Анализ дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Танас, Александр Сергеевич

• Танас, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Танас, Александр Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Значение метилирования ДНК в норме и патологии.

1.2. Распределение СрО-динклеотидов в геноме. СрО-островки.

1.3. Дифференциальное метилирование ДНК.

1.4. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез.

1.5. Методы анализа метилирования ДНК.

1.5.1. Методы ген-специфического анализа метилирования ДНК.

1.5.2. Методы скрининга дифференциального метилирования геномов нормальных и опухолевых клеток.

1.6. Обобщенный алгоритм геномного скрининга дифференциального метилирования ДНК.

1.7. Способы оптимизации методов поиска и идентификации СрО-островков, аномально метилированных в процессе канцерогенеза.

1.8. Программное обеспечение скрининга дифференциального метилирования геномов.

РЕЗЮМЕ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выявление дифференциально метилированных локусов геномов.

2.1.1. Выделение геномной ДНК.

2.1.2. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.1.3. Лигирование с адаптерами.

2.1.4. Полимеразная цепная реакция для метода АИМС.

2.1.5. Электрофорез ПААГ.

2.1.6. Фрагментный анализ продуктов АИМС.

2.1.7. Рестриктазное картирование.

2.1.8. Обработка ДНК бисульфитом натрия.

2.1.9. Метилспецифическое секвенирование.

2.1.10. Электрофорез МБ-ББСА.

2.2. Разработка алгоритмов и программного обеспечения непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов.

2.2.1. Модель обработки геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции.

2.2.2. Калибровка электрофореграмм по маркеру молекулярного веса.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Оптимизация алгоритма непредвзятого скрининга дифференциального метилированния геномов.

3.1.1. Требования к современному методу скрининга дифференциального метилирования геномов.

3.1.2. Оптимизация метода скрининга на основе анализа обобщенной схемы и алгоритма АИМС.

3.2. Алгоритм и компьютерная программа моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей.

3.2.1. Алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico.

3.3. Характеристика иерархии продуктов АИМС и описание количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС.

3.3.1. Количественная и качественная характеристика распределения сайтов узнавания эндонуклеазы рестрикции Xmal в геноме человека.

3.3.2. Количественная иерархия продуктов АИМС генома человека.

3.3.3. Качественный состав продуктов АИМС генома человека и дизайн экспериментов АИМС при помощи программы AIMS in silico.

3.3.4. Компьютерная программа визуализации данных экспериментов и дифференциации эпигеномных профилей.

3.4. Алгоритм и компьютерная программа геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК.

3.5. Анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы.

3.5.1. Выявление и картирование дифференциально метилированных локусов геномов.

3.5.2. Анализ дифференциально метилированных локусов, выявленных АИМС, методом метилспецифического секвенирования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга»

Актуальность проблемы.

Несмотря на очевидную ценность метилирования ДНК как диагностического маркера, накопленных на сегодняшний день данных об особенностях метилирования участков генома человека в норме и при патологии недостаточно для формирования эффективных систем эпигенетических маркеров опухолевого процесса (Shin et al, 2010; Hong et al, 2010; Wang et al, 2010; Suijkerbuijk et al 2011). Предполагается, что прогресс в разработке новых высокотехнологичных методов скрининга дифференциального метилирования ДНК позволит переломить эту ситуацию (Воск С., 2009).

Подходы к скринингу дифференциального метилирования ДНК можно принципиально разделить на две группы. Первая группа подразумевает предварительный отбор локусов для исследования, осуществляемый на основании некоторой гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Задача методов, осуществляющих подходы этой группы, - проверка исходной гипотезы о наличии дифференциального метилирования заранее отобранных последовательностей ДНК (Nemtsova M.V. et al., 2005; Wojdacz T., 2009; Ushijima T., 2005). Вторая группа подразумевает непредвзятый скрининг дифференциального метилирования. При помощи соответствующих методов в ходе скрининга сначала определяется дифференциальное метилирование заранее неизвестных локусов генома, а затем проводится идентификация их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают ни под одну из современных гипотез и не включаются в анализ методами первой группы, что не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard С. et al., 2006).

До недавнего времени возможности применения методов непредвзятого скрининга были в значительной степени ограничены сложностью геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК. Предложенный Е.Б.Кузнецовой с соавторами в 2007 г. протокол прямого секвенирования дифференциально метилированных фрагментов ДНК облегчает процесс геномного картирования за счет исключения этапа клонирования фрагментов, однако все еще требует их физического извлечения из полиакриламидных гелей. Секвенирование генома человека в сочетании с математическим моделированием раскрыло ранее недоступный способ картирования дифференциально метилированных локусов, выявляемых методами непредвзятого скрининга. Были предприняты попытки разработки виртуального изображения результатов одного из методов скрининга дифференциального метилирования - рестрикционно-ориентированного геномного сканирования - для идентификации фрагментов ДНК с использованием симулирующего программного обеспечения (Rouillard et al., 2001, Koike et al., 2008). Разработанные системы распространения не получили, вероятно, вследствие сложности самого метода скрининга. Очевидно, разработка подходов к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга все еще является актуальной задачей, что определило цель настоящей работы.

Целью настоящей работы является разработка подходов к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга.

Задачи исследования

1. Сформировать современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.

3. Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей.

4. Охарактеризовать иерархию и описать количественные и качественные параметры продуктов амплификации интерметилированных сайтов, получаемых при различных экпериментальных условиях.

5. Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования.

Научная новизна.

В результате проделанной работы разработан принципиально новый современный алгоритм скрининга дифференциального метилированния геномов, основанный на сочетании классического генноинженерного подхода - амплификации интерметилированных сайтов (АИМС), высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярном электрофорезе, и оригинального компьютерного обеспечения. Разработанная в рамках исследования программа AIMS in silico является первым компьютерным симулятором адаптор-опосредованной ПЦР, применимым к полному геному человека. Впервые охарактеризованы количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях; охарактеризована иерархия продуктов АИМС; критически переоценены закономерности редукции результирующей картины при увеличении длин универсальных праймеров АИМС в зависимости от нуклеотидного состава удлинителей.

Проведенный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 Т, ВТ-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12ql3.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

Практическая значимость.

Программа компьютерной симуляции результатов АИМС - AIMS in silico -позволяет в кратчайшие сроки провести научно обоснованное моделирование эксперимента с заранее заданными параметрами и определить оптимальный дизайн реальных экспериментов, исходя из задач исследования и приборной базы. Модуль программы AIMS in silico, обеспечивающий моделирование рестриктазного геномного картирования продуктов АИМС, позволяет быстро и эффективно проводить дизайн рестриктазного картирования. Разработанный способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК исключает необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.

Охарактеризованная иерархия продуктов АИМС служит удобным руководством к предварительной оценке степени снижения сложности результирующей картины при увеличении длин универсальных праймеров АИМС в зависимости от нуклеотидного состава удлинителей. Программа просмотра и анализа электрофореграмм РеакРюк обеспечивает удобную среду для осуществления дифференциального анализа репрезентаций эпигеномов и, кроме того, является одной из немногих общедоступных программ анализа результатов капиллярного электрофореза в целом. Разработанные алгоритмы, программы и методы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию.

Выявленные при анализе геномов клеточных линий рака молочной железы 211-751, НВЬ-100, Ш 578 Т, ВТ-474, МСБ7 и Т-47Э дифференциально метилированные геномные локусы могут служить субстратом для разработки молекулярно-генетических маркеров РМЖ.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2008 и 2009 гг., V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 г., 6-м симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний" (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010), конкурсе работ молодых ученых МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2010 (диплом и премия), VI

Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2011 г.

По результатам работы опубликовано 4 статьи, 15 тезисов, 2 главы в учебниках, 1 новая медицинская ДНК-технология, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation " Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers".

Положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный алгоритм скрининга дифференциального метилированния геномов, объединяющий классические генноинженерные подходы, высокоразрешающий способ разделения фрагментов нуклеиновых кислот и оригинальное компьютерное обеспечение представляет собой эффективную, завершенную систему, успешно прошедшую практическую апробацию.

2. Классический способ геномной идентификации дифференциально метилированных участков ДНК, выявляемых методом АИМС, может быть заменен рестриктазным картированием, проводимым на основе предварительного компьютерного моделирования.

3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.

4. Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование реальных экспериментов АИМС.

5. Непредвзятый характер скрининга дифференциального метилирования методом АИМС подтвержден выявлением в образцах клеточных линий РМЖ дифференциального метилирования неканонической локализации.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Танас, Александр Сергеевич

выводы.

1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза - с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов амплификации интерметилированных сайтов в процессе определения их геномной принадлежности.

3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов амплификации интерметилированных сайтов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.

4. Проведенная характеристика иерархии продуктов амплификации интерметилированных сайтов и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов.

5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 Т, ВТ-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12ql3.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ценность метилирования ДНК как диагностического маркера злокачественного опухолевого процесса не вызывает сомнений, однако информации о характере метилирования нормальных и опухолевых геномов получено на сегодняшний день крайне мало. Предполагается, что прогресс в разработке новых высокотехнологичных методов скрининга дифференциального метилирования ДНК позволит переломить эту ситуацию. Необходимым свойством таких методов является непредвзятый характер скрининга. Непредвзятый скрининг не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров.

До недавнего времени возможности применения методов непредвзятого скрининга были в значительной степени ограничены сложностью геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК.

В настоящем исследовании на основе анализа ранее разработанных методов сформирована обобщенная схема непредвзятого метода скрининга дифференциального метилирования геномов, включающая в себя этапы подготовки эпигеномных репрезентаций, их редукции, разделения элементов репрезентаций, определения геномной принадлежности элементов репрезентаций и их сравнения. Авторами методов предложено большое количество способов реализации каждого из этапов. Большинство модификаций приходится на этапы разделения, сравнения и определения геномной принадлежности отдельных элементов репрезентаций. На этапе разделения большинство нововведений коснулось способов сепарации фрагментов ДНК в гелях. В частности, осуществлены попытки применения капиллярного электрофореза. В области идентификации геномной принадлежности основные усилия направлены на исключение из протоколов скрининга процедур клонирования и секвенирования индивидуальных элементов репрезентации. На этапах сравнения репрезентаций и картирования их элементов все большее применение находят методы математического анализа. Возможности использования методов биоинформатики значительно расширились в результате завершения проекта «Геном человека». Появилась принципиальная возможность моделировать эксперименты по скринингу дифференциального метилирования иг зШсо, которой уже воспользовались авторы ряда компьютерных программ, направленных на снижение доли лабораторных процедур в процессе скрининга.

Указанные модификации не решили проблему создания оптимального метода скрининга дифференциального метилирования геномов. Для решения этой задачи необходим системный критический подход ко всем этапам скрининга, применение которого должно привести к формированию оптимальных алгоритмов, что определило цель и задачи проведенного нами исследования.

В результате исследования разработан алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов, отвечающий современным требованиям производительности и стандартизации, учитывающий текущий уровень развития приборно-методической лабораторной базы и возможности биоинформатики.

Для обеспечения возможности проведения научно обоснованного дизайна экспериментов по скринингу дифференциального метилирования геномов разработаны алгоритм и компьютерная программа моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей. Охарактеризована иерархия продуктов скрининговой реакции и описаны количественные и качественные параметры репрезентаций генома человека, получаемых при различных экпериментальных условиях. Для реализации общего алгоритма скрининга разработана компьютерная программа визуализации данных экспериментов и дифференциации эпигеномных профилей. Разработан протокол рестриктазного картирования, проводимого на основе предварительного математического моделирования, исключающий необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов АИМС в процессе определения их геномной принадлежности. На этапе разделения элементов эпигеномной репрезентации предложено использовать капиллярный электрофорез, обеспечивающий высокое разрешение фрагментов ДНК и предоставляющий электрофореграммы в виде, доступном для непосредственного использования программами цифровой обработки сигналов.

С использованием разработанного алгоритма проведен анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 Т, ВТ-474, MCF7 и T-47D. Выявлено 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpGостровков, расположенных в первых интронах генов А№СЗ и МАРК, в промоторной области гена С2СТ)2, в межгенных областях на хромосомах 12д13.13 и 13q32Л, а также участок первого экзона гена РТЖВ, не являющийся СрО-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Танас, Александр Сергеевич, 2012 год

1. Альберте Б., Брей Д. и др. Молекулярная биология клетки. // 1994. Издательство: Мир, Том 2, С.: 539

2. Залетаев Д.В., Горбунова В.Н., Бабенко О.В. Онкогеномика и молекулярная диагностика в онкологии // 2005. Геномика медицине. Научное издание / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН Л.Л. Киселева. - М.: ИКЦ «Академкнига» - 392 е.: ил.

3. Землякова В.В., Жевлова А.И., Стрельников В.В. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы.// 2003. Мол. Биол., 4, 693 703.

4. Кузнецова Е.Б., Кикеева Т.В., Ларин С.С., Землякова В.В., Бабенко О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Новые маркеры метилирования и экспессии генов при раке молочной железы // 2007. Молекулярная биология, 41(4), 624 633.

5. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В. Методы анализа метилирования ДНК // 2006. Медицинская генетика, 5(11), 3-11.

6. Стрельников В.В., Землякова В.В., Белецкий И.П., Грановский И.Э., Пальцева Е.М., Залетаев Д.В. ДНК-микрочипы в диагностике онкологических заболеваний // 2008. Молекулярная медицина, 5, 4-11.

7. Abe М., Okochi Е., Kuramoto Т., Kaneda A., Takato Т., Sugimura Т., Ushijima Т. Cloning of the 5' upstream region of the rat pl6 gene and its role in silencing. // 2002. Jpn. J. Cancer Res. 93(10), 1100-1106.

8. Abe M., Ohira M., Kaneda A., Yagi Y., Yamamoto S., Kitano Y., Takato Т., Nakagawara A., Ushijima T. CpG Island Methylator Phenotype Is a Strong Determinant of Poor Prognosis in Neuroblastomas // 2005. Cancer Res., 65, 828 -834.

9. Ahuja N., Issa J.P. Aging, methylation and cancer // 2000. Histol Histopathol, 15(3), 835 842.

10. Amir R.E., Van den Veyver I.B., Wan M., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2 // 1999. Nat. Genet., 23(2), 185 188.

11. Andrade L., Manolakos E.S. Signal Background Estimation and Baseline Correction Algorithms for Accurate DNA Sequencing // 2003. Journal of VLSI Signal Processing, 35, 229 -243.

12. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., et al. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia // 1998. Adv. Cancer. Res., 72, 141 196.

13. Bestor T.H. The DNA methyltransferases of mammals // 2000. Hum. Mol. Genet. 9, 2395 2402.

14. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // 2002. Genes & Dev. 16, 6-21.

15. Bianco T., Hussey D., Dobrovic A. Methylation-Sensitive, Single-Strand Conformation Analysis (MS-SSCA): A Rapid Method to Screen for and Analyze Methylation // 1999. Human Mutation, 14, 289 293.

16. Bikandi J., Millan R.S., Rementeria A., Garaizar J. In silico analysis of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR, and endonuclease restriction // 2004. Bioinformatics, 20(5), 798 799.

17. Bock C. Epigenetic biomarker development // 2009. Epigenomics, 1(1), 99-110.

18. Brock G.J.R., Huang T. H., Chen C., Johnson K.J. A novel technique for the identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (ICEAMP) // 2001. Nucleic Acids Res., 29, el23.

19. Brown C.G. The DNA sequencing renaissance and its implications for epigenomics // 2009. Epigenomics, 1(1), 5 8.

20. Chen R.Z., Pettersson U., Beard C., et al. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates // 1998. Nature. 395(6697), 89 93.

21. Costello J.F., Plass C. Methylation matters // 2001. J. Med. Genet., 38, 285 303.

22. Costello J.F., Hong C., Plass C., Smiraglia D.J. Restriction landmark genomic scanning: analysis of CpG islands in genomes by 2D gel electrophoresis // 2009. Methods Mol. Biol., 507,131 -48.

23. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes // 1995. Curr. Opin. Genet. Dev. 5(3), 309-314.

24. Esteller M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps // 2007. Nature Reviews Genetics, 8, 286 298.

25. Esteller M. DNA Methylation: Approaches, Methods and Applications // 2005. CRC Press, FL, USA, (2005).

26. Esteller M., Corn P., Baylin S., Herman J. A gene hypermethylation profile of human cancer. // 2001. Can.Res., 61, 3225 3229.

27. Evron E., Umbricht C.B., Korz D. et al. Loss of Cyclin D2 Expression in the Majority of Breast Cancers Is Associated with Promoter Hypermethylation // 2001. Cancer Res. 61,2782-2787.

28. Fraga M.F., Esteller M. DNA methylation: a profile of methods and applications // 2002. BioTechniques, 33, 632-649.

29. Frigola J., Solé X., Paz M.F., Moreno V., Esteller M., Capellá G., Peinado M.A. Differential DNA hypermethylation and hypomethylation signatures in colorectal cancer // 2005. Hum. Mol. Genet., 14, 319 326.

30. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes // 1987. J Mol. Biol., 196(2), 261 -282.

31. Gebhard C., Schwarzfischer L., Pham T.-H., Schilling E., Klug M., Andreesen R., Rehli M. Genome-Wide Profiling of CpG Methylation Identifies Novel Targets of Aberrant Hypermethylation in Myeloid Leukemia // 2006. Cancer Res., 66, 6118 -6128.

32. Gitan R.S., Shi H., Chen C., Yan P.S., Huang T.H. Methylation-Specific Oligonucleotide Microarray: A New Potential for High-Throughput Methylation Analysis // 2002. Genome Res., 12,158-164

33. Gonzalgo M.L., Liang G., Spruck C.H., III, Zingg J., Rideout W.M., Jones P.A. Identification and Characterization of Differentially Methylated Regions of Genomic DNA by Methylation-sensitive Arbitrarily Primed PCR // 1997. Cancer Res., 57, 594 599.

34. Gonzalgo M.L., Hayashida T., Bender C.M., Pao M.M., Tsai Y.C., Gonzales F.A., Nguyen H.D., Nguyen T.T., Jones P.A.The Role of DNA Methylation in Expression of the p 19/p 16 Locus in Human Bladder Cancer Cell Lines // 1998, Cancer Res., 58, 1245 1252.

35. Graham II M.L., Dalquist K.E., Horwitz K.B. Simultaneous Measurement of Progesterone Receptors and DNA Indices by Flow Cytometry: Analysis of Breast Cancer Cell Mixtures and Genetic Instability of the T47D Line // 1989. Cancer Res., 49, 3943-3949.

36. Hong C., Bollen A.W., Costello J.F. The Contribution of Genetic and Epigenetic Mechanisms to Gene Silencing in Oligodendrogliomas // 2003. Cancer Res, 63; 7600 -7605.

37. Issa J.P., Ahuja N., Toyota M., Bronner M.P., Brentnall T.A. Accelerated Age-related CpG Island Methylation in Ulcerative Colitis // 2001. Cancer Res., 61, 3573 -3577.

38. Jacinto F.V., Ballestar E., Esteller M. Methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP): hunting down the DNA methylome // 2008. BioTechniques, 44(1), 35 39.

39. Jacob S., Moley K.H. Gametes and Embryo Epigenetic Reprogramming Affect Developmental Outcome: Implication for Assisted Reproductive Technologies // 2005. Pediatr. Res. 58, 437 446.

40. James S.J., Pogribny I.P., Pogribna M., Miller B.J., Jernigan S., Melnyk S. Mechanisms of DNA Damage, DNA Hypomethylation, and Tumor Progression inthe Folate/Methyl-Deficient Rat Model of Hepatocarcinogenesis // 2003. J. Nutr., 133, 3740 3747.

41. Hajkova P., El-Maarri O., Engemann S., Oswald J., Olek A., Walter J. DNA-Methylation Analysis by the Bisulfite-Assisted Genomic Sequencing Method2002. Methods in Molecular Biology, vol. 200, 143-154

42. Haspel J., Blanco C., Jacob J., Grumet M. Promoter Methylation Analysis on Microdissected Paraffin-Embedded Tissues Using Bisulfite Treatment and PCR-SSCP // 2001. BioTechniques, 30, 66 72.

43. Kanel T., Gerber D., Schaller A., Baumer A., Wey E., Jackson C.B., Gisler F.M., Heinimann K., Gallati S. Quantitative 1-Step DNA Methylation Analysis with Native Genomic DNA as Template // 2010. Clin. Chem., 56, 1098 1106.

44. Kantlehner M., Kirchner R., Hartmann P., Ellwart J.W., Alunni-Fabbroni M., Schumacher A. A high-throughput DNA methylation analysis of a single cell // 2011. Nucleic Acids Res., 10,1093/nar/gkql357.

45. Khodosevich K.V., Lebedev Yu.B., Sverdlov E.D. The Tissue-Specific Methylation of Human-Specific Endogenous Retroviral LTRs // 2004. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 30(5), 441 445.

46. Koike K., Matsuyama T., Ebisuzaki T. Epigenetics: application of virtual image restriction landmark genomic scanning (Vi-RLGS) // 2008. FEBS Journal, 275(8), 1608 1616.

47. Levine J.J., Stimson-Crider K.M., Vertino P.M. Effects of methylation on expression of TMS1/ASC in human breast cancer cells // 2003. Oncogene, 22, 3475 3488.

48. Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs // 2002. Bioinformatics, 18(11), 1427 1431.

49. Marshall O.J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR // 2004. Bioinformatics, 20(15), 2471-2472.

50. Morey S.R., Smiraglia D.J., James S.R., Yu J, Moser M.T., Foster B.A., Karpf A.R. DNA Methylation Pathway Alterations in an Autochthonous Murine Model of Prostate Cancer// 2006. Cancer Res., 66,11659 11667.

51. NCBI Human Genome Build GRCh37http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/proj ects/genome/assembly/grc/

52. Nemtsova M., Zemlyakova V., Kusnetsova E., Strelnikov V., Lyubchenko L., Zaletayev D. Methylation profiling of carcinogenesis-associated genes in sporadic breast cancer // 2005. Breast Cancer Research, 7(Suppl 2), P4.17.

53. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // 1999. Cell. 99(3), 247-257.

54. Pattyn F., Hoebeeck J., Robbrecht P., Michels E., De Paepe A., Bottu G., Coornaert D., Herzog R., Speleman F., Vandesompele J. methBLAST and methPrimerDB: web-tools for PCR based methylation analysis // 2006, BMC Bioinformatics, 7, 496.

55. Rauch T.A., Zhong X., Wu X. et al.: High-resolution mapping of DNA hypermethylation and hypomethylation in lung cancer // 2008. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 105(1), 252-257.

56. Rein T., DePamphilis M.L., Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes // 1998. Nucleic Acids Research, 26(10), 2255 -2264.

57. Rohlin A., Wernersson J., Engwall Y., Wiklund L., Bjork J., Nordling M. Parallel Sequencing Used in Detection of Mosaic Mutations: Comparison With Four

58. Diagnostic DNA Screening Techniques // 2009. Human Mutation, 30 (6), 1012 -1020.

59. Rouillard J., Erson A.E., Kuick R., Asakawa J., Wimmer K., Muleris M., Petty E.M., Hanash S. Virtual Genome Scan: A Tool for Restriction Landmark-Based Scanning of the Human Genome // 2001. Genome Res., 11, 1453 1459.

60. Salem C.E., Markl I.D., Bender C.M., Gonzales F.A., Jones P.A., Liang G. PAX6 methylation and ectopic expression in human tumor cells // 2000. Int J Cancer, 87(2), 179- 185.

61. Seelan R.S., Pisano M.M., Greene R.M., Casanova M.F., Parthasarathy R.N. Differential methylation of the gene encoding myo-inositol 3-phosphate synthase (Isynal) in rat tissues // 2011. Epigenomics, 3(1), 111 124.

62. Serre D., Lee B.H., Ting A.H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome // 2010. Nucleic Acids Res., 38, 391 399.

63. Shin S.H., Kim B.H., Jang J. J., Suh K.S., Kang G.H. Identification of novel methylation markers in hepatocellular carcinoma using a methylation array // 2010. J. Korean Med. Sci., 25(8), 1152 1159.

64. Shpigelman E.S., Trifonov E.N., Bolshoy A.: CURVATURE: software for the analysis of curved DNA // 1993. Comput. Appl. Biosci., 9, 435 440.

65. Smiraglia D.J., Kazhiyur-Mannar R., Oakes C.C. et al. Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS) spot identification by second generation virtual RLGS in multiple genomes with multiple enzyme combinations // 2007. BMC Genomics, 8, 446.

66. Stellwagen N.C. Anomalous electrophoresis of DNA restriction fragments on Polyacrylamide gels // 1983. Biochemistry, 22(26), 6186 6193.

67. Strelnikov V.V., Kuznetsova E.B., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. Novel cancer related genes and methylation/expression markers associated with breast cancer // 2006a. AACR Meeting Abstracts, Nov 2006, B129.

68. Strelnikov V.V., Kuznetsova E.B., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. Identification of novel methylation/expression markers and genes associated with breast cancer // 2006b. AACR Meeting Abstracts, Sep 2006, A126.

69. Suijkerbuijk K. P. M., van Diest P. J., van der Wall E. Improving early breast cancer detection: focus on methylation // 2011. Ann. One., 22, 24 29.

70. Takai D., Jones P.A. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22 // 2002. PNAS, 99, 3740 3745.

71. Ting A.H., Jair K.W., Schuebel K.E., Baylin S.B. Differential requirement for DNA methyltransferase 1 in maintaining human cancer cell gene promoter hypermethylation // 2006. Cancer Res., 66, 729 735.

72. Trifonov E.N. Curved DNA // 1985. CRC Crit Rev Biochem, 19(2), 89 106.

73. Ushijima T. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells // 2005. Nat. Rev. Cancer, 5(3), 223 231.

74. Waki T., Tamura G., Sato M., Terashima M., Nishizuka S. and Motoyama T. Promoter methylation status of DAP-kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia // 2003. Cancer Sei, 94(4), 360 364.

75. Wang W., Srivastava S. Strategic Approach to Validating Methylated Genes as Biomarkers for Breast Cancer // 2010. Cancer Prevention Research, 3,16 24.

76. Weber M., Davies J .J., Wittig D. et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells // 2005. Nat. Genet. 37(8), 853 862.

77. Wojdacz T.K. Current methylation screening methods // 2009. Epigenomics, 1(2), 223 226.

78. Woodcock D.M., Linsenmeyer M.E., Doherty J.P., Warren W.D. DNA methylation in the promoter region of the pl6 (CDKN2/MTS-1/INK4A) gene in human breast tumours // 1999. Br J Cancer, 79(2), 251 256.

79. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor T.H. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites //1997. Trends Genet, 13(8), 335 340.

80. Yoshikawa H., de la Monte S., Nagai H., Wands J.R., Matsubara K., Fujiyama A. Chromosomal assignment of human genomic NotI restriction fragments in a two-dimensional electrophoresis profile // 1996. Genomics, 31(1), 28 35.

81. Zerilli F., Bonanno C., Shehi E., Amicarelli G., Adlerstein D., Makrigiorgos G. M. Methylation-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detecting Hypermethylated DNA in Simplex and Multiplex Formats // 2010. Clin. Chem., 56, 1287 1296.

82. Zilberman D., Henikoff S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns // 2007. Development, 134, 3959 3965.lOO.Zuo T., Tycko B., Liu T.M., Lin H.J., Huang T.H. Methods in DNA methylation profiling // 2009. Epigenomics, 1(2): 331 345