Комплексный подход в разработке генотерапевтического препарата на примере ВДКН тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Глазова Ольга Владимировна

• Глазова Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Глазова Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение коры надпочечников

1.2. ВДКН, описание патологии

1.3. Существующие подходы к терапии ВДКН. Генотерапия ВДКН

1.4. Подбор тканеспецифичных серотипов ААВ

1.5. Тканеспецифичные промоторы

1.6. Кодон-оптимизация

1.7. Существующие клеточные модели ВДКН

1.7. Описание мышиной модели - видоспецифичные отличия между мышью и человеком

1.8. scRNA-seq как метод глубокого анализа клеточных типов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Дизайн новых капсидных белков AAV

2.2. Дизайн последовательностей химерных промоторов

2.3. Дизайн кодоноптимизированной последовательности гена CYP21A2

2.4. Создание генетических конструкций

2.4.1. Создание баркодированных трансферных плазмид

2.4.2. Создание репортерных плазмид, несущих кассету экспрессии GFP под химерными промоторами

2.5. Сборка AAV векторов

2.6. Создание и наработка лентивируса

2.7. Клеточные линии

2.7.1. HEK293T, HEK293T-SF1, Huh

2.7.2. Адренокортикоподобные клетки L.MSC-SF1

2.8. Мышиная модель CD1-C57BL/10SnSlc-H-2aw18/H-2b

2.9. Анализ стероидного профиля

2.10. Внутривенная инъекция препаратов вирусов

2.11. Забор органов животных для анализа биораспределения вирусов

2.12. Выделение нуклеиновых кислот из органов

2.13. Оценка количества вирусных геномов

2.14. Оценка уровня экспрессии

2.15. Секвенирование

2.16. Иммунофлуоресцентный анализ

2.16.1. Клеточные линии

2.16.2. Иммуногистологическое окрашивание тканей

2.17. Подготовь библиотек для scRNA-seq

2.18. Биоинформатический анализ

2.18.1. Анализ результатов секвенирования библиотек химерных вирусных векторов

2.18.2. Биоинформатический анализ транскриптомов единичных клеток надпочечников мышей

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выбор серотипа ААУ с наибольшей тропностью к надпочечникам

3.1.1. Анализ тропности различных серотипов к надпочечникам и печени мышей

3.1.2. Анализ тропности различных серотипов AAV к другим органам мышей

3.2. Создание высокоэкспрессионного тканеспецифичного промотора для надпочечников

3.2.1. Анализ активности промоторов первого поколения в надпочечниках и печени мышей

3.2.2. Создание адреноподобных клеточных линий

3.2.3. Анализ активности промоторов второго поколения на адреноподобных клеточных линиях

3.2.4. Анализ активности промоторов второго поколения in vivo

3.3. Кодон-оптимизация последовательности гена CYP21A2

3.4. Характеризация мышиной модели CD1-C57Bl/10SnSlc-H-2aw18

3.4.1. Анализ жизнеспособности

3.4.2. Физиологическая характеристика

3.4.3. Анализ результатов секвенирования транскриптомов единичных клеток надпочечников

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексный подход в разработке генотерапевтического препарата на примере ВДКН»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Наследственные заболевания опосредованы мутациями в геноме, и специфика таких болезней в том, что патологическая симптоматика будет прямо коррелировать с функционалом поврежденного участка генома и затрагивать те ткани и органы, в которых этот участок принципиально значим. Наиболее простым и эффективным подходом терапии рецессивных моногенных патологий (в тех случая, когда это возможно) является доставка нормальной копии поврежденного гена с помощью вирусных векторов. Область вирус-опосредованной терапии активно развивается в последние годы, что связано как с увеличением знаний о генетических причинах различных патологий, так и с разработкой все лучших вирусных векторов. Терапия с помощью адено-ассоциированных вирусов (AAV) активно используется в направлении лечения генетически детерминированных болезней, в частности, на ресурсе clinicaltrials.gov при запросе "AAV" в поисковом поле "Others" на середину 2024 зарегистрировано 290 клинических испытания препаратов на основе ААВ-векторов для таких заболеваний, как Амавроз Лебера, Синдром Ушера, гемофилия тип В и многих других [1]. Актуальность разработки подобного рода препаратов наглядно демонстрирует количество капитала, инвестируемого в такие разработки. Ожидается, что сегмент генной терапии достигнет 4,1 млрд долларов США к 2032 году (Рис. 1).

. . . ■ I I I I I I М

2021 2022 2023 2024 2025 2026 2027 202Й 2029 2030 2031 2032

■ Opthalmic disorders ■ Muscular/Neuromusculardisorders

■ Inflammation and fibrosis ■ Other therapeutic areas

Рисунок 1. Рынок терапевтических препаратов на основе аденоассоциированных вирусных векторов, прогноз до 2032 года [2].

Несмотря на широкое использование, разработка геннотерапевтического препарата на основе AAV сопряжена как с преимуществами, так и с вызовами. Достоинствами такого подхода являются низкая иммуногенность вирусного капсида, относительная простота производства, широкий спект трансдуцируемых тканей. В свою очередь, ограничения использования рекомбинантных вирусных векторов следующие:

- наличие предсуществующего популяционного иммунитета против известных вирусных капсидных белков. По этой причине препараты, созданные на основе вирусов диких серотипов не могут быть применимы для пациентов, имеющих нейтрализующие антитела.

- низкая ёмкость вирусной частицы. Некоторые пораженные гены могут быть достаточно протяженными (например, ген дистрофина), и превышать ограничение в 4 тыс. п.н., способных упаковываться в AAV-частицу. Это ограничивает разработку препаратов, делая необходимым дополнительные исследования по уменьшению размеров генов или возможности упаковки одного гена в несколько вирусных частиц.

- низкая тканеспецифичность AAV. При невозможности локальной доставки препарата в пораженный орган, основным способом доставки его в организм становится интравенозная системная инъекция. Такой способ приводит к широкому распространению вируса по организму и трансдукции большого количества тканей, в частности, большая часть вирусных частиц "оседает" и затем выводится печенью. Это, в свою очередь, снижает абсолютное количество препарата в нужном органе, увеличивает иммуногенность, что снижает терапевтический эффект, увеличивает побочные эффекты, и приводит к необходимости увеличивать дозу препарата.

Более того, технически зачастую проверка терапевтического эффекта и биобезопасности вирусного препарата затруднена отсутствием или ограничением имеющихся моделей - клеточных, органоидных и животных. Клеточные модели частно не воспроизводят весь необходимый молекулярно-физиологический

контекст патологии, органоиды слишком трудоёмки для разработки, и на текущий момент существует ограниченное число тканевых систем, воспроизведённых в 3D культурах.

Из животных моделей на этапе ранней разработки генотерапевтических препаратов в подавляющем большинстве случаев используются мышиные модели. На сегодняшний день существуют нокаутные модели практически для любых патологий, однако не всегда ортологи и генные структуры достаточно гомологичны между мышью и человеком. Низкий процент гомологии приводит к сложностям в анализе получаемых данных и экстраполяции их на человека.

Таким образом, разработка препарата на ранней стадии включает в себя большой объем исследовательской работы, результаты которой, в конечном итоге, имеют не только практическое применение, но и дают фундаментальные научные знания. Практическая значимость разработки заключается в создании потенциально эффективного и безопасного метода лечения генетических заболеваний, многие из которых ранее считались неизлечимыми. Фундаментальная значимость связана с углублением понимания молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе патологий, а также с развитием новых биотехнологий и методов генетической инженерии. Эти исследования могут открыть новые горизонты в биологии и медицине, способствуя дальнейшему прогрессу в разработке инновационных терапевтических подходов (Рис. 2).

Рисунок 2. Основные и сопутствующие компоненты, необходимые для разработки, проверки и производства генотерапевтического препарата.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является разработка элементов генотерапевтического препарата для лечения ВДКН.

Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработка и выбор химерного серотипа AAV, обладающего повышенной тропностью к надпочечникам

2. Разработка и выбор химерного промотора, обладающего повышенной активностью и специфичностью для надпочечников

3. Разработка кодон-оптимизированной последовательности гена CYP21A2 для экспрессии в надпочечниках

4. Характеризация мышиной модели ВДКН на уровне транскриптомов единичных клеток коры надпочечников.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработка новых капсидов вирусов для AAV, является одной из ключевых научно-практических задач в области генной терапии. С ростом числа

генотерапевтических препаратов на основе AAV возникает необходимость создания капсидов с улучшенными характеристиками, такими как снижение иммуногенности, повышение тканеспецифичности, увеличение емкости для доставки более крупных генов и снижение токсичности. В рамках данной работы были созданы и проверены новые серотипы AAV-векторов, обладающие уникальными свойствами. В частности, впервые были разработаны вектора sAAB2 и sAAB3, обладающие преимущественной экспрессией в ткани надпочечников.

Промоторы играют ключевую роль в специфичности и эффективности генотерапевтических препаратов, поскольку они определяют, в каких клетках и с какой интенсивностью будет происходить экспрессия целевого гена. Разработка промоторов с улучшенными характеристиками способствует не только созданию более эффективных и точных методов терапии, но и углубляет наше понимание механизмов регуляции генов на молекулярном уровне, что имеет широкие фундаментальные и прикладные значения. В работе впервые были сконструированы и протестированы химерные промоторы, обладающие преимущественной активностью в тканях надпочечников.

Оптимизация кодонов - это процесс изменения нуклеотидных последовательностей гена для улучшения его экспрессии в конкретной клеточной системе. Это направление исследований позволяет лучше понять, как последовательность нуклеотидов влияет на процесс трансляции и работу геномной машины в целом. Кодон-оптимизация может существенно повысить эффективность терапии, обеспечивая более высокие уровни экспрессии терапевтических генов и, соответственно, улучшая терапевтический результат. На основе данных секвенирования транскриптомов единичных клеток коры надпочечника человека разработана кодон-оптимизированная последовательность гена CYP21A2, показана сравнимая с геном дикого типа активность новой последовательности в клеточной линии HEK293T.

Исследование клеточных и животных моделей на детальном, молекулярном уровне позволяет раскрыть новые механизмы функционирования биологических

систем. Эти модели являются неотъемлемой частью разработки генотерапевтических препаратов, так как они позволяют оценить терапевтический эффект, биобезопасность и возможные побочные реакции новых препаратов. В рамках данной работы впервые была охарактеризована в онтогенезе мышиная модель CD1-C57Bl/10SnSlc-H-2aw18, показаны особенности изменения её гормонального статуса в течение жизни, показаны сходства и различия протекания данной патологии у мышей и людей. Также впервые проведен анализ транскриптомов единичных клеток надпочечников мышей трех генотипов (Cyp21a1-/-, Cyp21a1+/-, Cyp21a1+/+), показаны особенности молекулярных процессов синтеза холестерола, стероидогенеза и обновления ткани надпочечников в норме и при патологии.

Методология и методы исследования

В работе использованы классические методы молекулярного клонирования и работы с нуклеиновыми кислотами. Также были использованы стандартные методы сборки лентивирусных векторов, вирусные вектора на основе AAV собирались по протоколам, разработанным в лаборатории геномной инженерии МФТИ. Все работы с культурами клеток эукариот производились в асептических условиях. Все работы с животными производились на базе Вивария факультета фундаментальной медицины МГУ в соответствии с правилами работы с животными. Секвенирование следующего поколения и секвенирование методом Сенгера, а также масс-спектрометрический анализ производились на сторонних площадках. Биоинформатический анализ данных осуществлялся командой Центра живых систем МФТИ с использованием биоинформатических инструментов, написанных на языке программирования R. Положения, выносимые на защиту

1. Серотипы sAAB2 и sAAB3 являются наиболее тропными к тканям надпочечника мыши.

2. Prom4v2 является наиболее тканеспецифичным для экспрессии трансгена в надпочечниках мыши и на клеточных моделях.

3. Кодон-оптимизированная последовательность гена CYP21A2 является подходящей для использования в качестве трансгена при доставке с помощью ААВ

4. Мышиная модель CD1-C57Bl/10SnSlc-H-2aw18 демонстрирует увеличение количество кортикостерона с возрастом, нарушения в клеточной структуре ZF, нарушения процессов обновления надпочечников и синтеза холестерола.

Степень достоверности и апробация результатов работы Результаты были получены с использованием современных методов молекулярной биологии и биоинформатики, на современном оборудовании, со всеми необходимыми контролями. По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МФТИ по специальности 1.5.3 - Молекулярная биология, а также получен 1 патент. Личное участие автора

Личный вклад автора заключается в работе с литературными источниками, планировании и проведении экспериментов, организации работы научных групп, анализе полученных результатов, подготовке материалов к печати и написании диссертационной работы. Основные результаты диссертационной работы получены лично автором или при его непосредственном участии. Имена всех соавторов указаны в опубликованных работах или отражены в тексте работы. Воронцова М.В. осуществляла научное и медицинское консультирование работы. Работа по анализу биоинформатических данных и экспериментам scRNA-seq производилась совместно с Максимовым Д.О., Девяткиным А.А., Казиахметовой С.А., Авсиевич Е. работа по постановке экспериментов по новым промоторам производилась совместно с Локтевой А.И., Крокуновой Т.Е. и Оняновым Н.А., работа по разработке новых серотипов AAV производилась совместно с Асаад В..

Структура и объём работы

Диссертационная работа изложена на 130 страницах и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Благодарности, Список использованной литературы, Дополнительные материалы. Рукопись включает 10 таблиц и 31 рисунка. Список литературы содержит 121 источник. Дополнительные материалы включают 7 приложений.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение коры надпочечников

Надпочечник - парная железа внутренней секреции, расположенная в забрюшинном пространстве над верхним полюсом почки [3]. Морфологически и функционально надпочечник подразделяется на внутреннее мозговое вещество (медула) и внешнее корковое вещество (кортекс, кора). Эти структуры имеют различное эмбриональное происхождение и, по сути, являются разными железами. Данная работа фокусируется на корковом веществе надпочечников, следовательно далее будет рассматриваться преимущественно эта часть органа.

Корковое вещество надпочечника человека состоит из следующих структур (Рис 3):

• капсула, представляющая из себя стромальную оболочку органа, в которой также располагаются стволовые клетки;

• пучковая зона (ZG), состоящая из клеток, продуцирующих глюкокортикоиды;

• клубочковая зона (ZF), состоит из клеток, продуцирующих минералокортикоидные гормоны;

• сетчатая зона (ZR), продуцирующая в основном андрогены;

Рисунок 3. Слева: поперечный разрез, изображающий три основные зоны надпочечника (капсулу, кору надпочечника и мозговое вещество). Справа: Анатомический эскиз нормального надпочечника взрослого человека с маркерами для каждого типа клеток. Рисунок адаптирован из [4].

Толщина капсулы надпочечника не превышает несколько клеток. Там располагаются нестероидогенные популяции SF1-отрицательных самообновляемых (стволовых: WT1, GLI1, Nestin, RSPO3, TAZ) и стромальных клеток (TCF21). Все эти популяции клеток имеют различную пролиферативную способность и свои особенности взаимодействия с субкапсулярными SF1-положительными клетками-предшественниками [5].

Прилегающий к капсуле слой коры надпочечника называется пучковая зона (zona glomerulosa, zG), клетки которой специализируются на производстве минералкортикоидов. Регуляция работы zG осуществляется посредством ангиотензина II (Ang II) как части ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС). Альдостерон, основной минералокортикоид, регулирует баланс натрия, тем самым контролируя внутрисосудистый объем и артериальное давление. Финальный этап цепи синтеза альдостерона из холестерола осуществляется ферментом альдостерон синтазой, CYP11B2, который, совметстно с SF1 и рецептором к ангиотензину II (AT1R), и является основным маркером клеток zG.

Однако клеточный состав зоны сложнее - помимо гормонпродуцирующих клеток, показано наличие CYP11B2' клеток-предшественников, взаимодействующих с капсулярными клетками. Сигнальные пути - sonic hedgehog (SHH), Wnt, Hippo - взаимно регулируют каждый тип сигнальной активности, и эти отношения имеют решающее значение для поддержания гомеостаза коры надпочечников [6].

Непосредственно прилегающая к zG, zF функционирует в ответ на адренокортикотропный гормон (АКТГ) как часть гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (HPA), производя глюкокортикоиды. Фиксация вторичного мессенджера АКТГ - цАМФ - на регуляторных субъединицах PKA приводит к высвобождению каталитических субъединиц, которые, в свою очередь, фосфорилируют несколько мишеней, включая факторы транскрипции, такие как C/EBP и CREB. Действуя скоординировано с тканеспецифичными факторами, такими как SF1, они стимулируют экспрессию генов, кодирующих ферменты и белки, участвующие в метаболизме, мобилизации и транспорте холестерина [7]. Основным глюкокортикоидом человека является кортизол, за финальную стадию синтеза которого отвечает фермент 11р-гидроксилаза, CYP11B1.

Последней зоной коры надпочечника человека является ZR, где производятся вещества-предшественники андрогенов. При помощи 17-гидроксилирования ферментом CYP17A1 синтезированные в ZF 17-гидрокси-прегненолон и 17-гидрокси-прогестерон превращаются в ДГЭА и андростендион, соответственно. Так же в самой ZR из ДГЭА за счет добавления сульфатной группы ферментом SULT2A1 образуется ДГЭА-С, а при помощи дегидрирования HSD3B2 синтезируется тот же андростендион, который служит матрицей для синтеза тестостерона при помощи восстановления ферментом AKR1C3 и для синтеза 11-гидрокси-андростендиона с помощью 11-гидроксилирования CYP11B1. Далее из тестостерона за счет добавления гидроксильной группы в 11 положение углерода ферментом CYP11B1 образуется 11-гидрокси-тестостерон, либо при помощи 5-альфа-восстановления ферментом SRD5A1 синтезируется дигидротестостерон [8].

Стоит отметить, что структура органа не гомологична среди различных видов млекопитающих. Так, у мышей и крыс кора надпочечников содержит zG и zF, но распознаваемая zR отсутствует за счет отсутствия экспрессии фермента CYP17A1, поэтому кортикостерон является основным секретируемым глюкокортикоидом. В свою очередь кора надпочечников молодой мыши содержит дополнительный слой, известный как X-зона. Функция X-зоны остается спорной, но она может участвовать в катаболизме прогестерона. Кора надпочечников крысы содержит менее выраженный слой — недифференцированную зону (zU), расположенный между zG и zF. zU участвует в адренокортикальном гомеостазе и ремоделировании и может представлять собой переходную популяцию клеток между прогенитоным и стероидогенном фенотипами (Рис.4).

В отличие от лабораторных мышей (род Mus), кора надпочечников иглистых мышей содержит zR и секретирует как кортизол, так и DHEA. В этом отношении надпочечники иглистой мыши имитируют надпочечники человека [9].

Клетки zF и zR хорьков, как и человека, обладают активностью 17а-гидроксилазы, поэтому кортизол является основным глюкокортикоидом, секретируемым надпочечниками этих организмов. У людей кора надпочечников начинает вырабатывать ДГЭА и ДГЭА-С во время адренархе, одновременно с увеличением экспрессии CYB5 в zR. Надпочечники хорьков производят лишь ограниченное количество андрогенов из-за низкой экспрессии CYB5 [10].

Клубочковая зона у собак хоть и имеет ферментативный профиль как у человека, морфологически отличается от других видов и состоит из относительно крупных, уплощенных клеток, которые бледно окрашиваются и собраны в большие петли [11].

Pregnenolone

| , | I HSD3B1 (Hsri3b6) lit! HSD3B2 (n-. ■')

Progesterone

ill! CYP21A2(C 11 -Deoxycorticosterone III CYP11B2 Corticosterone

| CYP11B2

18-OH Corticosterone

||| CYP11B2 Aldosterone

Pregnenolone

I CYP17A1 CYP17A1 \ * +

170H Pregnenolone

| HSD3B2

170H Progesterone

| | CYP21A2

11 -Deoxycortisol

| | CYP11B1 (cypllcl)

Cortisol

D11B2 С HSD11B1 Cortison

Cholesterol StAR mediated transfer | | | | CYP11A1

Pregnenolone

| | HSD3B2 (Hsd3b 1) Progesterone

J | CYP21A2 (Cvp?l a

11 -Deoxycorticosterone

| | CYP11B1 Corticosterone

ЛТ

Progesterone

CYP17A1 || |

170H Progesterone

CYP17A1 || |

Androstenedione

Pregnenolone

I I | CYP17A1 170H Pregnenolone

|| | CYP17A1 DHEA

HSD3B2 , , \SULT2A 1 (cyp17a1) | | 4

DHEA

Androstenedione

Human, Rabbit

Рисунок 4. Известные пути синтеза стероидов надпочечников для обсуждаемых моделей. Предшественники и продукты стероидов выделены жирным шрифтом. Гены и белковые продукты, ответственные за соответствующий этап синтеза, выделены курсивом. Названия генов указаны в человеческом режиме, но если есть ортологичный ген с другим названием, он обозначен в скобках цветом соответствующего вида [12].

1.2. ВДКН, описание патологии

Врожденная дисфункция коры надпочечников - группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных нарушением стероидогенеза в результате дефицита одного из ферментов, участвующих в биосинтезе кортизола и альдостерона. Более 90% случаев этого заболевания ассоциировано с дефицитом фермента 21-гидроксилазы, вызванного мутациями гена СУР21Л2 у человека (Сур21а1 у мыши), [13]. Фермент 21-ОН катализирует синтез кортизола из 17-гидроксипрогестерона (17OHП) и альдостерона из прогестерона, превращая их в соответствующие предшественники - 11-дезоксикортизол и 11-дезоксикортикостерон [14].

Ген СУР21Л2 рaсположен в длинном плече хромосомы 6 (6p21.3), в локусе пгавного комплексa гистосовместимости человек (HLA), регионе, который демонстрирует сложную оргaнизaцию генов с большой вaриaбельностью рaзмерa гета и количествa копий [12, 13]. Примерно в 30 т.п.н. от гета СУР21Л2 нaходится нефункционaльный псевдоген — СУР21Л1Р. И функционaльный ген, и псевдоген

содержат десять экзонов и имеют высокий уровень идентичности нуклеотидных последовательностей: 98% в экзонах и 96% в интронах [14, 15]. Псевдоген СУР21Л1Р неактивен из-за наличия множества патогенных вариантов - небольших вставок или делеций, а также точечных патогенных вариантов, которые препятствуют синтезу функционального белка.

Ввиду близкого расположения гена и псевдогена основной причиной возникновения патогенных вариантов СУР21Л2 считаются события рекомбинации между ними (более чем 95% случаев ВДКН). Примерно 75% опасных вариантов переносятся из псевдогена в ген путём микроковерсии во время мейоза.

В оставшихся 20-25% случаев ВДКН возникает вследствие неравномерного кроссинговера во время мейоза, что приводит к крупным перестройкам локуса -делециям, дупликациям генов и с участием СУР21Л2 и других смежных генов [16, 17]. В редких случаях ВДКН также может быть вызвана однородительской изодисомией [21].

Фенотипически выделяют три формы заболевания в зависимости от тяжести симптоматики. В свою очередь, тяжесть проявления патологии во многом зависит от типа мутаций и остаточной активности 21-ОН, хотя также известно влияние других факторов, таких как гены-модификаторы и возраст [22].

Неклассическая форма

Наиболее мягкий вариант патологии, при котором остаточная активность 21 -ОН превышает 10%, что не приводит к явному дефициту кортизола и альдостерона, и не вызывает характерных симптомов недостаточности надпочечников. Также избыток андрогенов не настолько выражен и не вызывает внутриутробную вирилизацию наружных половых органов у девочек. При неклассической форме дефицита 21-ОН заболевание манифестирует детском возрасте с признаков преждевременного адренархе, умеренного ускорения роста и костного возраста. В пубертатном и взрослом возрасте клинические симптомы значимо проявляются только у женщин и включают гирсутизм, андрогенную дерматопатию, алопецию и нарушения менструального цикла [20, 21, 22].

Для этой формы ВДКН характерны следующие наиболее распространенные мутации: P30L (p.(Pro31Leu)), P453S (p.(Pro454Ser), R339H (p.(Arg340His)), R369W (p.(Arg370Trp)), I230T (p.(Ile231Thr)) и V281L (p.(Val282Leu)) [26]. Так как большинство случаев ВДКН развиваются вследствии наличия двух разных вариантов (компаунд-гетерозигота), то зачастую степень проявления патологических симптомов определяется более лёгким вариантом, даже при наличии мутации, полностью выключающей активность 21-ОН.

Классическая вирильная форма

Если остаточная активность фермента 21-гидроксилазы составляет более 1% (как, например, в случае I172N (p.(Пe173Asn), ^р1), то это обеспечивает достаточную продукцию альдостерона и не вызывает клинических проявлений синдрома потери соли. Среди пациентов с классическим дефицитом 21-гидроксилазы 25% имеют простую вирильную форму. В отсутствие терапии данная форма проявляется мышечной слабостью, утомляемостью, потемнением кожных покровов на фоне симптомов гиперандрогении (вирилизация наружных половых органов, аменорея, выраженная алопеция и гирсутизм у женщин). При этом некорректная гормонзаместительная терапия может приводить к формированию низкого конечного роста как вследствие недостаточного (из-за избытка андрогенов), так и избыточного (из-за избытка глюкокортикоидов) лечения в детстве. В недиагностированных случаях ВДКН пациентки с женским кариотипом имеют мужской фенотип. У мужчин признаками надпочечниковой гиперандрогении являются бесплодие, акне [27].

Классическая сольтеряющая форма

Сочетание двух тяжелых мутаций (например, крупных делеции и сплайсинг-мутаций, E3del, R356W, Q318X, ^рШ172^, при которых активность фермента снижена до 0-2% - приводит к развитию сольтеряющей формы ВДКН, характеризующейся дефицитом как минералкортикоидов, так и глюкокортикоидов. Помимо всех симптомов, характерных для вирильной формы, такое состояние в отсутствие поддерживающей терапии может приводить к

развитию жизнеугрожающего состояния - сольтеряющего криза (снижение реабсорбции натрия в канальцах почек, снижение объема циркулирующей крови, артериального давления, развитие выраженного обезвоживания). Наиболее тяжело сольтеряющие кризы протекают в детском возрасте, с возрастом их частота снижается, однако в стрессовых ситуациях, например, при операциях, травмах, интеркуррентных заболеваниях, они могут осложнить течение заболевания и у взрослых [27].

1.3. Существующие подходы к терапии ВДКН. Генотерапия ВДКН

В лечении детей с врожденной гиперплазией коры надпочечников (ВГКН) выделяют три основные направления: физиологическая компенсация недостаточности надпочечников, снижение уровней надпочечниковых андрогенов до возрастных и половых норм, а также предотвращение развития ятрогенного гиперкортицизма и связанных с ним осложнений. Для достижения этих целей применяются более высокие дозы глюкокортикоидов по сравнению с другими видами первичной надпочечниковой недостаточности, что необходимо для подавления избыточной секреции андрогенов путем снижения секреции АКТГ. Однако важно тщательно подбирать дозировку глюкокортикоидов во избежание как гиперандрогении, так и гиперкортицизма, что может негативно сказаться на росте, развитии и метаболизме ребенка [28].

Согласно международным рекомендациям, таблетированный гидрокортизон считается препаратом выбора для лечения ВГКН у детей, так как он оказывает минимальное влияние на процессы роста по сравнению с другими глюкокортикоидами. В случаях, когда уровень АКТГ остается высоким несмотря на лечение, допустимо использование преднизолона в низких дозах для ночного приема (1-2 мг), особенно после полового созревания. Применение дексаметазона не рекомендуется из-за сложности его дозирования и риска развития ятрогенного синдрома Кушинга [29].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Глазова Ольга Владимировна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Home | ClinicalTrials.gov [Электронный ресурс]. URL: https://clinicaltrials.gov/ (accessed: 27.08.2024).

2. Mariam Faizullabhoy G.W. Adeno Associated Virus Vectors Manufacturing Market Size// Global Market Insights [Электронный ресурс]. URL: https://www.gminsights.com/industry-analysis/adeno-associated-virus-vectors-manufacturing-market/market-analysis (accessed: 25.08.2024).

3. Анатомия и физиология надпочечников [Электронный ресурс]. URL: https://online.zakon.kz/Document/?doc_id=39425168&pos=4;-55#pos=4;-55 (accessed: 25.08.2024).

4. Altieri B. Single-nucleus and spatial transcriptome reveal adrenal homeostasis in normal and tumoural adrenal glands / Altieri B., Secener A.K., Sai S., Fischer C., Sbiera S., Arampatzi P., Kircher S., Herterich S., Landwehr L.-S., Vitcetz S.N., Braeuning C., Fassnacht M., Ronchi C.L., Sauer S. // Clinical and Translational Medicine - 2024. - Т. 14 - № 8 - C.e1798.

5. Glazova O. V. Adrenal glands stem cells: general signaling pathways / Glazova O. V., Vorontsova M. V., Shevkova L. V., Sakr N., Onyanov N.A., Kaziakhmedova S.A., Volchkov P.Y. // Problems of Endocrinology - 2021. - Т. 67 - № 6 - С.90-97.

6. Kim J.H. Embryonic development and adult regeneration of the adrenal gland / Kim J.H., Choi M.H. // Endocrinology and Metabolism - 2021. - Т. 35 - № 4 - С.765-771.

7. Pastel E. Aldo-keto reductases 1B in adrenal cortex physiology // Front. Endocrinol. (Lausanne). - 2016. - Т. 7. - № JUL. - 208326с.

8. Endoh A.The zona reticularis is the site of biosynthesis of dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone sulfate in the adult human adrenal cortex resulting from its low expression of 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase / A. Endoh, S. B. Kristiansen, P. R. Casson, J. E. Buster, P. J. Hornsby, the A. Departments of Cell Biology, G. Sbk - , 1996.-3558-3565c.

9. Bilyalova A. Non-classical animal models for studying adrenal diseases: advantages,

limitations, and implications for research // Lab. Anim. Res. - 2024. - T. 40. - № 1. - 1-11c.

10. Pihlajoki M. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling / Pihlajoki M., Dôrner J., Cochran R.S., Heikinheimo M., Wilson D.B. // Frontiers in Endocrinology - 2015. -T. 6 - № MAR - C.131775.

11. Inomata A. Practical approaches for evaluating adrenal toxicity in nonclinical safety assessment // J. Toxicol. Pathol. - 2015. - T. 28. - № 3. - 125-132c.

12. Glazova O. Models of Congenital Adrenal Hyperplasia for Gene Therapies Testing // Int. J. Mol. Sci. - 2023. - T. 24. - № 6.

13. Naiki Y. SAT264 Effects Of Coenzymes In Gene Therapy For Congenital Adrenal Hyperplasia With AAV Vectors Into Model Mice / Naiki Y., Miyado M., Horikawa R., Katsumata N., Takada S., Fukami M. // Journal of the Endocrine Society - 2023. - T. 7 - № Supplement_1.

14. Hegde B.M. Textbook of Endocrine Physiology / Hegde B.M. // Postgraduate Medical Journal - 1994. - T. 70 - № 819 - C.57-57.

15. Parajes S. A simple and robust quantitative PCR assay to determine CYP21A2 gene dose in the diagnosis of 21-hydroxylase deficiency / Parajes S., Quinterio C., Domínguez F., Loidi L. // Clinical Chemistry - 2007. - T. 53 - № 9 - C.1577-1584.

16. Parajes S. High frequency of copy number variations and sequence variants at CYP21A2 locus: Implication for the genetic diagnosis of 21-hydroxylase deficiency / Parajes S., Quinteiro C., Domínguez F., Loidi L. // PLoS ONE - 2008. - T. 3 - № 5.

17. White P.C. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes / White P.C., New M.I., Dupont B. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1986. - T. 83 - № 14 - C.5111-5115.

18. Higashi Y. Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: A pseudogene and a genuine gene / Higashi Y., Yoshioka H., Yamane M., Gotoh O., Fujii-Kuriyama Y. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1986. - T. 83 - № 9 - C.2841-2845.

19. Speiser P.W. Molecular diagnosis of CYP21 mutations in congenital adrenal hyperplasia: implications for genetic counseling. // Am. J. Pharmacogenomics. - 2001. -Т. 1. - № 2. - 101-110с.

20. Miller W.L. Clinical review 54: Genetics, diagnosis, and management of 21-hydroxylase deficiency / Miller W.L. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 1994. - Т. 78 - № 2 - С.241-246.

21. Parker E.A. Maternal 21-hydroxylase deficiency and uniparental isodisomy of chromosome 6 and X results in a child with 21-hydroxylase deficiency and Klinefelter syndrome [1] // Am. J. Med. Genet. Part A. - 2006. - Т. 140. - № 20. - 2236-2240с.

22. Grinten H.L.C. van der Congenital Adrenal Hyperplasia—Current Insights in Pathophysiology, Diagnostics, and Management // Endocr. Rev. - 2022. - Т. 43. - № 1. - 91-159с.

23. Pignatelli D. Non-classic adrenal hyperplasia due to the deficiency of 21- hydroxylase and its relation to polycystic ovarian syndrome Front Horm Res, 2012. - 158-170с.

24. Escobar-Morreale H.F. A prospective study of the prevalence of nonclassical congenital adrenal hyperplasia among women presenting with hyperandrogenic symptoms and signs / Escobar-Morreale H.F., Sanchon R., San Millan J.L. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 2008. - Т. 93 - № 2 - С.527-533.

25. Pall M. The phenotype of hirsute women: a comparison of polycystic ovary syndrome and 21-hydroxylase-deficient nonclassic adrenal hyperplasia / Pall M., Azziz R., Beires J., Pignatelli D. // Fertility and Sterility - 2010. - Т. 94 - № 2 - С.684-689.

26. Tardy V. Phenotype-genotype correlations of 13 rare CYP21A2 mutations detected in 46 patients affected with 21-hydroxylase deficiency and in one carrier / Tardy V., Menassa R., Sulmont V., Lienhardt-Roussie A., Lecointre C., Brauner R., David M., Morel Y. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 2010. - Т. 95 - № 3 -С.1288-1300.

27. Общественная организация «Российская ассоциация эндокринологов» КЛИНИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ ПРИ ВРОЖДЕННОЙ ДИСФУНКЦИИ

КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ У ПАЦИЕНТОВ ВОВЗРОСЛОМ ВОЗРАСТЕ.

28. Mallappa A. Management challenges and therapeutic advances in congenital adrenal hyperplasia // Nat. Rev. Endocrinol. - 2022. - Т. 18. - № 6. - 337-352с.

29. Uslar T. Clinical Update on Congenital Adrenal Hyperplasia: Recommendations from a Multidisciplinary Adrenal Program // J. Clin. Med. - 2023. - Т. 12. - № 9. - 3128с.

30. Study Details | A Study of Gene Therapy for Classic Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) | ClinicalTrials.gov [Электронный ресурс]. URL: https://clinicaltrials.gov/study/NCT04783181 (accessed: 27.08.2024).

31. Глазова О.В. Генная и клеточная терапия функциональных патологий надпочечников: достижения и перспективы / Глазова О.В., Воронцова М.В., Шевкова Л.В., Сакр Н., Онянов Н.А., Казиахмедова С.А., Волчков П.Ю. // Проблемы Эндокринологии - 2021. - Т. 67 - № 6 - С.80-89.

32. Graves L.E. AAV-delivered hepato-adrenal cooperativity in steroidogenesis: Implications for gene therapy for congenital adrenal hyperplasia / Graves L.E., Dijk E.B. van, Zhu E., Koyyalamudi S., Wotton T., Sung D., Srinivasan S., Ginn S.L., Alexander I.E. // Molecular Therapy Methods and Clinical Development - 2024. - Т. 32 - № 2 -С.101232.

33. Drouin L.M. Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development // Future Virol. - 2013. - Т. 8. - № 12. - 1183-1199с.

34. Kuzmin D.A. The clinical landscape for AAV gene therapies / Kuzmin D.A., Shutova M. V., Johnston N.R., Smith O.P., Fedorin V. V., Kukushkin Y.S., Loo J.C.M. van der, Johnstone E.C. // Nature reviews. Drug discovery - 2021. - Т. 20 - № 3 - С.173-174.

35. Jerry R. Mendell N.C.H. Safety Study of Mini-dystrophin Gene to Treat Duchenne Muscular Dystrophy// Clinicaltrials.gov [Электронный ресурс]. URL: https://clinicaltrials.gov/study/NCT00428935#study-plan (accessed: 26.08.2024).

36. Mendell J.R. Dystrophin Immunity in Duchenne's Muscular Dystrophy / Mendell J.R., Campbell K., Rodino-Klapac L., Sahenk Z., Shilling C., Lewis S., Bowles D., Gray S., Li C., Galloway G., Malik V., Coley B., Clark K.R., Li J., Xiao X., Samulski J., McPhee S.W., Samulski R.J., Walker C.M. // New England Journal of Medicine - 2010.

- T. 363 - № 15 - C.1429-1437.

37. Viney L. Adeno-associated Virus (AAV) Capsid Chimeras with Enhanced Infectivity Reveal a Core Element in the AAV Genome Critical for both Cell Transduction and Capsid Assembly / Viney L., Bürckstümmer T., Eddington C., Mietzsch M., Choudhry M., Henley T., Agbandje-McKenna M. // Journal of Virology - 2021. - T. 95 - № 7 -C.2023-2043.

38. Grimm D. In Vitro and In Vivo Gene Therapy Vector Evolution via Multispecies Interbreeding and Retargeting of Adeno-Associated Viruses / Grimm D., Lee J.S., Wang L., Desai T., Akache B., Storm T.A., Kay M.A. // Journal of Virology - 2008. - T. 82 -№ 12 - C.5887-5911.

39. Drouyer M. Novel AAV variants with improved tropism for human Schwann cells / Drouyer M., Chu T.H., Labit E., Haase F., Navarro R.G., Nazareth D., Rosin N., Merjane J., Scott S., Cabanes-Creus M., Westhaus A., Zhu E., Midha R., Alexander I.E., Biernaskie J., Ginn S.L., Lisowski L. // Molecular Therapy Methods and Clinical Development - 2024. - T. 32 - № 2.

40. Yoo S.Y. Chimeric Adeno-Associated Virus-Mediated Cardiovascular Reprogramming for Ischemic Heart Disease / Yoo S.Y., Jeong S.N., Kang J.I., Lee S.W. // ACS Omega - 2018. - T. 3 - № 5 - C.5918-5925.

41. Zhao Y. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling / Zhao Y., Londono P., Cao Y., Sharpe E.J., Proenza C., O'Rourke R., Jones K.L., Jeong M.Y., Walker L.A., Buttrick P.M., McKinsey T.A., Song K. // Nature Communications - 2015. - T. 6 - № 1 - C.1-15.

42. Li C. Development of patient-specific AAV vectors after neutralizing antibody selection for enhanced muscle gene transfer / Li C., Wu S., Albright B., Hirsch M., Li W., Tseng Y.S., Agbandje-Mckenna M., Mcphee S., Asokan A., Samulski R.J. // Molecular Therapy - 2016. - T. 24 - № 1 - C.53-65.

43. Wang J.H. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases // Signal Transduct. Target. Ther. - 2024. - T. 9. - № 1. - 1-33c.

44. Appelbaum J.Context-specific synthetic T cell promoters from assembled

transcriptional elementsv / J. Appelbaum, J. Wei, T. Ishida, J. Rosser, C. Saxby, J. Chase, M. Carlson, C. Sather, W. Rahfeldt, M. Meechan, M. Baldwin, L. Flint, C. Spurrell, J. Gustafson, A. Johnson, M. Jensen - American Journal Experts, 2024.

45. Wu M.R. A high-throughput screening and computation platform for identifying synthetic promoters with enhanced cell-state specificity (SPECS) / Wu M.R., Nissim L., Stupp D., Pery E., Binder-Nissim A., Weisinger K., Enghuus C., Palacios S.R., Humphrey M., Zhang Z., Maria Novoa E., Kellis M., Weiss R., Rabkin S.D., Tabach Y., Lu T.K. // Nature Communications - 2019. - Т. 10 - № 1 - С.1-10.

46. Jüttner J. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans / Jüttner J., Szabo A., Gross-Scherf B., Morikawa R.K., Rompani S.B., Hantz P., Szikra T., Esposti F., Cowan C.S., Bharioke A., Patino-Alvarez C.P., Keles Ö., Kusnyerik A., Azoulay T., Hartl D., Krebs A.R., Schübeler D., Hajdu R.I., Lukats A., Nemeth J., Nagy Z.Z., Wu K.C., Wu R.H., Xiang L., Fang X.L., Jin Z.B., Goldblum D., Hasler P.W., Scholl H.P.N., Krol J., Roska B. // Nature Neuroscience - 2019. - Т. 22 - № 8 - С.1345-1356.

47. Johnson A.O. Bioinformatic Design of Dendritic Cell-Specific Synthetic Promoters / Johnson A.O., Fowler S.B., Webster C.I., Brown A.J., James D.C. // ACS Synthetic Biology - 2022. - Т. 11 - № 4 - С.1613-1626.

48. Govorkova P. Design of Synthetic Mammalian Promoters Using Highly Palindromic Subsequences / Govorkova P., Candice Lam C.K., Truong K. // ACS Synthetic Biology - 2022. - Т. 11 - № 3 - С.1096-1105.

49. Asimov [Электронный ресурс]. URL: https://www.asimov.com/news/asimov-to-present-data-on-ai-designed-tissue-specific-promoters-at-upcoming-annual-meeting-of-the-american-society-of-gene-cell-therapy-asgct (accessed: 26.08.2024).

50. Gosai S. Machine-guided design of synthetic cell type-specific cis-regulatory elements / Gosai S., Castro R., Fuentes N., Butts J., Kales S., Noche R., Mouri K., Sabeti P., Reilly S., Tewhay R. // bioRxiv - 2023. - С.1-30.

51. Taskiran I.I. Cell-type-directed design of synthetic enhancers / Taskiran I.I., Spanier K.I., Dickmänken H., Kempynck N., Pancikova A., Ek§i E.C., Hulselmans G., Ismail

J.N., Theunis K., Vandepoel R., Christiaens V., Mauduit D., Aerts S. // Nature - 2024. -T. 626 - № 7997 - C.212-220.

52. Mauro V.P. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics // Trends Mol. Med. - 2014. - T. 20. - № 11. - 604-613c.

53. Raab D. The GeneOptimizer Algorithm: Using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequence optimization / Raab D., Graf M., Notka F., Schödl T., Wagner R. // Systems and Synthetic Biology - 2010. - T. 4 - № 3 - C.215-225.

54. Ward N.J. Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression / Ward N.J., Buckley S.M.K., Waddington S.N., VandenDriessche T., Chuah M.K.L., Nathwani A.C., McIntosh J., Tuddenham E.G.D., Kinnon C., Thrasher A.J., McVey J.H. // Blood - 2011. - T. 117 - № 3 - C.798-807.

55. Alexaki A. Effects of codon optimization on coagulation factor IX translation and structure: Implications for protein and gene therapies / Alexaki A., Hettiarachchi G.K., Athey J.C., Katneni U.K., Simhadri V., Hamasaki-Katagiri N., Nanavaty P., Lin B., Takeda K., Freedberg D., Monroe D., McGill J.R., Peters R., Kames J.M., Holcomb D.D., Hunt R.C., Sauna Z.E., Gelinas A., Janjic N., DiCuccio M., Bar H., Komar A.A., Kimchi-Sarfaty C. // Scientific Reports - 2019. - T. 9 - № 1 - C.1-15.

56. Sack B.K. Transient B cell depletion or improved transgene expression by codon optimization promote tolerance to factor VIII in gene therapy / Sack B.K., Merchant S., Markusic D.M., Nathwani A.C., Davidoff A.M., Byrne B.J., Herzog R.W. // PLoS ONE - 2012. - T. 7 - № 5 - C.e37671.

57. Foster H. Codon and mRNA sequence optimization of microdystrophin transgenes improves expression and physiological outcome in dystrophic mdx mice following AAV2/8 gene transfer / Foster H., Sharp P.S., Athanasopoulos T., Trollet C., Graham I.R., Foster K., Wells D.J., Dickson G. // Molecular Therapy - 2008. - T. 16 - № 11 -C.1825-1832.

58. Lewis C.J. Codon optimization is an essential parameter for the efficient allotopic expression of mtDNA genes / Lewis C.J., Dixit B., Batiuk E., Hall C.J., O'Connor M.S.,

Boominathan A. // Redox Biology - 2020. - T. 30 - C.101429.

59. Paremskaia A.I. Codon-optimization in gene therapy: promises, prospects and challenges // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2024. - T. 12. - 1371596c.

60. Dittmar K.A. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression / Dittmar K.A., Goodenbour J.M., Pan T. // PLoS Genetics - 2006. - T. 2 - № 12 - C.2107-2115.

61. Gao W. Cell type-specific analysis by single-cell profiling identifies a stable mammalian tRNA-mRNA interface and increased translation efficiency in neurons / Gao W., Gallardo-Dodd C.J., Kutter C. // Genome research - 2022. - T. 32 - № 1 - C.97-110.

62. Brown H.C. Target-Cell-Directed Bioengineering Approaches for Gene Therapy of Hemophilia A / Brown H.C., Zakas P.M., George S.N., Parker E.T., Spencer H.T., Doering C.B. // Molecular Therapy Methods and Clinical Development - 2018. - T. 9 -C.57-69.

63. Hernandez-Alias X. Using protein-per-mRNA differences among human tissues in codon optimization / Hernandez-Alias X., Benisty H., Radusky L.G., Serrano L., Schaefer M.H. // Genome Biology - 2023. - T. 24 - № 1 - C.1-20.

64. Luo X. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation / Luo X., Ikeda Y., Parker K.L. // Cell - 1994. -T. 77 - № 4 - C.481-490.

65. Crawford P.A. Nuclear Receptor Steroidogenic Factor 1 Directs Embryonic Stem Cells toward the Steroidogenic Lineage / Crawford P.A., Sadovsky Y., Milbrandt J. // Molecular and Cellular Biology - 1997. - T. 17 - № 7 - C.3997-4006.

66. Hu M.C. Functions of the upstream and proximal steroidogenic factor 1 (SF-1)-binding sites in the CYP11A1 promoter in basal transcription and hormonal response / Hu M.C., Hsu N.C., Pai C.I., Leo Wang C.K., Chung B.C. // Molecular Endocrinology -2001. - T. 15 - № 5 - C.812-818.

67. Huang Y.Y. Action of hormone responsive sequence in 2.3 kb promoter of CYP11A1 / Huang Y.Y., Hu M.C., Hsu N.C., Wang C.K.L., Chung B.C. // Molecular and Cellular Endocrinology - 2001. - T. 175 - № 1-2 - C.205-210.

68. Bakke M. Mutually exclusive interactions of two nuclear orphan receptors determine activity of a cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-responsive sequence in the Bovine CYP17 gene / Bakke M., Lund J. // Molecular Endocrinology - 1995. - T. 9 - № 3 -C.327-339.

69. Sewer M.B. Transcriptional complexes at the CYP17 CRS Taylor & Francis, 2002. -551-558c.

70. Lee S.L. Luteinizing hormone deficiency and female infertility in mice lacking the transcription factor NGFI-A (Egr-1) / Lee S.L., Sadovsky Y., Swirnoff A.H., Polish J.A., Goda P., Gavrilina G., Milbrandt J. // Science - 1996. - T. 273 - № 5279 - C. 1219-1221.

71. Morohashi K.I. Activation of CYP11A and CYP11B gene promoters by the steroidogenic cell-specific transcription factor, Ad4BP / Morohashi K.I., Zanger U.M., Honda S.I., Hara M., Watermant M.R., Omura T. // Molecular Endocrinology - 1993. -T. 7 - № 9 - C.1196-1204.

72. Leers-Sucheta S. Synergistic activation of the human type II 3p-hydroxysteroid dehydrogenase/A5-A4 isomerase promoter by the transcription factor steroidogenic factor-1/adrenal 4-binding protein and phorbol ester / Leers-Sucheta S., Morohashi K.I., Mason J.I., Melner M.H. // Journal of Biological Chemistry - 1997. - T. 272 - № 12 -C.7960-7967.

73. Kawabe K. Dax-1 as one of the target genes of Ad4BP/SF-1 / Kawabe K., Shikayama T., Tsuboi H., Oka S., Oba K., Yanase T., Nawata H., Morohashi K.I. // Molecular Endocrinology - 1999. - T. 13 - № 8 - C.1267-1284.

74. Santa Barbara P. De Direct Interaction of SRY-Related Protein SOX9 and Steroidogenic Factor 1 Regulates Transcription of the Human Anti-Mullerian Hormone Gene / Santa Barbara P. De, Bonneaud N., Boizet B., Desclozeaux M., Moniot B., Sudbeck P., Scherer G., Poulat F., Berta P. // Molecular and Cellular Biology - 1998. -T. 18 - № 11 - C.6653-6665.

75. Sekido R. Sex determination involves synergistic action of SRY and SF1 on a specific Sox9 enhancer / Sekido R., Lovell-Badge R. // Nature - 2008. - T. 453 - № 7197 -C.930-934.

76. Santa Barbara P. De Steroidogenic Factor-1 Contributes to the Cyclic-Adenosine Monophosphate Down-Regulation of Human SRY Gene Expression / Santa Barbara P. De, Mejean C., Moniot B., Malcles M.H., Berta P., Boizet-Bonhoure B. // Biology of Reproduction - 2001. - T. 64 - № 3 - C.775-783.

77. Friedenstein A.J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs / Friedenstein A.J., Gorskaja U.F., Kulagina N.N. // Experimental Hematology -1976. - T. 4 - № 5 - C.267-274.

78. Gondo S. SF-1/Ad4BP transforms primary long-term cultured bone marrow cells into ACTH-responsive steroidogenic cells / Gondo S., Yanase T., Okabe T., Tanaka T., Morinaga H., Nomura M., Goto K., Nawata H. // Genes to Cells - 2004. - T. 9 - № 12 -C.1239-1247.

79. Gondo S. Adipose tissue-derived and bone marrow-derived mesenchymal cells develop into different lineage of steroidogenic cells by forced expression of steroidogenic factor 1 / Gondo S., Okabe T., Tanaka T., Morinaga H., Nomura M., Takayanagi R., Nawata H., Yanase T. // Endocrinology - 2008. - T. 149 - № 9 - C.4717-4725.

80. Yazawa T. PPAR-y coactivator-1a regulates progesterone production in ovarian granulosa cells with SF-1 and LRH-1 / Yazawa T., Inaoka Y., Okada R., Mizutani T., Yamazaki Y., Usami Y., Kuribayashi M., Orisaka M., Umezawa A., Miyamoto K. // Molecular Endocrinology - 2010. - T. 24 - № 3 - C.485-496.

81. Ruiz-Babot G. Modeling Congenital Adrenal Hyperplasia and Testing Interventions for Adrenal Insufficiency Using Donor-Specific Reprogrammed Cells / Ruiz-Babot G., Balyura M., Hadjidemetriou I., Ajodha S.J., Taylor D.R., Ghataore L., Taylor N.F., Schubert U., Ziegler C.G., Storr H.L., Druce M.R., Gevers E.F., Drake W.M., Srirangalingam U., Conway G.S., King P.J., Metherell L.A., Bornstein S.R., Guasti L. // Cell Reports - 2018. - T. 22 - № 5 - C. 1236-1249.

82. Yazawa T. Differentiation of adult stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells / Yazawa T., Mizutani T., Yamada K., Kawata H., Sekiguchi T., Yoshino M., Kajitani T., Shou Z., Umezawa A., Miyamoto K. // Endocrinology - 2006. - T. 147 - № 9 - C.4104-4111.

83. Li L. Directing differentiation of human induced pluripotent stem cells toward androgen-producing Leydig cells rather than adrenal cells / Li L., Li Y., Sottas C., Culty M., Fan J., Hu Y., Cheung G., Chemes H.E., Papadopoulos V. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2019. - T. 116 - № 46

- C.23274-23283.

84. Yazawa T. Liver receptor homolog-1 regulates the transcription of steroidogenic enzymes and induces the differentiation of mesenchymal stem cells into steroidogenic cells / Yazawa T., Inanoka Y., Mizutani T., Kuribayashi M., Umezawa A., Miyamoto K. // Endocrinology - 2009. - T. 150 - № 8 - C.3885-3893.

85. Schubert T. CYP21A2 Gene Expression in a Humanized 21-Hydroxylase Mouse Model Does Not Affect Adrenocortical Morphology and Function / Schubert T., Reisch N., Naumann R., Reichardt I., Landgraf D., Quitter F., Thirumalasetty S.R., Heninger A.K., Sarov M., Peitzsch M., Huebner A., Koehler K. // Journal of the Endocrine Society

- 2022. - T. 6 - № 6.

86. Riepe F.G. Congenital adrenal hyperplasia: The molecular basis of 21-hydroxylase deficiency in H-2aw18 mice / Riepe F.G., Tatzel S., Sippell W.G., Pleiss J., Krone N. // Endocrinology - 2005. - T. 146 - № 6 - C.2563-2574.

87. Perdomini M. An AAVrh10-CAG-CYP21-HA vector allows persistent correction of 21-hydroxylase deficiency in a Cyp21-/- mouse model / Perdomini M., Santos C. Dos, Goumeaux C., Blouin V., Bougneres P. // Gene Therapy - 2017. - T. 24 - № 5 - C.275-281.

88. Hwang B. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines // Exp. Mol. Med. - 2018. - T. 50. - № 8. - 1-14c.

89. Nguyen A. Single cell RNA sequencing of rare immune cell populations / Nguyen A., Khoo W.H., Moran I., Croucher P.I., Phan T.G. // Frontiers in Immunology - 2018. - T. 9 - № JUL - C.379154.

90. Valle I. del An integrated single-cell analysis of human adrenal cortex development / Valle I. del, Young M.D., Kildisiute G., Ogunbiyi O.K., Buonocore F., Simcock I.C., Khabirova E., Crespo B., Moreno N., Brooks T., Niola P., Swarbrick K., Suntharalingham

J.P., McGlacken-Byrne S.M., Arthurs O.J., Behjati S., Achermann J.C. // JCI Insight -2023. - T. 8 - № 14.

91. Iwahashi N. Characterization of Aldosterone-producing Cell Cluster (APCC) at Single-cell Resolution / Iwahashi N., Umakoshi H., Seki T., Gomez-Sanchez C.E., Mukai K., Suematsu M., Umezawa Y., Oya M., Kosaka T., Seki M., Suzuki Y., Horiuchi Y., Ogawa Y., Nishimoto K. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 2022. -T. 107 - № 9 - C.2439-2448.

92. Altieri B. Cell Atlas at Single-Nuclei Resolution of the Adult Human Adrenal Gland and Adrenocortical Adenomas / Altieri B., Secener A.K., Sai S., Fischer C., Sbiera S., Arampatzi P., Herterich S., Landwehr L.-S., Vitcetz S.N., Braeuning C., Fassnacht M., Ronchi C.L., Sauer S. // bioRxiv - 2022. - C.2022.08.27.505530.

93. Saul D. A new gene set identifies senescent cells and predicts senescence-associated pathways across tissues / Saul D., Kosinsky R.L., Atkinson E.J., Doolittle M.L., Zhang X., LeBrasseur N.K., Pignolo R.J., Robbins P.D., Niedernhofer L.J., Ikeno Y., Jurk D., Passos J.F., Hickson L.T.J., Xue A., Monroe D.G., Tchkonia T., Kirkland J.L., Farr J.N., Khosla S. // Nature Communications - 2022. - T. 13 - № 1 - C.1-15.

94. Iwahashi N. Single-cell and spatial transcriptomics analysis of human adrenal aging / Iwahashi N., Umakoshi H., Fujita M., Fukumoto T., Ogasawara T., Yokomoto-Umakoshi M., Kaneko H., Nakao H., Kawamura N., Uchida N., Matsuda Y., Sakamoto R., Seki M., Suzuki Y., Nakatani K., Izumi Y., Bamba T., Oda Y., Ogawa Y. // Molecular Metabolism - 2024. - T. 84 - C.101954.

95. Qiu C. A single-cell transcriptional timelapse of mouse embryonic development, from gastrula to pup. / Qiu C., Martin B.K., Welsh I.C., Daza R.M., Le T.-M., Huang X., Nichols E.K., Taylor M.L., Fulton O., O'Day D.R., Gomes A.R., Ilcisin S., Srivatsan S., Deng X., Disteche C.M., Noble W.S., Hamazaki N., Moens C.B., Kimelman D., Cao J., Schier A.F., Spielmann M., Murray S.A., Trapnell C., Shendure J. // bioRxiv: the preprint server for biology - 2023.

96. Lai S. Mapping a mammalian adult adrenal gland hierarchy across species by microwell-seq / Lai S., Ma L., E W., Ye F., Chen H., Han X., Guo G. // Cell Regeneration

- 2020. - Т. 9 - № 1 - С.1-12.

97. Neirijnck Y. Single-cell transcriptomic profiling redefines the origin and specification of early adrenogonadal progenitors / Neirijnck Y., Sararols P., Kühne F., Mayere C., Weerasinghe Arachchige L.C., Regard V., Nef S., Schedl A. // Cell reports - 2023. - Т. 42 - № 3.

98. Lopez J.P. Single-cell molecular profiling of all three components of the HPA axis reveals adrenal ABCB1 as a regulator of stress adaptation / Lopez J.P., Brivio E., Santambrogio A., Donno C. De, Kos A., Peters M., Rost N., Czamara D., Brückl T.M., Roeh S., Pöhlmann M.L., Engelhardt C., Ressle A., Stoffel R., Tontsch A., Villamizar J.M., Reincke M., Riester A., Sbiera S., Fassnacht M., Mayberg H.S., Craighead W.E., Dunlop B.W., Nemeroff C.B., Schmidt M. V., Binder E.B., Theis F.J., Beuschlein F., Andoniadou C.L., Chen A. // Science Advances - 2021. - Т. 7 - № 5 - С.4497-4524.

99. Zhang K. Single-cell atlas of murine adrenal glands reveals immune-adrenal crosstalk during systemic Candida albicans infection / Zhang K., Hu Y., Li R., Li T. // Frontiers in Immunology - 2022. - Т. 13 - С.966814.

100. Smith M.A. Chimeragenesis of distantly-related proteins by noncontiguous recombination / Smith M.A., Romero P.A., Wu T., Brustad E.M., Arnold F.H. // Protein Science : A Publication of the Protein Society - 2013. - Т. 22 - № 2 - С.231.

101. Cheng L.C. Regulation of human CYP11B1 and CYP11B2 promoters by transposable elements and conserved cis elements / Cheng L.C., Pai T.W., Li L.A. // Steroids - 2012. - Т. 77 - № 1-2 - С.100-109.

102. The human proteome in housekeeping - The Human Protein Atlas [Электронный ресурс]. URL: https: //www.proteinatlas. org/humanproteome/tissue/adrenal+gland (accessed: 26.08.2024).

103. Aysha J. Synthetic Promoters: Designing the cis Regulatory Modules for Controlled Gene Expression // Mol. Biotechnol. - 2018. - Т. 60. - № 8. - 608-620с.

104. White P.C. Aldosterone synthase (CYP11B2) polymorphisms and cardiovascular function Pergamon, 1999. - 409-412с.

105. Jadhav U. Steroidogenic factor-1 (SF-1)-driven differentiation of murine embryonic

stem (ES) cells into a gonadal lineage / Jadhav U., Jameson J.L. // Endocrinology - 2011.

- Т. 152 - № 7 - С.2870-2882.

106. RIKEN BioResource Research Center [Электронный ресурс]. URL: https://web.brc.riken.jp/en/ (accessed: 26.08.2024).

107. Д.О. Максимов1, 2, 4, Д.А. Наумова1, Е.А. Астахова1 В.В.А. Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo методом секвенирования нового поколения / Д.О. Максимов 1, 2, 4, Д.А. Наумова1, Е.А. Астахова1 В.В.А., С. А. Бирюков1, И.С. Абрамов1, 3, 4, А. А. Навойкова1, Н.В. Рудев1 4, С.Г. Феоктистова1, 4, О.В. Глазова1, 4, О.Н. Митяева1, 2, 4,?, П.Ю. Волчков 1, 2, 3 4 // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение

- 2024. - С.215-230.

108. Weikum E.R. The nuclear receptor superfamily: A structural perspective // Protein Sci. - 2018. - Т. 27. - № 11. - 1876-1892с.

109. Penvose A. Comprehensive study of nuclear receptor DNA binding provides a revised framework for understanding receptor specificity / Penvose A., Keenan J.L., Bray D., Ramlall V., Siggers T. // Nature Communications - 2019. - Т. 10 - № 1 - С.1-15.

110. Stepanenko A.A. HEK293 in cell biology and cancer research: Phenotype, karyotype, tumorigenicity, and stress-induced genome-phenotype evolution // Gene. -2015. - Т. 569. - № 2. - 182-190с.

111. Shaw G. Preferential transformation of human neuronal cells by human adenoviruses and the origin of HEK 293 cells. / Shaw G., Morse S., Ararat M., Graham F.L. // The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology - 2002. - Т. 16 - № 8 - С.869-871.

112. Zuker M. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information / Zuker M., Stiegler P. // Nucleic Acids Research - 1981. - Т. 9 - № 1 - С.133-148.

113. Mathews D.H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure / Mathews D.H., Disney M.D., Childs J.L., Schroeder S.J., Zuker M., Turner D.H. // Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America - 2004. - Т. 101 - № 19

- С.7287-7292.

114. Ding Y. RNA secondary structure prediction by centroids in a Boltzmann weighted ensemble / Ding Y., Chi Y.C., Lawrence C.E. // RNA - 2005. - Т. 11 - № 8 - С.1157-1166.

115. Bielohuby M. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: Time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment / Bielohuby M., Herbach N., Wanke R., Maser-Gluth C., Beuschlein F., Wolf E., Hoeflich A. // American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism

- 2007. - Т. 293 - № 1.

116. Arlt W. Health status of adults with congenital adrenal hyperplasia: A cohort study of 203 patients / Arlt W., Willis D.S., Wild S.H., Wu F.C. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 2010. - Т. 95 - № 11 - С.5110-5121.

117. Auer M.K. Congenital adrenal hyperplasia // Lancet. - 2023. - Т. 401. - № 10372.

- 227-244с.

118. Houri A. Suprabasin enhances the invasion, migration, and angiogenic ability of oral squamous cell carcinoma cells under hypoxic conditions / Houri A., Mukudai Y., Abe Y., Watanabe M., Nara M., Miyamoto S., Kurihara M., Shimane T., Shirota T. // Oncology Reports - 2023. - Т. 49 - № 5.

119. Aoshima M. Decreased expression of suprabasin induces aberrant differentiation and apoptosis of epidermal keratinocytes: Possible role for atopic dermatitis / Aoshima M., Phadungsaksawasdi P., Nakazawa S., Iwasaki M., Sakabe J. ichi, Umayahara T., Yatagai T., Ikeya S., Shimauchi T., Tokura Y. // Journal of Dermatological Science - 2019. - Т. 95 - № 3 - С.107-112.

120. Pribyl M. Suprabasin—a review // Genes (Basel). - 2021. - Т. 12. - № 1. - 1-21с.

121. Peroxide oxidation and radiation [Электронный ресурс]. URL: https://www.researchgate.net/publication/281147940_Peroxide_oxidation_and_radiatio n?channel=doi&linkId=55d85f6008ae9d65948f273e&showFulltext=true (accessed: 26.08.2024).

122. Menzies R.I. Transcription controls growth, cell kinetics and cholesterol supply to sustain ACTH responses / Menzies R.I., Zhao X., Mullins L.J., Mullins J.J., Cairns C., Wrobel N., Dunbar D.R., Bailey M.A., Kenyon C.J. // Endocrine Connections - 2017. -T. 6 - № 7 - C.446-457.

123. Agrawal A. WikiPathways 2024: next generation pathway database / Agrawal A., Balci H., Hanspers K., Coort S.L., Martens M., Slenter D.N., Ehrhart F., Digles D., Waagmeester A., Wassink I., Abbassi-Daloii T., Lopes E.N., Iyer A., Acosta J.M., Willighagen L.G., Nishida K., Riutta A., Basaric H., Evelo C.T., Willighagen E.L., Kutmon M., Pico A.R. // Nucleic Acids Research - 2024. - T. 52 - № D1 - C.D679-D689.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Приложение 1

Результаты цитометрии клеток НЕК293Т после трансдукции векторами ААУ-WT-CYP21A2 и ААУ-Со-СУР21А2 с последующей окраской антителами против белка СУР21А2.

Стратегия гейтирования

1 2. ОМ

е.ом - Single Cells ISM"

Cells . ' <''.':'. ; . * 3 1 ¿j 1.0М- DAPI-Э9.Э

2.ai|t Ж 500К 1

fl 0 vi §

500К 1.0М 1.5М 2,0 М FSC-H :: FSC-H

О 500К 1.0М 1,бМ 2.ОМ

FSC-H :: FSC-H

to 10 10 10

FLI O A::

Данные по всем образцам

97,0

FLi-H :: FITC-Й

Co CYP21A2

CYP21A2

98,1

" " :

' ' ' '"'1 .......1 ' "1 1 3 10 10 ............................ 5 7 10 10

FL1 H :: FITC-H

Интактный контроль

I WT CYP21A2 I

CYP21A2

I 39,1

I | f ^ ""

1 ....... ........... 1 3 10 10 ll| . II Hilf . ....... ........ 1 1 5 7 10 10

I FL1 H:: FITC-H

Только первичные антитела

FL1-H :: FITC-H

1 .......

1

о

— 590 К

I AAV-GFP I

CYP21A2

S9.6 I

- - #:

. . ми.! . и iiiif . и ............................

1 3 10 10 5 7 10 10

FL1 I1*:: FITC-H

Только вторичные антитела

CYP21A2

I 0

J I I

FL1-H:: FITC-H

FL1-H :: FITC-H

Сравнение активности сигнальных путей для возраста 5 недель групп Сур21+/+ (красный) и Сур21+/- (синий).

Сравнение композиционного состава (А) и активности сигнальных путей (Б) для самок возраста 5 недель групп Сур21+/+ (красный) и Сур21-/- (синий).

Сравнение композиционного состава (А) и активности сигнальных путей (Б) для самцов возраста 5 недель групп Cyp21+/+ (красный) и Cyp21-/- (синий).

Приложение 5

UMAP плот клеток кортекса и мезенхимы (К+М) с визуализацией клеток, экспрессирующих маркеры прогениторов (А, Б) и синтеза холестерола (В). Шкала отражает уровень экспрессии от минимального (0.0) до максимального (2,5-3).

, , Сур21+/+ А) а1рИа • 0.1 1 ■ Г1г 0 БЬИ Сур21+/- а1рЬа • 0.1 ГГЖ 1: Сур21-/- а1рЬа • 0.1 III Щ ю 0.5 0.0

ИМ( Сур21+/+ Ь) Ж Ш ,г 1 КпМ Сур21+/- г^Х'М 1 0 Wnt4 Сур21-Л • . а1рЬа • 0.1 Щь * •

Нтдсг Сур21+/+ о) а1рИа • 0.1 Г^Х^яС 1: 0 Нтдсг Сур21 + /- * а1рЬа • 0.1 ГГЖ 1! 0 Нтдсг Сур21-/- а1рЬа • 0.1 Г^Ш, 1! * . о

Приложение 6

Плазмиды, несущие в себе исследуемые промоторы второго поколения А- Prom1; Б - Prom3; В - Prom4; Г - Prom5; Д - Prom6.

Имуногистохимическое окрашивание органов мышей Prom4v2

№мы ши

212

.........

шшшш

ШШШШ .........