Новые маркеры аномального метилирования ДНК при раке молочной железы, идентифицированные непредвзятым скринингом дифференциального метилирования геномов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Руденко, Виктория Владимировна

• Руденко, Виктория Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Руденко, Виктория Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности морфологии молочной железы.

1.4. Стволовая клетка молочной железы.

1.5. Влияние микроокружения на инициацию и прогрессию РМЖ.

1.6. Наследственные и спорадические формы РМЖ.

1. 7. Клинико-морфологические параметры и их системы.

1.12. Значение метилирования в норме и в процессах канцерогенеза.

1.13. Маркеры гипо- и гиперметилирования.

1.14. Диагностические маркеры метилирования.

1.15. Применение маркеров метилирования в прогностических системах для РМЖ.

1.17. Применение маркеров метилирования в морфологической и молекулярной таксономии РМЖ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2. 4. Ферментативный гидролиз ДНК и лигирование с адаптерами.

2.5. Полимеразная цепная реакция для метода АИМС.

2. 6. Рестрикционный анализ.

2.7. Картирование по аналогии.

2. 8. Фрагментный анализ продуктов АИМС.

2. 9. Обработка ДНК бисульфитом натрия.

2. 10. Метил-специфическое секвенирование.

2. 11. Электрофорез в ПААГ.

2. 12. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

2. 13. Программное обеспечение.

2.14. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Модификация исходного протокола метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

3.1.1. Модификации метода АИМС на этапе лигирования.

3.1.2. Модификации метода АИМС на этапе ПЦР.

3.1.3. Модификации метода АИМС на этапах визуализации и геномной идентификации продуктов АИМС.

3.2. Характеристика метилирования нормальных и опухолевых геномов модифицированным методом АИМС.

3.2.1. Характеристика метилирования геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем вСв.

3.2.2. Характеристика метилирования участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем ССв.

3.3. Описание функциональной значимости выявленных геномных локусов

3.4. Формирование систем диагностических маркеров метилирования и выявление клинико-генетических корреляций.

3.4.1. Характеристика метилирования исследуемых локусов в норме и приРМЖ.

3.4.2. Ассоциации маркеров метилирования с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ.

3.4.3. Формирование системы маркеров для диагностики РМЖ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые маркеры аномального метилирования ДНК при раке молочной железы, идентифицированные непредвзятым скринингом дифференциального метилирования геномов»

Задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка эффективных методов диагностики, прогноза течения, оптимизации лечения и мониторинга рецидивирования опухолей. Процесс злокачественной трансформации клеток характеризуется накоплением большого количества повреждений в геноме опухолевой клетки. Нарушение функционирования генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, связывают как со структурными повреждениями, так и с эпигенетическими аномалиями, к числу которых относится, в частности, гиперметилирование ДНК в регуляторных областях генов (Esteller М. et al., 2001). Анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, то это остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение в основном в диагностике наследственных онкологических синдромов и для выявления стандартных мутаций, определяющих чувствительность опухолей к тем или иным химиопрепаратам (Васильев Е.В. с соавт., 2009; Бабенко О.В. с соавт., 2009; Алексеева Е.А. с соавт., 2012).

Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе (Kaneda et al., 2002; Miyamoto et al., 2003). Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР одного локуса. Поиск мутаций в одном гене требует анализа многих локусов; кроме того, 100%-ная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза (Esteller М. etal, 2001).

Несмотря на диагностические преимущества маркеров метилирования ДНК, они до сих пор не получили широкого распространения в клинической онкологии. Это объясняется, в частности, недостатком хорошо изученных и охарактеризованных генов, аномальное метилирование которых достоверно связано с тем или иным патоморфологическим типом опухоли (Jones Р. et al., 2007). В связи с этим особое значение приобретает идентификация и подробная характеристика особенностей метилирования новых геномных локусов, непосредственно или опосредованно вовлеченных в канцерогенез, что в значительной степени определило цель и задачи настоящей работы.

Первое место в структуре смертности от онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (Давыдов М. И. с соавт., 2007). Чрезвычайная гетерогенность молекулярно-генетических характеристик этого заболевания находит свое отражение на клиническом уровне. Рак молочной железы характеризуется крайне разнообразным клиническим течением - от агрессивного до вялотекущего с поздним и редким метастазированием (Ермилова В.Д., 2002). Выраженная гетерогенность на клиническом, гистопатологическом и молекулярном уровнях привела к созданию многочисленных маркеров заболевания, которые, тем не менее, не всегда обеспечивают достаточный уровень эффективности диагностики. Это объясняет необходимость разработки более современных мультигенных панелей маркеров, в том числе и панелей маркеров метилирования (Maier S. et al., 2007; Widschwendter M. et al., 2008). Современные исследования говорят о принципиальной возможности использования как панелей маркеров, так и единичных маркеров метилирования в качестве прогностических и предиктивных при раке молочной железы (Hartmann О. et al., 2009). Использование оптимизированого метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов в исследованиях рака молочной железы уже привело к выявлению целого ряда новых маркеров (Кузнецова Е.Б. с соавт., 2007), которые в настоящее время активно изучаются как с точки зрения участия в процессах канцерогенеза, так и с точки зрения диагностических приложений (Rutella, S. et al., 2009; Hawes S.E. et al., 2010; Wang Y., Rekaya R., 2010). Разработка и внедрение более современных протоколов скрининга дифференциального метилирования и характеристики новых маркеров аномального метилирования должны повысить эффективность создания систем диагностических маркеров рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) для непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК.

2. Идентифицировать новые дифференциально метилированные геномные локусы в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Оценить частоты метилирования выявленных геномных локусов в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

4. Выявить корреляции дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.

5. Предложить систему маркеров метилирования для диагностики РМЖ, оценить параметры её чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана модификация метода непредвзятого скрининга дифференциального метилированния геномов, применение которой позволило выявить 4 константно метилированных и 19 дифференциально метилированных областей генома. Дифференциальное метилирование при раке молочной железы впервые показано для 15 генов: LAMBI, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188. Четыре дифференциально метилированные области впервые выявлены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1. В выборке 140 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Впервые продемонстрированы ассоциации метилирования CpG-островков генов SH3KBP1, PHF15, GPC2 и LAMBI с клинико-морфологическими свойствами опухолей молочной железы. Промоторы SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в опухолях со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что говорит о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Также показано, что ген SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMBI в образцах рака молочной железы ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов.

Сформированы оригинальные системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. Показано, что для формирования системы, обеспечивающей молекулярную классификацию тканей молочной железы со специфичностью 100%, достаточно семи маркеров метилирования.

Теоретическая и практическая значимость.

Выявленные дифференциально метилированные локусы и разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов позволяют проводить сравнительные исследования паттернов метилирования ДНК в норме и при злокачественных новообразованиях. Предложенный дизайн адаптер-опосредованной метилчувствительной полимеразной цепной реакции позволяет определять в формате реакции в одной пробирке состояние метилирования 7 геномных локусов, составляющих систему маркеров диагностики рака молочной железы, различающую злокачественную опухоль от окружающей морфологически нормальной ткани молочной железы с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Использование этой системы для молекулярной классификации злокачественной опухоли и здоровой ткани молочной железы обеспечивает диагностическую чувствительностью 100% при 100%-ной специфичности.

Определено количество маркеров метилирования, необходимое и достаточное с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала. В частности, в системе из 7 маркеров для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; наличие 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров системы. Указанные параметры позволяют проводить диагностику со специфичностью 100%.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), III международной научно-практической конференции молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (г. Москва) в 2011 г., на конкурсе региональной программы "Умник" (г. Москва) в 2011г.

По результатам работы опубликовано 4 статьи, 15 тезисов.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 0804-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation " Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010rr).

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метода амплификации интерметилированных сайтов является эффективным унифицированным инструментом скрининга дифференциального метилирования геномов, который может использоваться как для поиска, так и для характеристики новых маркеров метилирования при канцерогенезе.

2. Применение оригинального лабораторного протокола позволяет выявлять дифференциально и константно метилированные локусы генома в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Определены достоверные связи ряда выявленных дифференциально метилированных локусов генома с клинико-морфологическими параметрами злокачественных опухолей молочной железы.

4. Существуют значительные различия в частотах аномального метилирования (информативности) маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Наблюдаемые различия необходимо учитывать при формировании систем молекулярно-генетических маркеров для классификации образцов тканей молочной железы.

5. Характеристика частот метилирования геномных локусов позволяет сформировать системы диагностических маркеров, которые могут быть использованы для молекулярно-генетической классификации тканей молочной железы.

Личный вклад автора.

Проведен анализ дифференциального метилирования ДНК в злокачественных опухолях, условно нормальных тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Анализ включал в себя следующие этапы: экстракцию геномной ДНК, амплификацию интерметилированных сайтов и сравнение геномных профилей, планирование и осуществление рестриктазного картирования дифференциально метилированных локусов. Все этапы исследования дифференциального метилирования ДНК выполнены лично. Проведен анализ полученных результатов: описание выявленных дифференциально метилированных локусов, оценка частот их метилирования, выявление корреляций дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы. Разработаны системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, проведена оценка параметров чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Руденко, Виктория Владимировна

выводы

1. Разработана оригинальная модификация лабораторного протокола адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов: модифицированы этапы лигирования и амплификации, предложены оригинальные подходы к определению геномной локализации дифференциально метилированных фрагментов ДНК на основе картирования по подобию, прямого секвенирования и рестриктазного картирования для локусов, предсказанных in silico.

2. С помощью разработанного метода выявлено 23 локуса, принадлежащих пулу интерметилированных сайтов. Из них 15 локусов, принадлежащие генам LAMBI, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, IQSEC2, и 4 локуса, принадлежащие межгенным областям хромосомных районов 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1, охарактеризованы как дифференциально метилированные в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Четыре локуса, представляющие собой участки генов CUX1, MAD1L1, TAF4 и ZBTB4, охарактеризованы как константно метилированные во всех исследованных нормальных и опухолевых образцах молочной железы.

3. Частоты аномального метилирования выявленных локусов при раке молочной железы составляют от 5,1% до 87,4%. Существуют значительные различия информативности маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Частоты метилирования локусов панели GCG находятся в диапазоне от 34,5% до 87,4%, в то время как частоты метилирования локусов панели CCG - в диапазоне от 5,1% до 59,7%.

4. Промоторные CpG-островки генов SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в образцах рака молочной железы со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что может свидетельствовать о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMBI в материале РМЖ ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Промотор гена SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2.

5. Для диагностики рака молочной железы предложены две системы, оптимизированные по количеству маркеров. Первая включает 13 маркеров СPPP2R5C; IQSEC2, PHF15, AT MIN, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, TAF4, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2 и фрагменты межгенных хромосомных районов 12ql3.13, 1рЗЗ, 5р15.33) и характеризуется чувствительностью 93,9% и специфичностью 93,9%. Вторая состоит из 7 маркеров (RAII, KCNH8, DOCK6, TAF4, GPC21 и фрагменты межгенных хромосомных районов 1рЗЗ, 5р15.33), с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Относительно нормальной молочной железы вторая система маркеров метилирования характеризуется чувствительностью 100%) и специфичностью 100%. При использовании любой из двух систем для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; метилирование 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров (TAF4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и характеристика аномалий их функционирования - ключевой момент при решении задач онкогеномики. Нарушение функционирования генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, связывают не только со структурными повреждениями, но и с эпигенетическими аномалиями, к числу которых относятся, в частности, метилирование/деметилирование ДНК геномов злокачественных новообразований. Метод амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) позволяет исследовать дифференциальное метилирование геномов, в том числе опухолевых клеток, на основе адаптер-опосредованной ПЦР фрагментов ДНК.

В результате проведенного исследования разработана модификация метода АИМС, в которой исключены этапы радиоавтографирования гелей и клонирования продуктов реакции, усовершенствованы лабораторные протоколы этапов лигирования и амплификации продуктов АИМС. Использование нового метода позволило выявить 4 константно метилированные области генома и 20 областей, дифференциально метилированных в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Для константно метилированных областей проведен анализ состояния хроматина в областях их локализации, показавший их пространственное совпадение с областями плотной упаковки нуклеосом и закрытого хроматина. Среди дифференциально метилированных областей 16 принадлежат определенным генам: LAMBI, TAF4, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В,

FOXMl/HKMTl 188). Четыре дифференциально метилированные области расположены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1. В выборке 140 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Для некоторых из выявленных дифференциально метилированных локусов генома определены достоверные связи с клинико-морфологическими параметрами опухолевого роста при РМЖ. Так, промоторные CpG-островки генов SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в РМЖ со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, подтверждая сделанные другими исследователями предположения о субъективизме определения и невысокой воспроизводимости критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения.

Для промоторного CpG-островка гена LAMBI показана ассоциация метилированного состояния с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов в материале РМЖ.

По результатам изучения особенностей метилирования этих областей сформирована система маркеров метилирования для диагностики РМЖ, демонстрирующая высокие показатели чувствительности и специфичности. Чувствительность панели из 20 маркеров метилирования, выявленных в настоящей работе, с точки зрения дифференциации РМЖ и морфологически нормальной прилежащей ткани составила 83,7% при специфичности 93,9%, при этом пороговое количество маркеров в метилированном состоянии равно трём. Для диагностики РМЖ нами предложены две системы, оптимизированные по количеству маркеров. Первая включает 13 маркеров и характеризуется чувствительностью 93,9% и специфичностью 93%, Вторая состоит из 7 маркеров, с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Относительно нормальной молочной железы вторая система маркеров метилирования характеризуется чувствительностью 100% и специфичностью 100%.

Предложенная модификация метода скрининга дифференциального метилированния геномов и проведенная характеристика эпигенетических маркеров и их систем при РМЖ будут использованы в дальнейшем при разработке новых панелей диагностических маркеров канцерогенеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Руденко, Виктория Владимировна, 2012 год

1. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г. Вестник РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН. 2009 Июль — сентябрь; том 20, №3 (77), прил. 1.

2. Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Ларин С.С., Землякова В.В., Бабенко О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Новые маркеры метилирования и экспрессии генов при раке молочной железы. Молекулярная биология, 2007, 41: 624-633.

3. Ермилова В.Д. Роль современной патоморфологии в характеристике рака молочной железы .// 2002 Практическая онкология т.З №1 - С. 15-20

4. Потапова A.A. Выявление и оценка диагностического значения гиперметилированных генов супрессоров при опухолях молочной железы и яичников. Автореферат дис. кандидата медицинских наук: 14.00.46 // Саратов, 2009.

5. Abd El-Rehim D.M., Pinder S.E, Paish C.E., Bell J., Blarney R.W., Robertson J.F., Nicholson R.I., Ellis I.O. Expression of luminal and basal cytokeratins in human breast carcinoma.// 2004. J Pathol. 203 (2):661-71.

6. Adjuvant Therapy for Breast Cancer. // NIH Consensus Statement 2000 November 1-3; 17(4): 1-23.

7. Adriance, M.C., Inman, J.L., Petersen, O.W., Bissell, M.J. Myoepithelial cells: good fences make good neighbors. // 2005 Breast CancerResearch 7, 190-197.

8. Allinen M, Beroukhim R, Cai L, Brennan C, Lahti-Domenici J, Huang H, Porter D, Ни M, Chin L, Richardson A, Schnitt S, Sellers WR, Polyak K. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer // 2004 Cancer Cell. Jul; 6(l):17-32.

9. Allis C.D., Jenuwein Т., Reinberg D. Epigenetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2007.

10. Arpino G, Laucirica R, Elledge RM. Premalignant and in situ breast disease: biology and clinical implications. // 2005 Ann Intern Med.; 143 (6):446-57.

11. Asselin-Labat, M.L., et al. Steroid hormone receptor status of mouse mammary stem cells. //2006 J. Natl. Cancer Inst. 98:1011-1014.

12. Bae Young Kyung, Brown Amy, Garrett Elizabeth, et al. Hypermethylation in Histologically Distinct Classes of Breast Cancer. // Clin Cancer Res 2004; 10:59986005.

13. Bird Adrian. Introduction Perceptions of epigenetics. // 2007 Nature 447, 396398

14. Berry D.A. et al. Estrogen-receptor status and outcomes of modern chemotherapy for patients with node-positive breast cancer. // JAMA 2006; 295: 1658-1667.

15. Bertucci F, Birnbaum D. Reasons for breast cancer heterogeneity. // J Biol 2008; 7: 6.

16. Bhargava Rohit, Dabbs J. David Luminal B breast tumors are not HER2 positive. // Breast Cancer Research 2008; 10:404.

17. Bocker W., Moll R, Poremba C., et al. Common adult stem cells in the human breast give rise to glandular and myoepithelial cell lineages: a new cell biological concept. //2002. Lab Invest; 82:737-746.

18. Booth, B.W., and Smith, G.H. Estrogen receptor-alpha and progesterone receptor are expressed in label-retaining mammary epithelial cells that divide asymmetrically and retain their template DNA strands. // 2006. Breast Cancer Res. 8:R49.

19. Brown LA, Hoog J, Chin SF, Tao Y, Zayed AA, Chin K, Teschendorff AE, Quackenbush JF, Marioni JC, Leung S, Perou CM, Neilsen TO, Ellis M, Gray JW,

20. Bernard PS, Huntsman DG, Caldas C. ESR1 gene amplification in breast cancer: a common phenomenon? // Nat Genet. 2008; 40(7):806-7, author reply 810-2.

21. Cancer staging manual //7th edition. AJCC, 2010.

22. Clarke, R.B., Howell, A., Potten, C.S., and Anderson, E. Dissociation between steroid receptor expression and cell proliferation in the human breast. // 1997. Cancer Res. 57: 4987^991.

23. Dabbs J. David, Chivukula Mamatha, Carter Gloria, Bhargava Rohit. Basal phenotype of ductal carcinoma in situ: recognition and immunohistologic profile.//2006. Modern Pathology. 19, 1506-1511.

24. Degnim AC, Visscher DW, Berman HK, et al. Stratification of breast cancer risk in women with atypia: a Mayo cohort study. //2007 J Clin Oncol.; 25(19):2671-7.

25. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. // 2003.Genes Dev. 17:1253-1270.

26. Dupont WD, Page DL. Risk factors for breast cancer in women with proliferative breast disease. // 1985 N Engl J Med.; 312(3): 146-51.

27. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. // The Lancet. 2005; 365: 1687 1717.

28. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials. // Lancet 1998; 351: 1451-1467.

29. Eeles R, Knee G, Jhavar S, Mangion J, Ebbs S, Gui G, Thomas S, Coppen M, A'hern R, Gray S, Cooper C, Bartek J, Yarnold J. Multicentric breast cancer: clonality and prognostic studies. Breast Cancer Res Treat. //2010 Nov 16. Epub ahead of print.

30. Elston, C.W. and Ellis I.O. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up. // Histopathology 1991; 19: 403-10.

31. Esteller, M. and J.G. Herman. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. // J. Pathol., 2002.196: 17.

32. Esteller M, Paul G. Corn, Stephen B. Baylin, and James G. Herman. A Gene Hypermethylation Profile of Human // Cancer Cancer Res, April 15, 2001 61; 3225

33. Fabian CJ, Kamel S, Zalles C, et al. Identification of a chemoprevention cohort from a population of women at high risk for breast cancer. // 1996 J Cell Biochem Suppl.; 25:112-22.

34. Fan Cheng, Oh S.Daniel, Wessels Lodewyk et al. Concordance among Gene-Expression-Based Predictors for Breast Cancer. // N Engl J Med 2006; 355:560569

35. Feinberg AP, Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. //Nature 1983; 301:89-92.

36. Feng L, Wang JT, Jin H, Qian K, Geng JG. SH3KBP1 -binding protein 1 prevents epidermal growth factor receptor degradation by the interruption of c-Cbl-CIN85 complex. // Cell Biochem Funct. 2011 Oct; 29(7):589-96.

37. Fiegl H, Millinger S, Mueller-Holzner E et al.: Circulating tumor-specific DNA: a marker for monitoring efficacy of adjuvant therapy in cancer patients. // Cancer Res. 65(4), 1141-1145 (2005).

38. Fiegl H, Jones A, Hauser-Kronberger C et al.: Methylated NEUROD1 promoter is a marker for chemosensitivity in breast cancer. // Clin. Cancer Res. 14(11), 3494-3502 (2008).

39. Finak G, Bertos N, Pepin F, et al. Stromal gene expression predicts clinical outcome in breast cancer. // Nat Med. 2008; 14(5):518-27.

40. Fraga MF, Agrelo R, Esteller M. Cross-talk between aging and cancer: the epigenetic language. // Ann N Y Acad Sci. 2007 Apr; 1100:60-74.

41. Frigola J, Ribas M, Risques RA, Peinado MA. Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS). // Nucleic Acids Res. 2002 Apr l;30(7):e28.

42. Galea MH, Blarney RW, Elston CE, Ellis 10. The Nottingham prognostic index in primary breast cancer. // Breast Cancer Res Treat 1992; 22: 207-219

43. Gialeli C, Theocharis AD, Karamanos NK. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. // FEBS J 2010

44. Giresi PG, Kim J, McDaniell RM, Iyer VR, Lieb JD. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. //2007 Genome Res 17: 877-885.

45. Hannemann J, Velds A, Halfwerk JB, Kreike B, Peterse JL, Vijver MJ: Classification of ductal carcinoma in situ by gene expression profiling. // 2006 Breast Cancer Res, 8:R61.

46. Harbeck Nadia, Nimmrich Inko et al. Multicenter Study Using Paraffin-Embedded Tumor Tissue Testing PITX2 DNA Methylation As a Marker for Outcome Prediction in Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer Patients.

47. Journal of Clinical Oncology, Vol 26, No 31 (November 1), 2008: pp. 50365042.

48. Hark AT, Schoenherr CJ, Katz DJ, Ingram RS, Levorse JM, Tilghman SM.CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. //Nature. 2000 May 25;405(6785):486-9.

49. Hadler-Olsen E, Fadnes B, Sylte I, Uhlin-Hansen L, Winberg JO. Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease. // 2011 FEBS J. Jan; 278(l):28-45.

50. Hawes SE, Stern JE, Feng Q, Wiens LW, Rasey JS, Lu H, Kiviat NB, and Vesselle H. DNA hypermethylation of tumors from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients is associated with gender and histologic type. Lung Cancer, Aug 2010; 69(2): 172-9.

51. Herynk MH, Fuqua S. Estrogen receptor mutations in human disease. // Endocrine Reviews 2004; 25 (6): 869-898.

52. Holm K, Hegardt C, Staaf J, Vallon-Christersson J, Jönsson G, Olsson H, Borg A, Ringner M. Molecular subtypes of breast cancer are associated with characteristic DNA methylation patterns. // Breast Cancer Res. 2010;12(3):R36.

53. Hoogerbrugge N, Bult P, de Widt-Levert LM, et al. High prevalence of premalignant lesions in prophylactically removed breasts from women at hereditary risk for breast cancer. // 2003 J Clin Oncol.; 21(l):41-5.

54. Hsiao Yi-Hsuan, Chou Ming-Chih, Fowler Carol, Mason T.Jeffrey, Man Yan-gao. Breast cancer heterogeneity: mechanisms, proofs, and implications. // J Cancer. 2010; 1:6-13.

55. Ipsogen Launches MapQuant Dx(TM).Genomic Grade Test to Identify Breast Cancer Patients who Benefit From Chemotherapy. // ASCO Annual Meeting, May 30, 2008

56. Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. // Nat Genet. 2003 Mar;33 Suppl:245-54. Review.

57. Jerevall P-L, Ma X-J, Li H, Salunga R et al. Br Prognostic utility of HOXB13:IL17BR and molecular grade index in early-stage breast cancer patients from the Stockholm trial. // J Cancer. 2011 May 24; 104(11): 1762-1769.

58. Jones PA, Baylin SB. The epigenomics of cancer. // Cell. 2007 Feb 23;128(4):683-92.

59. Jing F, Jun L, Yong Z et al.: Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker. // Oncology 75(1-2), 60-66 (2008).

60. Kalluri Raghu, Zeisberg Michael. Fibroblasts in cancer. 2006 Nature Reviews Cancer 6, 392-401

61. Kamanger F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, mortality and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancerdisparities in different geographic regions of the world. // J Clin Oncol. 2006; 24:2137-50.

62. Kaneda A, Kaminishi M, Yanagihara K, Sugimura T, Ushijima T. Identification of silencing of nine genes in human gastric cancers. Cancer Res. 2002 Nov 15;62(22):6645-50.

63. Kauff ND, Brogi E, Scheuer L, et al. Epithelial lesions in prophylactic mastectomy specimens from women with BRCA mutations. // 2003 Cancer.; 97(7): 1601-8.

64. Kim A, Song SH, Brand M, Dean A. Nucleosome and transcription activator antagonism at human beta-globin locus control region DNase I hypersensitive sites. // 2007. Nucleic Acids Res 35: 5831-5838.

65. Kioulafa M, Balkouranidou I, Sotiropoulou G et al.: Methylation of cystatin M promoter is associated with unfavorable prognosis in operable breast cancer. // Int. J. Cancer 25(12), 2887-2892 (2009).

66. Kioulafa M, Kaklamanis L, Mavroudis D, Georgoulias V, Lianidou ES: Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer. //Clin. Biochem. 42(10-11), 970-975 (2009).

67. Kioulafa M, Kaklamanis L, Stathopoulos E, Mavroudis D, Georgoulias V, Lianidou ES: Kallikrein 10 (klklO) methylation as a novel prognostic biomarker in early breast cancer. //Ann. Oncol. 20(6), 1020-1025 (2009).

68. Kordon, E.C., and Smith, G.H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. //1998. Development. 125:1921-1930.

69. Knudson A. Alfred Knudson and his two-hit hypothesis (interview by Ezzie Hutchinson). // The Lancet Oncology, Volume 2, Issue 10, Pages 642 645, October 2001.

70. Lebeau A, Nerlich AG, Sauer U, et al. Tissue distribution of major matrix metalloproteinases and their transcripts in human breast carcinomas. // Anticancer Res. 1999; 19(5B):4257-64.

71. Li, R.; Zhu, H.; Ruan, J.; Qian, W.; Fang, X.; Shi, Z.; Li, Y.; Li, S. et al. (Feb 2010). "De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing" // Genome Res 20 (2): 265-72.

72. Loi S et al. Definition of clinically distinct molecular subtypes in estrogen receptor-positive breast carcinomas through genomic grade. // J Clin Oncol. 2007 Apr l;25(10):1239-46.

73. London SJ, Connolly JL, Schnitt SJ, et al. A prospective study of benign breast disease and the risk of breast cancer. // 1992 JAMA.; 267(7):941^t.

74. Ma XJ, Salunga R, Tuggle JT, et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. // 2003 Proc Natl Acad Sci USA.; 100(10):5974-9.

75. Ma XJ, Wang Z, Ryan PD, Isakoff SJ et al. A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen. // Cancer Cell. 2004 Jun;5(6):607-16.

76. Mastracci Teresa, Boulos Fouad, Andrulis Irene and Lam Wan. Genomics and premalignant breast lesions: clues to the development and progression of lobular breast cancer. // 2007. Breast Cancer Research, 9:215.

77. Maxhimer JB, Pesce CE, Stewart RA, et al. Ductal carcinoma in situ of the breast and heparanase-1 expression: a molecular explanation for more aggressive subtypes. // J Am Coll Surg. 2005;200(3):328-35.

78. McGuire WL. Endocrine Therapy of Breast Cancer. // Annual Review of Medicine 1975; 26: 353-363.

79. Miyamoto, K., K. Asada, T. Fukutomi, E. Okochi and Y. Yagi et al., 2003. Methylation-associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3-Osulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers. Oncogene, 22: 274-280.

80. Müller A, Homey B, Soto H, Ge N, Catron D, Buchanan ME, McClanahan T, Murphy E, Yuan W, Wagner SN, Barrera JL, Mohar A, Verästegui E, Zlotnik A. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. // 2001. Nature. Mar l;410(6824):50-6.

81. Muller HM, Fiegl H, Widschwendter A, Widschwendter M: Prognostic DNA methylation marker in serum of cancer patients. // Ann. NY Acad. Sei. 1022, 4449 (2004).

82. Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H et al.: DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker. // Cancer Res. 63(22), 7641-7645 (2003).

83. Nielsen TO, Hsu FD, Jensen K, et al. Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. // 2004 Clin Cancer Res; 10:5367-5374.

84. Noetzel E, Veeck J, Niederacher D et al.: Promoter methylation-associated loss of id4 expression is a marker of tumour recurrence in human breast cancer. // BMC Cancer 8, 154 (2008).

85. O'Connell P, Pekkel V, Fuqua SA, et al. Analysis of loss of heterozygosity in 399 premalignant breast lesions at 15 genetic loci. // 1998 J Natl Cancer Inst.; 90(9):697-703.

86. Olumi AF, Grossfeld GD, Hayward SW, Carroll PR, Tlsty TD, Cunha GR. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. // 1999 Cancer Res. Oct 1;59(19):5002-11.

87. Pegram MD, Konecny G, Slamon DJ. The molecular and cellular biology of HER2/neu gene amplification/overexpression and the clinical development of Herceptin (Trastuzumab) therapy for cancer. // Cancer Treat Res. 2000; 103:747775.

88. Petersen, O.W., Hoyer, P.E., and van Deurs, B. Frequency and distribution of estrogen receptor-positive cells in normal, nonlactating human breast tissue. // 1987. Cancer Res. 47: 5748-5751.

89. Polyak K, Hu M. J Mammary Gland Biol Neoplasia. Do myoepithelial cells hold the key for breast tumor progression? // 2005 Jul; 10(3):231-47.

90. Press MF, Finn RS, Cameron D et al. HER-2 gene amplification, HER-2 and epidermal growth factor receptor mRNA and protein expression, and lapatinib efficacy in women with metastatic breast cancer. // Clin Cancer Res 2008; 14 (23): 7861-70.

91. Pusztai L. et al. Combined use of genomic prognostic and treatment response predictors in breast cancer. // J Clin Oncol 26: 2008 May 20 suppl; abstr 527.

92. Reis-Filho JS, Drury S, Lambros MB, Marchio C, Johnson N, Natrajan R, Salter J, Levey P, Fletcher O, Peto J, Ashworth A, Dowsett M. ESR1 gene amplification in breast cancer: a common phenomenon? // Nat Genet. 2008; 40(7): 809-10, author reply 810-2.

93. Rosen PP. Rosen's breast pathology. // Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins, 2008.

94. Rosen P.P., Lieberman P.H., Braun D.W., Kisloff C., Adair F. Lobular carcinoma in situ of the breast. //1978. Am J Surg Pathol; 2: 225-5.

95. Radisky ES, Radisky DC. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2010;15(2):201-12.

96. Rutella S, Bonanno G, and De Cristofaro R. Targeting indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) to counteract tumour-induced immune dysfunction: from biochemistry to clinical development. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, Jun 2009; 9(2): 151-77.

97. Sambrook Joseph, Russell David William. Molecular cloning: a laboratory manual // 1989 Cold Spring Harbor, New York

98. Santen RJ, Mansel R. Benign breast disorders. // 2005 N Engl J Med.; 353(3):275-85.

99. Sauter G, Lee J, Bartlett JM et al. Guidelines for human epidermal growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. // J Clin Oncol 2009; 27 (8): 1323-33.

100. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. // 2006. Nature. 439:84-88.

101. Singh-Ranger G, Salhab M, Mokbel K. The role of cyclooxygenase-2 in breast cancer: review. 2008. Breast Cancer Res Treat. May; 109(2): 189-98.

102. Smith, G.H., and Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. // 1988. J. Cell Sci. 90:173-183.

103. Smith, G.H. Label-retaining epithelial cells in mouse mammary gland divide asymmetrically and retain their template DNA strands. // 2005.Development. 132:681-687.

104. Sontag. L., Axelrod. D.E. Evaluation of pathways for progression of heterogeneous breast tumors. // 2005. J. Theoret. Biol. 232: 179-189.

105. Sorlie T. Molecular classification of breast tumors: toward improved diagnostics and treatments. // Methods Mol Biol. 2007; 360: 91-114. Review.

106. Sorlie, T., Tibshirani, R, Parker, J. et al., 2003. "Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets", // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, pp.8418-23.

107. Sotiriou C et al. Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. // Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 10393-10398.

108. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. // 2006. Nature.439:993-997.

109. Sunami E, Shinozaki M, Sim MS, Nguyen SL, Vu AT, Giuliano AE, Hoon DS. Estrogen receptor and HER2/neu status affect epigenetic differences of tumor-related genes in primary breast tumors. // Breast Cancer Res. 2008;10(3):R46.

110. Sundquist M, Thorstenson S, Brudin L, Nordenskjold B. Applying the Nottingham Prognostic Index to a Swedish breast cancer population. South East Swedish Breast Cancer Study Group. // Breast Cancer Res Treat 1999; 53: 1-8.

111. Symmans WF et al. Use of genomic grade index (GGI) to predict pathologic response to preoperative chemotherapy in breast cancer. // J Clin Oncol 26: 2008 May 20 suppl; abstr 541.

112. Tamimi RM, Rosner B, Colditz GA. Evaluation of a breast cancer risk prediction model expanded to include category of prior benign breast disease lesion. //2010 Cancer.; 116(21):4944-53

113. Tavassoli FA. Pathology of the breast. // New York: Mcgraw-hill Companies, 2010.

114. Tlsty TD, Coussens LM. Tumor stroma and regulation of cancer development. // Annu Rev Pathol 2006; 1:119-150.

115. Tordai A et al. Evaluation of biological pathways involved in chemotherapy response in breast cancer. // Breast Cancer Research 2008, 10:R37.

116. Van der Auwera I, Yu W, Suo L, Van Neste L, van Dam P, et al. (2010) Array-Based DNA Methylation Profiling for Breast Cancer Subtype Discrimination. // PLoS ONE 5(9): el2616.

117. Veeck J, Geisler C, Noetzel E et al.: Epigenetic inactivation of the secreted frizzled-related protein-5 (SFRP5) gene in human breast cancer is associated with unfavorable prognosis. // Carcinogenesis 29(5), 991-998 (2008).

118. Villadsen, R., et al. Evidence for a stem cell hierarchy in the adult human breast. // 2007.J. Cell Biol.l77:87-101.

119. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Homes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. // 1995 Nucleic Acids Res. Nov 11;23(21):4407-14.

120. Wagner, K.U., et al. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: itsn role in functional adaptation and tissue renewal. // 2002 Development. 129:1377-1386.

121. Wang Y and Rekaya R LSOSS: Detection of Cancer Outlier Differential Gene Expression. Biomark Insights, Jan 2010; 5: 69-78.

122. Weisenberger Daniel, Campan Mihaela, Long Tiffany, Kim Myungjin, Woods Christian, Fiala Emerich, Ehrlich Melanie and Laird Peter. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. // Nucleic Acids Res. 2005; 33(21): 6823-6836.

123. Wiechmann L, Kuerer HM. The molecular journey from ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer. // Cancer. 2008;112 (10):2130-42.

124. Young, L.J., Medina, D., DeOme, K.B., and Daniel,C.W. The influence of host and tissue age on life span and growth rate of serially transplanted mouse mammary gland.// 1971 Exp. Gerontol. 6:49-56.

125. Yu, K., Lee, C.H., Tan, P.H., and Tan, P. Conservation of breast cancer molecular subtypes and transcriptional patterns of tumor progression across distinct ethnic populations. // 2004.Clin. Cancer Res. 10:5508-5517.

126. Zeps, N., Bentel, J.M., Papadimitriou, J.M., D'Antuono, M.F., and Dawkins, H.J. Estrogen receptor-negative epithelial cells in mouse mammary gland development and growth.// 1998. Differentiation. 62:221-226