Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Швецов, Алексей Валерьевич

• Швецов, Алексей Валерьевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Швецов, Алексей Валерьевич

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структура и функции семейства белков гомологической рекомбинации Ree А

1.2. Исследования структуры комплексов белков Ree А в растворе с помощью методов МУРН и НСЭ

1.3. Применение методов молекулярного моделирования к нук-леопротеидным комплексам

Глава 2. Методы

2.1. Молекулярное моделирование

2.1.1. Моделирование филаментов белка RecA

2.1.1.1. Моделирование гомополимера белков RecA

из Е. coli и D. radiodurans

2.1.1.2. Моделирование комплекса RecA::онДНК::АТФ из Е. coli и D. radiodurans

2.1.1.3. Моделирование комплекса RecA::днДHK::ATФ из Е. coli и D. radiodurans

2.1.1.4. Моделирование комплекса RecA::THflHK::ATO из Е. coli и D. radiodurans

2.1.2. Моделирование комплексов белка RecX из Е. coli

2.1.2.1. Моделирование гомополимера белка RecX из

Е. coli

2.1.2.2. Моделирование комплекса RecX: юнДНК

2.1.2.3. Моделирование комплекса RecA:^есХ::онДНК::АТФ из Е. coli

2.2. Молекулярная динамика

2.3. Моделирование спектров МУРН

2.3.1. Расчёт спектра МУРН по одному фрейму траектории

2.3.2. Усреднение спектра МУРН по всей траектории или её части

2.3.3. Реализация метода в виде модуля g_sans для GROMACS

2.3.3.1. Реализация параллельного метода Дебая в модуле g sans для GROMACS

2.3.3.2. Реализация параллельного метода Монте-Карло в модуле g_sans для GROMACS

2.4. Моделирование спектров НСЭ

2.4.1. Реализация алгоритма расчета спкетра НСЭ в модуле

g_nse в GROMACS

2.5. Экспериментальное измерение спектров МУРН нуклеопротеид-

ных комплексов

2.6. Экспериментальное измерение спектров НСЭ нуклеопротеидных комплексов

Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1. Анализ МД траекторий комплексов тримеров белка RecA

3.1.1. Анализ средней конформационной подвижности комплексов тримеров белков RecA

3.1.2. Анализ локальной конформационной подвижности комплексов тримеров белков RecA

3.1.3. Анализ принципиальных компонент движения комплексов тримеров белков RecA

3.2. Анализ МД траекторий комплексов додекамеров белка RecA

3.2.2. Анализ локальной конформационной подвижности комплексов додекамеров белков ЫесА

3.2.3. Анализ динамики изменения шага филамента додекамеров белков ЫесА

3.3. Анализ МД траекторий комплексов белка ЯесХ

3.3.1. Средняя конформационнная подвижность комплексов белка ЫесХ

3.3.2. Локальная конформационнная подвижность комплексов белка ЯесХ

3.3.3. Взаимодействия белка ЯесХ и онДНК в комплексах белков ЯесХ::онДНК из Е. соН

3.4. Анализ МД траектории комплекса 11есА::11есХ::онДНК

3.4.1. Средняя конформационная подвижность комплексов

белков ЯесА: :ЯесХ: :онДНК

3.4.2. Взаимодействия между белком RecX, белком RecA и

онДНК в комплексе 11есА::КесХ::онДНК из Е. coli

3.5. Анализ спектров МУРН комплексов гомополимеров белков RecA, КесХ::онДНК, RecA:: RecX:: онДНК: : ATOyS и RecA: :онДНК:: ATOyS

3.5.1. Анализ спектров МУРН комплексов гомополимеров белков RecA и RecA::онДНК:: ATOyS из Е. coli и

D. radiodurans

3.5.2. Анализ спектров МУРН комплексов RecX::oHflHK и RecA: :RecX: :онДНК::ATOyS из Е. coli

3.6. Анализ спектров НСЭ комплексов гомополимеров белка RecA и RecA::онДНК::ATOyS из D. radiodurans

Основные результаты и выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список работ опубликованных по теме диссертации

Цитированная литература

Список иллюстраций

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-динамическое моделирование и нейтронная спектроскопия мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз»

Введение

Актуальность исследования

Современный арсенал методов, доступный для биологических исследований, позволяет ответить на многие вопросы, касающиеся функционирования белков и их комплексов. Однако далеко не все методы позволяют исследовать структуру и динамику белка в его нативном состоянии в растворе. Особенно это сложно сделать для крупных нуклеопротеидных комплексов, например, таких, которые образует семейство белков RecA на онДНК и днДНК.

Белок RecA, принадлежащий к классу ДНК-трансфераз, - это один из основных белков, ответственный за гомологичную рекомбинацию и репарацию ДНК у бактерий. RecA осуществляет реакцию гомологической рекомбинации: перенос гомологичных нитей ДНК, что позволяет исправлять двунитевые разрывы ДНК или другие повреждения, вызванные, например, воздействием ионизирующего излучения. Белки RecA в растворе функционируют в виде гомофи-ламентов или же в виде филаментов, образованных на он- или днДНК. На протяжении последних 20 лет стали известны несколько десятков кристаллических структур филаментов белков семейства RecA [14]. Белок RecA состоит из трёх доменов: С-концевого, N-концевого и Р-домена. Образование филаментов происходит за счёт взаимодействия jß-листов Р- и N- доменов соседних мономеров. Недавно стала известна структура комплекса белка RecA с онДНК и с днДНК [15]. Но, несмотря на это, остаётся нераскрытым вопрос: какие именно конфор-мационные изменения ответственны за перенос нитей ДНК в реакции гомологической рекомбинации ДНК.

Белки RecA, а также их нуклеопротеидные комплексы исследовались в растворе с помощью методов малоуглового рассеяние нейтронов (МУРН) и малоуглового рассеяния рентгена (МУРР). Эти методы позволяют получать структурно-динамическую информацию о сложных нуклеопротеидных комплексах в нативном состоянии, и это их преимущество, но, с другой стороны, они явля-

ются методами низкого разрешения. В силу последнего обстоятельства решение обратной задачи - получение из экспериментальных спектров структурно-динамических параметров исследуемого комплекса при использовании этих методов - требует точного знания структуры и внутренней динамики исследуемого нук-леопротеидного комплекса. Так как исследуемый комплекс находится в растворе и имеет ненулевую конформационную подвижность, в большинстве случаев теоретические кривые МУРН, полученные с использованием только одной статической структуры, не в состоянии адекватно описать экспериментальные данные [1]. Таким образом, разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования сложных нуклеопротеидных комплексов, в том числе муль-тимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, которые могут являться основой для расчёта спектров МУРН и МУРР с учетом конформационной подвижности нуклеопротеидных комплексов в растворе, является актуальной задачей.

С другой стороны, конформационная подвижность, или внутренняя динамика нуклеопротеидных комплексов в растворе может быть явно исследована с помощью метода нейтронного спин-эхо (НСЭ). В основе метода НСЭ лежит метод МУРН на пучке поляризованных нейтронов, в котором измеряется релаксация поляризации нейтронов за счёт квазиупругого рассеяния их на образце. Время релаксации поляризации напрямую связано с эффективной диффузией рассеивающего объекта, которая складывается из диффузии комплекса как целого и внутренней динамики нуклеопротеидного комплекса. В силу сказанного решение обратной задачи в данном методе зависит не только от точного знания структуры исследуемого комплекса, но и от точного знания динамики этой структуры на временах измерения релаксации поляризации (1-200 нсек).

Таким образом, разработка методов структурно-динамического молекулярного моделирования нуклеопротеидных комплексов, являющихся базой для расчёта спектров НСЭ также является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка методов структурно-динами-

ческого молекулярного моделирования и методов верификации полноатомных моделей с помощью МУРН и НСЭ при исследовании мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод построения полноатомных молекулярных моделей фи-ламентной структуры мультимолекулярных комплексов ДНК трансфе-раз из Escherichia coli и Deinococcus radiodurans, а именно: гомополи-мер RecA, RecA::oнДHK::ATФ, RecA::днДHK::ATФ, КесА::тнДНК::АТФ; и комплексов из Е. coli: КесХ::онДНК, RecA::RecX::oнДHK::ATФ;

2. рассчитать методами молекулярной динамики (МД) зависимость от времени (МД траектории) построенных полноатомных филамент-ных структур мультимолекулярных комплексов ДНК трансфераз из Е. coli и D. radiodurans: гомополимер RecA, RecA::oнДHK::ATФ, КесА::днДНК::АТФ, RecA::тнДHK::ATФ; и комплексов из Е. coli: RecX::онДНК, RecA::RecX::онДНК::АТФ;

3. разработать метод расчёта спектров МУРН на основе структур мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз, полученных путём молекулярного моделирования, с возможностью усреднения спектра МУРН по МД траекториям;

4. разработать метод расчёта спектров НСЭ на основе структур мультимолекулярных комплексов ДНК трансфераз, рассчитанных методами МД (по МД-траекториям);

5. провести регистрацию экспериментальных спектров МУРН нативных растворов мультимолекулярных комплексов Е. coli : гомополимер RecA, RecA::онДНК::АТФу8, RecX::oнДHK и КесА:^есХ::онДНК::АТФу8;

6. провести сравнительный анализ теоретических спектров МУРН и НСЭ на

структурах, полученных путем молекулярного моделирования, и экспериментальных спектров на предмет верификации разработанных методов моделирования мультимолекулярных комплексов ДНК-трансфераз.

Научная новизна

1. Разработан новый метод решения прямой задачи - построение спектров МУРН на основании данных траекторий полноатомной МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов, позволяющий учитывать конформационную подвижность этих структур в растворах.

2. Разработан новый метод решения прямой задачи - построение спектров НСЭ на основании данных траекторий полноатомной МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов.

3. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecX с онДНК.

4. Впервые построена полноатомная структура комплекса белка RecA в комплексе с белком RecX в присутствии онДНК, описывающая экспериментальные данные МУРН.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в рамках траекторий полноатомной МД филаментные структуры мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов ДНК трансфераз могут быть использованы при решении прямой задачи в рамках других методов исследования, например в методе FRET (Forster Resonance Energy Transfer).

Разработанные методы расчёта спектров МУРН по полноатомным траекториям молекулярной динамики, позволяющие учитывать конформационную подвижность нуклеопротеидных комплексов в растворе, могут быть также использованы для расчёта спектров МУРН других молекулярных комплексов, таких как гликопротеины и другие сложные многокомпонентные молекулярные системы.

Разработанный метод расчёта спектров НСЭ по полноатомным траекториям молекулярной динамики позволяет использовать его для расчёта спектров НСЭ других сложных многокомпонентных молекулярных систем. Основные положения, выносимые на защиту

1. Новый метод решения прямой задачи - расчёт спектров МУРН по полноатомным траекториям МД, позволяющий учитывать конформационную подвижность нуклеопротеидных мультимолекулярных комплексов в растворе.

2. Новый метод решения прямой задачи - расчёт спектров НСЭ по полноатомным траекториям МД филаментных структур мультимолекулярных нуклеопротеидных комплексов в растворе.

3. Спектры МУРН, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК-трансфераз из Е. coli и D. radiodurans, удовлетворительно описывают экспериментально наблюдаемые спектры МУРН.

4. Спектры НСЭ, рассчитанные предлагаемым методом для гомополимера белка RecA и нуклеопротеидных комплексов ДНК-трансфераз из D. radiodurans качественно согласуются с экспериментальными данными.

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях: РНИКС (2010 [2] и 2012 [3]); РСНЭ-НБИК 2011 [4]; БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых [5]; Sweedish Neutron Scattering Society 14th Annual Meeting [6]; 5th European Conference on Neutron Scattering [7]; The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11 [8]; FEBS Congress [9, 10].

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работах, из них 4 статьи в рецензируемых журналах [1, 11-13], 9 тезисов докладов [2-10].

Личный вклад автора

Содержание диссертации и основные положения, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованные работы. Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причем вклад диссертанта был определяющим. Все представленные в диссертации результаты, кроме экспериментальных данных МУРН и НСЭ, получены лично автором.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, три главы (обзор литературы, методы, результаты и обсуждение) и выводы. Материал иллюстрирован 58 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 123 источника.

12

Глава 1

Обзор литературы

1.1. Структура и функции семейства белков гомологической рекомбинации RecA

Белок ReeA являясь центральным ферментом в реакции гомологической рекомбинации и рекомбинационной репарации ДНК в бактериях, также играет главную роль в репродуцировании и поддержания целостности генома [16-19]. В ходе нормального клеточного роста белок RecA необходим при вынужденной остановки репликации, что сопровождается коллапсом репликативной вилки вблизи повреждения на онДНК. RecA-подобные белки принадлежат к большому семейству белков, включая белки RecA в бактериях, белки Rad51 и Dmcl у эукариот, и белок RadA у архей. Белок RecA функционирует in vivo и in vitro в виде полимерного филамента. Активная форма филамента белка RecA способна связываться с однонитевой ДНК (онДНК) в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Активированная форма филамента RecA (комплекс RecA: :онДНК::АТФ) способна взаимодействовать с двунитевой ДНК (днДНК), после чего происходит гомологичное спаривание онДНК и днДНК внутри филамента RecA (образование промежуточного комплекса содержащего трёхнитевую ДНК (тнДНК) RecA: :тнДНК::АТФ) и обмен нитями между днДНК и онДНК (образование комплекса RecA::днДНК::АТФ + онДНК), что составляет три основных этапа реакции гомологичной рекомбинации.

В живой клетке, при наличии большого количества повреждений ДНК, возрастает количество филаментов белка RecA на онДНК, что инициирует так называемую SOS-функцию белка [16, 18, 20-22]. В норме SOS-состояние клетки контролируется репрессорным белком LexA, который при взаимодействии с филаментом RecA начинает интенсивно саморасщепляться. По мере того, как

концентрация LexA в клетке уменьшается, промоторы генов SOS-ответа открываются. При этом изменяется экспрессия более 40 генов, в том числе, и самого гена гесА. Активность синтезированого в клетке RecA находится под строгим контролем белков, непосредственно взаимодействующих с филаментом RecA. В настоящее время известно более десятка вспомогательных белков, участвующих в регуляции активности филамента RecA. Это RecO, RecF, RecR, RecX, PsiB, DinI, DinD, SSB и некоторые другие [22-29]. Все они могут быть подразделены на группы позитивных и негативных регуляторов, хотя это деление достаточно условно, поскольку некоторые из них, подавляя одни функции филамента, активируют другие. Особый интерес представляет белок RecX [30-36]. Белок RecX является негативным регулятором белка RecA как in vivo, так и in vitro. Показано, что RecX, взаимодействуя непосредственно с RecA, препятствует элонгации филамента, способствуя его диссоциации от ДНК [31]. Существует несколько моделей угнетения филаментации белка RecA белком RecX. Согласно одной из них, RecX находит брешь между соседними кластерами мономеров RecA и, связываясь с ближайшим мономером, прерывает полимеризацию мономеров вдоль нити ДНК. При этом динамика диссоциации мономеров от 5'-конца филамента не нарушается, но прекращается процесс сборки, а именно - этапа достройки филамента с 3'-конца за счет присоединения новых мономеров [31]. Исходя из другой модели, RecX взаимодействует с мономерами RecA спонтанно вдоль всего филамента, провоцируя диссоциацию RecA прямо в местах их взаимодействия [34]. Так же было показано, что белки RecX и SSB (белок связывающий онДНК) - это функциональные антагонисты: в присутствии белка SSB значительно снижается ингибирующее воздействие RecX на RecA [36]. Так как прямое взаимодействие между RecX и SSB не было обнаружено, а белок SSB не взаимодействует с RecA напрямую, то вероятно в процесс регуляции вовлечены участки ДНК, находящиеся либо внутри филамента, либо непосредственно за его пределами. В нескольких работах было показано, что белок RecX может взаимодействовать со свободной от RecA молекулой ДНК [32, 37]. Однако

структурные детали взаимодействий RecX-ДНК, и RecA-RecX в пресинаптиче-ском комплексе RecA::oнДHK::ATФ остаются невыясненными.

Рис. 1.1. Структура белка RecA из E.coli PDB:2REB показана слева. Справа каждый домен RecA выделен своим цветом: N-концевой - красный, АТФазный - зелёный, С-концевой - синий

^A/WWWWW-A/V—Л--^ЛЛЛ/V

/\Л ДДДДДУ\_ У\- 100

- -ЛАЛЛл^—W- —^ЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛ^— -AN

«' —w-vwwwwwwv1- — »

ЛАА/И

-лллллллл^ л л

301 ~'\l\l\l\l\l\l\l^'\l\l\l\l\l\l\l\l\l\n- 350

ЛЛЛЛЛЛЛЛЛАЛЛЛЛЛЛЛЛЛ

- 352

Рис. 1.2. Вторичная структура белка RecA из E.coli PDB.2REB

Анализ трёхмерной структуры белка RecA из Е. coli показал, что он состоит из трёх доменов: N-концевой домен (аминокислотные остатки А1-М35), АТФазный домен (аминокислотные остатки D36-I268) и С-концевой домен (аминокислотные остатки N269-F352) (рис. 1.1, 1.2). Центральный домен представляет собой /?-слой, состоящий из восьми yß-нитей (от 1 до 8), с внедрёнными в него шестью а-спиралями (от В до G включительно). N-субдомен состоит из а-спирали А и ув-нити 0; С-субдомен содержит 3 ортогонально ориентированные в пространстве О'-спирали Н, 1 и J со связкой, содержащей /?-нити 9 и 10 между Q'-спиралями Н и I [14].

Экспериментально было показано, что С-концевой домен RecA непосредственно может взаимодействует с ДНК [38, 39], и что модификация С-концевого участка цепи белка RecA значительно влияет на рекомбинационную активность белка [40]. Так же имеются предположения о том, что изменения конформа-ции С-концевого домена белка RecA необходима для перехода филамента белка RecA в активную форму при его связывании с двунитевой ДНК и АТФ [41, 42]. В нашей лаборатории было показано, что рекомбинационная активность белка RecA вероятно связана с его конформационной подвижностью [43].

Рис. 1.3. Суперпозиция 6 структур белка 11есА из М. smegmatis[42] (2С)ПМ, 2СЮ\¥, 20Е2, 20ЕР, 20Е8, 20Р0) на которых видно положение петель И и Ь2

К настоящему моменту времени опубликовано 48 различных кристаллических структур структур высокого разрешения белка КесА и его комплексов из различных бактерий, включая филаменты RecA из Е. соП[ 14, 15, 47, 49],

Таблица 1.1. Известные структуры белков RecA и их комплексов

PDBid Организм Год Лиганды

1REA, 2REB [14] Е. coli 1993 АДФ

1G18, 1G19 [44] М. tuberculosis 2000 АДФ::А1Г4

1МОЗ, 1М04, 1М05, 1М06 [45] М. tuberculosis 2003 АДФ, АТФ-yS, ATOyS::Mg2+, дАТФ::1У^2+

1UBC, 1UBE, 1UBG [46] М. smegmatis 2003 АДФ, АТФуЪ

1U94, 1U98, 1U99 [47] Е. coli 2004 нет

1ХР8 [48] D. radiodurans 2004 ATOyS

1XMS, 1XMV [49] Е. coli 2005 АМФ::М£2+, АДФ::М£2+

2G88 [50] М. smegmatis 2006 дАТФ

20DN, 20DW, 20Е2, 20ЕР, 20ES, 20F0 [42] М. smegmatis 2007 АДФ, дАТФ, АТФу8,

ЗСМТ, 3CMU, 3CMV, 3CMW, ЗСМХ [15] Е. coli 2008 АДФ::А1Р4, АМФ, онДНК, днДНК

2ZR7, 2ZRP, 2ZRN, 2ZRO, 2ZRM, 2ZRH, 2ZRI, 2ZRJ, 2ZRK, 2ZRL, 2ZRC, 2ZRD, 2ZRE, 2ZRF, 2ZRG, 2ZRB, 2ZR0, 2ZRA, 2ZR9 [51] М. smegmatis 2008 АДФ, АТФ yS, дАТФ

М. tuberculosis [44, 45], М. tuberculosis [42, 46, 50, 51] и гиперрадиорезистент-ной бактерии D. radiodurans [48] (см таблицу 1.1). Все белки RecA обладают высоким уровнем гомологии их аминокислотных последовательностей с белком RecA из Е. coli (62% для белков RecA из М. tuberculosis и М. smegmatis и

56% для белков ЛесА В. гасИосЬлгат). Кристаллические структуры белков ЯесА так же обладают схожей топологией, архитектурой филамента и областью взаимодействия соседних субъединиц белка, хотя шаг спирали их филаментов изо

меняется в широких пределах от 67 до 83А. В ранних структурах белков ЫесА обычно не удавалось закристаллизовать петли Ы и Ь2 находящиеся в АТФаз-ном домене [14, 46-50]. Впервые структура белка ЯесА в которой было видно положение петель Ы и Ь2 была получена только в 2007 году [42] (рис. 1.3). Годом позже была сделана серия структур белка ЯесА из М. smegmatis, показывающая движения С-концевого домена [51]. В 2006 в нашей лаборатории была предложена модель конформационных переходов филамента 11есА из неактивной в активную конформацию с помощью координированных вращений вокруг двух пар двугранных углов основной цепи белка (К230/К24|Д и 12680/гЫ269<Д) [52]. Предложенная модель способна воспроизводить как широкий спектр экспериментально наблюдаемых изменений шага спирали при переходах филамента ЯесА от сжатой (неактивной) к вытянутой (активной) конформации белка ЯесА, так и конформационные изменения его С-концевого домена, наблюдаемые методами электронной микроскопии. В 2008 году была опубликована первая кристаллическая структура активного комплекса ЛесА с онДНК и днДНК [15]. Комплекс содержал химерный белок ЯесА (6 модифицированных субъединиц ЯесА в одной полипептидной цепи). Структура активного филамента белка ЯесА содержащая ДНК, подтвердила более ранние исследования сделанные с помощью метов ЯМР [53] в которых было показано, что ДНК внутри филамента является приблизительно в полтора раза более вытянутой по сравнению с классической В-формой. Тем не менее молекулярные механизмы поиска гомологии и обмена нитями между одно- и двуцепочечными ДНК катализируемыми феламентом белка ЯесА до сих пор не известны.

1.2. Исследования структуры комплексов белков RecA в растворе с помощью методов МУРН и НСЭ

Поскольку комплексы белков RecA являются довольно крупными образованиями (филаменты могут достигать в длину 1/лм [54]), то прямое исследование нативного состояния комплексов белков RecA в растворе является затруднительным с использованием методов ЯМР, однако можно использовать методы низкого разрешения такие как МУРН для изучения структуры комплексов, и метод НСЭ для изучения динамики комплексов в растворе.

Комплексы белков RecA широко исследовались с помощью методов МУРН [55, 56], в том числе в нашей лаборатории [52, 54, 57], С помощью методов МУРН было показано что в присутствии ДНК и АТФ филамент RecA переходит в активную конформацию, существенно отличающуюся от конформации его неактивной формы в кристаллах. В частности, что активный филамент обладает

о о

увеличенным шагом спирали (67-83А у неактивных форм против 91-95А у ак-

о о

тивных), и более коротким радиусом гирации (38А у неактивной формы, 33А у активной).

Хотя методы МУРН и позволяют изучать нативную структуру комплекса в растворе, однако являясь методом низкого разрешения они позволяют напрямую из спектров МУРН получить только некоторые параметры системы, такие как длинна филамента, радиус гирации филамента и мономера, и количество мономеров на виток. Для более полного раскрытия потенциала методов МУРН требуется их совместное использование с различными методами моделирования. Такие методы включают в себя как аналитические приближенные модели, такие например, как модель однородной спирали [54], так и методы молекулярного моделирования, позволяющие построить и сравнить полноатомную структуру комплексов RecA с получаемой экспериментально кривой рассеяния. Применение методов моделирования требует наличия различных возможностей по расчёту спектров МУРН и НСЭ по приближенным или же полноатомным моделям.

Одним из первых методов моделирования рассеяния на биологических объектах был метод Дебая [58, 59], позволяющий вычислить зависимость интенсивности рассеяния 8{д) от величины вектора рассеяния q (1.1):

G<,rf-^dr (1.1)

qr

где функция G(r) представляет собой функцию распределения парных расстояний. Для точечных частиц обладающих длинами рассеяния b¿ и координатами r¡, G(r) можно записать, как (1.2):

G(rU)= J] btbj (1.2)

i,j

r¡j=lln-rjll

Иногда вместо точечных частиц, используется приближение полишаровой модели, в таком случае формулы (1.1) и (1.2) если функция распределения плотности частицы i равна /;(<?), можно записать как (1.3):

Esin qr, ¡

f¡iq)f№)—— (1-3)

яп,

где fi{q) в случае однородной сферы радиуса R¡ и плотности р/ (1.4):

т^рГ4«';^0^' (1.4)

Метод Дебая был реализован в таких программных пакетах, например как DALAI_GA [60, 61] использующий метод Дебая и генетический алгоритм, для частичного решения обратной задачи (получения формы молекулы по её спектру). Данный подход в некоторых довольно простых случаях (преимущественно для глобулярных объектов) даёт хорошее согласие с экспериментом.

Другая группа методов использует приближение формы объекта в виде его разложения по радиальным оболочкам [62], и представления такого разложения в виде сферических функций. При этом функция G(r) представляется в виде суммы сферических гармоник Y¡m (1.5):

_ т—1

G(r) = Z Yicrim{r)Yim(-cj) (L5)

1=0 m=—l

Данный метод был реализован в таких программах как SASHA, DAMIN,CRYSON, CRYSOL из пакета AtSAS [63], а так же в пакете SASSIM [64]. Последний так же позволяет делать расчёт спектров по полноатомным моделям, в том числе сольватированных белков.

С ростом вычислительной мощности, также стали использоваться методы основанные на прямом преобразовании Фурье, используемом для вычисления спектров МУРН, такой метод реализован например в программном пакете S ASSENA [65]. Однако методы основанные на прямом вычислении зависимости интенсивности рассеяния от вектора рассеяния очень трудоёмки, и их применение для систем большого размера (более 100 тысяч атомов) требует использования суперкомпьютеров.

Так же существуют методы позволяющие рассчитывать спектры НСЭ по траекториям молекулярной динамики. Они были реализованы в программных пакетах SAS SENA [65] и nMoldyn [66]. В обоих случаях метод основан на прямом использовании преобразования Фурье для вычисления пространственно-временной корреляционной функции G(r,r). Так же метод позволяет получать спектры усреднённые по траекториям молекулярной динамики, однако учитывая трудоёмкость метода, он оказывается применим только для систем небольшого размера.

1.3. Применение методов молекулярного моделирования к нуклеопротеидным комплексам

Методы моделирования комплексов биомакромалекул, в том числе и нук-леопротеидных комплексов, можно разбить на две группы:

• статические методы;

• динамические методы.

К статическим методам, обычно относят различные методы построения структурных моделей комплексов биомакромалекул, такие как:

• гомологическое моделирование структуры белков, основанное на сходстве аминокислотной последовательности с последовательностью структура которой известна [67-69];

• различные методы докинга (встраивания одной молекулярной структуры в другую);

• различные методы поиска конформаций макромолекулярной системы, а также минимизации конформационной энергий.

К динамическим методам, обычно относят молекулярную динамику (МД) и методы Монте-Карло (МК). Так же методы в каждой группе можно разбить на методы основанные на первых принципах - ab initio - это преимущественно методы вычислительной квантовой химии и молекулярной динамики основанной на квантовой механике [70], и на методы основанные на приближенных моделях - empirical и semi empirical - это классическое молекулярное моделирование и молекулярная динамика основанная на решении уравнений движения ньютона для многих частиц находящихся в потенциальном поле. Для моделирования макромолекул применяются только приближенные методы.

Для эмпирических методов описание взаимодействия между атомами в макромолекулах происходит с помощью задания наборов потенциальных функций называемых молекулярными полями. Типы взаимодействия в молекулярных полях обычно разделяют на связанные - взаимодействия атомов между которыми есть химические связи, и не связанные - это кулоновские и ван-дер-вааль-совы взаимодействия. Все не связанные взаимодействия описываются парными потенциалами - потенциалы которые зависят только от типов и возможно положения двух частиц, в то время, как потенциалы для связанных взаимодействий могут зависеть от типов двух, трех, и четырех частиц. Математическая форма

записи потенциалов зависит от типа поля (таблица 1.2).

Таблица 1.2. Математическая форма записи потенциала для поля Amber

Тип взаимодействия Потенциал U(r)

не связанные Кулон 1 я,Я] 4ле г2

не связанные Ван-дер-Ваальс

связанные Валентные L2kij(r - г0)2

связанные Угловые \kiji(6 - во)2

связанные Диэдральные \kijim(ü) - Шо)2

связанные Торсионные \kijini 1 - cos (пф + фо))

Молекулярные поля можно разделить на три группы:

• полноатомные поля, такие как amber [71], glycam [72],gaff [73], charm [74-76], opls-aa [77, 78] - в модели системы используется полноатомное представление биомакромалекул. При этом описывается весь набор взаимодействий в системе, в том числе водородные связи, стекинг азотистых оснований, в отдельных случаях учитывается возможность поляризации системы;

• тяжело-атомные поля, такие как gromos [79-82] - в модели системы используются только тяжёлые атомы (все что не водород), а так же полярные водороды. Неполярные - алифатические атомы водорода присоединяются к атомам углерода, с которыми они имеют ковалентные связи. Полярные атомы водорода представлены явно. Так же как и в предыдущем случае, описываются все взаимодействия присутствующие в системе;

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Швецов, Алексей Валерьевич, 2013 год

Цитированная литература

14. Story Randall M., Weber Irene T., Steitz Thomas A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer // Nature. 1992. Vol. 355, no. 6358. P. 318-325.

15. Chen Zhucheng, Yang Haijuan, Pavletich Nikola P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures // Nature. 2008. Vol. 453, no. 7194. P. 489-494.

16. Cox Michael M., Goodman Myron F., Kreuzer Kenneth N. et al. The importance of repairing stalled replication forks // Nature. 2000. Vol. 404, no. 6773. P. 37-41.

17. Cox Michael M. The nonmutagenic repair of broken replication forks via. recombination // Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of* Mutagenesis. 2002. Vol. 510, no. 1-2. P. 107 - 120.

18. Kowalczykowski Stephen C. Initiation of genetic recombination and recombination-dependent replication // Trends in Biochemical Sciences. 2000. Vol. 25, no. 4. P. 156- 165.

19. Lusetti Shelley L., Cox Michael M. The bacterial reca protein and the recombi-national DNA repair of stalled replication forks // Annual Review of Biochemistry. 2002. Vol. 71, no. 1. P. 71-100.

20. Cox Michael M. Motoring along with the bacterial RecA protein // Nature JR^e-views Molecular Cell Biology. 2007. Vol. 8, no. 2. P. 127-138.

21. Amundsen Susan K, Smith Gerald R. Interchangeable Parts of the Escherichia coli Recombination Machinery // Cell. 2003. Vol. 112, no. 6. P. 741 - 744.

22. Lanzov Vladislav A., Bakhlanova Irina V., Clark Alvin J. Conjugational TTy-perrecombination Achieved by Derepressing the LexA Regulon, Altering the

Properties of ReeA Protein and Inactivating Mismatch Repair in Escherichia coli K-12 // Genetics. 2003. Vol. 163, no. 4. P. 1243-1254.

23. Arnold Deana A., Kowalczykowski Stephen C. Facilitated Loading of RecA Protein Is Essential to Recombination by RecBCD Enzyme // Journal of Biological Chemistry. 2000. Vol. 275, no. 16. P. 12261-12265.

24. Churchill Jason J, Kowalczykowski Stephen C. Identification of the RecA protein-loading domain of RecBCD enzyme // Journal of Molecular Biology. 2000. Vol. 297, no. 3. P. 537 - 542.

25. Petrova Vessela, Chitteni-Pattu Sindhu, Drees Julia C. et al. An SOS Inhibitor that Binds to Free RecA Protein: The PsiB Protein // Molecular cell. 2009. Vol. 36, no. 1. P. 121-130.

26. Roy Rahul, Kozlov Alexander G., Lohman Timothy M., Ha Taekjip. SSB protein diffusion on single-stranded DNA stimulates RecA filament formation // Nature. 2009. Vol. 461, no. 7267. P. 1092-1097.

27. Shan Qun, Bork Julie M., Webb Brian L. et al. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins // Journal of Molecular Biology. 1997. Vol. 265, no. 5. P. 519-540.

28. Morimatsu Katsumi, Kowalczykowski Stephen C. RecFOR Proteins Load RecA Protein onto Gapped DNA to Accelerate DNA Strand Exchange: A Universal Step of Recombinational Repair // Molecular cell. 2003. Vol. 11, no. 5. P. 1337-1347.

29. Handa Naofumi, Morimatsu Katsumi, Lovett Susan T., Kowalczykowski Stephen C. Reconstitution of initial steps of dsDNA break repair by the RecF pathway of E. coli II Genes & Development. 2009. Vol. 23, no. 10. P. 1234-1245.

30. Lusetti Shelley L., Voloshin Oleg N., Inman Ross B. et al. The DinI Protein Stabilizes RecA Protein Filaments // Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279, no. 29. P. 30037-30046.

31. Drees Julia C., Lusetti Shelley L., Chitteni-Pattu Sindhu et al. A RecA Filament Capping Mechanism for RecX Protein // Molecular Cell. 2004. Vol. 15, no. 5. P. 789-798.

32. Drees Julia C., Lusetti Shelley L., Cox Michael M. Inhibition of RecA Protein by the Escherichia coli RecX Protein: MODULATION BY THE RecA C TERMINUS AND FILAMENT FUNCTIONAL STATE // Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279, no. 51. P. 52991-52997.

33. Bakhlanova Irina V., Dudkina Alexandra V., Baitin Dima M. et al. Modulating cellular recombination potential through alterations in RecA structure and regulation // Molecular Microbiology. 2010. Vol. 78, no. 6. P. 1523-1538.

34. Ragone Stefania, Maman Joseph D., Furnham Nicholas, Pellegrini Luca. Structural basis for inhibition of homologous recombination by the RecX protein // EMBO J. 2008. Vol. 27, no. 16. P. 2259-2269.

35. VanLoock Margaret S., Yu Xiong, Yang Shixin et al. Complexes of RecA with LexA and RecX Differentiate Between Active and Inactive RecA Nucleoprotein Filaments // Journal of Molecular Biology. 2003. Vol. 333, no. 2. P. 345-354.

36. Baitin Dmitry M., Gruenig Marielle C., Cox Michael M. SSB Antagonizes RecX-RecA Interaction // Journal of Biological Chemistry. 2008. Vol. 283, no. 21. P. 14198-14204.

37. Gruenig Marielle C., Stohl Elizabeth A., Chitteni-Pattu Sindhu et al. Less Is More: Neisseria gonorrhoeae RecX Protein Stimulates Recombination by Inhibiting RecA // Journal of Biological Chemistry. 2010. Vol. 285, no. 48. P. 37188-37197.

38. Aihara Hideki, Ito Yutaka, Kurumizaka Hitoshi et al. An interaction between a specified surface of the C-terminal domain of RecA protein and double-stranded DNA for homologous pairing // Journal of Molecular Biology. 1997. Vol. 274, no. 2. P. 213-221.

39. Kurumizaka Hitoshi, Aihara Hideki, Ikawa Shukuko et al. A Possible Role of the C-terminal Domain of the RecA Protein: A GATEWAY MODEL FOR DOUBLE-STRANDED DNA BINDING // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271, no. 52. P. 33515-33524.

40. Yu X., Egelman E.H. Removal of the RecA C-terminus results in a conformational change in the RecA-DNA filament // Journal of Structural Biology. 1991. Vol. 106, no. 3. P. 243 - 254.

41. VanLoock Margaret S., Yu Xiong, Yang Shixin et al. ATP-Mediated Conformational Changes in the RecA Filament // Structure. 2003. Vol. 11, no. 2. P. 187 - 196.

42. Krishna R., Prabu J. Rajan, Manjunath G.P. et al. Snapshots of RecA Protein Involving Movement of the C-domain and Different Conformations of the DNA-binding Loops: Crystallographic and Comparative Analysis of 11 Structures of Mycobacterium smegmatis RecA // Journal of Molecular Biology. 2007. Vol. 367, no. 4. P. 1130- 1144.

43. Petukhov Michael, Kil Yuri, Kuramitsu Seiki, Lanzov Vladislav. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their a-helices // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 1997. Vol. 29, no. 3. P. 309-320.

44. Datta S., Prabu M. M., Vaze M. B. et al. Crystal structures of Mycobacterium tuberculosis RecA and its complex with ADP-A1F4: implications for decreased ATPase activity and molecular aggregation // Nucleic Acids Research. 2000. Vol. 28, no. 24. P. 4964-4973.

45. Datta S., Ganesh N., Chandra Nagasuma R. et al. Structural studies on MtRe-cA-nucleotide complexes: Insights into DNA and nucleotide binding and the structural signature of NTP recognition // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2003. Vol. 50, no. 3. P. 474-485.

46. Datta S., Krishna R., Ganesh N. et al. Crystal Structures of Mycobacterium smegmatis RecA and Its Nucleotide Complexes // Journal of Bacteriology. 2003. Vol. 185, no. 14. P. 4280-4284.

47. Xing Xu, Bell Charles E. Crystal Structures of Escherichia coli RecA in a Compressed Helical Filament // Journal of Molecular Biology. 2004. Vol. 342, no. 5. P. 1471 - 1485.

48. Rajan Rakhi, Bell Charles E. Crystal Structure of RecA from Deinococcus radio-durans: Insights into the Structural Basis of Extreme Radioresistance // Journal of Molecular Biology. 2004. Vol. 344, no. 4. P. 951-963.

49. Xing Xu, Bell Charles E. Crystal Structures of Escherichia coli RecA in Complex with MgADP and MnAMP-PNPf,$ // Biochemistry. 2004. Vol. 43, no. 51. P. 16142-16152.

50. Krishna R., Manjunath G. P., Kumar P. et al. Crystallographic identification of an ordered C-terminal domain and a second nucleotide-binding site in RecA: new insights into allostery // Nucleic Acids Research. 2006. Vol. 34, no. 8. P. 2186-2195.

51. Prabu J. Rajan, Manjunath G. P., Chandra Nagasuma R. et al. Functionally important movements in RecA molecules and filaments: studies involving mutation and environmental changes // Acta Crystallographica Section D. 2008. Vol. 64, no. 11. P. 1146-1157.

52. Petukhov Michael, Lebedev Dmitry, Shalguev Valéry et al. Conformational flexibility of RecA protein filament: Transitions between compressed and stretched

states // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2006. Vol. 65, no. 2. P. 296-304.

53. Nishinaka Taro, Ito Yutaka, Yokoyama Shigeyuki, Shibata Takehiko. An extended DNA structure through deoxyribose-base stacking induced by RecA protein // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997. Vol. 94, no. 13. P. 6623-6628.

54. Lebedev D.V., Baitin D.M., Islamov A.Kh. et al. Analytical model for determination of parameters of helical structures in solution by small angle scattering: comparison of RecA structures by {SANS} // {FEBS} Letters. 2003. Vol. 537, no. 1-3. P. 182- 186.

55. DiCapua Elisabeth, Schnarr Manfred, Ruigrok Rob W.H. et al. Complexes of RecA protein in solution: A study by small angle neutron scattering // Journal of Molecular Biology. 1990. Vol. 214, no. 2. P. 557 - 570.

56. Timmins P.A., Ruigrok R.W.H., DiCapua E. The solution structure of recA filaments by small angle neutron scattering // Biochimie. 1991. Vol. 73, no. 2-3. P. 227 - 230.

57. Karelov D V, Lebedev D V, Suslov A V et al. Large-scale structure of RecA protein from Deinococcus radiodurance and its complexes in solution // Journal of Physics: Condensed Matter. 2008. Vol. 20, no. 10. P. 104215.

58. Debye P. Scattering from non-crystalline substances // Ann. Phys. 1915. no. 46. P. 809-823.

59. Свергун Д.И., Фейгин Jl.A. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. "Наука,"Глав. ред. физико-математической лит-ры, 1986.

60. Chacon Р., Morän F., Diaz J. F. et al. Low-Resolution Structures of Proteins in

Solution Retrieved from X-Ray Scattering with a Genetic Algorithm // Biophysical Journal. 1998. Vol. 74, no. 6. P. 2760-2775.

61. Chacon Pablo, Diaz, Morân Federico, Andreu José M. Reconstruction of protein form with X-ray solution scattering and a genetic algorithm // Journal of Molecular Biology. 2000. Vol. 299, no. 5. P. 1289-1302.

62. Stuhrmann H. B., Miller A. Small-angle scattering of biological structures // Journal of Applied Crystallography. 1978. Vol. 11, no. 5. P. 325-345.

63. Petoukhov Maxim V., Franke Daniel, Shkumatov Alexander V. et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis // Journal of Applied Crystallography. 2012. Vol. 45, no. 2. P. 342-350.

64. Merzel Franci, Smith Jeremy C. SASSIM: a method for calculating small-angle X-ray and neutron scattering and the associated molecular envelope from explicit-atom models of solvated proteins // Acta Crystallographica Section D. 2002.-Feb. Vol. 58, no. 2. P. 242-249.

65. Lindner Benjamin, Smith Jeremy C. Sassena — X-ray and neutron scattering calculated from molecular dynamics trajectories using massively parallel computers // Computer Physics Communications. 2012. Vol. 183, no. 7. P. 1491 -1501.

66. Rôg T., Murzyn K., Hinsen K., Kneller G. R. A Program Package for a Neutron Scattering Oriented Analysis of Molecular Dynamics Simulations // J. Comput. Chem. 2003. Vol. 24. P. 657-667.

67. Fiser Andrâs, Do Richard K., Sali Andrej. Modeling of loops in protein structures //Protein Science. 2000. Vol. 9, no. 9. P. 1753-1773.

V _

68. Sali Andrej, Blundell Tom L. Comparative Protein Modelling by Satisfaction

of Spatial Restraints // Journal of Molecular Biology. 1993. Vol. 234, no. 3. P. 779-815.

69. Marti-Renom Marc A., Stuart Ashley C., Fiser Andras et al. COMPARATIVE PROTEIN STRUCTURE MODELING OF GENES AND GENOMES // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 2000. Vol. 29, no. 1. P. 291-325.

70. Car R., Parrinello M. Unified Approach for Molecular Dynamics and Density-Functional Theory // Phys. Rev. Lett. 1985. Vol. 55, no. 22. P. 2471-2474.

71. Lindorff-Larsen Kresten, Piana Stefano, Palmo Kim et al Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2010. Vol. 78, no. 8.

72. Kirschner Karl N., Yongye Austin B., Tschampel Sarah M. et al. GLYCAM06: A generalizable biomolecular force field. Carbohydrates // Journal of Computational Chemistry. 2008. Vol. 29, no. 4. P. 622-655.

73. Wang Junmei, Wolf Romain M., Caldwell James W. et al. Development and testing of a general amber force field // Journal of Computational Chemistry. 2004. Vol. 25, no. 9. P. 1157-1174.

74. MacKerell A. D., Bashford D., Bellott et al. All-Atom Empirical Potential for Molecular Modeling and Dynamics Studies of Proteinsf // The Journal of Physical Chemistry B. 1998. Vol. 102, no. 18. P. 3586-3616.

75. MacKerell Alexander D., Banavali Nilesh, Foloppe Nicolas. Development and current status of the CHARMM force field for nucleic acids // Biopolymers. 2000. Vol. 56, no. 4. P. 257-265.

76. Mackerell Alexander D., Feig Michael, Brooks Charles L. Extending the treatment of backbone energetics in protein force fields: Limitations of gas-phase

quantum mechanics in reproducing protein conformational distributions in molecular dynamics simulations // Journal of Computational Chemistry. 2004. Vol. 25, no. 11. P. 1400-1415.

77. Jorgensen William L., Tirado-Rives Julian. The OPLS [optimized potentials for liquid simulations] potential functions for proteins, energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin // Journal of the American Chemical Society. 1988. Vol. 110, no. 6. P. 1657-1666.

78. Jorgensen William L., Maxwell David S., Tirado-Rives Julian. Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids // Journal of the American Chemical Society. 1996. Vol. 118, no. 45. P. 11225-11236.

79. Schuler Lukas D., Daura Xavier, van Gunsteren Wilfred F. An improved GRO-MOS96 force field for aliphatic hydrocarbons in the condensed phase // Journal of Computational Chemistry. 2001. Vol. 22, no. 11. P. 1205-1218.

80. Oostenbrink Chris, Villa Alessandra, Mark Alan E., Van Gunsteren Wilfred F. A biomolecular force field based on the free enthalpy of hydration and solvation: The GROMOS force-field parameter sets 53A5 and 53A6 // Journal of Computational Chemistry. 2004. Vol. 25, no. 13. P. 1656-1676.

81. Soares Thereza A., Hiinenberger Philippe H., Kastenholz Mika A. et al. An improved nucleic acid parameter set for the GROMOS force field // Journal of Computational Chemistry. 2005. Vol. 26, no. 7. P. 725-737.

82. Schmid Nathan, Eichenberger AndreasP., Choutko Alexandra et al. Definition and testing of the GROMOS force-field versions 54A7 and 54B7 // European Biophysics Journal. 2011. Vol. 40, no. 7. P. 843-856.

83. Marrink Siewert J., de Vries Alex H., Mark Alan E. Coarse Grained Model

for Semiquantitative Lipid Simulations // The Journal of Physical Chemistry B. 2004. Vol. 108, no. 2. P. 750-760.

84. Marrink Siewert J., Risselada H. Jelger, Yefimov Serge et al The MARTINI Force Field: Coarse Grained Model for Biomolecular Simulations // The Journal of Physical Chemistry B. 2007. Vol. Ill, no. 27. P. 7812-7824. PMID: 17569554.

85. Risselada H. Jelger, Marrink Siewert J. The molecular face of lipid rafts in model membranes // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. Vol. 105, no. 45. P. 17367-17372.

86. Monticelli Luca, Kandasamy Senthil K., Periole Xavier et al The MARTINI Coarse-Grained Force Field: Extension to Proteins // Journal of Chemical Theory and Computation. 2008. Vol. 4, no. 5. P. 819-834.

87. Periole Xavier, Cavalli Marco, Marrink Siewert-Jan, Ceruso Marco A. Combining an Elastic Network With a Coarse-Grained Molecular Force Field: Structure, Dynamics, and Intermolecular Recognition // Journal of Chemical Theory and Computation. 2009. Vol. 5, no. 9. P. 2531-2543.

88. Freddolino Peter L., Arkhipov Anton S., Larson Steven B. et al Molecular Dynamics Simulations of the Complete Satellite Tobacco Mosaic Virus // Structure. 2006. Vol. 14, no. 3. P. 437 - 449.

89. Zhao Gongpu, Perilla Juan R., Yufenyuy Ernest L. et al Mature HIV-1 cap-sid structure by cryo-electron microscopy and all-atom molecular dynamics // Nature. 2013. Vol. 497, no. 7451. P. 643-646.

90. Abagyan Ruben, Totrov Maxim, Kuznetsov Dmitry. ICM: A new method for protein modeling and design: Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation // Journal of Computational Chemistry. 1994. Vol. 15, no. 5. P. 488-506.

91. Abagyan Ruben, Totrov Maxim. Biased Probability Monte Carlo Conformational Searches and Electrostatic Calculations for Peptides and Proteins // Journal of Molecular Biology. 1994. Vol. 235, no. 3. P. 983-1002.

92. Consortium The UniProt. Update on activities at the Universal Protein Resource (UniProt) in 2013 //Nucleic Acids Research. 2013. Vol. 41, no. Dl. P. D43-D47.

93. Lu Xiang-Jun, Olson Wilma K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding and visualization of three-dimensional nucleic acid structures // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31, no. 17. P. 5108-5121.

94. Lu Xiang-Jun, Olson Wilma K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures // Nature Protocols. 2008. Vol. 3, no. 7. P. 1213-1227.

95. Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. Vol. 171, no. 4356. P. 737-738.

96. Hoogsteen K. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine // Acta Crystallographica. 1963. Vol. 16, no. 9. P. 907-916.

97. Pilch Daniel S., Levenson Corey, Shafer Richard H. Structure, stability, and thermodynamics of a short intermolecular purine-purine-pyrimidine triple helix // Biochemistry. 1991. Vol. 30, no. 25. P. 6081-6087.

98. Garzon José Ignacio, Lopèz-Blanco José Ramôn, Pons Carles et al FRODOCK: a new approach for fast rotational protein-protein docking // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, no. 19. P. 2544-2551.

99. Berendsen H.J.C., van der Spoel D., van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation // Computer Physics Communications. 1995. Vol. 91, no. 1-3. P. 43-56.

100. Lindahl Erik, Hess Berk, van der Spoel David. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis // Molecular modeling annual. 2001. Vol. 7, no. 8. P. 306-317.

101. Van Der Spoel David, Lindahl Erik, Hess Berk et al GROMACS: Fast, flexible, and free // Journal of Computational Chemistry. 2005. Vol. 26, no. 16. P. 1701-1718.

102. Hess Berk, Kutzner Carsten, van der Spoel David, Lindahl Erik. GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation // Journal of Chemical Theory and Computation. 2008. Vol. 4, no. 3. p. 435-447.

103. Pronk Sander, Pall Szilard, Schulz Roland et al GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit // Bioinformatics. 2013. Vol. 29, no. 7. P. 845-854.

104. Sousa da Silva Alan, Vranken Wim. ACPYPE - AnteChamber PYthon Parser interfacE // BMC Research Notes. 2012. Vol. 5, no. 1. P. 367.

105. Wang Junmei, Wang Wei, Kollman Peter A., Case David A. Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations // Journal of Molecular Graphics and Modelling. 2006. Vol. 25, no. 2. P. 247 - 260.

106. Case David A., Darden T. A., Cheatham T. E. et al. Amber 12. University of California, San Francisco, 2012.

107. Salomon-Ferrer Romelia, Case David A., Walker Ross C. An overview of the Amber biomolecular simulation package // Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Molecular Science. 2013. Vol. 3, no. 2. P. 198-210.

108. Jorgensen William L., Chandrasekhar Jayaraman, Madura Jeffry D. et al. Com-

parison of simple potential functions for simulating liquid water // The Journal of Chemical Physics. 1983. Vol. 79, no. 2. P. 926-935.

109. Berendsen H. J. C., Postma J. P. M., van Gunsteren W. F. et al. Molecular dynamics with coupling to an external bath // The Journal of Chemical Physics. 1984. Vol. 81, no. 8. P. 3684-3690.

110. Darden T., York D., Pedersen L. Particle mesh Ewald: An N$ bullet$log(N) method for Ewald sums in large systems // J. Chem. Phys. 1993. Vol. 98. P. 10089-10092.

111. Essmann Ulrich, Perera Lalith, Berkowitz Max L. et al. A smooth particle mesh Ewald potential // J. Chem. Phys. 1995. Vol. 103. P. 8577-8592.

112. Nose Shuichi. A molecular dynamics method for simulations in the canonical ensemble // Molecular Physics. 1984. Vol. 52, no. 2. P. 255-268.

113. Hoover William G. Canonical dynamics: Equilibrium phase-space distributions // Phys. Rev. A. 1985. Vol. 31. P. 1695-1697.

114. Martyna Glenn J., Klein Michael L., Tuckerman Mark. Nose-Hoover chains: The canonical ensemble via continuous dynamics // The Journal of Chemical Physics. 1992. Vol. 97, no. 4. P. 2635-2643.

115. Martyna Glenn J., Tuckerman Mark E., Tobias Douglas J., Klein Michael L. Explicit reversible integrators for extended systems dynamics // Molecular Physics. 1996. Vol. 87, no. 5. P. 1117-1157.

116. Parrinello M., Rahman A. Polymorphic transitions in single crystals: A new molecular dynamics method // Journal of Applied Physics. 1981. Vol. 52, no. 12. P. 7182-7190.

117. Nose Shuichi, Klein M.L. Constant pressure molecular dynamics for molecular systems // Molecular Physics. 1983. Vol. 50, no. 5. P. 1055-1076.

118. Sears Yarley F. Neutron scattering lengths and cross section // Neutron News. 1992. Vol. 3, no. 3. P. 26-37.

119. Amadei Andrea, Linssen Antonius B. M., Berendsen Herman J. C. Essential dynamics of proteins // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 1993. Vol. 17, no. 4. P. 412^425.

120. Mu Yuguang, Nguyen Phuong H., Stock Gerhard. Energy landscape of a small peptide revealed by dihedral angle principal component analysis // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2005. Vol. 58, no. 1. P. 45-52.

121. Hinsen Konrad. Comment on: "Energy landscape of a small peptide revealed by dihedral angle principal component analysis" // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2006. Vol. 64, no. 3. P. 795-797.

122. Hayward Steven, Kitao Akio, Berendsen Herman J.C. Model-free methods of analyzing domain motions in proteins from simulation: A comparison of normal mode analysis and molecular dynamics simulation of lysozyme // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 1997. Vol. 27, no. 3. P. 425-437.

123. Hayward Steven, Berendsen Herman J.C. Systematic analysis of domain motions in proteins from conformational change: New results on citrate synthase and T4 lysozyme // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 1998. Vol. 30, no. 2. P. 144-154.

Список иллюстраций

1.1 Структура белка RecA из E.coli PDB:2REB показана слева. Справа каждый домен RecA выделен своим цветом: N-концевой - красный, АТФазный - зелёный, С-концевой - синий........... 14

1.2 Вторичная структура белка RecA из E.coli PDB:2REB........ 14

1.3 Суперпозиция 6 структур белка RecA из М. smegmatis[42] (20DN, 20DW, 20Е2, 20ЕР, 20ES, 20F0) на которых видно положение петель LI и L2.............................. 15

о

2.1 Суперпозиция (RMSD=0.945A) кристаллической структуры RecA из Е. coli PDB:2REB (красный) с полной моделью (синий). Восстановленные петли LI и L2 показаны в виде полноатомной модели, остальные элементы структуры показаны схематически ... 25

о

2.2 Суперпозиция (RMSD=1.246A) кристаллической структуры RecA

из D. radiodurans PDB:1XP8 (красный) с полной моделью (синий). Восстановленные петли LI, L2 и LAL показаны в виде полноатомной модели, остальные элементы структуры показаны схематически ................................26

2.3 Суперпозиция (RMSD=0.913Ä) кристаллической структуры комплекса RecA::онДНК::АДФ::AIF4 из Е. coli PDB:3CMW (красный) с моделью моделью тримера белка RecA в комплексе с АТФ

и онДНК (синий) ............................27

2.4 Модель додекамера белка RecA из Е. coli в комплексе с онДНК и АТФ. Каждый мономер додекамера покрашен своим цветом (от красного к синему) ...........................28

2.5 Модель 33-мера белка RecA из Е. coli в комплексе с онДНК и АТФ. Каждый мономер 33-мера покрашен от N-конца к С-концу цветом (от красного к синему).....................29

о

2.6 Суперпозиция (RMSD=0.989A) кристаллической структуры RecA из Е. coli PDB:2REB (жёлтый) с кристаллической структурой RecA из D. radiodurans (зелёный)...................29

о

2.7 Суперпозиция (RMSD=0.749A) кристаллической структуры комплекса RecA::днДНК::АДФ::A1F4 из Е. coli PDB:3CMX (красный) с моделью моделью тримера белка RecA в комплексе с АТФ и днДНК (синий)..............................30

2.8 Возможные варианты образования Хугстиновских [96] троек азотистых оснований в тнДНК ......................32

2.9 Укладка тнДНК с Хугстиновскими [96] водородными связями в комплексе RecA: :тнДНК::АТФ из Е. coli. Три нити ДНК покрашены цветом (нить поли(сГГ) полностью находящаяся внутри фи-ламента - циан, нить поли(с1А) - зелёная, приходящая поли(с!Т) -

фиолетовая) ...............................33

2.10 Модель структуры комплекса RecA: :тнДНК::АТФ из Е. coli . Три нити ДНК покрашены цветом (нить поли(с1Т) полностью находящаяся внутри филамента - циан, нить поли(с1А) - зеленая, приходящая поли(сГГ) - фиолетовая).....................34

2.11 Структура модельного комплекса гомополимера белка RecX из

Е. coli. Вид комплекса сверху и снизу.................35

2.12 Зарядовая структура мономера белка RecX из Е. coli. Вид комплекса сверху и снизу. Положительный заряд показан синим, отрицательный красным..........................36

2.13 Зарядовая структура модельного комплекса гомополимера белка RecX из Е. coli. Вид комплекса сверху и снизу, положительный заряд показан синим, отрицательный красным............36

2.14 Структуры возможных комплексов RecX::oнДHK из Е. coli. Две верхние структуры покрывают онДНК с одной стороны, две нижние структуры сандвич-подобного типа................37

2.15 Структура комплекса RecA::RecX::онДНК::АТФ из Е. coli с соотношением RecA:RecX 12:5. RecA показан синим, RecX зеленым, онДНК фиолетовым...........................38

3.1 RMSD для комплексов гомополимеров белка RecA из Е. coli (красные кружки) и D. radiodurans (красная линия), а так же для комплексов RecA: :днДНК::АТФ из Е. coli (синие кружки) и D. radiodurans (синяя линия)................50

3.2 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов гомополимера RecA (верхняя карта) и RecA: :днДНК::АТФ (нижняя карта) из Е. coli...........................52

3.3 Схема стабилизации петель Ы и Ь2 в тримерах комплекса RecA::днДHK::ATФ, мономеры А (красный), В (синий), С (зелёный) взаимодействуют при помощи петель Ы и Ь2 образуя пары взаимодействий Ь1А-Ь2В, Ь1В-Ь2С, при этом петли нарушают

стекинг в днДНК через каждые три пары оснований.........53

3.4 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов гомополимера RecA (верхняя карта) и RecA::днДНК::АТФ (нижняя карта) из D. radiodurans......................54

3.5 Поворот С-концевого домена белка RecA из Е. coli скореллиро-ван с поворотом N-концевого домена и вносит основной вклад в конформационную подвижность белка. Показаны крайние положения поворота (зелёная и красная структуры) ...........56

3.6 Поворот С-концевого домена белка RecA из D. radiodurans ско-реллирован с поворотом N-концевого домена и вносит основной вклад в конформационную подвижность белка. Показаны крайние положения поворота (зелёная и красная структуры).........56

3.7 Поворот С-концевого домена белка ReeA из Е. coli (слева) и D. radiodurans (справа) в комплексе RecA:: днДНК:: АТФ вносит основной вклад в конформационную подвижность белка. Показаны крайние положения поворота (зелёная и красная структуры) . . 57

3.8 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса гомополимера RecA из Е. coli....................59

3.9 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса гомополимера RecA из D. radiodurans...............60

3.10 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA: :онДНК: :АТФ из Е. coli....................60

3.11 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA::oнДHK::ATФ из D. radiodurans...............61

3.12 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA::днДНК::АТФ из Е. coli....................62

3.13 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA::днДНК::АТФ из D. radiodurans...............62

3.14 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA: :тнДНК::АТФ из Е. coli....................63

3.15 Средняя конформационная подвижность по додекамеру комплекса RecA: :тнДНК::АТФ из D. radiodurans...............63

3.16 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов гомополимеров RecA из Е. coli (верхняя карта) и

D. radiodurans (нижняя карта).....................65

3.17 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов RecA: юнДНК::АТФ из Е. coli (верхняя карта) и

D. radiodurans (нижняя карта).....................66

3.18 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов RecA::днДНК::АТФ из Е. coli (верхняя карта) и

D. radiodurans (нижняя карта).....................67

3.19 Карты локальной конформационной подвижности для комплексов RecA ::тнДНК:: АТФ из Е. coli (верхняя карта) и

D. radiodurans (нижняя карта).....................68

3.20 Изменение шага филамента гомополимера белка RecA из

E. coli со временем. Локальные значения шага спирали для пар мономеров имеют большой разброс, однако среднее за виток значение (жирная линия) достаточно стабильно.............70

3.21 Изменение шага филамента гомополимера белка RecA из

D. radiodurans со временем. Локальные значения шага спирали для пар мономеров имеют большой разброс, при этом видно что шаг филамента из кристаллической структуры релаксирует к наблюдаемому в растворе значению (жирная линия) ........70

3.22 Средняя конформационная подвижность гомополимера RecX из

E. coli. Цветами показана подвижность как для всего филамента,

так и для мономеров в отдельности..................72

3.23 Средняя конформационная подвижность комплекса RecX::oнДHK из Е. coli. Цветами показана подвижность как для всего филамента, так и для мономеров в отдельности................73

3.24 Средняя конформационная подвижность сандвич-подобного комплекса RecX::онДНК из Е. coli. Цветами показана подвижность

как для всего филамента, так и для мономеров в отдельности ... 73

3.25 Локальная конформационная подвижность гомополимера белка RecX из Е. coli..............................74

3.26 Локальная конформационная подвижность мономера белка RecX

в простом комплексе RecX::oнДHK из Е. coli.............75

3.27 Локальная конформационная подвижность сандвич подобного комплекса КесХ::онДНК из Е. coli...................75

3.28 Средняя карта контактов между белком RecX и он ДНК для сандвич подобного комплекса КесХ::онДНК из Е. coli..........76

3.29 Расстояние между основаниями онДНК в комплексах белков ЯесА::онДНК, ЯесХ::онДНК и сандвич-подобного комплекса ЯесХ::онДНК из Е. coli.........................77

3.30 Средняя конформационная подвижность филаментов 11есА::КесХ::онДНК::АТФ при различном соотношении RecA:RecX (сверху вниз 2:12, 3:12, 5:12)...............79

3.31 Средняя карта контактов между белком RecX и онДНК для комплекса КесА:^есХ::онДНК из Е. coli.................80

3.32 Средняя карта контактов между белками RecX и Ree А для комплекса RecA::RecX::oнДHK из Е. coli.................80

3.33 Экспериментальные спектры МУРН для гомополимера (зелёная линия) белков RecA и комплекса RecA::oнДHK::ATФyS (красная линия) из Е. coli (слева) и D. radiodurans (справа)..........82

3.34 Сравнение спектров расчитанных с помощью CRYSON и g_sans

с экспериментом для гомополимера белка RecA из D. radiodurans . 83

3.35 Сравнение модельного спектра МУРН для компекса RecA::онДНК::АТФ из Е. coli с экспериментальным спектром МУРН ...............................83

3.36 Экспериментальные и модельные спектры МУРН для комплексов RecA::RecX::oнДHK::ATФ из Е. coli с различным соотношением RecX: RecA................................ 84

3.37 Экспериментальные и модельные спектры МУРН для комплексов RecX::oнДHK из Е. coli......................... 85

3.38 Экспериментальные спектры НСЭ для гомополимера белка RecA (слева) и комплекса RecA::онДНК::АТФу8 (справа) из

D. radiodurans.............................. 86

3.39 Модельные спектры НСЭ для гомополимера белка RecA (слева)

и комплекса RecA::онДНК::АТФу8 (справа) из D. radiodurans ... 86

©Jt«

3.40 Экспериментальный (слева) и модельный спектр МУРН и зависимость диффузии от вектора рассеяния для гомополимера белка RecA (черные квадраты) и комплекса RecA: :онДНК:: АТФу S (красные круги) из D. radiodurans..................