Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Грищук, Юлия Владимировна

• Грищук, Юлия Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Грищук, Юлия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биосинтез стероидных гормонов.

1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека -общие стадии.

1.1.2. Синтез минералокортикоидов.

1.1.3. Синтез глюкокортикоидов.

1.1.4. Синтез половых гормонов.

1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов.

1.2.1. Адреногенитальный синдром.

1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы.

1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы.

1.3. Особенности структуры и расположения гена CYP21A2.

1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса.

1.3.2. Структура RCCX-модуля.

1.3.3 Структура гена CYP21A2 и псевдогена CYP21AIP.

1.4. Молекулярно-генетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене CYP21A2.

1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера.

1.4.2. Небольшие генные конверсии.

1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном.

1.4.4. Возникновение мутаций de novo.

1.4.5. Методы выявления мутаций в гене CYP21A2.

1.4.6. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 в российской популяции.

1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците 21-гидроксилазы.

1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека.

1.6. Стероид 21-гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р450.

1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р450.

1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции.

1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства цитохромов Р450.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Пациенты и молекулярно-генетический анализ мутаций.

2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы.

2.3. Создание генно-инженерных конструкций и сайт-специфичный мутагенез.

2.4. Культивирование и трансфекция клеток COS-7.

2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7.

2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов.

2.7. Получение рекомбинантных бакмид.

2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов.

2.9. Определение вирусного титра.

2.10. Экспрессия в клетках насекомых Sf9 и Я/5.

2.11. Получение микросомных фракций.

2.12. Анализ каталитической активности в микросомной фракции Я/5.

2.13. Измерение концентрации белка.

2.14. ДСН-ПААГ электрофорез.

2.15. Вестерн-блот-анализ.

2.16. Иммунофлуоресценция.

2.17. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.

2.18. Анализ клонов методом ПЦР.

2.19. Выделение плазмидной ДНК.

2.20. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.21. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.22. Лигирование.

2.23. Моделирование трехмерной структуры.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP21A2.

3.2. Экспрессия и функциональный анализ CYP21A2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7.

3.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 в клетках COS-7.

3.4. Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы.

3.5. Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Hi5.

3.6. Анализ модели трехмерной структуры.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом»

Адреногенитальный синдром (АТС; врожденная дисфункция коры надпочечников, ВДКН) - группа наследственных заболеваний человека с аутосомно-рецессивным характером наследования, обусловленных нарушением биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. Врожденным дефицитом стероид 21-гидроксилазы вызвано 90-95% всех случаев адреногенитального синдрома.

Фермент стероид 21-гидроксилаза (21-гидроксилаза, CYP21A2) катализирует монооксигеназные реакции превращения 17-гидроксипрогестерона (17-ОН прогестерона, 17 0НП) в дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон, участвуя в биосинтезе глюкокортикоидов и минералокортикоидов, соответственно, и относится к семейству цитохромов Р450. Белки этого семейства обнаружены у всех изученных эукариот и некоторых прокариот и широко участвуют в окислительном метаболизме эндогенных соединений (стероидогенезе, поддержании гомеостаза витамина Д), а также разнообразных ксенобиотиков (лекарств, химических канцерогенов, растительных метаболитов и пр.). Учитывая широкое распространение цитохромов Р450 и разнообразие катализируемых ими реакций, исследование белков этого семейства имеет большое значение для фармакологии (разработки новых лекарственных средств, определения индивидуальной переносимости лекарственных препаратов и т.д.), анализа экологических загрязнений, а также молекулярной генетики человека.

Недостаточность стероид 21-гидроксилазы является одним из наиболее распространенных генетических дефектов человека. Частота классических форм заболевания оценивается в среднем как 1:15000 новорожденных, тогда как неклассические случаи составляют 1% в общей популяции. Причина высокой частоты встречаемости дефицита 21-гидроксилазы объясняется особенностями организации области генома, в которой находится ген

CYP21A2. Он расположен в коротком плече шестой хромосомы (6р21.3) в локусе генов главного комплекса гистосовместимости третьего класса (называемого также областью HLA - Human Leukocyte Antigen- III класса). Длина гена CYP21A2 составляет 3,4 т.п.н, он содержит 10 экзонов и 9 интронов. На расстоянии 30 т.п.н. от активного гена CYP21A2 между генами 4-го компонента комплемента С4А и С4В расположен псевдоген CYP21A1P. Степень гомологии гена и псевдогена составляет 98% в экзонах и 96% в интронах (Higashi, et al, 1986; White, et al, 1986; Rodrigues, et al, 1987). Рекомбинация между высокогомологичными CYP21A2 и CYP21A1P по механизму неравного кроссинговера или генной конверсии является основной причиной дефицита 21-гидроксилазы. Наряду с этим, по мере проведения молекулярно-генетического скрининга мутаций в разных популяциях мира, накапливаются сведения о спонтанно возникающих мутациях, происхождение которых не связано с псевдогеном. Эти редкие или уникальные мутации характерны для отдельных семей или небольших по численности популяций. К настоящему моменту описано 60 таких мутаций.

Молекулярно-генетический анализ пациентов с адреногенитальным синдромом, проводимый в разных популяциях, выявляет хорошее соответствие между генотипом и клиническими проявлениями, которые в случае сочетанной гетерозиготности связаны с наименее поврежденным аллелем CYP21A2. Отмеченная корреляция генотипа и фенотипа позволяет классифицировать мутации в зависимости от степени инактивации 21-гидроксилазы, что крайне важно для прогнозирования тяжести заболевания в ходе пренатальной диагностики и своевременной пренатальной или ранней постнатальной терапии. Вовремя начатая пренатальная терапия помогает предупредить осложнения, связанные с нарушением стероидогенеза in utero, такие как повреждения репродуктивной функции, низкорослость, трансформация пола, а также водно-электролитный дисбаланс в случае наиболее тяжелой соль-теряющей формы заболевания.

При классификации редких и уникальных мутаций, когда статистический анализ клинических проявлений невозможен, наиболее надежным подходом является функциональная характеристика мутаций in vitro с последующим анализом модели пространственной структуры CYP21A2 и установление соответствия между эффектами, обнаруженными in vitro, и фенотипом пациента.

Для проведения функционального анализа мутаций CYP21A2 in vitro наиболее часто используемой системой экспрессии является система на основе клеток млекопитающих линии COS-1 и COS-7. Имеются также данные по экспрессии гена CYP21A2 в дрожжах, а также в клетках млекопитающих с использованием вируса осповакцины. Однако одним из наиболее перспективных подходов к получению высокого уровня экспрессии (в среднем 3-10% от общего количества белка клетки) функционально-активных белков эукариот, в большинстве случаев прошедших все стадии посттрансляционной модификации и созревания, для проведения функционального анализа и кристаллографии является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Несколько цитохромов Р450 были успешно синтезированы в клетках насекомых, однако данных по экспрессии гена 21-гидроксилазы до настоящего времени не было.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является функциональная характеристика уникальных миссенс-мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, выявленных при проведении молекулярно-генетического тестирования российских пациентов в рамках совместного проекта Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Эндокринологического научного центра РАМН. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1 - введение миссенс-мутаций в кДНК гена 21-гидроксилазы человека для изучения свойств мутантных вариантов фермента in vitro;

2-получение рекомбинантных векторов для экспрессии кДНК стероид 21-гидроксилазы дикого типа и анализируемых мутантных вариантов в клетках млекопитающих линии COS-7 и клетках насекомых линий Sf9 и Hi5;

3 - определение влияния мутаций на биосинтез и ферментативную активность 21-гидроксилазы и ее свойства в клетках COS-7;

4 - получение функционально-активной стероид 21-гидроксилазы в клетках насекомых и изучение влияния одной из мутаций - C169R - на функциональную активность фермента в микросомных фракциях клеток насекомых;

5-анализ модели пространственной структуры 21-гидроксилазы, определение структурно-функциональных последствий аминокислотных замен, определяемых изучаемыми мутациями.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Грищук, Юлия Владимировна

выводы

1. Анализ каталитической активности мутантных вариантов стероид 21-гидроксилазы человека C169R, G178R W302R и R426C, проведенный в системе клеток млекопитающих COS-7, показал, что все они неактивны в отношении двух субстратов фермента - 170НП и прогестерона.

2. Установлено, что инактивирующий эффект в случае всех исследуемых миссенс-мутаций не связан с нарушением биосинтеза, внутриклеточной локализации и общей укладки молекулы стероид 21-гидроксилазы в клетках COS-7.

3. Получена рекомбинантная функционально-активная стероид 21-гидроксилаза с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 с использованием рекомбинантных бакуловирусов.

4. Проведен анализ каталитической активности мутантного варианта C169R в микросомных препаратах из клеток Hi5. Результаты исследования совпадают с результатами, полученными на интактных клетках COS-7, и свидетельствуют о практически полном отсутствии активности в отношении двух субстратов фермента - 170НП и прогестерона, не связанном со снижением уровня синтеза мутантного белка или нарушением его внутриклеточной локализации.

5. В результате моделирования влияния миссенс-мутаций на трехмерную структуру молекулы стероид 21-гидроксилазы предложены возможные механизмы инактивации фермента, наблюдаемой in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен функциональный анализ четырех новых, не описанных ранее мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, обнаруженных у пациентов с классическими формами недостаточности 21-гидроксилазы. Показано, что все мутации приводят к потере активности фермента по отношению к двум субстратам - 170НП и прогестерону. При этом исследуемые замены аминокислот не влияют на биосинтез CYP21A2 и внутриклеточную локализацию в эндоплазматическом ретикулуме. Мутации G178R и R426C обнаружены в гетерозиготном состоянии у пациентов с простой вирильной формой дефицита 21-гидроксилазы совместно с хорошо охарактеризованной и часто встречающейся мутацией I172N в другом аллеле. Мутация I172N относится к группе мутаций средней тяжести и чаще всего ассоциирована с простой вирильной формой. Поскольку известно, что в подавляющем большинстве случаев фенотип при адреногенитальном синдроме определяется наименее поврежденным аллелем, клинические проявления пациентов F и V находятся в соответствии с установленным генотипом. Ожидаемое генотип-фенотипическое соответствие обнаружено и для пациента Р. Мутация W302R, по нашим данным полностью инактивирующая фермент, представлена в гемизиготном состоянии, и приводит к наиболее тяжелой соль-теряющей форме АГС у пациента. Мутация C169R обнаружена у пациента с простой вирильной формой дефицита 21-гидроксилазы совместно с делецией большого участка гена во втором аллеле. При этом в большинстве случаев наблюдаемые клинические проявления напрямую зависят от повреждающего эффекта мутации, обнаруживаемой в сохранившемся аллеле. Мутации, ассоциированные с простой вирильной формой заболевания, как правило, при измерении in vitro проявляют остаточную активность 1-5 % от активности 21-гидроксилазы дикого типа. Однако данные по измерению активности CYP21A2-C169R на целых клетках COS-7 свидетельствуют о полной утрате ферментативной активности мутантным ферментом по отношению к двум субстратам CYP21A2. Сходные результаты были получены и в более эффективной системе измерения - в микросомных препаратах из клеток насекомых Hi5. Таким образом, мутация C169R может быть классифицирована как тяжелая, а исследуемый случай, вероятно, можно отнести к одному из редких примеров несоответствия генотипа и проявляемого фенотипа при дефиците 21-гидроксилазы.

Стероид 21-гидроксилаза человека получена нами в клетках насекомых с использованием рекомбинантных бакуловирусов. Высокий выход активного фермента позволяет рассматривать бакуловирусную систему экспрессии как высокоэффективную для синтеза CYP21A2 в культивируемых клетках насекомых и функционального анализа мутаций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Грищук, Юлия Владимировна, 2006 год

1. Белжеларская С.Н. Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых.//Молекуляр. биология. -2002,- Вып.36.-С.371-385.

2. Вартанян J1.C., Рашба Ю.Э., Наглер Л.Г. Мембраны субклеточных органелл как источник супероксидных радикалов при ишемии печени.// Бюл.эксперим.биологии и медицины.- 1990.-№6.-С.550-552.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование./ М.-Мир,-1984.- 480 с.

4. Осиновская Н.С., Иващенко Т.Э., Соболева Е.Л., Баранов B.C., Потин В.В., Плотников Е.В. Анализ спектра мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы у больных с адреногенитальным синдромом.// Генетика.-2000.-Вып.36.-№8.-С.1147-1149.

5. Al-Othman A.N., Docherty К., Makgoba N.W., Sheppard М.С., London D.R. DNA and RNA analysis of cytochrome P-450 21-hydroxylase: transcriptional activity in congenital adrenal hyperplasia.// J Mol Endocrinol.-1988.-V. 1 .-P. 157-164.

6. Antonarakis S.E. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group.// Hum Mutat.-1998.-V.11.-P.1-3.

7. Arnold G.E., Ornstein R.L. Molecular dynamics study of time-correlated protein domain motions and molecular flexibility: cytochrome P450BM-3.// Biophys J.-1997.-V.73.-T.3.-P.1147-1159.

8. Asseffa A., Smith S.J., Nagata K., Gillette J., Gelboin H.V., Gonzalez F.J. Novel exogenous heme-dependent expression of mammalian cytochrome P450 using baculovirus.// Arch Biochem Biophys.-1989.-V.274.-P.481-490.

9. Bachega T.A., Billerbeck A.E., Modureira G., Arnhold I.J., Medeiros M.A., Marcondes J.A., Lonqui C.A., Nicolau W., Bloise W., Mendonca

10. B.B. Low frequency of CYP21B deletions in Brazilian patients with Congenital Adrenal Hyperplasa due to 21-hydroxylase deficiency// Hum.Hered.-1999.-V.49.-P.9-14.

11. Bachega T.A., Billerbeck A.E., Madureira G., Marcondes J.A., Longui

12. C.A., Leite M.V., Arnhold I.J., Mendonca B.B. 21-Hydroxylase deficiency in Brazil.// Braz J Med Biol Res.-2000.- V.33.-I.10.-P.1211-1216.

13. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life Technologies, Inc./ St.Louis.-1993.

14. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life Technologies, Inc./ www.invitrogen.com.-2004.

15. Baculodirect Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life technologies, Inc./ www.invitrogen.com.-2006.

16. Baculovirus Expression Vector System Manual. Instruction Manual. Pharmingen. / www.pharmingen.com. -1999.

17. Barbaro M, Baldazzi L, Balsamo A, Lajic S, Robins T, Barp L, Pirazzoli P, Cacciari E, Cicognani A, Wedell A. 2006. Functional studies of two novel and two rare mutations in the 21-hydroxylase gene. J Mol Med. 84(6), 521-528.

18. Beale D., Feinstein A. Structure and function of the constant regions of immunoglobulins.// Q Rev Biophys.-1976.-T.9.-V.2.-P.135-180.

19. Bernhardt R., Pommerening K., Ruckpaul K. Modification of carboxyl groups on NADPH-cytochrome P-450 reductase involved in binding of cytochromes с and P-450 LM2.// Biochem Int.-1987.-V.14.-T.5.-P.823-832.

20. Beyenburg S., Watzka M., Clusmann H., Blumcke I., Bidlingmaier F., Elger C.E., Stoffel-Wagner B. Messenger RNA of steroid 21-hydroxylase (CYP21) is expressed in the human hippocampus//Neurosci Lett.-2001.-V.308-P.111-114.

21. Biagini C., Ceiler C. CDNA-directed expression of two allelic variants of cytochrome P450 2C11 using COS1 and SF21 insect cells// Arch Biochem Biophys.-1996.-T.326.-V.2.-P.298-305.

22. Black S.D., Martin S.T., Smith C.A. Membrane topology of liver microsomal cytochrome P450 2B4 determined via monoclonal antibodies directed to the halt-transfer signal.// Biochemistry.- 1994.-V.33.-P.6945-6951.

23. Bormann M, Kochhan L, Knorr D, Bidlingmaier F, Olek K. Clinical heterogeneity of 21-hydroxylase deficiency of sibs with identical 21-hydroxylase genes.// Acta Endocrinol.-1992.-V.126.-P.7-9.

24. Bridges A., Gruenke L., Chang Y.T., Vakser I.A., Loew G., Waskell L. Identification of the binding site on cytochrome P450 2B4 for cytochrome b5 and cytochrome P450 reductase.// J Biol Chem.-1998.-V.273.-T.27.-P.17036-17049.

25. Bryan G.T., Lewis A.M., Harkins J.B., Micheletti S.F., Boyd G.S. Cytochrome P450 and steroid 21-hydroxylation in microsomes from beef adrenal cortex// Steroids.-1974.-T.23.-V.2.-P.185-201.

26. Buters J.T.N., Korzekwa K.R., Kunze K.L., Omata Y., Hardwick J.P., Gonzalez F.J. cDNA-directed expression of human cytochrome P450 CYP3A4 using baculovirus.// Drug Methab Dispos Bio Fate Chem.-1994.-V.22.-P.688-692.

27. Carrera P, Bordone L, Azzani T, Brunelli V, Garancini MP, Chiumello G, Ferrari M. Point mutations in Italian patients with classic, non-classic, and cryptic forms of steroid 21-hydroxylase deficiency.// Hum Genet.-1996.-V.98.-I.6.-P.662-665.

28. Carrington M. Recombination within the human MHC// Immunol Rev.-1999.-V. 167.-P.245-256.

29. Casey M.L., Winkel C.A., MacDonald P.C. Conversion of progesterone to deoxycorticosterone in the human fetus: steroid 21-hydroxylase activity in fetal tissues// J Steroid Biochem.-1983.-V.18.-P.449-452.

30. Chen L., Buters J.T.M., Hardwick J.P., Tamura Sh., Penman B.W., Gonzalez F.J., Crespi Ch.L. Coexpression of cytochrome P4502A6 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the baculovirus system.// Drug Methab Dispos.-1997.-V.25.-P.399-405.

31. Chen S., Zhou D. Functional domains of aromatase cytochrome P450 inferred from comparative analyses of amino acid sequences and substantiated by site-directed mutagenesis experiments.// J Biol Chem.-1992.-V.267.-T.31 .-P.225 87-22594.

32. Chin K.K., Chang S.F. The -104G nucleotide of the human CYP21 gene is important for CYP21 transcription activity and protein interaction.// Nucleic Acids Res.-1998.-V.26.-P.1959-1964.

33. Chiou S.H., Ни M.C., Chung B.C. AmissensemutationatIlel72Asnor Arg356Trp causes steroid 21-hydroxylase deficiency.// J Biol Chem.-1990.-T.265.-V.6.-P.3549-3552.

34. Coghlan V.M., Vickery L.E. Site-specific mutations in human ferredoxin that affect binding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc.// J Biol Chem. 1991.-V.266.-T.28.-P.18606-18612.

35. Collier S., Tassabehji M., Sinnott P.J., Strachan Т. A de novo pathological point mutation at the 21-hydroxylase locus: implications for gene conversion in the human genome.// Nat Genet.-1993.-V.3.-P.260-265; V.4.-P.101.

36. Cooper D.N., Youssoufian H. The CpG dinucleotide and human genetic disease.//Hum Genet.-1988.-V.78.-P.151-155.

37. Coon M.J., Vaz A.D., McGinnity D.F., Peng H.M. Multiple activated oxygen species in P450 catalysis: contributions to specificity in drug metabolism.// Drug Metab Dispos.-1998.-T.26.-V.12.-P.l 190-1193.

38. Cupp-Vicker J.R., Li H., Poulos T.L. Structure of cytochrome P450eryf involved in erythromycin biosynthesis.//Nature Struct Biol.-1995.-V.2.-P.144-153.

39. Curnow К., Slutsker L., Vitek J., Cole Т., Speiser P., New M., White P., Pascoe L. Mutations in the CYP11B1 Gene Causing Congenital Adrenal Hyperplasia and Hypertension Cluster in Exons 6, 7, and 8.// PNAS.-1993.-V.90.-P.4552-4556.

40. Day D.J., Speiser P.W., White P.C., Barany F. Detection of steroid 21 -hydroxylase alleles using gene-specific PCR and a multiplexed ligation detection reaction.// Genomics.-1995.-V.29.-P.152-162.

41. Dawkins R., Leelayuwat C., Gaudieri S., Hui J., Cattley S., Martinez P., Kulski J. Genomics of the major histocompatibility complex: haplotypes, duplication, retroviruses and disease.// Immunol Rev.-1999,-V. 167.-P.275-304.

42. Deiter H.H., Muller-Eberhard U., Johnson E.F. Identification of rabbit microsomal P-450 isozyme, form I, as a hepatic progesterone 21-hydroxylase.// Biochem Biophys Res Comm.-1982.-V.105.-P.515-520.

43. Endoh A., Natsume H., Igarashi Y. Dual regulation of 21 -hydroxylase activity by sex steroid hormones in rat hepatocytes.// J Steroid Biochem Mol Biol.-1995.-V.54.-P. 163-165.

44. Endoh A., Yang L., Hornsby P.J. CYP21 pseudogene transcripts are much less abundant than those from the active gene in normal humanadrenocortical cells under various condition in culture.// Mol Cell Endocrinol.-1998.-V. 137-P. 13-19.

45. Ezquieta В., Oliver A., Gracia R., Gancedo P.G. Analysis of steroid 21-hydroxylase gene mutations in the Spanish population.// Hum Genet.-1995.-V.96.-P. 198-204.

46. Ezquieta В., Varela J.M., Jariego C., Oliver A., Gracia R. Nonisotopic detection of point mutations in CYP21B gene in steroid 21-hydroxylase deficiency.// Clin Chem.-1996.-V.42.-P.l 108-1110.

47. Fardella C., Hum D., Homoki J., Miller W. Point mutation of Arg440 to His in cytochrome P450cl7 causes severe 17 alpha-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1994.-V.79.-P.160-164.

48. Gotoh 0. Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences.//J Biol Chem.-1992.-V.267.-P.83-90.

49. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling.// Electrophoresis.-1997.-V.18.-P.2714-23.

50. Hasemann C.A., Ravichandran K.G., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure and refinement of cytochrome P450terp at 2.3 A resolution.// J Mol Biol.-1994.-T.236.-V.4.-P. 1169-1185.

51. Hasia J.G. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays.// Nat Genet.-1999.-V.21 -P.42-47.

52. Hayashi Z., Orimo H., Araki Т., Shimada T. Prenatal diagnosis of steroid 21-hydroxylase deficiency by analysis of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) profiles.// Prenatal Diagn.-1997.-V. 17.-P.43 5-442.

53. Helmberg A., Tusie-Luna M.T., Tabarelli M., Kofler R., White P.C. R339H and P453S: CYP21 mutations associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency that are not apparent gene conversions.// Mol Endocrinol.-1992.-V.6-P. 1318-1322.

54. Higashi Y., Yoshioka H., Yamane M., Gotoh O., Fujii-Kuriyama Y. Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene.// Proc Natl Acad Sci USA.-1986.-V.83.-P.2841-2845.

55. Higashi Y., Tanae A., Inoue H., Fujii-Kuriyama Y. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21) gene: implications for steroid 21-hydroxylase deficiency.// Am J Hum Genet.-1988.-V.42.-P.17-25.

56. Higashi Y., Fujii-Kuriyama Y. Functional analysis of mutant P450 (C21) genes in COS cell expression system.// Methods Enzymol.-1991.-V.206-P.166-173.

57. Hogstrand K., Bohme J. Gene conversion can create new MHC alleles.// Immunol Rev.-1999.-V. 167.-P.305-317.

58. Honig В., Nicholls A. Classical electrostatics in biology and chemistry.// Science.-1995.-V.268.-T.5214.-P.l 144-1149.

59. Hsu L.C., Ни M.C., Cheng H.C., Lu J.C., Chung B.C. The N-terminal hydrophobic domain of P450c21 is required for membrane insertion and enzyme stability.//J Biol Chem.-1993.-V.268.-14682-14686.

60. Ни M.C., Hsu L.C., Hsu N.C., Chung B.C. Function and membrane topology of wild-type and mutated cytochrome P-450c21.// Biochem J.-1996.-V.316.-P.325-329.

61. Ни M.C., Chung B.C. Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: a system to characterize normal and mutant enzymes.// Mol Endocrinol.-1990.-V.4.-P.893-898.

62. Ichikawa Y., Kroda M., Yamano T. Zonation of hemoprotein P-450 and cytochrome b5 in the adrenocortex of mammals.// J Cell Biol.-1984-V.45.-P.640-643.

63. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of E.coli with plasmids.// Gene.-1990.- V.6.-P.23-28.

64. Jeffreys A.J., Kauppi L., Neumann R. Intensely punctate meiotic recombination in the class II region of the major histocompatibility complex.// Nat Genet.-2001.-V.29.-P.217-222.

65. Johnson R.D., Jasin M. Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells.// EMBO J.-2000.-V.19.-P.3398-3407.

66. Joint LWPES/ESPE САН Working Group. Consensus statement on 21 -hydroxylase deficiency from the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society and the European Society for Paediatric Endocrinology.// J Clin Endocrinol Metab.-2002.-V.87.-P.4048-53.

67. Kassner RJ. A theoretical model for the effects of local nonpolar heme environments on the redox potentials in cytochromes.// J Am Chem Soc.-1973.-T.95.-V.8.-P.2674-2677.

68. Kayes-Wandover K.M., White P.C. Steroidogenic enzyme gene expression in the human heart//J Clin Endocrinol Metab.-2000.-V.85-P.2519-2525.

69. Killeen A.A., Sane K.S., Orr H.T. Molecular and endocrine characterization of a mutation involving a recombination between the steroid 21-hydroxilase functional gene and pseudogene.// J Steroid Biochem Mol Biol.-1991.-V.38.-P.677-686.

70. Kitamura M., Buczko E., Dufau M.L. Dissociation of hydroxylase and lyase activities by site-directed mutagenesis of the rat P45017 alpha.// Mol Endocrinol.-1991.-V.5.-T.10.-P. 1373-1380.

71. Koppens PF, Hoogenboezem T, Degenhart HJ. Duplication of the CYP21A2 gene complicates mutation analysis of steroid 21-hydroxylasedeficiency: characteristics of three unusual haplotypes.// Hum Genet.-2002.-V. 111 .-T.4,5.-P.405-410.

72. Kronbach Т., Larabee T.M., Johnson E.F. Hybrid cytochromes P-450 identify a substrate binding domain in P-450IIC5 and P-450IIC4.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1989.-V.86.-P.8262-8265.

73. Lajic S., Levo A., Nikoshkov A., Lundberg Y., Partanen J., Wedell A. A cluster of missense mutations at Arg356 of human steroid 21-hydroxylase may impair redox partner interaction.// Hum Genet.-1997.-T.99.-V.6.-P.704-709.

74. Lajic S., Nikoshkov A., Hoist M., Wedell A. Effects of missence mutations and deletions on membrane anchoring and enzyme function of human steroid 21-hydroxylase.// Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.257.-P.384-390.

75. Lajic S., Robins Т., Krone N., Schwarz H.P., Wedell A. CYP21 mutations in simple virilizing congenital adrenal hyperplasia.// J Mol Med.-2001.-V.79.-P.581-586.

76. Lajic S., Clauin S., Robins Т., Vexiau P., Blanche H., Bellanne-Chantelot C., Wedell A. Novel mutations in CYP21 detected in individuals with hyperandrogenism.// J Clin Endocrinol Met.-2002.-V.86.-T.6.-P.2824-2829.

77. Lee H.H., Chao H.T., Ng H.T., Choo K.B. Direct molecular diagnosis of CYP21 mutations in congenital adrenal hyperplasia.// J Med Genet.-1996.-V.33.-P.371-375.

78. Lee H.H., Chao H.T., Lee Y.J., Shu S.G., Chao M.C., Kuo J.M., Chung B.C. Identification of four novel mutations in the CYP21 gene in congenital adrenal hyperplasia in the Chinese.// Hum Genet.-1998.

79. V. 103 .-1.3 .-P.3 04-310.

80. Lee H.H., Kuo J.M., Chao H.T., Lee Y.T., Chang J.T., Tsai C.H., Chung B.C. Carrier analysis and prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia caused by 21-hydroxylase deficiency in Chinese.// J Clin Endocrinol Metab.-2000-V.85.-P.597-600.

81. Lee H.H. CYP21 mutations and congenital adrenal hyperplasia.// Clin Genet.-2001 .-V.59.-P.293-3 01.

82. Lee S.-J., Buhler D.R. Functional properties of a rainbow trout CYP3A27 expressed by recombinant baculovirus in insect cells.// Drug Metab Disp.-2002.-V.30.-P. 1406-1412.

83. Levo A., Partanen J. Novel mutations in the human CYP21 gene.// Prenatal Diagn.-2001 .-V.21 .-P.885-889.

84. Lindberg R.L., Negishi M. Alteration of mouse cytochrome P450coh substrate specificity by mutation of a single amino-acid residue.// Nature.-1989.- V.339.-T.6226.-P.632-634.

85. Luo Z., He Y.A., Halpert J.R. Role of residues 363 and 206 in conversion of cytochrome P450 2B1 from a steroid 16-hydroxylase to a 15 alpha-hydroxylase.// Arch Biochem Biophys.-1994.- V.309.-P.52-57.

86. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. A laboratory manual./ Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982.

87. Martinsohn J.T., Sousa A.B., Guethlein L.A., Howard J.C. The gene conversion hypothesis of MHC evolution: a review.// Immunogenetics.1999.-V.50.-P. 168-200.

88. Matthews F.S. The structure, function and evolution of cytochromes.// Prog Biophys Molec Biol.-1985.-V.85.-P. 1-56.

89. Mellon S.H., Miller W.L. Extraadrenal steroid 21-hydroxylation is not mediated by P450c21.// Clin Invest.-1989.-V.84-P.1497-1501.

90. Miller W.L. Molecular biology of steroid hormone synthesis.// Endocr Rev.-1988.-V.9.-P.295-318.

91. Milstone D.S., Shaw S.K., Parker K.L., Szyv M., Seidman J.G. An element regulating adrenal-spesific steroid 21-hydroxylase expression is located within the Sip gene.// J Biol Chem.-1992.-V.267.-P.21924-21927.

92. Miyazawa M., Sugie A., Shimada T. Roles of human CYP2A6and 2B6 and rat CYP2C11 and 2B1 in the 10-hydroxylation of (-)-verberone by liver microsomes.// Drug Metab Disp.-2003.-V.31.-P.l049-1053.

93. Modi S., SutcliffeM.J., Primrose W.U., LianL.Y., Roberts G.C. The catalytic mechanism of cytochrome P450 BM3 involves a 6 A movement of the bound substrate on reduction.// Nat Struct Biol.-1996.-V.3.-T.5.-P.414-417.

94. Monier S., Van Luc P., Kreibich G., Sabatini D.D., Adesnik M. Signals for the incorporation and orientation of cytochrome P450 in the endoplasmic reticulum membrane.// J Cell Biol.-1988.-V.107.-P.457-470.

95. Mornet E., Gibrat J.F. A 3D model of human P450c21: study of the putative effects of steroid 21-hydroxylase gene mutations.// Hum Genet.2000.-V.106.-P.330-339.

96. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins.// J Biol Chem.-1988.-V.263.-P.6038-6050.

97. New M.I., White P.C., Pang S., Dupont В., Speiser P.W. The adrenal hyperplasias. In: Scriver Ch.R. et al., eds.: The metabolic basis of inherited disease./ New York-London.-McGraw-Hill.-1989.

98. New M.I. Prenatal treatment of congenital adrenal hyperplasia: the United States experience.// Endocrinol Metab Clin.-2001.-V.30.-P.l-13.

99. Nikoshkov A., Lajic S., Hoist M., Wedell A., Luthman H. Synergistic effect of partially inactivating mutations in steroid 21-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1997.-V.82.-P. 194-199.

100. Nunez B.S., Lobato M.N., White P.C., Meseguer A. Functional analysis of four CYP21 mutations from spanish patients with congenital adrenal hyperplasia.//Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.262.-P.635-637.

101. Ohlsson G., Schwartz M. Mutations in the gene encoding 21-hydroxylase detected by solid-phase minisequensing.// Hum Genet.-1997.-V.99.-P.98-102.

102. Ohlsson G., Muller J., Skakkebaek N.E., Schwartz M. Steroid 21-hydroxylase deficiency: mutational spectrum in Denmark, three novel mutations, and in vitro expression analysis.// Hum Mutat.-1999.-V.13.-I.6.-P.482-486.

103. Ohta D., Matsu-ura Y., Sato R. Expression and characterization of a rabbit liver cytochrome P450 belonging to P450IIB subfamily with the aid of the baculovirus expression vector system.// Biochem Biophys Res Commun-1991.- T.l 75.-V.2.-P.394-399.

104. Omura и Sato, The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties.// J Biol Chem.-1964.-V.39.-P.2379-2385.

105. Oriola J., Plensa I., Machuca I., Pavia C., Rivera-Fillat F. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene.// Clin Chem.-1997.-V.43.-P.557-561.

106. Owerbach D., Crawford Y.M., Draznin M.B. Direct analysis of CYP21B genes in 21-hydroxylase deficiency using polymerase chain reaction amplification.// Mol Endocrinol.-1990.-V.4.-P.125-131.

107. Owerbach D., Sherman L., Ballard A.L., Azziz R. Pro-453 to Ser mutation is associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency.// Mol Endocrinol.-1992.-V.6.-P. 1211-1215.

108. Paine M.J.I., Gilham D., Roberts G.C.K., Wolf R. Functional high level expression of cytochrome P450 CYP2D6 using baculoviral expression systems.// Arch Biochem Biophys.-1996.-V.328.-P.143-150.

109. Pang S., Murphey W., Levine L.S., Spence D., Leon A., La Franchi S., Surve A., New M.I. A pilot newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in Alaska.// J Clin Endocrinol Metab.-1982.-V.55.-P.413-420.

110. Patience C., Wilkinson D.A., Weiss R.A. Our retroviral heritage.// Trends Genet.-1997.-V. 13 .-P. 116-120.

111. Paulsen M.D., Ornstein R.L. Active-site mobility inhibits reductive dehalogenation of 1,1,1-trichloroethane by cytochrome P450cam.// J Comput Aided Mol Des.-1994.-V.8.-T.4.-P.389-404.

112. Peterson J.A., Graham S.E. A close family resemblance: the importance of structure in understanding cytochromes P450.// Structure.-1998.-V.6.1. P.l 079-1085.

113. Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalus I.C., Wagner G.C., Kraut J. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450.// J Biol Chem.-1985.-T.260.-V.30.-P.16122-16130.

114. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.// J Mol Biol.-1987.-V.195.-P.687-700.

115. Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasemann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure of hemoprotein domain of P450bm-3, a prototype for microsomal P450s.// Science.-1993.-V.261.-P.731-736.

116. Rice D.A., Kronenberg M.S., Mouw A. R., Aitken L.D., Franklin A., Schimmer B.P., Parker K.L. Multiple regulatory elements determine adrenocortical expression of steroid 21-hydroxylase.// J Biol Chem.-1990.-V.265.-P.8052-8058.

117. Rodrigues N.R., Dunham I., Yu C.Y., Carrot M.C., Porter R.R., Campbell R.D. Molecular characterization of the HLA-linked steroid 21-hydroxylase В gene from an individual with congenital adrenal hyperplasia.// EMBO J.-1987.-V.6.-P. 1653-1661.

118. Rogoff D., Gomez-Sanchez C.E., Foecking M.F., Wortsman J., Slominski A. Steroidogenesis in the human skin: 21-hydroxilation in cultured keratinocytes.// J Steroid Biochem Mol Biol.-2001.- V.78.-P.77-81.

119. Rowen L., Dankers C., Baskin D., Faust J., Loretz C., Ahearn M.E., Banta A., Schwartzell S., Smith T.M., Spies Т., Hood L. Sequence determination of 300 kilobases of the human class III MHC locus.// EMBL/GenBank/DDBJ accession number AFO19413.-1999.

120. Sakaguchi M., Mihara K., Sato R. A short amino-terminal segment of microsomal cytochrome P450 functions both as insertion signal and as a stop-transfer sequence.// EMBO J.-1987.-V.6.-P.2425-2431.

121. Schneider P.M., Witzel-Schlomp K., Rittner C., Zhang L. The endogenous retroviral insertion in the human complement C4 gene modulates the expression of homologous genes by antisense inhibition.// Immunogenetics.-2001 .-V.53 .-V. 1 -9.

122. Schoch G.A., Yano J.K., Wester M.R., Griffin K.J., Stout C.D., Johnson E.F. Structure of human microsomal cytochrome P450 2C8. Evidence for a peripheral fatty acid binding site.// J Biol Chem.-2004.-T.279.-V.10.-P.9497-9503.

123. Scott E.E., He Y.A., Wester M.R., White M.A., Chin C.C, Halpert J.R., Johnson E.F., Stout C.D. An open conformation of mammalian cytochrome P450 2B4 at 1.6-A resolution.// Proc Natl Acad Sci U S A.-2003 .-Т. 100.-V.23 .-P. 13196-13 201.

124. Sevrioukova I.F., Li H., Zhang H., Peterson J.A., Poulos T.L. Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1999.-V.96.-P.1863-1868.

125. Sigle R., Titus M., Harada N., Nelson S. Baculovirus mediated high level expression of human placental aromatase (CYP19A1).// Biochem Biophys Res Commun.-1994.-V.201.-P.694-700.

126. Sinnott P.J., Dyer P.A., Price D.A., Harris R., Strachan T. 21-hydroxylase deficiency families with HLA identical affected and unaffected sibs.// J Med Genet.-1989.-V.26.-P. 10-17.

127. Sinnott P.J., Collier S., Costigan C., Dyer P.A., Harris R., Strachan T. Genesis by meiotic unequal crossover of a de novo deletion that contributes to steroid 21-hydroxylase deficiency.// Proc Natl Acad Sci USA.-1990.-V.87.-P.2107-2111.

128. Szklarz G.D., He Y.A., Halpert J.R. Site-directed mutagenesis as a tool for molecular modeling of cytochrome P450 2B1.// Biochemistry.-1995.-V.34-P.14312-14322.

129. Slominski A., Ermak G., Mihm M. ACTG receptor, CYP11A1, CYP 17 and CYP21A2 genes are expressed in skin.// J Clin Endocrin Metab.-1996.-P.2746-2749.

130. Speiser P.W., Agdere L., Ueshiba H., White P.C., New M.I. Aldosterone synthesis in salt-wasting congenital adrenal hyperplasia with complete absence of adrenal 21-hydroxylase.//New Engl J Med.-1991.-V.324.-P.145-149.

131. Stayton P.S., Sligar S.G. The cytochrome P-450cam binding surface as defined by site-directed mutagenesis and electrostatic modeling.// Biochemistry.-1990.-V.29.-T.32.-P.73 81-73 86.

132. Szczesna-Skorupa E., Browne N., Mead D., Kemper B. Positive charges at the NH2 terminus convert the membrane-anchor signal peptide of cytochrome P450 to a secretory signal peptide.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1988.-V.85.-P.738-742.

133. Thompson C.M., Kawashima H, Strobel H.W. Isolation of partially purified P450 2D18 and characterization of activity toward the tricyclic antidepressants imipramine and desipramine.// Arch Biochem Biophys.-1998.-T.359.-V.1.-P.115-121.

134. Tusie-Luna M.T., Traktman P., White P.C. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus.// J Biol Chem.-1990.-V.265.-P.20916-20922.

135. Tusie-Luna M.T., Speiser P.W., Dumic M., New M.I., White P.C. A mutation (Pro-30 to Leu) in CYP21 represents a potential nonclassic131steroid 21-hydroxylase deficiency allele.// Mol Endocrinol.-1991.-V.5.-P.685-692.

136. Tusie-Luna M.T., White P.C. Gene conversions and unequal crossovers between CYP21 (steroid 21-hydroxylase gene) and CYP21P involve different mechanisms.// Proc Natl Acad Sci USA.-1995.-V.92.-P. 1079610800.

137. Vriend G. WHAT IF: a molecular modeling and drug design program.// J Mol Graph.-1990.-V.8.-P.52-56,29.

138. Wada A., Waterman M.R. Identification by site-directed mutagenesis of two lysine residues in cholesterol side chain cleavage cytochrome P450 that are essential for adrenodoxin binding.// J Biol Chem.-1992.- V.267.-P.22877-22882.

139. Wang M., Roberts D.L., Paschke R., Shea T.M., Masters B.S., Kim J.J.P. Three-dimentional structure of NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase: prototype for FMN- and FAD-containing enzymes.// Proc Natl Acad Sci USA.-1997.-V.94.-P.8411-8416.

140. Wang S.-L., He X.-Y., Hong J.-Y. Human cytochrome P450 2S1: lack of activity in the metabolic activation of several cigarette smoke carcinogens and in the metabolism of nicotine.// Drug Methab Dispos.-2005.-V.33.-P.336-340.

141. Wedell A., Ritzen E.M., Haglund-Stengler В., Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: three additional mutated alleles and establishment of phenotype-genotype relationships of common mutations.// Proc Natl Acad Sci USA.-1992.-V.89.-P.7232-7236.

142. Wedell A., Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: two additional mutations in salt-wasting disease and rapid screening of disease-causing mutations.// Hum Mol Gen.l993.-V.2.-P.499-504.

143. White P.C., New M.I., Dupont B. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes.// Proc Natl Acad Sci USA.-1986.-V.83.-P.5111-5115.

144. White P.C., Dupont J., New M.I., Leiberman E., Hochberg Z., Rosier A. A mutation in CYP11B1 (Arg-448-His) associated with steroid 1 lb-hydroxylase deficiency in Jews of Moroccan oridgin.// J Clin Invest.-1991.-V.87.-1664-1667.

145. White P.C., New,M.I. Genetic basis of endocrine disease 2: congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1992.-T.74.-V. 1 .-P. 6-11.

146. White P.C., Speiser P.W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.// Endocr Rev.-2000.-V.21.-P.245-291.133

147. Wijesuriya S.Q., Zhang G., Dardis A., Miller WL. Transcriptional regulatory elements of the human gene for cytochrome P450c21 (steroid 21-hydroxylase) lie within intron 35 of the linked C4B gene// J Biol Chem.-1999.-V.274.-P.38097-38106.

148. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McRee D.E. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structure adaptations for membrane binding and functional diversity.// Molecular Cell.-2000.-V.5.-P.121-131.

149. Williams P.A., Cosme J., Ward A., Angove H.C., Vinkovic D.M., Jhoti H. Crystal structure of human cytochrome P450 2C9 with bound warfarin.// Nature.-2003.-V.424.-P.464-468.

150. Williams PA, Cosme J., Vinkovic D.M., Ward A., Angove H.C., Day P.J., Vonrhein C., Tickle I.J., Jhoti H. Crystal structures of human cytochrome P450 3A4 bound to metyrapone and progesterone.// Science.-2004.-V.305.-P.683-686.

151. Wilson Т.Е., Mouw A.R., Weaver C.A., Milbrandt J., Parker K.L. The orphan nuclear receptor NGFI-B regulates expression of the gene encoding steroid 21-hydroxylase.// Mol Cell Biol.-1993.-V.13.-P.861-868.

152. Wilson R.C., Mercado A.B., Cheng K.S., new M.I. Steroid 21-hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype.// J Clin Endocrinol Metab.-1995.-V.80.-P.2322-2329.

153. Wu D.-A., Chung B. Mutations of P450c21 at Cys428, Val281, and Ser268 result in complete, partial, or no loss of enzymatic activity, respectively.//J Clin Invest.-1991.-V.88.-P.519-523.

154. Yano J.K., Wester M.R., Schoch G.A., Griffin K.J., Stout C.D., Johnson E.F. The structure of human microsomal cytochrome P450 3A4 determined by X-ray crystallography to 2.05-A resolution.// J Biol Chem.-2004.-T.279.-V.37.-P.38091-38094.

155. Yasui H., Hayashi S., Sakurai H. Possible involvement of singlet oxygen species as multiple oxidants in p450 catalytic reactions.// Drug Metab Pharmacokinet.-2005 .-V.20.-P. 1-13.

156. Yoshikawa K., Noguti Т., Tsutjimura M., Koga H., Yasukochi Т., Horiuchi Т., Go M. Hydrogen bond network of cytochrome P-450cam: a network connecting the heme group with helix К.// Biochim Biophys Acta.-1992.-V.l 122.-P.41-44.

157. Zhou Z., Agarwal V.R., Dixit N., White P.C., Speiser P.W. Steroid 21-hydroxylase expression and activity in human lymphocytes.// Mol Cell Endocrinol.-1997.-V. 127.-P. 11 -18.

158. БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность и признательность

159. Светлане Николаевне Белжеларской за чуткое руководство и терпение, за полученные знания, поддержку и помощь при проведении исследования и при написании диссертации;

160. Петру Михайловичу Рубцову за участие, помощь и советы в экспериментальной работе, обсуждении результатов, за прочтение рукописи и замечания;

161. Сотрудникам Эндокринологического научного центра А.Н. Тюльпакову, Т.В. Семичевой, В.А. Петерковой за предоставление необходимых клинических сведений;

162. Людям, чьи данные были использованы в работе;

163. Всем сотрудникам Лаборатории молеулярной эндокринологии ИМБ РАН за ежедневный совместный труд, участие и профессиональные советы.