Лизоцимный фактор пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum: выделение, характеристика, функции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Карнаухова, Ирина Владимировна

• Карнаухова, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Карнаухова, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Лизоцим в природе и его роль у беспозвоночных животных.

1.1. Распространение лизоцима в природе.

1.2. Спектр и механизм антимикробного действия лизоцима.

1.3. Лизоцим как антимикробный фактор беспозвоночных животных.

Глава 2. Объект и методы исследования.

2.1. Характеристика объекта и места отбора проб.

2.2. Определение литической активности моллюсков.

2.3. Выделение и очистка лизоцима моллюсков.

2.4. Электрофоретическое исследование препаратов лизоцима.

2.5. Определение численности сапрофитных бактерий.

2.6. Изучение спектра антимикробного действия препаратов лизоцима.

2.7. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Изучение распространения двустворчатых моллюсков р. Урал и их взаимодействия с сапрофитной микрофлорой водоема.

3.1. Пространственная динамика фауны двустворчатых моллюсков.

3.2. Взаимодействие двустворчатых моллюсков Unió pictorum с сапрофитной микрофлорой.

Глава 4. Установление природы антибактериального фактора пресноводных двустворчатых моллюсков.

4.1. Изучение литической активности моллюсков семейства Unionidae.

4.2. Выделение и очистка антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum.

4.3. Электрофоретическое подтверждение лизоцимной природы антибактериального фактора пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum.

Глава 5. Физико-химическая характеристика и антибактериальная активность препарата лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Unió pictorum.

5.1. Физико-химические свойства.

5.2. Антибактериальная активность.

Глава 6. Оценка влияния лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска Unió pictorum на сапрофитную микрофлору.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лизоцимный фактор пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum: выделение, характеристика, функции»

Одним из экологически значимых факторов, принимающих участие в формировании гидробиоценозов, является лизоцим (Багнюк и др., 1980; 1983). Исследованиями последних лет обосновано существование в пресных водоемах особой функциональной системы "лизоцим -атилизоцим" на уровне бактериоценозов (Соловых, 1995) и в водорослевых сообществах (Алехина, 1996). Показано, что среди различных групп гидробионтов - бактерий, микроводорослей, зоопланктеров широко распространена лизоцимная активность и наблюдается высокая частота встречаемости лизоцимного фактора (Соловых, 1995; Алехина, 1996; Немцева, 1998). Однако представители бентоса - пресноводные двустворчатые моллюски, несмотря на их особую функциональную роль в водоеме, связанную с фильтрационно-окислительной способностью (Догель, 1981; Скопцова, 1984), в этом отношении не исследовались.

Пропуская через мантийную полость огромные количества воды с взвешенными в ней веществами, двустворчатые моллюски в водоеме играют роль естественных биологических фильтров. Обезвреживание чужеродных частиц, попавших в организм моллюска, происходит с участием фагоцитов, содержащих целый комплекс гидролитических ферментов, и в том числе, возможно, лизоцим (Флоренсов В.А., Пестова И.М., 1990). В литературе имеются данные о продукции лизоцима моллюсками (Ломакин, 1990; СагЬа11а1 <?/ а1., 1997), отмечено присутствие этого фермента в гемолимфе устриц (Трипп, 1966). Однако распространенность данного антибактериального фактора среди различных систематических групп пресноводных двустворчатых моллюсков не изучена. В доступной литературе отсутствуют также какие-либо сведения о физико-химических и биологических свойствах лизоцима моллюсков.

Все это обусловило актуальность работы, которая определяется тем, что предпринята попытка установить присутствие лизоцима у представителей двустворчатых моллюсков среднего течения реки Урала, получить очищенный препарат лизоцима моллюсков, оценить его физико-химические свойства и антибактериальную активность.

Цель настоящей работы - обнаружение, характеристика и оценка биологической роли лизоцимного фактора у пресноводного двустворчатого моллюска Unio pictorum.

Конкретные задачи исследования:

1. Определение доминирующих видов пресноводных двустворчатых моллюсков среднего течения реки Урала и изучение их взаимодействия с сапрофитной микрофлорой водоема.

2. Исследование литической активности двустворчатых моллюсков в отношении тест-культуры Micrococcus lysodeikticus, отбор наиболее активных по данному признаку представителей малакофауны.

3. Выделение, очистка и характеристика физико-химических свойств лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum.

4. Определение антибактериальной активности лизоцима двустворчатого моллюска U. pictorum в отношении индикаторной культуры М. lysodeikticus, а также условно-патогенной культуры Staphilococcus epidermidis и Escherichia coli.

5. Оценка влияния лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum на сапрофитную микрофлору микрокосма и его роли в процессах очищения водоема от условно-патогенных микроорганизмов.

Научная новизна.

Впервые обнаружена лизоцимная активность у пресноводных двустворчатых моллюсков семейства Unionidae (Перловицы).

Впервые получен препарат лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum и исследованы его физико-химические свойства.

Изучен спектр антимикробной активности полученного препарата лизоцима моллюсков. Установлено, что лизоцим пресноводного двустворчатого моллюска V. рШогит проявляет антимикробную активность как в отношении грамотрицательных, так и грамположительных бактерий.

В условиях микрокосма выявлена высокая антибактериальная активность лизоцима пресноводного двустворчатого моллюска V. рШогит в отношении водных сапрофитов, показано его косвенное участие в процессах очищения водоемов от условно-патогенных микроорганизмов.

Теоретическое и практическое значение. Полученные данные расширяют представления о распространенности лизоцима в природе и роли данного фактора в питании и защите пресноводных двустворчатых моллюсков от микрофлоры, а также в процессах очищения водоемов от условно-патогенных микроорганизмов и формирования водных бактериоценозов.

Полученные сведения об антибактериальном факторе моллюсков как о новом представителе семейства лизоцимов включены в учебный материал для преподавания курса биологической химии и микробиологии на соответствующих кафедрах Оренбургской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Пресноводный двустворчатый моллюск V. рШогит продуцирует антибактериальный фактор лизоцимной природы.

2. Лизоцим пресноводного двустворчатого моллюска и. рШогит является новым представителем семейства лизоцимов, проявляющим высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий.

3. Обладая выраженной лизоцимной активностью, пресноводные двустворчатые моллюски участвуют в процессах очищения водоемов от условно-патогенных микроорганизмов и формирования водных бактериоценозов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на конференции молодых ученых и студентов "Охрана природы и здоровья человека" (Оренбург, 1997); XV научно-практической конференции "Молодые ученые - здравоохранению" (Оренбург, 1998); Региональной научно-практической конференции "Проблемы экологии Уральского региона" (Оренбург, 1998); Региональной конференции "Молодых ученых и специалистов Оренбуржья" (Оренбург, 1999); Конференции "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (Пермь, 1999); Конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии" (Челябинск, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 24 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения и выводов. Список литературы включает 149 наименований работ отечественных (94) и зарубежных (55) авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Карнаухова, Ирина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено, что пресноводные двустворчатые моллюски семейства Unionidae проявляют бактериолитическую активность, связанную с продукцией лизоцима.

2. Показано, что антибактериальная активность экстрактов мантии и жабр доминирующего в малакофауне р. Урал двустворчатого моллюска Unió pictorum в 2-7 раз выше, по сравнению с таковой представителей другого рода - Anodonta cygnea.

3. Впервые из пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum получен препарат лизоцима, удельная литическая активность которого составляет 100 ед./мг белка. Активность полученного препарата в 200 раз превышает активность неочищенного экстракта тканей моллюска.

4. Установлено, что в полученном препарате лизоцим пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum обладает термостабильностью и выдерживает кипячение в слабокислой среде (pH 5,0-6,0); проявляет активность в широком диапазоне pH - от 4,0 до 9,0 с максимумом активности при pH 5,0.

5. Обнаружено, что в отличие от действия препарата яичного лизоцима на грамотрицательные бактерии, которое проявляется при концентрациях на несколько порядков выше, необходимых для антибактериального эффекта в отношении грамположительных бактерий, полученный препарат лизоцима обладает практически одинаковой активностью в отношении как грамположительных (S. epidermidis), так и грамотрицательных (Е. coli) бактерий.

6. Совокупность результатов исследования физико-химических свойств и антибактериальной активности полученного препарата лизоцима моллюсков свидетельствует о том, что лизоцим пресноводного двустворчатого моллюска U. pictorum является новым представителем семейства лизоцимов.

7. В условиях микрокосма выявлено, что лизоцим двустворчатого моллюска U. pictorum существенно снижает численность водных сапрофитных микроорганизмов. Это позволяет предполагать участие двустворчатых моллюсков в процессах очищения водоемов от условно-патогенных микроорганизмов и формирования водных бактериоценозов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованиями последних лет показано, что одним из регулирующих факторов в водном биоценозе является лизоцим (Багнюк и др., 1980, 1983; Соловых, 1995; Бухарин, с соавт., 1997, 1999), обнаружена высокая частота встречаемости лизоцимного фактора среди различных групп гидробионтов (Алехина, 1996; Немцева, 1998). Широкое распространение лизоцима в живой природе, его роль в регуляции водных биоценозов позволили предположить возможную продукцию этого фермента пресноводными двустворчатыми моллюсками.

Первоначальной задачей нашего исследования было определение видового разнообразия двустворчатых моллюсков среднего течения реки Урал в районе г. Оренбурга с целью выявления доминирующих видов, а также оценка взаимодействия моллюсков с водными сапрофитами.

В результате проведенных исследований выявлено обеднение состава малакофауны на изучаемом участке русла Урала. Ни на одном из исследуемых участков мы не обнаружили моллюсков Sphaeriastrum rivicola, многочисленность которых отмечали П.А. Воронцовский (1922), Е.Г. Мартынова и Л.П. Никитина (1974); в пробах отсутствовали также моллюски Euglesa supina. Обеднение видового разнообразия малакофауны изучаемого участка русла Урала свидетельствует о неблагоприятных изменениях, затронувших все звенья гидробиоценозов реки, что подтверждается результатами недавних исследований альгофлоры (Алехина, 1996) и зоопланктона (Раимова, 2000).

Г.П. Алехина отмечает сокращение флористического списка водорослей на 35 видов по сравнению с данными С.Н. Порядиной (1974).

При исследовании зоопланктона Е.К. Раимовой (2000) зафиксировано резкое снижение и обеднение его видового состава. Если в 1971г. в Урале и его притоках регистрировали 81 вид коловраток, 44 вида ветвистоусых и 19 видов веслоногих ракообразных, то в 1999 году на исследуемом участке реки было обнаружено всего 13 видов коловраток 4 вида ветвистоусых и 3 веслоногих ракообразных.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что в гидробиоценозах Урала за истекший почти тридцатилетний период произошли изменения, затронувшие качественный и количественный состав его обитателей: исчезли доминировавшие ранее виды, их место заняли другие. Установлено, что в гидробиоценозах среднего течения р. Урал доминируют моллюски Uniopictorum.

Изучение взаимодействия этих моллюсков с сапрофитной микрофлорой показало, что перловицы U. pictorum активны в отношении водных сапрофитов, в том числе обладающих антилизоцимным признаком, и способны значительно снижать их численность. Общее число сапрофитов, AJIA-форм бактерий в смывах с жабр моллюсков было на несколько порядков ниже, чем в воде исследуемого биотопа. Эти данные подтверждались показателями коли-титра. Такое действие моллюсков можно было связть с наличием у них антибактериальных факторов, возможно, лизоцима. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на выяснение этого вопроса.

В ходе экспериментов, был обнаружен литический эффект экстрактов тканей моллюсков в отношении индикаторной культуры М. lysodeikticus. Кроме того, изучение литической активности экстрактов тканей моллюсков семейства Unionidae в отношении Micrococcus lysodeikticus выявило различия в уровне относительной литической активности тканей моллюсков Anodonta cygnea и моллюсков Unio pictorum: последние оказались более активны в отношении тест-культуры микрококка.

Учитывая высокую чувствительность клеточных стенок М. lysodeikticus к литическому действию лизоцима, полученные результаты позволили предположить, что данный антимикробный фактор моллюсков может иметь мурамидазную (лизоцимную) природу.

Вместе с тем литическая активность препаратов экстрактов моллюсков в отношении М. lysodeikticus является лишь косвенным признаком возможности присутствия лизоцима у данных животных. Для более обоснованного суждения необходимо было выделить литическое начало и провести его идентификацию. Как известно, важная особенность лизоцима - это не только его активность в отношении клеточных стенок микрококка, но и высокое сродство к хитину (Страйер, 1984). Именно на данном свойстве лизоцима основан метод специфической сорбции этого фермента на хитине, использующийся для выделения и очистки лизоцима (Черкасов, Кравченко, 1969).

Как показали наши исследования, использование хитина оказалось эффективным и для выделения антибактериального фактора предполагаемой мурамидазной природы из экстрактов моллюсков U. pictorum. В результате был получен препарат лизоцима моллюсков U. pictorum, очищенный в 200 раз. Наличие лизоцима в препарате было подтверждено методом электрофореза в 12%-ном ПААГ по Laemmli (1970) и методом Lehrer et al. (1991) с использованием техники "gel overlay".

В полученных препаратах присутствовала фракция с подвижностью, близкой к подвижности яичного лизоцима и молекулярной массой около 15 кДа. Данная белковая фракция препарата так же как и яичный лизоцим проявляла литическую активность в отношении М. lysodeikticus при наслоении на несущий белковые фракции гель агарозного геля с индикаторной культурой в системе "gel-overlay". Таким образом, в результате электрофоретических исследований полученного препарата была доказана мурамидазная природа содержащегося в нем антибактериального фактора.

Известно, что лизоцимы различного происхождения отличаются по физико-химическим свойствам и биологической активности.

Достаточно хорошо изучены лизоцимы позвоночных животных (1то1;о еГ а1., 1972; Бухарин, Васильев, 1974). О лизоцимах беспозвоночных животных известно меньше (Подборонов, Бердыев, 1991).

Таким образом, оценка физико-химических свойств и спектра антимикробного действия полученного препарата лизоцима моллюсков II. рШогит представляет принципиальный интерес.

В ходе исследований были выявлены некоторые отличия физико-химических свойств полученного препарата от соответствующих характеристик яичного лизоцима (табл. 15.).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Карнаухова, Ирина Владимировна, 2000 год

1. Алексеев А.Н. К вопросу об иммунитете насекомых // Энтомологическое обозрение. Л. 1971. - Т. 56, № 3. - С. 738-149.

2. Алексеев А.Н., Бибикова В.А., Хрусцелевская Н.М. К вопросу о бактерицидном факторе желудочно-кишечного тракта блох. // Проблемы дезинфекции и стерилизации. М. - 1969. - Вып. 20. - С. 367-371.

3. Алехина Т.П. Лизоцимная и антилизоцимная активность альгофлоры в водных биоценозах. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Оренбург, 1996.-24 с.

4. Ашмарин И.П., Васильев H.H. Быстрые методы статистической обработки и планирования эксперимента. Л. - 1971. - 60 с.

5. Багнюк В.М., Закордонец O.A. Исследование экологической роли литических бактерий в активном иле. // Доклады АН СССР. 1980. -Т. 254, №4.-С. 1018-1021.

6. Багнюк В.М., Новоженко Л.С., Закордонец O.A. Литические бактерии в активном иле станции биохимической очистки сточных вод. // Микробиологический журнал. 1983. - Т. 45, № 2. - С. 15-21.

7. Бенинг А.Л. Материалы по гидробиологии реки Урала. Большая Эмба. Казахск. филиал АН СССР. - 1938. - Т. 11. - С. 153-253.

8. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим методам исследований. М. - 1982. - 464 с.

9. Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. М.: Мир, 1979. -620 с.

10. Бухарин О.В. Актовая речь на заседании Ученого Совета Оренбургского медицинског института. Оренбург, 1992. - 31 с.

11. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999.-365 с.

12. Бухарин О.В, Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1974. - 208 с.

13. Бухарин O.B, Васильев Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов.- Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1985. -213 с.

14. Бухарин О.В., Валышев A.B., Елагина H.H., Иванов Ю.Б., Черкасов C.B. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии. 1997, № 4. - С. 117-120.

15. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1984, № 2. - С. 27-28.

16. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Матияш И.Н., Пастухова Г.В., Прянишникова Л.И. Характеристика антимикробной активности лизоцима // Антибиотики. 1976. - Т. 21, № 9. - С. 805-808.

17. Бухарин О.В., Соловых Г.Н., Немцева H.B., Алехина Г.П., Фабарисова Л.Г. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов как показатель состояния водных биоценозов // Гигиена и санитария. 1997, № 5. -С. 57-59.

18. Воронцовский П.А. Материалы к изучению фауны моллюсков (mollusca) окрестностей города Оренбурга // Изв. Оренбургского отд. ИРГО. 1912. - Вып. XXIII. - С. 23-25.

19. Воронцовский П.А. Материалы к познанию моллюсков окрестностей г. Оренбурга // Тр. Общества изучения Киргизского края. 1922. -Вып.Ш. - С. 31-39.

20. Галаев И.Ю., Маттиассон Б. Новые методы аффинной очистки белков // Биохимия. 1997. - Т. 62, вып. 6. - С. 669-676.

21. Гинодман Л.М. Хроматография белков на ионообменниках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом. // В кн.: Современные методы в биохимии. 1964. - Т. 1. -С. 37-73.

22. Данилов С.Н., Плиско Е.А. Изучение хитина // Журнал общей химии.- 1954. T. XXIV, вып. 10. - С. 1761-1769.

23. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - Т. 1. - 387 с.

24. Догель В.А. Зоология беспозвоночных животных. М.: Высш. шк. -1975.-560с.

25. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.-544 с.

26. Ермольева 3.В. Лизоцим // Успехи современной биологии.- 1938. Т. 9,№ 1. - С. 5-8.

27. Ермольева З.В. Лизоцим //Антибиотики, интерферон, бактериальные полисахариды. -М.: 1968. С. 169-182.

28. Жадин В.И. Пресноводные моллюски СССР. ОГИЗ, Ленснабтехиздат, 1933. - 200 с.

29. Жадин В.И. Моллюски пресных вод СССР. М., Л.: Изд-во АН СССР. - 1952. - 450 с.

30. Жужиков Д.П., Ульченко В.М. Лизоцим термитов. // Тр. энтомол. сектора. М., Л.: 1972. - Вып. 2. - С. 179-185.

31. Захарова И.Я., Павлова И.Н. Литические ферменты микроорганизмов. Киев: Наукова думка. - 1985. - 216 с.

32. Игнатович В.Ф., Подборонов В.М. Изучение действия лизоцима, выделенного из некоторых видов иксодовых клещей, на Rickettsis prowazcki, R.canada, R.sibirica. II Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1974. - Т. 49, № 6. - С. 16-22.

33. Каграманова К.А., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима // Антибиотики. 1966. - Т. 11,№ 10-С. 9117-9119.

34. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. -СПб: Наука, 1999.- 162 с.

35. Костантино Г.Р., Швендеман С.Р. Лангел Р., Клибанов A.M. Повреждение препаратов лиофилизированных белков // Биохимия. -1998. Т. 63, вып. 3.

36. Кравченко H.A. Источники, методы выделения, строение и ферментативные свойства лизоцима // В кн.: Биологическая роль лизоцима и его лечебное применение. Караганда. - 1972. - С. 117-119.

37. Кравченко H.A., Клеопина Г.В., Каверзнева Е.Д. Выделение и обессоливание продуктов модификации лизоцима йодуксусной кислотой // Биохимия.- 1965. Т. 30, вып. 3 - С. 534- 542.

38. Купер Э. Сравнительная иммунология. М.: Мир, 1980. - 422 с.

39. Лахтин В.М., Костанова Е.А., Арбатский Н.П. Очистка и характеристика множественных форм лизоцима латекса папайи. // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - Т. 31, № 2. - С. 247254.

40. Леонтьев В.В. Влияние точечных аминокислотных замен на структуру и функцию лизоцима бактериофага Т4 идигидрофолатредуктазы Е. соИ. II Дисс. канд. биол. наук. РАН, Институт белка, Пущино. - 1992. - 104 с.

41. Ломакин М.С. Иммунобиологический надзор. М.: Медицина, 1990. -256 с.

42. Мартынова Е.Г. Бентос реки Урал в районе Оренбурга. // Гидробиологический журнал. 1967, № 3. - С. 66-69.

43. Мартынова Е.Г. Зообентос. // В кн.: Гидробиология реки Урала. -Юж-Урал кн. изд-во. 1971. - С. 78-99.

44. Монцевичюте-Эрингене Е.В. Упрощенные матиматико-статистические методы в медицинской исследовательской работе. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1964, № 4.-С. 71-78.

45. Мориг В., Месснер Б. Значение лизоцима в антибактериальном иммунитете насекомых. // Журнал общей биологии. М. - 1969. - Т. 30, № 1. - С. 62-72.

46. Немцева Н.В. Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов // Автореф. дисс. доктора, мед. наук. Челябинск. - 1998. -38 с.

47. Нечаева Э.А., Падерина Е.М. Лизоцимная активность у стафилококков различного происхождения и бактериоциногенность // Антибиотики. 1974. - Т. 19, № 8. - С. 724-727.

48. Никитина Л.П., Кононова В.М., Мартынова Е.Г. Моллюски р. Урала и его притоков // Гидробиологический журнал. 1974. - Т. X, № 2. - С. 76-79.

49. Определитель пресноводных беспозвоночных СССР (планктон и бентос). Л.: Гидрометеоиздат, 1977. - 360 с.

50. Павловский П.Е., Черкасов И.А., Чикина Н.С. Исследование содержания и некоторых свойств лизоцима в тканях органов убойного скота // Прикладная биохимия и микробиология. 1976. - Т. 12, вып. 1.1. С. 134-137.

51. Перри С., Амос Р., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974. - 260 с.

52. Подборонов В.М., Степанченок Г.И., Гроховская И.М. Изучение антибактериального действия кишечника и гемолимфы клещей1.odoidea: сообщение I // Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 1972.-Т. 41, № 4. - С. 468-571.

53. Подборонов В.М., Степанченок-Рудник Г.И., Гроховская И.М. Изучение антибактериального действия органов и тканей клещей надсемейства Ixodoidea: сообщение II // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1972. - Т. 41, № 5. - С. 577-581.

54. Подборонов В.М., Степанченок-Рудник Г.И., Гроховская И.М. Изучение антибактериального действия органов и тканей клещей Hyalomma asiaticum (Ixodoidea) II Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1974. - Т. 43. - С. 715-719.

55. Подборонов В.М., Степанченок-Рудник Г.И., Гроховская И.М. Изучение антибактериального действия органов и тканей клещей Alveonasus lahorensis 11 Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1975. - Т. 44, № 1. - С. 20-24.

56. Подборонов В.М., Гроховская И.М. Изучение антибактериального действия органов и тканей клещей Hyalomma dromedarii, Hialomma anatolicum, Ixodes persulcatus II Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1975. - Т. 44, № 5. - С. 545-549.

57. Подборонов В.М., Гроховская И.М., Степанченок-Рудник Г.И. Получение и свойства бактерицидного вещества, выделенного из клещей Ornithodoros papillipes II Медицинская паразитология. 1975. -Т. 44, №6.-С. 716-719.

58. Подборонов В.М. Действие лизоцимоподобного вещества клещей на патогенные микроорганизмы // Тез. докл III Всесоюз. совещания по теор. и прикл. акарологии. Ташкент. - 1976. - С. 193-194.

59. Подборонов В.М., Степанченок-Рудник Г.И. О бактерицидном факторе членистоногих {Arthropoda) II Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1977. - Т. 46, № 1. - С. 92-99.

60. Подборонов В.М., Ревина Т.А., Гроховская И.М., Журавлева Т.П., Финник В.П. Некоторые биохимические свойства лизоцимов аргасовых клещей. // Медицинская паразитология. 1978 .- № 5. - С. 96-99.

61. Подборонов В.М., Бондаренко В.М., Гроховская И.М., Журавлева Т.П., Ревина Т.А., Курбатова И.А. Изучение действия лизоцима аргасовых клещей на клетки линии Нер-2 // Антибиотики. 1978. - № 8,- С. 726-731.

62. Подборонов В.М., Гроховская И.М., Подборонов A.M. Сравнительное изучение бактерицидного действия организма клеща О. Papillipes II Паразитология. 1978. - Т. 12, № 5. - С. 400-405.

63. Подборонов В.М., Игнатович В.Ф., Гроховская И.М. Действие одного из факторов защиты клещей (лизоцима) на риккетсии // Вопросы риккетсиологии / Сб. статей. М,- 1978. - С. 22-23.

64. Подборонов В.М. Изучение антибактериального действия кишечника клещей О. papillipes Birula II В сб.: Развитие паразитологической науки в Туркменистане. Ашхабад: Ылым, 1979. - С. 150-155.

65. Подборонов В.М. Изучение биологической активности лизоцимов различного происхождения // Антибиотики. 1982. - Т. 31, № 10. -С. 50-54.

66. Подборонов В.М., Бондаренко В.М., Евдокимов В.В. Иммунные реакции организма клещей О. papillipes на введение бактерий и фагов // Паразитология. 1982. - Т. 16, № 3. - С. 238-241.

67. Подборонов В.М., Цветков B.C. Изучение имунологической специфичности лизоцимов различного происхождения // Антибиотики.- 1985.-Т. 31, №8.-С. 598-600.

68. Подборонов В.М., Бердыев А. Защитные механизмы иксодоидных клещей и их прокормителей. Ашхабад: Ылым, 1991. - 240 с.

69. Покидова Н.В., Бабаян С.С., Журавлева Т.П., Ермольева З.В. Химические и физико-химические свойства лизоцима человека // Антибиотики. 1974. - Т. 19, № 8. - С. 721 -724.

70. Порядина С.Н. Альгофлора реки Урал и ее притоков // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ташкент. - 1973 . - 34 с.

71. Раимова Е.К. Характеристика зоопланктона верхнего и среднего течения реки Урала // В кн.: Животный мир Южного Урала и Северного Прикаспия, Оренбург. 1984. - С. 35-37

72. Раимова Е.К., Марусенко М., Михеев М. Характеристика зоопланктона среднего течения р. Урал в районе города Оренбурга / Материалы 55-ой итоговой Научно-практической конференции студ. науч. общ.-ва им. Ф.М. Лазаренко Оренбург. - 2000. - с. 97.

73. Рамад Ф., Основы прикладной экологии. Л: Гидрометеоиздат, 1981.- 544 с.

74. Реброва Р.Н., Горохов В.И. О лизоцимной активности грибов рода Candida II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1983.-№3. С. 45-46.

75. Ревина Т.А., Журавлева Т.П., Подборонов В.М., Гроховская И.М. Выделение лизоцима из клещей Alveonasus lahorensis (Argasidae)

76. Медицинская паразитология. 1977. - № 4. - С. 418-420.

77. Ревина Т.А., Подборонов В.М., Сычева И.М. Определение изоэлектрической точки лизоцимов, выделенных от разных видов клещей // Медицинская паразитология. 1980. -N 2. - С. 33-35.

78. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Л.: Наука, 1974. - 194 с.

79. Савельев Е.П., Петров Г.И., Шмакова З.Ф., Битко С.А. Выделение и характеристика эндо-Ы-ацетилмурамидазы, продуцируемой Actinomyces levoris // Биохимия. 1980. - Т. 45, вып. 2. - С. 329-336.

80. Скопцова Т.Н. Роль зообентоса в самоочищении воды водохранилища / В кн.: Самоочищение воды и миграция загрязнений по трофической цепи. -М.: Наука, 1984. С.81-85.

81. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358с.

82. Соловых Г.Н., Бритвина Е.И., Дедков Э., Соловых Д.И. Лизоцимная активность гидробионтов реки Урал. // В сб.: Водные экосистемы Урала, их охрана и рациональное использование. Изд-во УРО РАН СССР и ВГБО. - Свердловск.- 1989. - С. 129-130.

83. Соловых Г.Н. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов // Дисс. д-ра биол. наук. Челябинск. - 1995. - 216 с.

84. Страйер Л., Биохимия. М.: Мир, 1984 (T.I, 287с.).

85. Унифицированные методы исследования качества вод // Совещание руководителей водоохранных органов стран членов СЭВ, ч.Ш. -Микробиологические методы. - М. - 1985. - 205с.

86. Флоренсов В.А., Пестова И.М. Очерки эволюционной иммуноморфологии. Иркутск: Изд-во Иркутск, ун-та. - 1990. - 248 с.

87. Черкасов И.А., Кравченко H.A., Каверзнева Е.Д. О хроматографическом поведении лизоцима на колонке с хитином // Докл. АН СССР. 1966. - Т. 170, № 1. - С. 213-215.

88. Черкасов И.А., Кравченко H.A. О некоторых особенностях сорбционного взаимодействия лизоцима с хитином // Биохимия. 1968.- Т.ЗЗ, вып.4.- С. 761-765.

89. Черкасов И.А., Кравченко H.A. Усовершенствованный способ выделения лизоцима методом фермент-субстратной хроматографии //Биохимия. 1969. - Т. 33, № 5. - С. 1089-1091.

90. Чуракова Н.И., Черкасов И.А., Кравченко H.A. О роли остатка триптофана-62 в структуре и функции лизоцима // Биохимия. 1977. -Т. 42, вып.2. - С. 274-276.

91. Шевкунова B.C. Фагоцитарные реакции и бактерицидное действие гемолимфы насекомых // Изв. Сибирского отделения АН СССР. Сер. паразитол. 1968. - № 5. - С. 90-94.

92. Щербак В.П., Ромашева Л.Ф., Видомский Э.Р. Защитные реакции гемолимфы клопов // Изв. АН Кирг. ССР. 1972. - № 4. - С. 76-79.

93. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - 567с.

94. Aksnes L., Grov A. Studies on the bacteriolytic activity of Streptomyces albus culture filtrates. 2.Affmity chromatography for chitin // Acta Chem. Scand. B. 1974. - V. 28, № 2. - P. 221-224.

95. Anigstein L., Whitney D.M., Mick D.W. Antibakterial activity of a substance present in ticks (Ixodoidae) of Texas // Nature. 1950. - V. 166. -P. 141-145.

96. Brehelin M., Greenberg B. Galmonella in the american cooroach outcome of natural invasion of the hemocel // J. Med. Entomol. 1977. - V. 14, № 3. -P. 326-366.

97. Carayon J. Les cellules capables de phagocytose chez les insects // Ann. Parasitol. et Comt. 1977. - V. 52, № 1. - P. 63-65.

98. Carballal M. J., Azevedo C., Villalba A., Pez C.L. Enzyme characterisation of the circulating haemocytes of the carpet schell clam, Ruditapes decussatus (Mollusca: bivalvia) // Fish & Shellfish Immunology.- 1997. V. 7, № 8, p. 595-608.

99. Capellato M., Narpossi A. Fattori di immunita aspecifica nellamolimfa di Bombyxmori //Bull. 1st. Sicdroteah., Milano. 1960. - V. 39.- P. 40-73.

100. Carton Y. La reaction d immunité cellulaire (capsule hemocytaire) chez un insecte, en fonction de la region du corps // Ann. Parasitol. et Comt. 1977. -V. 52, № 1. -P. 59-61.

101. Chorine V. Immunité antitoxique chez chenilles de Gallería mellonella // Ann. Inst. Pasteur. 1929. - V. 43, № 7- P. 955-958.

102. Chung J.C. et al. Purification and properties of a bacteriolytic enzyme from a soil amoeba Hartmanella glebae // Arch. Biochem. Biophys. 1969. - V. 135.-P. 244-252.

103. Croizier G., Odier F. L immunité antiviral chez les insectes // Ann. Parasitol. et Comt. 1977. - V. 52, № 1. - P. 89- 91.

104. Dolp R.M. Biochemical and physiological studies of certain ticks (Ixodoidea): Quantitative studies of hemocytes //J. Med. Entomol. 1970. -V. 7, № 3. - P. 277-288.

105. Duncan J.T. On a bactericidal principle presant in the alimentary canal of insects and arachnids // Parasitology. 1926. - V. 18, № 2. - P. 238-252.

106. During K., Porsch P., Mahn A., Brinkmann O., Werner G. The non-enzymatic microdicidal activity of lysozymes // FEBS letters. 1999. -V. 449, issue 2-3.-P. 93-100.

107. Flemming A. On a remarcable bacteriolytic element found tissues and secretions // Proc.Roy.Soc. 1922. - Bd. 93. - S. 306-317.

108. Frings H., Goldberg E., Arentzen J.C. Antibacterial action of the blood of the large milkweed bug // Science. 1948. - V. 108, № 4. - P. 689-690.

109. Ghuysen J.M. Acetylhexosamine compounds enzymically released from Micrococcus lysodeikticus cell walls.II Enzymatic sensitivity of purified acetylhexosamin and acetylhexosaminepeptide complex // Biochem. Biophys. Acta. 1960. - V. 40, №3.-P. 462-472.

110. Glaser R.W. On the existence of immunity principles in insects // Psyche. Cambridge. 1918. - V. 25. - P. 179-194.

111. Goetz P., Roettgen I., Lingg W. Encapsulman humoral en tant que reaction de defence chez les Dihteres // Ann. Parasitol. et Comt. 1977. - V. 52, № 1. - P. 95-97.

112. Hoffmann D. Données experimentales sur la protection (Immunité acquise) contre Bacillus thuringiensis chez des Imagos males de Locusta migratoria L.(Orthoptere) // C.R. Acad. Sei. 1972. - V. 244. - P. 11091122.

113. Hoffmann D., Brehelin M., Hoffmann J.-A. Premiers résultats sur les reactions de defense antibacteriennes de larves et d imagos de Locusta migratoria II Ann. Parasitol. et Comt. 1977. - V. 52, № 1. - P. 87-88.

114. Howard J.B., Glazer A.N. Studies of the Physicochemical and Enzymatic Properties ofpapay lysozyme. // J. of Biological Chemistry. 1967. - V. 242, №24. -P. 5715 - 5723.

115. Hultmark D. Immune reaction in Drosophila and other insects: a model for innate immunity // Trends in Genetics. 1993. - V. 9, № 5. - P. 178-182.

116. Ioshimoto T., Hayashida S., Tobishi M. et al. Purification of serval bacteriolytic enzymes by affinity chromatography on lisozyme-lysate of Micrococcus lysodeikticus cell wall couple with Shepharose // J. Biochem. -, 1975 V. 78, № 2. - P. 253-259.

117. Jocquet J.P., Saint-Blancard J., Jolies P. Apparent affinity constants of lysozymes from different origins for Micrococcus lysodeikticus cells // Biochim. et biophys. Acta. 1968. - V. 167, № 1. - P. 150-153.y

118. Jolies P., Jolies J. Lysozyme from human milk // Nature. 1961. - V. 192.- P.1187

119. Jolies P. Rapports entre la structure et 1 activité de quelques lysozymes //Bull. Soc. Chim.Biol. 1967. - V. 49, № 8. - P. 1001-1012.

120. Jolies P. Relations hip between chemical structure and biological activity of hen-egg-wite lysozyvt and Lysozymes of different species // Proc. Roy. Soc. 1967. - N1009. - P. 350-354.

121. Klowden M.J., Greenberg B. Galmonella in the american cooroach outcom of natural invasion of the hemocel // J. Med. Entomol. 1977. - V. 14, № 3.- P. 326-366.

122. Koch G., Drey er W. Characterization of an Enzyme of Phage T2 as a lysozyme // Vyrology. 1958. - № 6. - P. 291.

123. Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polipeptides // Journal of Immounological Methods. 1991. - 137. - P. 167-173.

124. Linliolm W.A. Zur Molluskenfauna der Qouvernemants Koursk unal Orenbourg // Extrait de 1 Annuaire du Museeque Zoologicpit de 1 Academie Imperial des Sciences de St.-Petersb. 1903. - V.VIII. - P.23-25

125. Malek E.A., Cheng T.C. Medical and Economic Malacology. Academie Press. Publ., New York et Londres. - 1974. - 398c.

126. Malke H. Wirkung von Lysozym auf die Symbioten der Blattiden // Z. allgem. Microbiol. 1964. - Bd. 4. - S. 88-91.

127. Malke H. Uber des Vorcommen von Lysozym in Insekten // Z. allgem. Microbiol.- 1965. Bd. 5, № 1. - S. 42-47.

128. Matz G. Reaction d immunité cellulaire apres implantation de cellophan et dans la tumorigenese chez les insectes // Ann. Parasitol. et Comt. 1977. -V. 52, № 1. - P. 68-69.

129. Messner B. Das Lysozymvorkommen in Beziehung zur inspezifischen Immunitat der Insekten // Zool. Anz. 1966. - Bd.29, Suppl. - S. 511-521.

130. Mohrig W., Messner B. Lysozym im humoralen Abwehrmechanismus Spezifisch und anspezifisch immunisierter Insectelarven // Biol. Rasch. -1967.-Bd.5.-S. 181-183.

131. Mohrig W., Messner B. Antibacterielles Abwehrsystem im Darmtrakt von Insekten // Biol. Rasch. 1968 - Bd.6. - S. 136-138.

132. Munôz E., Ghuysen J.M., Leyh-Bouille M. et al. Structural variations in bacterial cell wall peptidoglycans studiend with Streptomyces Fl endo-N-acetylmuramidase // Biochemistry. 1966. - V. 5, № 10. - P. 3091-3099.

133. Nakahara H., Bevelander G. Ingestion of particulate matter by the outre surface celles of the molluse mantle // J. Morph. 1967. - V. 122. - P. 139.

134. Norman A. a. Richard S. Multiple genes for lysozyme in birds // Arch. Bioch. a. Biophys. 1970. - V. 141, № 2. - P. 656.

135. Okada S., Kitahata S. Purification and some properties of bacterial lysozyme // J. Ferment. Technol. 1973. - V. 51, № 10. - P. 705-712.

136. Osserman E. F. et al. Preliminary Crystallographic Data on Human Lysozyme. // J. of Molecular biolodgy. 1969. - V 46, № 1, P. 211-212.

137. Petit J.F., Jolies P. Purification and analysis of human saliva lysozyme. //Nature. 1963. - V. 200. - P. 168-169.

138. Prager E.M., Wilson A.C. Multiple Lysozymes of Duck Egg White //Journ. Biol. Chem. 1971. - V. 246, № 2. - P. 523-530.

139. Ratchiffe N.A., Rowley A.F. Cellular defense reaction of insect hemocytes in vitro: Phagocytosis in a new auspension culture system // J. Invertebr. Pathol., 1975, V.26, № 3, P. 225-233.

140. Reade P., Reade E. Phagocytosis in invertebrates. II. The clearence of carbon partycles by the clam, Tridacna maxima // J. Ret. Soc. 1972. - № 12.-P. 349-358.110

141. Schumacher H. Darmakanal und Verdanung bie stechuckenlarven // Z. Angew. Entomol. 1950. - Bd.69. - S. 390-438.

142. Schumacher H. Neue Erkenntnisse über die Biochemie des Lysozyms und ihre klinische Bedeutung fur Augenheilkunde // For Fortschr. Augenheilk. -1958. Bd. 8, №2. - S. 142-211.

143. Stuart A.E. The reticoloendothelial apparatus of the lesse octopus, Eledone cirrosa // J. Path. Bact. 1968. - V. 96. - P. 44.

144. Taylor P.W. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum agenst gramnegative bacteria // Microbiogical Reviews. 1983. - V. 47, № 1. - P. 46-83.

145. Thompson R. Lysozyme and relation to antibacterial properties of various tissues and secretions // Arch. Path. 1940. - V. 30. - P. 1036-1134.

146. Tripp M.R. The fate of foreign materials experimentally introduced into the sneil, Australorbis glabratus // J. Parasitol. 1961. - V. 47. - P. 745-753.

147. Tripp M.R. Immunity in invertebrates // Aspects of the Biology of Simbiosis /Ed.: Th. C. Cheng.- Baltimore; University Park Press. 1971. -P. 275-281.

148. Vey A. Etude in vitro reactions hemocytaires dinvertebrés et de leur sensibilité a certaines influances biochemiques // Ann. Parasitol. Hum. et Comp. 1977. - V. 52, № 1. - P. 75-77.

149. Выражаю благодарность своему первому руководителю доктору биологических наук, профессору

150. Галине Николаевне Соловых за неоценимую помощь и поддержку, оказывавшиеся мне на всех этапах работы.

151. Зав. кафедрой, доктор медицинских наук.у^академик РАН, профессор £ /У ^.В. Бухарин/

152. Кандидат биологических наук, / Jдоцент /Е-А* Михайлова/

153. Кандидат медицинских наук,доцент /И.Н. Чайникова/t^L^e tLAipluu VU^C A y

154. Зав. кафедрой, доктор медицинских наук, профессор

155. Кандидат биологических наук, доцент

156. Кандидат биологических наук, ассистент1. В.П. Твердохлиб/1. М.М. Павлова/1. E.H. Лебедева/