уменьшается представленность молекул ДНК, содержащих модифицированные щггозиновые остатки; то есть, акцепторная способность полученного амплификата в этом случае будет пропорциональна количеству 5-метилцитозинов в исходном препарате.

Некоторые рестрикционные эндонуклеазы и iix метил-чувствительные изошизомеры также применяются для исследования метилирования (Singer et al, 1979а; Antequera et al, 1984; Tweedie et al, 1997). В частности, анализ наличия в препарате ДНК фракции, гидролизуемой некоторой рестрикционной эндонуклеазой, но устойчивой к действию ее метил-чувствительного изошизомера, позволяет получить сведения о количестве и распределении соответствующих сайтов в образце, содержащих 5-метил-цитозин. Очевидно, нужно учитывать, что анализу подвергается не весь геном, а лишь та часть цитозиновых остатков, которые входят в состав узнаваемой ферментами последовательности. Также этот подход может быть сопряжен с некоторыми артефактами вроде (i) частичной неферментативной деградации ДНК или, с другой стороны, (ii) ее неполного гидролиза ферментом (последнее может объясняться присутствием ингибитора или неполной депротеинизацией). И то, и другое обычно обусловлено загрязненностью используемых препаратов, по этой причине подобные эксперименты требуют исключительной чистоты анализируемых образцов. При этом рекомендуется включение внутреннего контроля эффективности гидролиза ферментом - радиоактивно меченой ДНК (для увеличения чувствительности), которую можно отличить от исследуемой и которая содержит сайты, узнаваемые используемой рестрикционной эндонуклеазой (Rein et al., 1998).

Наконец, некую минимальную информацию о рисунке распределения метилированных остатков цитозина в исследуемом препарате может дать анализ частот встречаемости динуклеотидов (метод "ближайшего соседа" (Josse et al, 1961)). При этом после предварительной ник-трансляции анализируемой ДНК в присутствии одного из четырех [a- P]-dNTP и последующего ее гидролиза микрококковой нуклеазой или фосфодиэстеразой селезенки теленка, образуются меченные З'-фосфатмононуклеотиды, исходно находившиеся в цепи с 5'-конца от включившегося dNTP.

Последующие хроматографическое разделение и количественный анализ .«,. ij |, ii. получившейся смеси позволяют получить сведения« о частотах встречаемости определенных динуклеотидов в исследуемом образце (от 5 мкг) с достоверностью от 0,01% (Gruenbaum et al, 1981). Дополнительно, неполный гидролиз ДНК расширяет возможности подобного анализа до олигонуклеотидов (Josse et al, 1961), а увеличение чувствительности может быть достигнуто специфическим in vivo мечением 5-метил-цитозина при помощи SAM (Antequera et al, 1984).

Таким образом, разнообразие подходов, предназначенных для идентификации общего количества 5-метил-цитозина, позволяют выбрать среди них максимально адекватный в отношении трудоемкости и требуемой чувствительности. Тем не менее, те сведения, которые они позволяют получить, недостаточны для анализа специфического рисунка распределения метилированных последовательностей в геноме и его динамики.

1.2 Применение метил-чувствительных рестрикционных эндонуклеаз

Одними из часто используемых подходов являются методы идентификации 5-метилцитозина, основанные на использовании метил-чувствительных рестрикционных эндонуклеаз. На сегодняшний день известно более трехсот подобных ферментов и около тридцати из них имеют метил-нечувствительные изошизомеры (McClelland et al., 1994).

Впервые возможность подобного рода подхода была предложена в работах Эдвина Саузерна и Эдриэна Бёрда по изучению метилирования генов рРНК амфибий (Bird and Southern, 1978). При этом использованные ими эндонуклеазы по-разному гидролизовали соматическую и ооцитарную рДНК, что, как было показано в этой работе, связано с различиями в степени их метилирования. Сходным образом Герард Роизес объяснял неравномерное распределение сайтов рестрикции тех же ферментов в повторах сателлитной ДНК теленка (Roizes, 1976). В обоих случаях исследователи работали с очищенными в градиенте хлористого цезия фракциями многокопийной ДНК, что, очевидно, значительно упрощало анализ. Для изучения же статуса метилирования специфических монокопийных геномных последовательностей подобный способ фракционирования не приго-ден, а использование пред-варительного клонирования или ПЦР амплификации приводит к утрате исходного рисунка метилирования (Gautier et

Геномная ДНК

ПЕТИЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ РЕСТРИКЦИОНЦАЯ, ЭНДОНУКЛЕАЗА

UU.v,

МЕТИЛ-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ РЕСТРИКЦИОННАЯ ЭНДОНУКЛЕАЗА

ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ САУЗЕРН БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ

ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Рисунок 1. Изучение статуса метилирования специфических сайтов гидролиза рестрикционных эн-а1., 1977). Тем не менее, для донуклеаз ) с использованием методов Саузерн блот-гибридизацни (слева, [О - специфический решения такой задачи зонд) и ПЦР' (справа, -праймеры). может быть исполь-зован метод, являющийся фактически одним из вари-антов анализа полиморфиз-ма длин рестриктных фраг-ментов (ПДРФ, Bird, 1978; Bird and Southern, 1978). В этом случае преперат исследуемой ДНК, обработанной метил-чувствительной рест-рикционной эндонуклеазой, предварительно фракционируют при помощи гель-электрофореза, иммобилизуют на нитроцеллюлозной мембране, а затем гибридизуют со специфическим зондом (Саузерн-блот гибридизация, рис. 1, слева). Последующий анализ длин полученных фраг-ментов позволяет сделать выводы о статусе метилирования исследуемой последовательности. Дополнительно в качестве контроля может быть использован соответствующий метил-нечувствительный изошизомер. Нужно также отметить, что применение этого довольно простого в своем экспериментальном исполнении подхода позволяет с удовлетворительной чувствительностью (от 10 % метилированных последовательностей в 10 мкг исходной ДНК) проводить быстрый анализ большого числа образцов.

Позже была предложена также более чувствительная модификация этого метода (от 0,1% метилированных последовательностей в 10 нг исходной ДНК), основанная на ПЦР амплификации исследуемой области генома после обработки препарата эндонуклеазой (Singer-Sam et al., 1990а). При этом только исходно метилированный и поэтому не подвергшийся гидролизу фрагмент ДНК будет амплифицироваться экспоненциально (рис. 1, справа). Количественно оценивать представленность метилированных и неметилированных последовательностей в исходном препарате позволяет так называемый "конкурентный" (competitive) ПЦР, где одна и та же пара праймеров используется для амплификации как геномной, так и идентичной ей, но к • •» О отличимой по размеру экзогенно добавленной ДНК (Singer-Sam et al, 1990b). Можно также использовать предварительное лигирование адаптеров к продуктам гидролиза и последующий ПЦР с одним специфическим праймером и другим, идентичным последовательности адаптера (ligation mediated PCR, LM-PCR). При этом амплифицироваться будут как гидролизованные, так и не гидролизованные (то есть метилированные) в исследуемом сайте фрагменты, а конечное количественное отношение продуктов амплификации будет соответствовать их представленности в исходной смеси (Steigerwald et al., 1990).

Тем не менее, очевидно, что для проведения исследований с помощью подобных подходов требуется предварительное секвенирование изучаемой области генома. Также принципиальным ограничением этих методов является то, что в данном случае м м «ч J исследуется статус метилирования не всей последовательности, а лишь тех ее участков, которые содержат сайт узнавания используемой эндонуклеазы. К другими их

0) (¡)

ГЕНОМНАЯ ДНК 0) т(н)

ГИДРОЛИЗ ЭНДОНУКЛБАЗАМИ л.,И

ЛИГИРОВАНИЕ

АДАПТЕРОВ (¡-□)Н-и) п о и

ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ^праймеры

1-М-о) о о о

ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

1) 0) хз □—□ о о о о сг сг

Рисунок 2. Метод анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов. Образцы ДНК гидролизуют двумя эндонуклеазами: 1 - метил-нечувствительной, гидролизующей редко встречаемую последовательность (0, и и - метил-чувствительной (слева) или ее метил-нечувствительным изошизомером (справа), узнающими последовательность (н). После чего к полученным фрагментам лигируют соответственно два типа адаптеров ( □ ■ ) и проводят ПЦР с праймерами ( • О ), идентичными последовательности использованных адаптеров. Анализ ампликонов методом гель-электрофореза позволяет идентифицировать фрагменты (отмечены стрелкой), содержащие на одном из своих концов метилированный сайт (11). недостаткам можно отнести возможные артефакты, связанные с неполным гидролизом ДНК. В частности, немногие из ныне применяемых ферментов, которые были протестированы на чувствительность к модификациям вне сайта узнавания, оказались в некоторых случаях подвержены сильному ингибированию (McClelland et al., 1994). Среди других причин устойчивости неметилированных последовательностей к действию метил-чувствительных рестрикционных эндонуклеаз можно назвать пониженную частоту встречаемости узнаваемых сайтов в гидролизуемой ДНК. Так, например, было показано, что Hpall эндонуклеаза, требует для своей активности наличия по меньшей мере двух узнаваемых ею последовательностей (5'-CCGG-3'), и поэтому не способна гидролизовать геном вируса SV40, где 5'-CCGG-3' сайт встречается один раз (Kupper et al, 1997). Для решения этой проблемы было предложено включать в инкубационные смеси олигонуклеотидные дуплексы (15нт), содержащие сайт рестрикции соответствующей эндонуклеазы, в количестве 20-100 кратного молярного избытка по отношению к гидролизуемому субстрату (Kupper et al., 1997).

Не так давно была также разработана модификация метода анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов (рис. 2, ПДАФ, MSAP, methylation

-1 • \ I sensitive amplification polymorphism, Reyna-Lopez et al, 1997), предназначенная для полногеномного анализа метилирования. В этом случае сначала осуществляют гидролиз

ДНК двумя рестрикционными эндонуклеазами: метил-нечувствительной, узнающей и гидролизующей редко встречаемую последовательность (обычно гексануклеотид, для уменьшения количества получаемых продуктов гидролиза и упрощения последующего анализа); и метил-чувствительной эндонуклеазой, параллельно ее метил- ) I. J нечувствительным изошизомером. Это различие объясняется метилированием исходного образца ДНК по сайту, узнаваемому второй парой эндонуклеаз и находящемуся с одного из концов соответствующего фрагмента. Последующая элюция этого фрагмента из геля и ре-ПЦР с использованными праймерами позволят в дальнейшем его секвенировать . и, возможно, картировать расположение iMи. . ; соответствующего метилированного сайта в геноме. Можно также добавить, что обычно для упрощения анализа результатов проводят ПЦР с олигонуклеотидами, идентичными последовательности используемого адаптера, но содержащими на 3'-конце дополнительные 1-4 нуклеотида (overhang) для избирательной амплификации лишь части рестриктных фрагментов. Таким образом, последовательно комбинируя все возможные варианты сочетаний этих нуклеотидов, можно упорядоченно проанализировать тот огромный набор фрагментов, который образуется после гидролиза исследуемой ДНК эндонуклеазами. Нужно также добавить, что использование двух изошизомеров, обладающих чувстительностью к метилированию разных цитозиновых остатков в узнаваемой ими последовательности (например, Hpall и Mspl эндонуклеазы неспособны гидролизовать CmCGG и mCCGG сайты, соответственно), может значительно расширить возможности метода (Xiong et al., 1999; Noyer et al., 2005).

Еще одним вариантом подхода, основанного на применении рестрикционных эндонуклеаз, можно считать так называемый "фингерпринтинг" с использованием ПЦР со случайными праймерами (methylation-sensitive restriction fingerprinting, MSRF, Gonzalgo et al., 1997; Huang et al., 1997; Wu and Ho, 2004). Ha первом этапе ДНК также подвергают обработке двумя эндонуклеазами: метил-нечувствительной, узнающей и гидролизующей часто встречаемую последовательность; и метил-чувствительнои или ее метил-нечувствительным изошизомером, соответственно. Далее две смеси продуктов гидролиза используют для последующей ПЦР со случайными короткими олигонуклеотидами в качестве праймеров. Получаемый амплификат сходным образом анализируют при помощи метода гель-электрофореза высокогоразрешения, а интересующие фрагменты также элюируют из геля. Причем необходимо добавить,что

ОБА АЛЛЕЛЯ НЕМЕТИЛИРОВАНЫ

Г,. <А>

ОДИН АЛЛЕЛЬ МЕТИЛИРОВАН

ОБА АЛЛЕЛЯ МЕТИЛИРОВАНЫ

ГИДРОЛИЗ ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ А МЕЧЕНИЕ КОНЦОВ <"А)

ГИДРОЛИЗ Э/ФОРЕЗ В 1011 НАПРАВЛЕНИИ ГИДРОЛИЗ Э/ФОРЕЗ ВО 2ОН НАПРАВЛЕНИИ

Рисунок 3. Метод ИЬвв-М. Исследуемые образцы ДНК сначала гидролизуют метил-чувствительной эндонуклеазой А, затем проводят достройку липких концов в присутствии радиоактивно меченых нуклеозидтрифосфатов. Далее гидролизуют- препарат эндонуклеазой В и фракционируют электрофоретически в первом направлении, после чего гель обрабатывают эндонуклеазой С и вновь разделяют во втором направлении. Сравнение интенсивности пятен на радиоавтографах, полученных из разных образцов, позволяет идентифицировать дифференциально метилированные последовательности. последующая их реамплификация с использованием тех же коротких олигонуклеотидов сопряжена с повышенной гетерогенностью и низким выходом получаемых продуктов, а также обычно не позволяет с достаточной эффективностью эти продукты клонировать. По этим причинам часто используют олигонуклеотиды общей длиной около 20 нт, которые идентичны исходным прайм ерам в своей 3'-области и содержат в дополнительной 5'-концевой последовательности сайты узнавания определенных эндонуклеаз, что облегчает последующие этапы клонирования (Zeng et al., 1998). Нужно отметить, что главным отличием метода MSRF от описанного выше ПДАФ является заведомо неполный анализ получаемых рестриктных смесей. Причиной тому очевидно является использование ПЦР со случайными олигонуклеотидами. Существует также возможность комбинирования различных последовательностей праймеров, нотем не менее, подобный анализ не является упорядоченным и по „этим причинам может приводить к излишней г .< v. трудоемкости.Другой принцип лежит в основе полногеномного анализа метилирования ДНК методом RLGS-M (рис.3, restriction landmark genomic scanning using methylation-sensitive restriction endonucleases, Hatada et al., 1991; Kawai et al., 1993; Costello et al., 2000; Takamiya et al., 2006). В этом случае препарат сначала щцролизуют метил-чувствительной рестрикционной эндонуклеазой А (чаще всего Not I, узнающей i , i N > палиндромныи октануклеотид 5' -GCUgGCCGC-З ' ), а образовавшиеся фрагменты радиоактивно метят достройкой "липких" концов в присутствии [a-32P]-dNTP и гидролизуют ферментом В. Затем гидролизат электрофоретически фракционируют, после чегоагарозный гель обрабатывают эндонуклеазой С и вновь разделяют во втором направлении (методом гель-электрофореза высокого разрешения). Полученный в конечном итоге радиоавтограф представляет собой характерную двумерную картину распределения (паттерн) более чем трех тысяч А/А, А/В и А/С рестриктных фрагментов. Нужно отметить, что хорошая воспроизводимость этого рисунка позволяет применять его для сравнения в двух образцах ДНК статуса метилирования одновременно большого количес-тва последовательностей. При этом увеличение или уменьшение интенсивности определенного пятна связано соответственно с гипо- или гиперметилированием сайта узнавания эндонуклеазы А. Интересующие фрагменты могут быть элюированы из геля и использованы для их картирования в исследуемом геноме. Следует также добавить, что использование в качестве фермента А именно эндонуклеазы Not I позволяет более или менее направленно исследовать участки генома, представляющие собой кодирующие области. Это обусловлено тем, что около i >14. i<. . i А

89% всех узнаваемых Not I эндонуклеазой последовательностей находится в CpGостровках (Lindsay and Bird, 1987), большинство из которых в свою очередь ассоциировано с генами и их промоторными участками в геномах млекопитающих (см. выше).

Тем не менее, несмотря на большое количество преимуществ, метод также обладает недостатками, среди которых можно отметить: i) необходимость большого количества ДНК (от 10 мкг) для получения радиоавтографа удовлетворительного качества; ii) большую трудоемкость, связанную с получением и последующим анализом радиоавтографов; при этом за последнее время было разработано и предложено к использованию довольно большое количество всевозможного программного обеспечения, автоматизирующего обработку результатов, полученных с помощью RLGS-M (Rouillard et al, 2001; Takahashi and Nakazawa, 2001); iii) ограниченность использования в связи с размером изучаемого генома (до 3*109 по); тем не менее, включение этапа "рестриктной ловушки" (см. ниже) позволяет предварительно "упрощать" исследуемый образец и поэтому может быть использовано в случае исследования сложных геномов (например, высших растений, амфибий и т.д., Okuizumi et al., 1994); iv) низкая эффективность и значительный фон при клонировании интересующих фрагментов; объясняется это тем, что элюат из соответствующей области геля чаще всего представляет собой сложную смесь В/С, В/В и С/С продуктов гидролиза и одного из интересующих меченных А/А, А/В или А/С рестриктных фрагментов.

При этом для решения последней проблемы, то есть для увеличения эффективности и специфичности клонирования, были предложены следующие способы: - перед разделением препарата в первом- направлении' его при помощи так

I I 1 чич1 ' называемой "рестриктной ловушки" (restriction trapper) специфически обогащают фрагментами, содержащими на одном/двух концах сайт(ы) гидролиза эндонуклеазы А. Для этого после обработки образца ферментами А и В, полученные фрагменты специфиески лигируют к олигонуклеоитидному дуплексу, гидролизованному с одного конца эндонуклеазой А и иммобилизованному с другого на твердой подложке (латексные шарики). Далее после отмывки нелигировавшихся молекул ДНК, проводят элюцию А/А, А/В и А/С фрагментов путем обработки образца ферментом A. (Hayashizaki et al., 1992; Hirotsune et al., 1993);

- после элюции смеси фрагментов из геля, ее амплифицируют, используя предварительно дотированные три типа адапторов (соотвествующие трем эндонуклеазам и восстанавливающие их сайты узнавания) и идентичные им праймеры; затем, после обработки амплификата эндонуклеазой А, специфически лигируют полученные продукты в линеаризованный вектор, содержащий на одном конце выступающий 3'-концевой тиминовый остаток, а на другом -гидролизованный эндонуклеазой A (Suzuki et al., 1994);

- комбинация двух описанных выше модификаций (Suzuki et al., 1994).

Можно добавить также, что также было предпринято предварительное клонирование всех А/А и А/В рестриктных фрагментов с последующим картированием их в геноме и идентификацией соответствующих им пятен на радиоавтографе (Plass et al., 1997). Этот очень трудоемкий подход позволяет, таким образом, систематически анализировать результаты, получаемые с помощью RLGS-M, и в будущем приведет к созданию упорядоченной базы данных, что, в свою очередь, значительно облегчит исследования ш -4— га ш 1 I В mm —Н

D Е F 1m m —I—H

Smal Xmal тупые" концы липкие концы

-1"—|

ЛИГИРОВАНИЕ АДАПТЕРОВ

АНПЛИКОН X

АМПЛИКОН XI

ГИБРИДИЗАЦИЯ р ЗОНД "В"

ЗОНД "D"

АМПЛИКОН I

АМПЛИКОН II

ВЫЧИТАЮЩАЯ П ГИБРИДИЗАЦИЯ

Рисунок 4. Метод амплификации метилированных Срв-островков. Препарат ДНК ги-дролизуют метил-чувствительной эндонуклеазой Бта! (5'-СССССО-3', образует "тупые" концы), а затем ее метил-нечувствительным изошизомером Хта1 (образует "липкие" концы) (слева - образец содержит метилированный, справа - неметилированный СрО-островок О). К "липким" концам продуктов гидролиза лигируют адапторы, после чего проводят ПЦР с праймерами, идентичными последовательности адаптеров. Полученные ампликоны используют для гибридизации с зондами, специфическими к определенным Срв-островкам (слева) или сравнивают методом вычитающей гибридизации (справа). метилирования ДНК методом RLGS-M (Yu et al, 2004).

Сравнение статуса метилирования двух образцов можно также осуществлять при помощи метода вычитающей гибридизации. Впервые этот подход был применен группой японских ученых для поиска дифференциально метилированных последовательностей в нормальной паренхиме печени и гепатоцеллюлярной карциноме, соответственно (Ushijima et al., 1997). Для этого они к предварительно обработанным метил-чувствительной рестрикционной эндонуклеазой препаратам трейсера и драйвера лигировали адаптеры после чего проводили ПЦР с праймерами, идентичными последовательности использованных адаптеров. При этом, в процессе амплификации происходит обогащение смеси фрагментами размером 300-600 по, представляющими собой, главным образом, гипо-метилированные (и поэтому подвергшиеся гидролизу эндонуклеазой) участки генома. Последующее проведение 2-3 раундов вычитающей гибридизации позволяет получить набор последовательностей, имеющих разный статус метилирования в двух сравниваемых образцах ДНК (Chien et al., 2005). Подобным образом можно также проводить: i) поиск генов, подверженных импринтингу (Peters et al., 1999); ii) идентификацию тканеспецифически экспрессирующихся последова

I 1 L тельностей (Yuan et al., 1999); iii) анализировать на полногеномном уровне изменения в статусе метилирования при инсерциях чужеродной ДНК (трансгены, ретровирусы, ДНК-транспозоны) (Muller et al., 2001);

Тем не менее, очевидно, что "упрощение" образцов в результате их амплификации, приводит к потере части дифференциально метилированных последовательностей.

Среди других недостатков метода можно отметить сильную "загрязненность" получаемых библиотек повторяющимися элементами, что, в свою очередь, затрудняет как ее анализ, так и последующее картирование вставок клонов. Избежать этой проблемы можно путем введения дополнительной стадии нормализации* амплификатов перед проведением вычитающей гибридизации (Muller et al., 2001). i [ / - - •

Был также разработан новый подход для идентификации метилированных CpG-островков (MCA, methylated ÇpG island amplification, Toyota et al, 1999; Asada et al, 2006). Принцип метода схематически изображен на рисунке 4. Получаемые в результате наборы последовательностей, кроме электрофоретического разделения (Frigola et al, 2002) или прямого секвенирования, обычно также анализируют методом

- под нормализацией образца понимают выравнивание представленности фрагментов ДНК, входящих в его состав. вычитающей гибридизации (рис.4,справа, Toyota et al, 1999). Далее, для анализа статуса метилирования определенного CpG-островка можно гибридизовать получаемые в результате MC А ампликоны с соответствующим специфическим зондом (рис.4,слева, Toyota et al., 1999).

В последнее время появилась тенденция ограничить полногеномный анализ протяженными полигенными локусами, обладающими общими регуляторными системами. В ЛСФГЧ была разработана методика картирования неметилированных CpG-сайтов на мегабазных участках генома (Non-methylated Genomic Sites Coincidence Cloning (NGSCC)), которая позволяет картировать сайты вне зависимости от их расположения по отношению к CpG-островку. Метод основан на клонировании идентичных нуклеотидных последовательностей, принадлежащих к разным фрагментированным ДНК-пулам. В качестве сравниваемых пулов ДНК используют:

- геномную ДНК из клеток определенной ткани, фрагментированную метил-чувствительной рестриктазой Hpall;

- полный набор Hpall рестриктных фрагментов ДНК клонированного локуса.

К полученным пулам лигируют два разных типа супрессионных олигонуклеотидных адаптеров. В результате совместной денатурации и ренатурации обоих пулов фрагментов происходит образование гетеродуплексов идентичных нуклеотидных последовательностей, принадлежащих различным пулам. Для выделения таких гетеродуплексов из смеси используют эффект селективной супрессии ПЦР, г. V , 1 возникающий вследствие наличия различных супрессионных адаптеров. Выделенные

Т Г 1 » таким образом фрагменты принадлежат к изучаемому геномному локусу и при этом содержат неметилированный CpG-сайт, характерный для данной ткани. Клонирование, определение нуклеотидной последовательности этих фрагментов, картирование неметилированных CpG-сайтов в геноме обеспечивают профиль распределения неметилированных сайтов в изучаемом локусе генома. Такое тканеспецифическое распределение характерно для определенной ткани, или стадии развития организма, поэтому должно отражать ее функциональные особенности. Таким образом, методом NGSCC можно получить набор неметилированных CpG-динуклеотидов в составе рестриктных сайтов (Unmethylated Restriction Sites (URS)), которые распределены по длине изучаемого геномного локуса вне зависимости от положения CpG-островков. Такие URS могут рассматриваться как маркеры, распределение которых достоверно описывает тканеспецифический профиль метилирования внутри протяженного локуса. Этот профиль уникален, характерен только для данной ткани и отражает ее функциональное состояние.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Гайнетдинов, Ильдар Ваисович

выводы

1) Создан принципиально новый методический подход к экспресс-картированию сайтов расщепления генома (на примере сайтов метил-чувствительной эндонуклеазы Нра11).

2) Создано программное обеспечение, необходимое для обработки результатов метода и их визуализации.

3) Впервые с помощью разработанного метода получен подробный профиль метилирования для локуса Б1982()8-СОХ7А1 19й хромосомы в нормальной ткани легкого человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гайнетдинов, Ильдар Ваисович, 2008 год

1. Antequera F, Tamame M, Villanueva JR and Santos T. DNA methylation in fungi. J Biol Chem 259, 8033-8036 (1984).

2. Asada K, Asada R, Yoshiji H, Fukui H, Floyd RA and Kotake Y. DNA cytosine methylation profile in various cancer-related genesi altered in cultured rat hepatocyte cell lines as compared with primary hepatocytes. Oncol Rep 15, 1241-1248 (2006).

3. Barbin: A, Montpellier G, Kokalj-Vokac N, Gibaud A, Nivcleau A, Malfoy B, Dutrillaux B and Bourgeois CA. New sites of methylcytosine-rich DNA detected on metaphase chromosomes. Hum: Genet. 94; 684-692 (1994).

4. Baumer A, Wiedemann U, Hergersberg M and Schinzel A. A novel MSP/ DHPLC method for the investigation of the methylation status of imprinted genes enables the molecular detection of low cell mosaicisms. Hum. Mutat. 17,423-430 (2001).

5. Benhattar, J and Clement G. Mèthylation-sensitive. single-strand conformation analysis: a; rapid method to screen for and analyze DNA methylation. Methods. Mol- Biol 287, 181-193 (2004).

6. Bestor TH. The DNA methyltransferascs of mammals. Hum Mol Genet 9,2395-2402 (2000).

7. Bird AP! Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II: The symmetry of methylated' sites supports; semi-conservative^^copying : of methylation patterns. J Mol Biol 118, 49-60 (1978).

8. Bird AP and .Southern EM; Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation-patterns in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol 118, 27-47(1978).

9. Brena RM, Auer H, Kornacker K, Hackanson B, Raval A, Byrd JC and Plass C. Accuratei '• • miciMN'!.;: ■ ¡1 ^ ■■quantificatio of DNA methylation using COBRA coupled with the Agilent Bioanalyzer platform. Nucleic Acids Res 34, el7 (2006).

10. Brock GJ, Charlton J and Bird A. Densely methylated sequences that are preferentially localized^ at telomere-proximal regions of human chromosomes. Gene 240, 269-277. (1999).

11. Catania J, Keenan BC, Margison GP and Fairweather DS. Determination of 5-methylcytosine by acid- hydrolysis of DNA with} hydrofluoric acid. Anal; BiocKem; 167, 347-351 (1987). ' . ' ■ "■ .

12. Chien J, Staub J, Avula R, Zhang H, Liu W, Hartmann LC, Kaufmann SH, Smith DI and . . Shridhar Y. Epigenetic silencing of TCEAL7 (Bex4) in ovarian cancer. Oncogene 24, 5089-5100 (2005).

13. Church GM and Gilbert W. Genomic sequencing; Proc Natl^Acad»Sei U S A 81; 1991-1995: ,■ *''--. • 1. t !. :.rii i . . ,i :1984).• ■ '-en,'. ••••.'

14. Clark SJ, Harrison? J, Paul CL and.; Frommer M. High sensitivity mapping of methylatedcytosines. Nucleic Acids Res 22, 2990-2997. (1994). Cross SH, Charlton JA, Nan X and Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated

15. Eick D, Fritz HJ and Doerfler W. Quantitative determination of 5-methylcytosine in DNA by reverse-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 135,165-171 (1983).

16. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM; Watt F, Grigg GW, Molloy PL and Paulr V Ir ■-. I'

17. DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR. Cancer Res 57, 594-599:1 i <J VA uii1997).

18. Harbers K, Harbers B and Spencer JH. Nucleotide clusters in deoxyribonucleic acids. XII. The distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine oligonucleotides of mouse L-cellsatellite DNA and main band DNA. Biochem Biophys Res Commun 66, 738-746 (1975).

19. Kuo KC, McCune RA, Gehrke GW, Midgett R" and EhrlichrM; Quantitative reversed-phase; high performance liquid chromatographic determination of major and modified deoxyribonucleosides in DNA. Nucleic Acids Res. 8,4763-4776 (1980).

20. Kupper D, Reuter M, Meisel A and Kruger DH. Reliable detection of DNA CpG methylation••'• ■■ A. I'.':/• :n:rv • profiles by the isoschizomers Mspl/Hpall using: oligonucleotide stimulators.

21. Rouillard'rJMi Erson^AE, RuickR; AsakawaJ;lWimmer:K,.Muleris"M^Petty EM^

22. S: Virtual genome scan: a tool for restriction landmark-based scanning of the humangenome. Genome Res 11, 1453-1459. (2001).

23. Rubery ED and Newton AA. A simple paper chromatographic method for separation ofmethylated adenines and cytosine from the major bases found in nucleic acids. Anal•!• • Mi. A-.liw Biochem 42-149-154. (1971).

24. Rubery ED and Newton AA. DNA methylation in normal and tumour virus-transformed cellsin tissue culture. I. The level of DNA methylation in BHK21 cells and in BHK21 cellstransformed by polyoma virus (PyY cells). Biochim Biophys Acta 324; 24-36. (1973).

25. Takahashi K and Nakazawa M. DNAinsight: a web based image processing system for large scale RLGS analysis. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 12, 212-221 (2001).

26. Wu M and Ho SM-.PMP24, a gene identified by MSRF, undergoes DNA hypermethylation-associated gene silencing during cancer progression in an LNCaP model. Oncogene 23,250-259 (2004).

27. Xiong LZ, Xu LZ, Saghai Maroof MA and Zhang Q: Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by a methylation-sensitiveamplification polymorphism technique. Mol Gen Genet 261, 439-446 (1999).1 it. tin., a

28. Xiong Z and Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 25,2532-2534 (1997).1. U'v-ii- 1

29. Yamamoto F, Yamamoto M, Soto JL, Kojima E, Wang EN, Perucho M, Sekiya T and Yamanaka H. Notl-Msell methylation-sensitive amplied fragment length polymorhism for DNA methylation analysis of human cancers. Electrophoresis 22, 1946-1956. (2001).

30. Yan PS, Perry MR, Laux DE, Asare AL, Caldwell CW and Huang TH-M. CpG island arrays: an application toward deciphering epigenetic signatures of breast cancer. Clin Cancer Res 6,1432-1438 (2000).

31. Yu L, Liu C, Bennett K, Wu YZ et al. A Notl-EcoRV promote library for studies of genetic and epigenetic alterations in mouse models of human malignancies. Genomics 84, 647-660 (2004).

32. Yuan L, Shan J, Risi DD, Broome J, Lovecchio J, Gal D, Vinciguerra V and Xu H-P. Isolation of a novel gene, TSP50, by a hypomethylated DNA fragment in human breast cancer. Cancer Res 59, 3215-3221 (1999).

33. Zeng M, Martsen EO and Lapeyre JN. Re-amplification of short primer-generated bands from RAPD and methylation-sensitive restriction fingerprinting by discrimination primers. Biotechniques 24,402-403, 406. (1998).

34. Zhou D, Qiao W, Yang L and Lu Z. Bisulfite-modified target DNA array for aberrant methylation analysis. Anal Biochem 351,26-35 (2006).1..V .1 \1. БЛАГОДАРНОСТИ

35. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова за полученные знания, а также за высокую требовательность и постоянное внимание.