Механизмы взаимодействия регуляторного белка RecX с нуклеопротеиновыми филаментами RecA тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Алексеев Александр Андреевич

• Алексеев Александр Андреевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Алексеев Александр Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная роль белка RecA

1.2. Классификация филаментов RecA

1.3. Структурные особенности филаментов RecA

1.3.1. Кристаллические структуры филаментов RecA

1.3.2. Определение структурных параметров филаментов RecA методом малоуглового рассеяния нейтронов

1.3.3. Исследования филаментов RecA при помощи методов электронной микроскопии

1.4. Взаимодействие RecA с ДНК

1.5. Реакция обмена нитей

1.6. Взаимодействие RecA с регуляторными белками

1.7. Белок RecX - негативный регулятор RecA

1.8. Исследования неактивных состояний филамента RecA-онДНК

1.9. RecA из бактерии Deinococcus radiodurans

1.10. Исследование ДНК-белковых взаимодействий методом оптического захвата

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Подготовка ДНК

2.2. Выделение белков

2.2.1. Выделение и очистка RecA E. coli и RecA D. radiodurans

2.2.2. Выделение и очистка RecX E. coli

2.2.3. Выделение и очистка белка слияния RecX E. coli c флуоресцентным

белком mNeonGreen

2.3. Измерение АТФазной активности

2.4. Проведение экспериментов на установке Лазерный пинцет

2.4.1. Схема установки Лазерный пинцет

2.4.2. Промывка и пассивация микрофлюидной камеры

2.4.3. Калибровка оптической ловушки

2.4.4. Описание экспериментальных условий и растворов для проведения экспериментов методом оптического захвата

2.4.5. Манипуляции с одиночными молекулами ДНК

2.4.6. Флуоресцентная визуализация комплексов RecXmNG c филаментом RecA-онДНК

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеризация конформационных состояний филаментов образуемых на онДНК белком RecA из бактерии E. coli

3.1.1. Формирование филамента RecA на однонитевой ДНК

3.1.2. Переход филамента RecA из АТФ- в АДФ-состояние

3.1.3. Переход филамента RecA из АТФ в apo состояние

3.1.4. Последовательные переходы филамента RecA между АТФ, АДФ и apo состояниями

3.1.5. Исследование механических свойств филамента RecA в АТФ, АДФ и apo состояниях

3.1.6. Динамика конформационных переходов филамента RecA

3.1.7. Исследование кооперативности конформационных переходов филамента RecA

3.2. Характеризация неактивных филаментов RecA E. coli, формируемых на онДНК в результате de novo полимеризации

3.2.1. Формирование неактивного филамента RecA-онДНК в результате связывания RecA с онДНК в отсутствии нуклеотидных кофакторов

3.2.2. Динамика изменения длины неактивного филамента RecA-онДНК, сформированного de novo, при помещении в среду с АТФ

3.2.3. Оценка стехиометрии связывания RecA с ДНК для неактивных филаментов RecA-онДНК, полученных разными способами

3.3. Характеризация конформационных состояний филамента RecA

D. radiodurans на онДНК

3.3.1. Формирование активного филамента RecADr на онДНК

3.3.2. Переход филамента RecADr из АТФ- в apo состояние

3.3.3. Переходы филамента RecADr-онДНК между АТФ, АДФ и apo состояниями

3.3.4. Механические свойства филамента RecADr в АДФ и apo состояниях

3.4. Взаимодействие RecX E. coli с различными конформационными состояниями филамента RecA E. coli, сформированного на онДНК

3.4.1. Влияние RecX на АТФ форму филамента RecA

3.4.2. Влияние RecX на apo и АДФ состояния филамента RecA

3.4.3. Влияние RecX на конформационные переходы филамента RecA из неактивных форм в активную

3.4.4. Визуализация взаимодействия RecX с различными конформациями филамента RecA

3.4.5. Модель взаимодействия RecX с филаментом RecA-онДНК в присутствии АТФ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы взаимодействия регуляторного белка RecX с нуклеопротеиновыми филаментами RecA»

Актуальность темы исследования

Исследовательской доминантой данной работы является изучение механизмов взаимодействия регуляторного белка RecX с филаментом RecA, формируемом на однонитевой ДНК (онДНК), с учетом различных конформационных состояний филамента ЯееЛ-онДНК, реализующихся при гидролизе АТФ.

Белок ЯееЛ представляет собой центральный фермент гомологической рекомбинации в бактериях [1]. Для осуществления своих функций ЯееЛ в присутствии АТФ и ионов М^ формирует правозакрученные спиральные филаменты на онДНК [2]. ЯееЛ в виде нуклеопротеинового филамента на однонитевой ДНК осуществляет запуск бактериального БОБ-ответа, процесса ответственного за возникновение генов устойчивости к антибиотикам. Помимо запуска БОБ-ответа, филамент ЯееЛ играет основную роль в системе рекомбинационной репарации ДНК [3], а также задействован в горизонтальном переносе генов в ходе натуральной трансформации [4]. Изучение механизмов регуляции RecA важно для разработки способов борьбы с адаптацией бактерий к антибиотикам.

RecA относится к семейству рекомбиназ - высококонсервативных и жизненно важных ферментов, присутствующих в бактериях, археях, эукариотах и даже некоторых вирусах [5]. Несмотря на различие в аминокислотной последовательности, рекомбиназа Rad51 человека в значительной степени схожа структурно и функционально с бактериальным RecA [6]. Ингибирование Rad51 является одним из перспективных подходов в борьбе с онкологическими заболеваниями [7], в связи с чем изучение механизмов работы и регуляции рекомбиназ является актуальным.

Одним из важных регуляторов активности ЯееЛ является белок ЯееХ. ЯееХ ингибирует катализируемую филаментом ЯееЛ-онДНК реакцию обмена нитей,

АТФазную активность RecA и индукцию SOS-ответа. Ингибирование гомологической рекомбинации при помощи RecX используется при редактировании генома бактерий при помощи систем CRISPR-Cas [8]. На основе RecX разрабатываются пептиды, которые потенциально могут применяться совместно с антибиотиками [9]. По литературным данным концентрация RecX в клетке на два порядка ниже концентрации RecA [10], что коррелирует с экспериментами in vitro, демонстрирующими, что RecX способен ингибировать АТФазную активность RecA и рекцию обмена нитей при концентрациях значительно меньших концентрации RecA [11, 12]. Таким образом, RecX - очень эффективный ингибитор RecA, для объяснения механизма действия которого предложено несколько моделей, не сходящихся к единому консенсусу. Также никто ранее не исследовал, как регуляторные белки в принципе влияют на конформационные переходы внутри филамента RecA. Поэтому исследование того, как RecX воздействует на филамент RecA с учетом высокой конформационной динамичности филамента, является актуальным как с фундаментальной, так и с практической точки зрения.

Степень разработанности темы исследования

По имеющимся представлениям белок RecX стимулирует разборку филаментов RecA-ДНК, тем самым ингибируя АТФазную и другие активности RecA, требующие образования протяженного нуклеопротеинового филамента. В рамках одного из предложенных в литературе механизмов, RecX связывается с растущим 3'-концом филамента RecA и блокирует рост филамента, в то время как диссоциация RecA со стороны 5'-конца приводит к общей разборке филамента RecA-ДНК [11].

Согласно другому механизму взаимодействие RecX с мономерами внутри филамента RecA приводит к их локальной дестабилизации, что увеличивает количество концов, с которых происходит разборка филамента RecA [13]. Данный механизм базируется на наблюдении более быстрой разборки филамента

ЯесЛ-онДИК при увеличении концентрации ЯесХ и результатах структурных исследований, согласно которым связывание ЯесХ происходит внутри бороздки филамента ЯесЛ.

Известно, что ЯесЛ обладает по крайней мере двумя конформационными состояниями или формами: активной и неактивной. Нуклеопротеиновые филаменты, формируемые в присутствии АТФ представляют собой активную форму [14, 15], в то время как в присутствии АДФ или в отсутствии нуклеотидных кофакторов реализуется неактивная форма филамента ЯесЛ [15, 16]. Две формы филамента отличаются своими механическими свойствами, в частности, активная форма характеризуется большим шагом спирали по сравнению с неактивной [14-17].

Переходы между двумя формами филамента, происходящие в результате гидролиза и связывания АТФ, были продемонстрированы в ряде относительно недавних одномолекулярных исследований [18, 19]. Известно, что гидролиз АТФ внутренними мономерами ЯесЛ нуклеопротеинового филамента не приводит к их диссоциации от ДНК [20]. Диссоциация мономеров ЯесЛ от нуклеопротеинового филамента при гидролизе АТФ происходит только с концов филамента. Учитывая, что в своей активной форме филамент ЯесЛ гидролизует значительное количество АТФ, большинство актов гидролиза должно происходить во внутренней части филамента, а не на его концах. Поскольку связанный в межмономерном интерфейсе нуклеотидный кофактор определяет конформацию комплекса ЯесЛ-ДИК [15, 16], гидролиз АТФ может потенциально приводить к локальному появлению в активном филаменте ЯесЛ-ДНК участков неактивной формы. Вместе с тем роль структурных перестроек внутри рекомбиназных филаментов, индуцируемых гидролизом АТФ, до сих пор полностью не изучена.

Локальное появление участков неактивной конформации в филаменте ЯесЛ-ДНК, находящемся в среде с АТФ, может служить дополнительным уровнем регуляции, реализующимся через конформационно-специфические взаимодействия. Однако, каких-либо сведений о взаимодействии регуляторных

белков, в том числе белка RecX, с неактивными конформациями филамента RecA-ДНК ранее в литературе описано не было.

Цели и задачи

Цель работы — Разработка модели конформационно-специфической регуляции филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК белком RecX E. coli.

Задачи работы:

1. Разработка протоколов формирования на уровне одиночных молекул конформационных состояний филамента RecA на однонитевой ДНК в присутствии АТФ, АДФ и в отсутствии нуклеотидных кофакторов (apo).

2. Характеризация механических свойств филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК во всех трёх конформационных состояниях и измерение динамики переходов между ними.

3. Оценка кооперативности конформационных переходов филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК при связывании АТФ и АДФ.

4. Оценка консервативности конформационных переходов на примере нуклеопротеинового филамента RecA D. radiodurans.

5. Определение влияния RecX E. coli на АТФ, АДФ и apo состояния филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК и динамику переходов между ними.

6. Визуализация взаимодействия RecX E. coli с различными конформациями филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК.

7. Построение модели взаимодействия RecX с филаментом RecA-онДНК с учетом АТФ-зависимых конформационных перестроек филамента

Научная новизна

Проведенная впервые на уровне одиночных молекул характеризация взаимодействия белка RecX E. coli с неактивными конформациями филамента RecA E. coli (RecAEc) на однонитевой ДНК показала, что RecX приводит к

стабилизации неактивной конформации филамента RecAEc-онДНК и замедлению перехода неактивной конформации в активную. Также впервые показано, что RecX E. coli вызывает обратимое увеличение числа неактивных состояний в структуре филамента RecAEc-онДНК, находящегося в среде с АТФ. Полученные данные позволили предложить новый механизм регуляции филамента RecA-онДНК белком RecX через конформационно-специфические взаимодействия.

Разработка модели регуляции филамента RecAEc-онДНК белком RecX потребовала детальной характеризации конформационных состояний филамента RecAEc-онДНК на одномолекулярном уровне. Результаты исследования показали, что неактивная форма филамента представлена двумя различными неактивными АДФ и apo конформационными состояниями, обладающими различными механическими свойствами и стабильностью. Исследование динамики прямых и обратных конформационных переходов между активным и неактивными состояниями для протяженных (~3000 мономеров) филаментов RecAEc-онДНК позволило измерить константы скоростей этих процессов, а на основании данных о зависимости длины индивидуальных филаментов от концентрации кофакторов получить численные значения коэффициентов Хилла, показывающие что эти переходы имеют кооперативный характер.

В работе также были получены данные о конформационных состояниях филамента, формируемого белком RecA D. radiodurans (RecADr) на онДНК. Впервые было показано, что филамент RecADr-онДНК испытывает обратимые конформационные переходы, что свидетельствует о высокой степени консервативности конформационных состояний нуклеопротеиновых филаментов, образуемых семейством рекомбиназ.

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе обнаружена и охарактеризована ранее неизвестная активность белка ЯееХ, непосредственно задействованная в ингибировании нуклеопротеиновых филаментов ЯееЛ. Полученные результаты необходимы для полноценного понимания механизмов ингибирования активности ЯееЛ белком ЯееХ, а также проясняют роль локальных конфорционных изменений, происходящих в филаменте ЯееЛ-онДНК в ходе гидролиза АТФ.

Разработанные протоколы регистрации конформационных состояний индивидуальных филаментов ЯееЛ и результаты экспериментов по характеризации этих состояний создают основу для дальнейшего исследования регуляции активности филамента ЯееЛ другими белковыми кофакторами в контексте их взаимодействия с тремя различными конформационными состояниями филамента ЯееЛ-онДНК, а также для исследования конформационных состояний нуклеопротеиновых филаментов, образуемых гомологами ЯееЛ.

Практическая значимость работы обусловлена тем, что ЯееЛ непосредственно участвует как в репарации ДНК бактерий, так и в процессах связанных с выработкой и распространением генов устойчивости к антибиотикам. В связи с этим, полученные данные о новом механизме ингибирования ЯееЛ белком ЯееХ представляют практическую ценность при разработке антибактериальных препаратов, использующих ЯееЛ в качестве мишени.

Методология и методы исследования

Основным методом исследования, использовавшимся в данной диссертационной работе, является метод оптического захвата, реализованный на установке УНУ «Лазерный пинцет» в НИК «Нанобиотехнологии» СПбПУ. Экспериментальная установка включает в себя УНУ «Лазерный пинцет» и пятиканальную микрофлюидную систему. Установка «Лазерный пинцет»

позволяет создавать две независимые оптические ловушки, за счет фокусировки двух лазерных пучков ортогональной поляризации.

Манипуляция одиночными молекулами ДНК и ДНК-белковыми комплексами осуществлялась посредством двух полистироловых микросфер (диаметр 2,1 мкм), удерживаемых оптическими ловушками. Используемые молекулы ДНК представляли собой линейные двунитевые молекулы длиной около 11 тыс. пар оснований с модифицированными биотином концами.

Анализ изображений, получаемых при помощи EMCCD камеры, использовался для контроля в реальном времени положения микросфер и силы натяжения, прикладываемой к удерживаемой молекуле ДНК.

В ходе эксперимента однонитевой ДНК-субстрат получали методом силового плавления из исходно двунитевых молекул ДНК, содержащих модификацию биотином на 5'- и 3'- концах одной и той же нити ДНК.

Манипуляции с ДНК проводились внутри промываемой камеры микрофлюидной системы. Данная система позволяет формировать внутри камеры до пяти каналов, представляющих собой ламинарные потоки с различным содержанием, не имеющих при этом физических границ между друг другом. Совмещение метода оптического захвата с пятиканальной микрофлюидной системой позволяет переносить захваченные объекты между каналами камеры, тем самым меняя состав раствора вокруг исследуемого субстрата.

Формирование нуклеопротеинового филамента ЯесЛ на однонитевой ДНК, а также конформационные изменения филамента при переносе между каналами, содержащими различные нуклеотидные кофакторы, приводят к изменениям механических свойств удерживаемого субстрата, что регистрируется в ходе эксперимента с использованием метода оптического захвата.

Положения, выносимые на защиту

1. Исследованиями на уровне одиночных молекул показано, что АДФ форма филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК отличается от apo формы филамента

механическими свойствами и обладает меньшей в сравнении с apo формой стабильностью.

2. Показано, что взаимодействие АТФ и АДФ с apo формой филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК носит кооперативный характер с коэффициентом Хилла около 3.

3. Показано, что RecX E. coli специфически связывается с неактивными состояниями филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК, проявляя к ним большее сродство, чем к активному АТФ-связанному состоянию филамента.

4. Показано, что время жизни неактивных состояний филамента RecA E. coli на однонитевой ДНК, динамически возникающих в результате гидролиза АТФ, многократно увеличивается при взаимодействии с RecX E. coli.

5. На основе полученных результатов предложена новая модель регуляции нуклеопротеинового филамента RecA белком RecX, осуществляющейся через взаимодействие RecX с неактивными состояниями филамента RecA, возникающими в ходе гидролиза АТФ.

Личный вклад автора

Автором диссертации непосредственно выполнен основной массив экспериментов с использованием метода оптического захвата по определению механизмов конформационно-специфической регуляции филамента RecA-онДНК белком RecX и характеризации конформационных состояний филамента RecA-онДНК. Получение и очистка белков RecA E. coli, RecA D. radiodurans, RecX E. coli осуществлялись Дмитрием Михайловичем Байтиным. Получение и очистка флуоресцентно модифицированного белка RecX выполнены Георгием Евгеньевичем Побегаловым. Ходорковский Михаил Алексеевич и Побегалов Георгий Евгеньевич принимали активное участие в обсуждении экспериментальных данных, планировании экспериментов, а также в решении различных технических вопросов, связанных с проведением экспериментов на установке "Лазерный пинцет" и подготовке публикаций.

Степень достоверности и апробация результатов

Все проведённые эксперименты были корректно спланированы. Получаемые в ходе экспериментов данные обрабатывались с использованием стандартных статистических методов. Результаты диссертационной работы опубликованы в ряде высокорейтинговых научных журналах, в том числе в журнале eLife с импакт-фактором 8.14. Также результаты работы были представлены на ряде конференций, в том числе с международным участием. Исследования по теме данной диссертационной работы были финансово поддержаны грантом РНФ №19-74-10049.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка литературы, списка сокращений и условных обозначений и благодарностей. Работа изложена на 134 страницах, содержит 1 таблицу, 56 рисунков и 1 приложение. Список литературы включает 169 источников.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Функциональная роль белка RecA

Ген recA E. coli открыт Кларком и Маргулис в 1965-м году [21]. Молекулярная масса белка RecA (E. coli) 38 кДа [22]. RecA содержит 352 аминокислотных остатка и состоит из трех доменов: центрального корового домена, обладающего АТФазной активностью, и двух небольших N-концевого и C-концевого доменов [17, 23]. RecA является центральным ферментом гомологической рекомбинации в бактериях, механизма, используемого живыми организмами для поддержания целостности генома [1]. При помощи гомологической рекомбинации клетки осуществляют точное восстановление тяжелых повреждений ДНК, в частности двунитевых разрывов [3, 5, 24]. В ходе восстановления поврежденного участка ДНК RecA полимеризуется на участке однонитевой ДНК, образуя спиралевидный нуклеопротеинвый филамент, который осуществляет поиск гомологичной последовательности ДНК и последующий обмен нитей ДНК в случае достаточной гомологии [2, 25]. Схема восстановления двунитевого разрыва ДНК при помощи гомологической рекомбинации представлена на рисунке 1.

<1>|

(2) {

(3) {

гхИ'........)С1

(4,|

Рисунок 1 - Восстановление двунитевого разрыва ДНК при помощи гомологической рекомбинации; (1)-удаление части ДНК для образования однонитевых участков с З'-концом; (2)-связывание однонитевых участков с гомологичными участками идентичной неповрежденной молекулы; (3)-достраивание недостающих фрагменов ДНК-полимеразой; (4)-разделение молекул при помощи рестрикции крестообразных соединений никирующими

эндонуклеазами. Адаптировано из [26]

При возникновении двунитевого разрыва с образовавшимися концами ДНК связывается белковый комплекс ЯееБСВ, который осуществляет процессинг ДНК, формируя в конечном итоге однонитевой участок ДНК на конце молекулы ДНК [27]. ЯееЛ полимеризуется на однонитевой ДНК, образуя нуклеопротеиновый филамент [2, 19]. Филамент RecA осуществляет поиск гомологичной последовательности и связывание однонитевых участков с комплементарной цепью найденной молекулы. В результате обмена нитей ДНК становится возможным достраивание недостающих фрагментов

ДНК-полимеразой по матрице неповрежденной молекулы. На завершающем этапе происходит рестрикция никирующими эндонуклеазами крестообразных соединений ДНК, благодаря чему две молекулы могут отделиться друг от друга [28]. В результате восстановления двунитевого разрыва произошел обмен однонитевыми участками между восстанавливаемой молекулой и исходно неповрежденной молекулой, используемой для восстановления.

Стоит отметить, что комплекс RecBCD обладает одновременно хеликазной и нуклеазной активностью и регулируется короткой специфичной последовательностью 5'-GCTGGTGG-3', именуемой %-сайтом [29, 30]. Помимо формирования однонитевого участка ДНК с 3'-концом, RecBCD катализирует связывание RecA с образующейся онДНК [31, 32].

Помимо восстановления двунитевых разрывов, RecA участвует в восстановлении репликационных вилок, подвергнувшихся коллапсу вследствие повреждений различного типа на реплицируемой ДНК-матрице [33-35].

Реакцией бактериальной клетки на значительные повреждения ДНК является SOS-ответ [36]. Экспрессия SOS-индуцируемых генов запускается в результате катализируемого филаментом RecA-онДНК автопротеолиза репрессора LexA [37]. SOS-ответ у бактерий является одним из потенциальных путей выработки и распространения генов устойчивости к антибиотикам [38]. Примечательно, что при SOS-ответе многократно увеличивается экспрессия самого recA [39].

Для бактерии Bacillus subtilis было показано, что RecA участвует в процессе горизонтального переноса генов в ходе природной трансформации [4].

1.2. Классификация филаментов RecA

Для осуществления обмена гомологичных участков ДНК (синапса), RecA в присутствии АТФ и ионов Mg формирует филамент на иницирующей однонитевой ДНК. Данный филамент RecA упоминается в литературе как пресинаптический [40, 41]. В ходе взаимодействия пресинаптического филамента

с гомологичной дуплексной ДНК, содержащей идентичную и комплементарную цепь (Рисунок 2), происходит разрыв водородных связей между комплементарной и идентичной цепью и образование новых водородных связей между комплементарной и иницирующей цепью [42]. Филамент ЯееЛ, содержащий в своей центральной части (первичном сайте связывания ДНК) гетеродуплексную ДНК, образованную в результате обмена нитей, упоминается как постсинаптический [17]. В случае успешного синапса, постсинаптический филамент разбирается в ходе гидролиза АТФ, в результате чего конечным продуктом обмена нитей становится молекула днДНК, состоящая из иницирующей и комплементарной цепи и молекула онДНК из идентичной цепи.

Рисунок 2 - Обмен нитей ДНК; а) Филамент ЯееЛ на иницирующей ДНК катализирует обмен нитей ДНК; б) Принципиальная схема обмена нитей, желтым изображена иницирующая нить, фиолетовым - комплементарная, голубым -

идентичная. Адаптировано из [42]

Согласно литературным данным, филамент ЯееЛ может находиться в двух конформационных состояниях, в зависимости от типа нуклеотидного кофактора,

связанного в межмономерном интерфейсе [15, 16]. Конформация филамента ЯееЛ на ДНК, упоминаемая как активная, реализуется в присутствии АТФ или его аналогов. В присутствии АДФ или в отсутствии нуклеотидных кофакторов реализуется неактивная конформация ДНК-белкового филамента ЯееЛ. ЯееЛ способен образовывать филаменты без ДНК, данные комплексы также иногда упоминаются как неактивные филаменты или неактивная форма ЯееЛ [17, 43]. Неактивная конформация филаментов ЯееЛ на ДНК также, как и неактивные филаменты ЯееЛ без ДНК характеризуется меньшим шагом спирали по сравнению с активной конформацией филамента ЯееЛ.

1.3. Структурные особенности филаментов RecA 1.3.1. Кристаллические структуры филаментов RecA

В 1992-ом году впервые была разрешена кристаллическая структура ЯееЛ. Кристаллическая структура была получена для филаментов ЯееЛ без ДНК, содержащих [44] и не содержащих АДФ [23]. Структуры с АДФ были получены путем внедрения АДФ посредством диффузии к кристаллам, выращенным исходно в отсутствии АДФ. Согласно полученным данным присутствие АДФ приводило лишь к малозначительным изменениям белковой конформации. Структура филамента ЯееЛ без АДФ характеризовалась шагом спирали 82.7 А, а структура с АДФ 83.1 А.

В 2005-ом году были получены кристаллические структуры для филаментов без ДНК, образуемых каталитически активным вариантом ЯееЛ, содержащим дополнительные аминокислотные остатки Гли-Сер-Гис-Мет со стороны К-конца [45]. Данные структуры характеризовались несколько меньшим шагом спирали около 74 А, но схожим устройством межмономерного интерфейса и конформацией корового домена в сравнении с кристалллическими структурами, полученными ранее.

В 2008-ом в работе [17] получены кристаллические структуры активного пресинаптического филамента ЯееЛ-онДНК, активного постсинаптического филамента и филамента ЯееЛ без ДНК. Для получения активной конформации ДНК-белковых филаментов ЯееЛ использовали АДФ-ЛШ4, представляющий собой один из негидролизуемых аналогов АТФ. ДНК-белковые филаменты представляли собой результат полимеризации белков слияния ЯееЛ (5 или 6 мономеров ЯееЛ) на коротких гомополимерных ДНК (15 или 18 нуклеотидов соответственно). Для получения структуры филамента ЯееЛ без ДНК использовался белок слияния из 4-х мономеров ЯееЛ. Структура активного филамента ЯееЛ-онДНК представлена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Структура активного филамента ЯееЛ-онДНК. Шесть последовательных мономеров представлены разными цветами Адаптировано из

[17]

Согласно полученным данным [17], активный филамент ЯееЛ-онДНК обладает шагом спирали 94 А, при этом на один оборот приходится 6,2 мономера ЯееЛ. Данный филамент является правозакрученным. ДНК, расположенная в первичном сайте связывания вблизи центральной оси филамента, в среднем удлинена в 1,5 раза в сравнении с В-формой ДНК, при этом в структуре связанной ДНК можно выделить триплеты, на участки между которыми приходится основная часть удлинения. Стехиометрически на один триплет приходится один мономер ЯееЛ, однако каждый не концевой триплет образует контакты с тремя последовательными мономерами ЯееЛ.

Петли Ь1 и Ь2 (остатки 155-170 и 195-205 соответственно [46]), неупорядоченные в филаменте ЯееЛ без ДНК, упорядочиваются в активном филаменте ЯееЛ-онДНК (Рисунок 4) и принимают участие в связывании сахарофосфатного остова иницирующей онДНК аминокислотными остатками Мет 197, Гли 211, Гли 212 [17]. Также в связывании сахарофосфатного остова задействованы аминокислотные остатки Асн 213, Сер 172, Арг 176, входящие в состав а-спиралей центрального домена. Упорядоченный в виде р-шпильки участок петли Ь2 стабилизирует промежутки между триплетами, в взаимодействии с основаниями крайних нуклеотидов в триплете заняты аминокислотные остатки Мет 197, Иле 199, Гли 200, Лиз 198, Тре 208. Участки оснований триплета, обычно задействованные в образовании водородных связей между комплементарными основаниями в структуре днДНК, остаются доступными для взаимодействия со стороны растворителя.

Рисунок 4 - Взаимодействия триплета онДНК с аминокислотными остатками мономеров ЯееЛ в структуре пресинаптического филамента. Три последовательных мономера ЯееЛ изображены коричневым, зелёным и голубым цветом. Центральный триплет выделен жёлтым цветом. Адаптировано из [17]

В пресинаптическом филаменте ЯееЛ молекула нуклеотидного кофактора в комплексе с ионом М£2+ расположена в интерфейсе, образуемом центральными доменами двух соседних мономеров, и не доступна для растворителя (Рисунок 5). Со стороны одного мономера нуклеотидный кофактор взаимодействует с высоконсервативной последовательностью, называемой мотивом Уолкера (Р-петля). Данный интерфейс взаимодействия нуклеотидного кофактора с ЯееЛ также присутствует в структуре филамента без ДНК, рассматриваемого в работе [17] как неактивное состояние ЯееЛ. Со стороны второго мономера в пресинаптическом филаменте ЯееЛ нуклеотидный кофактор упирается в поверхность мономера и координируется аминокислотными остатками Лиз 248 и

Лиз 250. В филаменте ЯееЛ без ДНК данный интерфейс отсутствует и нуклеотидный кофактор становится доступным с этой стороны для растворителя.

Взаимодействие АТФ с остатками Лиз 248 и Лиз 250 стабилизирует интерфейс между мономерами ЯееЛ, соответствующий активной конформации филамента ЯееЛ-ДНК. Данный интерфейс и сайт связывания нуклеотидного кофактора аллостерически сцеплены через цепь водородных связей с первичным сайтом связывания ДНК. Гидролиз АТФ и уход у-фосфата приводит к дестабилизации активной конформации нуклеопротеинового филамента ЯееЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алексеев Александр Андреевич, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kowalczykowski S. C., Eggleston A. K. Homologous pairing and DNA strandexchange proteins // Annual review of biochemistry. - 1994. - T. 63, № 1. - C. 9911043.

2. Hegner M., Smith S. B., Bustamante C. Polymerization and mechanical properties of single RecA-DNA filaments // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1999. - T. 96, № 18. - C. 10109-10114.

3. Jasin M., Rothstein R. Repair of strand breaks by homologous recombination // Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2013. - T. 5, № 11. - C. a012740.

4. Le S., Serrano E., Kawamura R., Carrasco B., Yan J., Alonso J. C. Bacillus subtilis RecA with DprA-SsbA antagonizes RecX function during natural transformation // Nucleic acids research. - 2017. - T. 45, № 15. - C. 8873-8885.

5. del Val E., Nasser W., Abaibou H., Reverchon S. RecA and DNA recombination: a review of molecular mechanisms // Biochemical Society Transactions. - 2019. - T. 47, № 5. - C. 1511-1531.

6. Baumann P., West S. C. Role of the human RAD51 protein in homologous recombination and double-stranded-break repair // Trends in biochemical sciences. -1998. - T. 23, № 7. - C. 247-251.

7. Gu P., Xue L., Zhao C., Li W., Jiang Z., Liu A., Li T., Liu L., Decker M., Cheng X. Targeting the homologous recombination pathway in cancer with a novel class of RAD51 inhibitors // Frontiers in Oncology. - 2022. - C. 1741.

8. Ding X.-Y., Li S.-S., Geng Y.-M., Yan M.-Y., Li G.-B., Zhang G.-L., Sun Y.-C. Programmable base editing in Mycobacterium tuberculosis using an engineered CRISPR RNA-guided cytidine deaminase // Frontiers in Genome Editing. - 2021. - T. 3. - C. 734436.

9. Yakimov A., Pobegalov G., Bakhlanova I., Khodorkovskii M., Petukhov M., Baitin D. Blocking the RecA activity and SOS-response in bacteria with a short a-helical peptide // Nucleic acids research. - 2017. - T. 45, № 16. - C. 9788-9796.

10. Pages V., Koffel-Schwartz N., Fuchs R. P. recX, a new SOS gene that is co-transcribed with the recA gene in Escherichia coli // DNA repair. - 2003. - T. 2, № 3. -C. 273-284.

11. Drees J. C., Lusetti S. L., Chitteni-Pattu S., Inman R. B., Cox M. M. A RecA filament capping mechanism for RecX protein // Molecular cell. - 2004. - T. 15, № 5. -C. 789-798.

12. Stohl E. A., Brockman J. P., Burkle K. L., Morimatsu K., Kowalczykowski S. C., Seifert H. S. Escherichia coli RecX inhibits RecA recombinase and coprotease activities in vitro and in vivo // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - T. 278, № 4. - C. 2278-2285.

13. Ragone S., Maman J. D., Furnham N., Pellegrini L. Structural basis for inhibition of homologous recombination by the RecX protein // The EMBO journal. - 2008. - T. 27, № 16. - C. 2259-2269.

14. Morimatsu K., Takahashi M., Norden B. Arrangement of RecA protein in its active filament determined by polarized-light spectroscopy // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - T. 99, № 18. - C. 11688-11693.

15. Yu X., Egelman E. Structural data suggest that the active and inactive forms of the RecA filament are not simply interconvertible // Journal of molecular biology. - 1992. -T. 227, № 1. - C. 334-346.

16. Ruigrok R., Bohrmann B., Hewat E., Engel A., Kellenberger E., DiCapua E. The inactive form of recA protein: the 'compact'structure // The EMBO journal. - 1993. -T. 12, № 1. - C. 9-16.

17. Chen Z., Yang H., Pavletich N. P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures // Nature. - 2008. - T. 453, № 7194. - C. 489-494.

18. Nishinaka T., Doi Y., Hara R., Yashima E. Elastic behavior of RecA-DNA helical filaments // Journal of molecular biology. - 2007. - T. 370, № 5. - C. 837-845.

19. van Loenhout M. T., van der Heijden T., Kanaar R., Wyman C., Dekker C. Dynamics of RecA filaments on single-stranded DNA // Nucleic acids research. - 2009. - T. 37, № 12. - C. 4089-4099.

20. Cox J. M., Tsodikov O. V., Cox M. M. Organized unidirectional waves of ATP hydrolysis within a RecA filament // PLoS biology. - 2005. - T. 3, № 2. - C. e52.

21. Clark A. J., Margulies A. D. Isolation and characterization of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K12 // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1965. - T. 53, № 2. - C. 451-459.

22. Vlckova V., Cernakova L., Farkasova E., Brozmanova J. The Escherichia coli recA gene increases UV-induced mitotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae // Current genetics. - 1994. - T. 25. - C. 472-474.

23. Story R. M., Weber I. T., Steitz T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer // Nature. - 1992. - T. 355, № 6358. - C. 318.

24. Cox M. M. Recombinational DNA repair in bacteria and the RecA protein // Progress in nucleic acid research and molecular biology. - 1999. - T. 63. - C. 311-366.

25. Bell J. C., Kowalczykowski S. C. RecA: regulation and mechanism of a molecular search engine // Trends in biochemical sciences. - 2016. - T. 41, № 6. - C. 491-507.

26. Heller I., Hoekstra T. P., King G. A., Peterman E. J., Wuite G. J. Optical tweezers analysis of DNA-protein complexes // Chemical reviews. - 2014. - T. 114, № 6. - C. 3087-3119.

27. Lohman T. M., Fazio N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD helicase // Bioessays. - 2018. - T. 40, № 6. - C. 1800009.

28. Spies M., Kowalczykowski S. C. Homologous recombination by the RecBCD and RecF pathways // The bacterial chromosome. - 2004. - C. 389-403.

29. Dixon D. A., Kowalczykowski S. C. The recombination hotspot x is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme // Cell. - 1993. - T. 73, № 1. - C. 87-96.

30. Spies M., Amitani I., Baskin R. J., Kowalczykowski S. C. RecBCD enzyme switches lead motor subunits in response to x recognition // Cell. - 2007. - T. 131, № 4. - C. 694-705.

31. Arnold D. A., Kowalczykowski S. C. Facilitated loading of RecA protein is essential to recombination by RecBCD enzyme // Journal of Biological Chemistry. -2000. - T. 275, № 16. - C. 12261-12265.

32. Spies M., Kowalczykowski S. C. The RecA binding locus of RecBCD is a general domain for recruitment of DNA strand exchange proteins // Molecular cell. - 2006. - T. 21, № 4. - C. 573-580.

33. Lusetti S. L., Cox M. M. The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks // Annual review of biochemistry. - 2002. - T. 71, № 1. - C. 71-100.

34. Khan S. R., Kuzminov A. Replication forks stalled at ultraviolet lesions are rescued via RecA and RuvABC protein-catalyzed disintegration in Escherichia coli // Journal of Biological Chemistry. - 2012. - T. 287, № 9. - C. 6250-6265.

35. Robu M. E., Inman R. B., Cox M. M. RecA protein promotes the regression of stalled replication forks in vitro // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2001. - T. 98, № 15. - C. 8211-8218.

36. Shinagawa H. SOS response as an adaptive response to DNA damage in prokaryotes // Stress-inducible cellular responses. - 1996. - C. 221-235.

37. Little J. LexA cleavage and other self-processing reactions // Journal of bacteriology. - 1993. - T. 175, № 16. - C. 4943.

38. Memar M. Y., Yekani M., Celenza G., Poortahmasebi V., Naghili B., Bellio P., Baghi H. B. The central role of the SOS DNA repair system in antibiotics resistance: A new target for a new infectious treatment strategy // Life Sciences. - 2020. - T. 262. -C. 118562.

39. Bianco P. R., Kowalczykowski S. C. RecA protein // Encyclopedia of Life Sciences (eLS). - 2005. - C. 1-8.

40. Flory J., Tsang S. S., Muniyappa K. Isolation and visualization of active presynaptic filaments of recA protein and single-stranded DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1984. - T. 81, № 22. - C. 7026-7030.

41. Thresher R. J., Christiansen G., Griffith J. D. Assembly of presynaptic filaments: Factors affecting the assembly of RecA protein onto single-stranded DNA // Journal of molecular biology. - 1988. - T. 201, № 1. - C. 101-113.

42. Prentiss M., Prévost C., Danilowicz C. Structure/function relationships in RecA protein-mediated homology recognition and strand exchange // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. - 2015. - T. 50, № 6. - C. 453-476.

43. Lebedev D., Baitin D., Islamov A. K., Kuklin A., Shalguev V. K., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. Analytical model for determination of parameters of helical structures in solution by small angle scattering: comparison of RecA structures by SANS // FEBS letters. - 2003. - T. 537, № 1-3. - C. 182-186.

44. Story R. M., Steitz T. A. Structure of the recA protein-ADP complex // Nature. -1992. - T. 355, № 6358. - C. 374-376.

45. Xing X., Bell C. E. Crystal structures of Escherichia coli RecA in a compressed helical filament // Journal of molecular biology. - 2004. - T. 342, № 5. - C. 1471-1485.

46. Shvetsov A. V., Lebedev D. V., Chervyakova D. B., Bakhlanova I. V., Yung I. A., Radulescu A., Kuklin A. I., Baitin D. M., Isaev-Ivanov V. V. Structure of RecX protein complex with the presynaptic RecA filament: Molecular dynamics simulations and small angle neutron scattering // FEBS letters. - 2014. - T. 588, № 6. - C. 948-955.

47. Kurumizaka H., Ikawa S., Sarai A., Shibata T. The mutant RecA proteins, RecAR243Q and RecAK245N, exhibit defective DNA binding in homologous pairing // Archives of biochemistry and biophysics. - 1999. - T. 365, № 1. - C. 83-91.

48. Ellouze C., Takahashi M., Wittung P., Mortensen K., Schnarr M., Nordén B. Evidence for Elongation of the Helical Pitch of the RecA Filament Upon ATP and ADP Binding Using Small-Angle Neutron Scattering // European journal of biochemistry. -1995. - T. 233, № 2. - C. 579-583.

49. DiCapua E., Schnarr M., Ruigrok R. W., Lindner P., Timmins P. A. Complexes of reca protein in solution: a study by small angle neutron scattering // Journal of molecular biology. - 1990. - T. 214, № 2. - C. 557-570.

50. Petukhov M., Lebedev D., Shalguev V., Islamov A., Kuklin A., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. Conformational flexibility of RecA protein filament: transitions between compressed and stretched states // PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2006. - T. 65, № 2. - C. 296-304.

51. Menetski J. P., Kowalczykowski S. C. Interaction of recA protein with single-stranded DNA: quantitative aspects of binding affinity modulation by nucleotide cofactors // Journal of molecular biology. - 1985. - T. 181, № 2. - C. 281-295.

52. Chang C.-F., Rankert D. A., Jeng T.-W., Morgan D. G., Schmid M. F., Chiu W. Cryo electron microscopy of unstained, unfixed RecA-cssDNA complexes // Journal of ultrastructure and molecular structure research. - 1988. - T. 100, № 2. - C. 166-172.

53. Yu X., Jacobs S. A., West S. C., Ogawa T., Egelman E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - T. 98, № 15. - C. 8419-8424.

54. Heuser J., Griffith J. Visualization of RecA protein and its complexes with DNA by quick-freeze/deep-etch electron microscopy // Journal of molecular biology. - 1989. -T. 210, № 3. - C. 473-484.

55. Dunn K., Chrysogelos S., Griffith J. Electron microscopic visualization of recA-DNA filaments: evidence for a cyclic extension of duplex DNA // Cell. - 1982. - T. 28, № 4. - C. 757-765.

56. VanLoock M. S., Yu X., Yang S., Lai A. L., Low C., Campbell M. J., Egelman E. H. ATP-mediated conformational changes in the RecA filament // Structure. - 2003. -T. 11, № 2. - C. 187-196.

57. Egelman E., Stasiak A. Electron microscopy of RecA-DNA complexes: two different states, their functional significance and relation to the solved crystal structure // Micron. - 1993. - T. 24, № 3. - C. 309-324.

58. Kiianitsa K., Stasiak A. Helical repeat of DNA in the region of homologous pairing // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1997. - T. 94, № 15. - C. 78377840.

59. Stasiak A., Egelman E. H., Howard-Flanders P. Structure of helical RecA-DNA complexes: III. The structural polarity of RecA filaments and functional polarity in the RecA-mediated strand exchange reaction // Journal of molecular biology. - 1988. - T. 202, № 3. - C. 659-662.

60. Pugh B. F., Cox M. M. High salt activation of recA protein ATPase in the absence of DNA // Journal of Biological Chemistry. - 1988. - T. 263, № 1. - C. 76-83.

61. McEntee K., Weinstock G., Lehman I. Binding of the recA protein of Escherichia coli to single-and double-stranded DNA // Journal of Biological Chemistry. - 1981. - T. 256, № 16. - C. 8835-8844.

62. Shivashankar G., Feingold M., Krichevsky O., Libchaber A. RecA polymerization on double-stranded DNA by using single-molecule manipulation: the role of ATP hydrolysis // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1999. - T. 96, № 14.

- C. 7916-7921.

63. Menetski J. P., Varghese A., Kowalczykowski S. C. Properties of the high-affinity single-stranded DNA binding state of the Escherichia coli recA protein // Biochemistry.

- 1988. - T. 27, № 4. - C. 1205-1212.

64. Arenson T. A., Tsodikov O. V., Cox M. M. Quantitative analysis of the kinetics of end-dependent disassembly of RecA filaments from ssDNA // Journal of molecular biology. - 1999. - T. 288, № 3. - C. 391-401.

65. Galletto R., Amitani I., Baskin R. J., Kowalczykowski S. C. Direct observation of individual RecA filaments assembling on single DNA molecules // Nature. - 2006. - T. 443, № 7113. - C. 875-878.

66. Joo C., McKinney S. A., Nakamura M., Rasnik I., Myong S., Ha T. Real-time observation of RecA filament dynamics with single monomer resolution // Cell. - 2006.

- T. 126, № 3. - C. 515-527.

67. Brenner S., Mitchell R., Morrical S., Neuendorf S., Schutte B., Cox M. recA protein-promoted ATP hydrolysis occurs throughout recA nucleoprotein filaments // Journal of Biological Chemistry. - 1987. - T. 262, № 9. - C. 4011-4016.

68. Bianco P. R., Weinstock G. M. Interaction of the RecA protein of Escherichia coli with single-stranded oligodeoxyribonucleotides // Nucleic acids research. - 1996. - T. 24, № 24. - C. 4933-4939.

69. Van der Heijden T., Dekker C. Monte Carlo simulations of protein assembly, disassembly, and linear motion on DNA // Biophysical journal. - 2008. - T. 95, № 10. -C. 4560-4569.

70. Bell J. C., Plank J. L., Dombrowski C. C., Kowalczykowski S. C. Direct imaging of RecA nucleation and growth on single molecules of SSB-coated ssDNA // Nature. -2012. - T. 491, № 7423. - C. 274-278.

71. Kim S. H., Ahn T., Cui T. J., Chauhan S., Sung J., Joo C., Kim D. RecA filament maintains structural integrity using ATP-driven internal dynamics // Science advances. - 2017. - T. 3, № 9. - C. e1700676.

72. Cox M. M., Lehman I. R. recA protein-promoted DNA strand exchange. Stable complexes of recA protein and single-stranded DNA formed in the presence of ATP and single-stranded DNA binding protein // Journal of Biological Chemistry. - 1982. - T. 257, № 14. - C. 8523-8532.

73. Kowalczykowski S. C., Krupp R. A. DNA-strand exchange promoted by RecA protein in the absence of ATP: implications for the mechanism of energy transduction in protein-promoted nucleic acid transactions // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1995. - T. 92, № 8. - C. 3478-3482.

74. Bedale W. A., Cox M. M. Evidence for the coupling of ATP hydrolysis to the final (extension) phase of RecA protein-mediated DNA strand exchange // Journal of Biological Chemistry. - 1996. - T. 271, № 10. - C. 5725-5732.

75. Menetski J. P., Bear D. G., Kowalczykowski S. C. Stable DNA heteroduplex formation catalyzed by the Escherichia coli RecA protein in the absence of ATP hydrolysis // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1990. - T. 87, № 1. -C. 21-25.

76. Rosselli W., Stasiak A. Energetics of RecA-mediated recombination reactions: without ATP hydrolysis RecA can mediate polar strand exchange but is unable to recycle // Journal of molecular biology. - 1990. - T. 216, № 2. - C. 335-352.

77. Kim J.-I., Cox M., Inman R. On the role of ATP hydrolysis in RecA proteinmediated DNA strand exchange. I. Bypassing a short heterologous insert in one DNA substrate // Journal of Biological Chemistry. - 1992. - T. 267, № 23. - C. 16438-16443.

78. van der Heijden T., Modesti M., Hage S., Kanaar R., Wyman C., Dekker C. Homologous recombination in real time: DNA strand exchange by RecA // Molecular cell. - 2008. - T. 30, № 4. - C. 530-538.

79. Fulconis R., Mine J., Bancaud A., Dutreix M., Viovy J. L. Mechanism of RecA-mediated homologous recombination revisited by single molecule nanomanipulation // The EMBO journal. - 2006. - T. 25, № 18. - C. 4293-4304.

80. Lohman T. M., Ferrari M. E. Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple DNA-binding modes and cooperativities // Annual review of biochemistry. -1994. - T. 63, № 1. - C. 527-570.

81. Umezu K., Chi N.-W., Kolodner R. D. Biochemical interaction of the Escherichia coli RecF, RecO, and RecR proteins with RecA protein and single-stranded DNA binding protein // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - T. 90, № 9. - C. 3875-3879.

82. Morimatsu K., Kowalczykowski S. C. RecFOR proteins load RecA protein onto gapped DNA to accelerate DNA strand exchange: a universal step of recombinational repair // Molecular cell. - 2003. - T. 11, № 5. - C. 1337-1347.

83. Morimatsu K., Wu Y., Kowalczykowski S. C. RecFOR proteins target RecA protein to a DNA gap with either DNA or RNA at the 5' terminus: implication for repair of stalled replication forks // Journal of Biological Chemistry. - 2012. - T. 287, № 42. - C. 35621-35630.

84. Yadav T., Carrasco B., Hejna J., Suzuki Y., Takeyasu K., Alonso J. C. Bacillus subtilis DprA recruits RecA onto single-stranded DNA and mediates annealing of complementary strands coated by SsbB and SsbA // Journal of Biological Chemistry. -2013. - T. 288, № 31. - C. 22437-22450.

85. Lusetti S. L., Voloshin O. N., Inman R. B., Camerini-Otero R. D., Cox M. M. The DinI protein stabilizes RecA protein filaments // Journal of Biological Chemistry. -2004. - T. 279, № 29. - C. 30037-30046.

86. Lusetti S. L., Drees J. C., Stohl E. A., Seifert H. S., Cox M. M. The DinI and RecX proteins are competing modulators of RecA function // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - T. 279, № 53. - C. 55073-55079.

87. Yasuda T., Morimatsu K., Horii T., Nagata T., Ohmori H. Inhibition of Escherichia coli RecA coprotease activities by DinI // The EMBO Journal. - 1998. - T. 17, № 11. -C. 3207-3216.

88. Gao B., Liang L., Su L., Wen A., Zhou C., Feng Y. Structural basis for regulation of SOS response in bacteria // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2023. -T. 120, № 2. - C. e2217493120.

89. Uranga L. A., Reyes E. D., Patidar P. L., Redman L. N., Lusetti S. L. The cohesin-like RecN protein stimulates RecA-mediated recombinational repair of DNA doublestrand breaks // Nature Communications. - 2017. - T. 8, № 1. - C. 15282.

90. Chimthanawala A., Parmar J. J., Kumar S., Iyer K. S., Rao M., Badrinarayanan A. SMC protein RecN drives RecA filament translocation for in vivo homology search // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2022. - T. 119, № 46. - C. e2209304119.

91. VanLoock M. S., Yu X., Yang S., Galkin V. E., Huang H., Rajan S. S., Anderson W. F., Stohl E. A., Seifert H. S., Egelman E. H. Complexes of RecA with LexA and RecX differentiate between active and inactive RecA nucleoprotein filaments // Journal of molecular biology. - 2003. - T. 333, № 2. - C. 345-354.

92. Cárdenas P. P., Carrasco B., Defeu Soufo C., César C. E., Herr K., Kaufenstein M., Graumann P. L., Alonso J. C. RecX facilitates homologous recombination by modulating RecA activities // PLoS genetics. - 2012. - T. 8, № 12. - C. e1003126.

93. Gruenig M. C., Stohl E. A., Chitteni-Pattu S., Seifert H. S., Cox M. M. Less is more: Neisseria gonorrhoeae RecX protein stimulates recombination by inhibiting RecA // Journal of Biological Chemistry. - 2010. - T. 285, № 48. - C. 37188-37197.

94. Sano Y. Role of the recA-related gene adjacent to the recA gene in Pseudomonas aeruginosa // Journal of bacteriology. - 1993. - T. 175, № 8. - C. 2451-2454.

95. Vierling S., Weber T., Wohlleben W., Muth G. n. Transcriptional and mutational analyses of the Streptomyces lividans recX gene and its interference with RecA activity // Journal of bacteriology. - 2000. - T. 182, № 14. - C. 4005-4011.

96. Papavinasasundaram K., Colston M. J., Davis E. O. Construction and complementation of a recA deletion mutant of Mycobacterium smegmatis reveals that the intein in Mycobacterium tuberculosis recA does not affect RecA function // Molecular microbiology. - 1998. - T. 30, № 3. - C. 525-534.

97. Sukchawalit R., Vattanaviboon P., Utamapongchai S., Vaughn G., Mongkolsuk S. Characterization of Xanthomonas oryzae pv. oryzae recX, a gene that is required for high-level expression of recA // FEMS microbiology letters. - 2001. - T. 205, № 1. - C. 83-89.

98. Sheng D., Liu R., Xu Z., Singh P., Shen B., Hua Y. Dual negative regulatory mechanisms of RecX on RecA functions in radiation resistance, DNA recombination and consequent genome instability in Deinococcus radiodurans // DNA repair. - 2005. -T. 4, № 6. - C. 671-678.

99. Prasad D., Muniyappa K. The extended N-terminus of Mycobacterium smegmatis RecX potentiates its ability to antagonize RecA functions // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. - 2020. - T. 1868, № 10. - C. 140468.

100. Le S., Chen H., Zhang X., Chen J., Patil K. N., Muniyappa K., Yan J. Mechanical force antagonizes the inhibitory effects of RecX on RecA filament formation in Mycobacterium tuberculosis // Nucleic acids research. - 2014. - T. 42, № 19. - C. 11992-11999.

101. Drees J. C., Lusetti S. L., Cox M. M. Inhibition of RecA protein by the Escherichia coli RecX protein: modulation by the RecA C terminus and filament functional state // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - T. 279, № 51. - C. 52991-52997.

102. Dudkina A., Schvetsov A., Bakhlanova I., Baitin D. Change of filamentation dynamics of RecA protein induced by D112R Amino acid substitution or ATP to dATP replacement; results in filament resistance to RecX protein action // Molecular Biology. - 2011. - T. 45. - C. 500-507.

103. Kim S. H., Ragunathan K., Park J., Joo C., Kim D., Ha T. Cooperative conformational transitions keep RecA filament active during ATPase cycle // Journal of the American Chemical Society. - 2014. - T. 136, № 42. - C. 14796-14800.

104. Robertson R. B., Moses D. N., Kwon Y., Chan P., Chi P., Klein H., Sung P., Greene E. C. Structural transitions within human Rad51 nucleoprotein filaments // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106, № 31. - C. 12688-12693.

105. Hilario J., Amitani I., Baskin R. J., Kowalczykowski S. C. Direct imaging of human Rad51 nucleoprotein dynamics on individual DNA molecules // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106, № 2. - C. 361-368.

106. Boyer B., Danilowicz C., Prentiss M., Prévost C. Weaving DNA strands: structural insight on ATP hydrolysis in RecA-induced homologous recombination // Nucleic Acids Research. - 2019. - T. 47, № 15. - C. 7798-7808.

107. Minton K. W. DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans // Molecular microbiology. - 1994. - T. 13, № 1. - C. 9-15.

108. Battista J. R. Against all odds: the survival strategies of Deinococcus radiodurans // Annual review of microbiology. - 1997. - T. 51, № 1. - C. 203-224.

109. Cox M. M., Battista J. R. Deinococcus radiodurans—the consummate survivor // Nature Reviews Microbiology. - 2005. - T. 3, № 11. - C. 882-892.

110. Slade D., Lindner A. B., Paul G., Radman M. Recombination and replication in DNA repair of heavily irradiated Deinococcus radiodurans // Cell. - 2009. - T. 136, № 6. - C. 1044-1055.

111. Slade D., Radman M. Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans // Microbiology and molecular biology reviews. - 2011. - T. 75, № 1. - C. 133-191.

112. Daly M. J., Gaidamakova E. K., Matrosova V. Y., Kiang J. G., Fukumoto R., Lee D.-Y., Wehr N. B., Viteri G. A., Berlett B. S., Levine R. L. Small-molecule antioxidant proteome-shields in Deinococcus radiodurans // PloS one. - 2010. - T. 5, № 9. - C. e12570.

113. Bentchikou E., Servant P., Coste G., Sommer S. A major role of the RecFOR pathway in DNA double-strand-break repair through ESDSA in Deinococcus radiodurans // PLoS Genet. - 2010. - T. 6, № 1. - C. e1000774.

114. Gutman P. D., Carroll J. D., lan Masters C., Minton K. W. Sequencing, targeted mutagenesis and expression of a recA gene required for the extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans // Gene. - 1994. - T. 141, № 1. - C. 31-37.

115. Daly M. J., Minton K. W. Interchromosomal recombination in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans // Journal of Bacteriology. - 1995. -T. 177, № 19. - C. 5495-5505.

116. Zahradka K., Slade D., Bailone A., Sommer S., Averbeck D., Petranovic M., Lindner A. B., Radman M. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans // Nature. - 2006. - T. 443, № 7111. - C. 569-573.

117. Tempest P. R., Moseley B. E. Lack of ultraviolet mutagenesis in radiation-resistant bacteria // Mutat Res. - 1982. - T. 104, № 4-5. - C. 275-80.

118. Rajan R., Bell C. E. Crystal structure of RecA from Deinococcus radiodurans: insights into the structural basis of extreme radioresistance // J Mol Biol. - 2004. - T. 344, № 4. - C. 951-63.

119. Carroll J. D., Daly M. J., Minton K. W. Expression of recA in Deinococcus radiodurans // Journal of bacteriology. - 1996. - T. 178, № 1. - C. 130-135.

120. Kim J.-I., Cox M. M. The RecA proteins of Deinococcus radiodurans and Escherichia coli promote DNA strand exchange via inverse pathways // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - T. 99, № 12. - C. 7917-7921.

121. Warfel J. D., LiCata V. J. Enhanced DNA binding affinity of RecA protein from Deinococcus radiodurans // DNA repair. - 2015. - T. 31. - C. 91-96.

122. Hsu H.-F., Ngo K. V., Chitteni-Pattu S., Cox M. M., Li H.-W. Investigating Deinococcus radiodurans RecA protein filament formation on double-stranded DNA by a real-time single-molecule approach // Biochemistry. - 2011. - T. 50, № 39. - C. 8270-8280.

123. Pobegalov G., Cherevatenko G., Alekseev A., Sabantsev A., Kovaleva O., Vedyaykin A., Morozova N., Baitin D., Khodorkovskii M. Deinococcus radiodurans RecA nucleoprotein filaments characterized at the single-molecule level with optical tweezers // Biochemical and biophysical research communications. - 2015. - T. 466, № 3. - C. 426-430.

124. Rajpurohit Y. S., Bihani S. C., Waldor M. K., Misra H. S. Phosphorylation of Deinococcus radiodurans RecA regulates its activity and may contribute to radioresistance // Journal of Biological Chemistry. - 2016. - T. 291, № 32. - C. 16672-16685.

125. Sharma D. K., Siddiqui M. Q., Gadewal N., Choudhary R. K., Varma A. K., Misra H. S., Rajpurohit Y. S. Phosphorylation of deinococcal RecA affects its structural and

functional dynamics implicated for its roles in radioresistance of Deinococcus radiodurans // J Biomol Struct Dyn. - 2020. - T. 38, № 1. - C. 114-123.

126. Perkins T. T. Optical traps for single molecule biophysics: a primer // Laser & Photonics Reviews. - 2009. - T. 3, № 1-2. - C. 203-220.

127. Ashkin A., Dziedzic J. M., Bjorkholm J. E., Chu S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles // Optics letters. - 1986. - T. 11, № 5.

- C. 288-290.

128. Ashkin A., Dziedzic J. M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria // Science. - 1987. - T. 235, № 4795. - C. 1517-1520.

129. Ashkin A., Dziedzic J. M., Yamane T. Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams // Nature. - 1987. - T. 330, № 6150. - C. 769-771.

130. Yin H., Wang M. D., Svoboda K., Landick R., Block S. M., Gelles J. Transcription against an applied force // Science. - 1995. - T. 270, № 5242. - C. 1653-1657.

131. Chu S. Nobel Lecture: The manipulation of neutral particles // Reviews of Modern Physics. - 1998. - T. 70, № 3. - C. 685.

132. Kimura Y., Bianco P. R. Single molecule studies of DNA binding proteins using optical tweezers // Analyst. - 2006. - T. 131, № 8. - C. 868-874.

133. Diaz-Celis C., Canari-Chumpitaz C., Sosa R. P., Castillo J. P., Zhang M., Cheng E., Chen A. Q., Vien M., Kim J., Onoa B. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2022. - T. 119, № 33. - C. e2206513119.

134. Candelli A., Holthausen J. T., Depken M., Brouwer I., Franker M. A., Marchetti M., Heller I., Bernard S., Garcin E. B., Modesti M. Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - T. 111, № 42. - C. 15090-15095.

135. Morati F., Modesti M. Insights into the control of RAD51 nucleoprotein filament dynamics from single-molecule studies // Current Opinion in Genetics & Development.

- 2021. - T. 71. - C. 182-187.

136. Bennink M. L., Schärer O. D., Kanaar R., Sakata-Sogawa K., Schins J. M., Kanger J. S., de Grooth B. G., Greve J. Single-molecule manipulation of double-stranded DNA

using optical tweezers: interaction studies of DNA with RecA and YOYO-1 // Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. - 1999. -T. 36, № 3. - C. 200-208.

137. Wang M. D., Yin H., Landick R., Gelles J., Block S. M. Stretching DNA with optical tweezers // Biophysical journal. - 1997. - T. 72, № 3. - C. 1335-1346.

138. Smith S. B., Cui Y., Bustamante C. Overstretching B-DNA: the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules // Science. - 1996. - T. 271, № 5250. - C. 795-799.

139. Baumann C. G., Cross S. J. Probing the mechanics of the complete DNA transcription cycle in real-time using optical tweezers // Single Molecule Enzymology: Methods and Protocols. - 2011. - C. 175-191.

140. Gross P., Farge G., Peterman E. J., Wuite G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions // Methods in enzymologyElsevier, 2010. - C. 427-453.

141. Bianco P. R., Brewer L. R., Corzett M., Balhorn R., Yeh Y., Kowalczykowski S. C., Baskin R. J. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules // Nature. - 2001. - T. 409, № 6818. - C. 374-378.

142. Handa N., Bianco P. R., Baskin R. J., Kowalczykowski S. C. Direct visualization of RecBCD movement reveals cotranslocation of the RecD motor after % recognition // Molecular cell. - 2005. - T. 17, № 5. - C. 745-750.

143. Morin J. A., Cao F. J., Lázaro J. M., Arias-Gonzalez J. R., Valpuesta J. M., Carrascosa J. L., Salas M., Ibarra B. Mechano-chemical kinetics of DNA replication: identification of the translocation step of a replicative DNA polymerase // Nucleic acids research. - 2015. - T. 43, № 7. - C. 3643-3652.

144. Hodges C., Bintu L., Lubkowska L., Kashlev M., Bustamante C. Nucleosomal fluctuations govern the transcription dynamics of RNA polymerase II // Science. -2009. - T. 325, № 5940. - C. 626-628.

145. John R., Davenport n., Wuite G. J., Landick R., Bustamante C. Single-molecule study of transcriptional pausing and arrest by E. coli RNA polymerase // Science. -2000. - T. 287, № 5462. - C. 2497-2500.

146. Qu X., Wen J.-D., Lancaster L., Noller H. F., Bustamante C., Tinoco I. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation // Nature. - 2011. - T. 475, № 7354. - C. 118-121.

147. Wen J.-D., Lancaster L., Hodges C., Zeri A.-C., Yoshimura S. H., Noller H. F., Bustamante C., Tinoco I. Following translation by single ribosomes one codon at a time // Nature. - 2008. - T. 452, № 7187. - C. 598-603.

148. Kuo S. C., Sheetz M. P. Force of single kinesin molecules measured with optical tweezers // Science. - 1993. - T. 260, № 5105. - C. 232-234.

149. Block S. M., Goldstein L. S., Schnapp B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers // Nature. - 1990. - T. 348, № 6299. - C. 348-352.

150. Svoboda K., Schmidt C. F., Schnapp B. J., Block S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry // Nature. - 1993. - T. 365, № 6448. - C. 721-727.

151. Newton M. D., Taylor B. J., Driessen R. P., Roos L., Cvetesic N., Allyjaun S., Lenhard B., Cuomo M. E., Rueda D. S. DNA stretching induces Cas9 off-target activity // Nature structural & molecular biology. - 2019. - T. 26, № 3. - C. 185-192.

152. Gutierrez-Escribano P., Newton M. D., Llauro A., Huber J., Tanasie L., Davy J., Aly I., Aramayo R., Montoya A., Kramer H. A conserved ATP-and Scc2/4-dependent activity for cohesin in tethering DNA molecules // Science advances. - 2019. - T. 5, № 11. - C. eaay6804.

153. Eeftens J. M., Bisht S., Kerssemakers J., Kschonsak M., Haering C. H., Dekker C. Real-time detection of condensin-driven DNA compaction reveals a multistep binding mechanism // The EMBO journal. - 2017. - T. 36, № 23. - C. 3448-3457.

154. Ryu J.-K., Rah S.-H., Janissen R., Kerssemakers J. W., Dekker C. Resolving the step size in condensin-driven DNA loop extrusion identifies ATP binding as the stepgenerating process // Available at SSRN 3728949. - 2020.

155. Potyseva Alina S., Pavlinova Polina A., Yakunina Maria V., Khodorkovskii Mikhail A., Arseniev Anatoly N., Panfilov Mikhail A., Pobegalov Georgiy E. Single molecules characterization of transcription of bacterial RNA-polymerase parameters

using acoustic force spectroscopy // St. Petersburg Polytechnic University Journal. Physics and Mathematics. - 2022. - T. 55, № 1. - C. 70-80.

156. Metelev M., Arseniev A., Bushin L. B., Kuznedelov K., Artamonova T. O., Kondratenko R., Khodorkovskii M., Seyedsayamdost M. R., Severinov K. Acinetodin and klebsidin, RNA polymerase targeting lasso peptides produced by human isolates of Acinetobacter gyllenbergii and Klebsiella pneumoniae // ACS chemical biology. -2017. - T. 12, № 3. - C. 814-824.

157. Fisher T. E., Marszalek P. E., Fernandez J. M. Stretching single molecules into novel conformations using the atomic force microscope // Nature structural biology. -2000. - T. 7, № 9. - C. 719-724.

158. Silverstein T. D., Gibb B., Greene E. C. Visualizing protein movement on DNA at the single-molecule level using DNA curtains // DNA repair. - 2014. - T. 20. - C. 94109.

159. Lyubchenko Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM // Biophysical reviews. - 2014. - T. 6. - C. 181-190.

160. Sivkina A. L., Karlova M. G., Valieva M. E., McCullough L. L., Formosa T., Shaytan A. K., Feofanov A. V., Kirpichnikov M. P., Sokolova O. S., Studitsky V. M. Electron microscopy analysis of ATP-independent nucleosome unfolding by FACT // Communications biology. - 2022. - T. 5, № 1. - C. 2.

161. Horspool D. R., Coope R. J., Holt R. A. Efficient assembly of very short oligonucleotides using T4 DNA Ligase // BMC research notes. - 2010. - T. 3, № 1. - C. 291.

162. Candelli A., Hoekstra T. P., Farge G., Gross P., Peterman E. J., Wuite G. J. A toolbox for generating single-stranded DNA in optical tweezers experiments // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 2013. - T. 99, № 9. - C. 611-620.

163. Cox M. M., McEntee K., Lehman I. A simple and rapid procedure for the large scale purification of the recA protein of Escherichia coli // Journal of Biological Chemistry. - 1981. - T. 256, № 9. - C. 4676-4678.

164. Побегалов Г. Е. Особенности взаимодействия ДНК с белками и интеркалирующими красителями, выявленные на одномолекулярном уровне методом оптического захвата: дис ... канд. физ.-мат. наук: 03.01.02; СПб, 2016.

165. van Loenhout M. T., Kerssemakers J. W., De Vlaminck I., Dekker C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification // Biophysical journal. - 2012. - T. 102, № 10. - C. 2362-2371.

166. Svoboda K., Block S. M. Biological applications of optical forces // Annu Rev Biophys Biomol Struct. - 1994. - T. 23. - C. 247-85.

167. Swoboda M., Henig J., Cheng H.-M., Brugger D., Haltrich D., Plumere N., Schlierf M. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments // ACS nano. - 2012. - T. 6, № 7. - C. 6364-6369.

168. Gesztelyi R., Zsuga J., Kemeny-Beke A., Varga B., Juhasz B., Tosaki A. The Hill equation and the origin of quantitative pharmacology // Archive for history of exact sciences. - 2012. - T. 66. - C. 427-438.

169. McEvoy J. P., Kay A. The saturation game: teaching protein-ligand binding with a playing card analogy // Journal of Chemical Education. - 2020. - T. 97, № 10. - C. 3727-3730.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор диссертации выражает благодарность Михаилу Алексеевичу Ходорковскому за научное руководство и возможность проведения уникальных научных исследований в стенах НИК "Нанобиотехнологии", Георгию Евгеньевичу Побегалову за обучение методикам проведения экспериментов на установке "Лазерный пинцет" и помощь в работе, Дмитрию Михайловичу Байтину за привнесение интересной тематики в НИК "Нанобиотехнологии" и предоставление исследуемых белков.

Также автор благодарит за помощь в работе научный коллектив НИК "Нанобиотехнологии" в лице: Анатолия Арсениева, Антона Сабанцева, Алексея Ведяйкина, Наталии Морозовой, Елены Знобищевой, Максима Сердакова, Марии Якуниной, Инны Курдюмовой, Максима Казалова, Виктора Винника, Яны Фёдоровой, Марии Соколовой, Анны Майковой, Татьяны Олеговны Артамоновой, Сергея Вадимовича Мурашова, Лидии Ракчеевой, Алексея Мельникова, Амиры Туми, Александра Якимова.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(рекомендуемое)

Сравнение зависимостей силы натяжения от длины для онДНК и филамента

ЯееЛ-онДНК

Рисунок 1 - зависимости силы натяжения от длины для несвязанной онДНК и активного филамента КееЛ-онДНК. Пунктирная линия - уровень силы 3 пН