Клинико-диагностическое значение определения антител к дезоксирибонуклеазе I типа у больных системной красной волчанкой с использованием иммобилизированной гранулированной формы фермента тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.39, кандидат медицинских наук Трофименко, Андрей Степанович

• Трофименко, Андрей Степанович
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Трофименко, Андрей Степанович

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные этиопатогенетические факторы СКВ. Современные представления.

1.2. ДНКаза I. Характеристика фермента.

1.2.1. Структурные и генетические аспекты.

1.2.2. Особенности ферментативной и биологической функции ДНКазы 1.

1.2.3. Иммунологические эффекты ДНКазы I.

1.3. Клинико-патогенетическое значение ДНКазы I и антител к ней при системной красной волчанке.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Клинические методы.

2.1.1. Больные СКВ.

2.1.2. Контрольная группа.

2.1.3. Референтная группа.

2.2. Статистические методы.

2.3. Лабораторные методы.

2.3.1. Получение образцов исследуемого материала.

2.3.2. Характеристика антигена.

2.3.3. Определение ферментативной активности ДНКазы 1.

2.3.4. Определение активности актин-ингибированной фракции ДНКазы 1.

2.3.5. Иммобилизация ДНКазы I.

2.3.6. Определение содержания антител к ДНКазе I с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами.

2.3.7. Прочие лабораторные исследования.

ГЛАВА 3. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУПП.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Активность свободной фракции ДНКазы I в изучаемых группах.

4.1.1. Общая характеристика. Зависимость от пола и возраста.

4.1.2. Зависимость от активности патологического процесса.

4.1.3. Зависимость от продолжительности и характера течения заболевания, а также объема кумулятивного повреждения организма вследствие СКВ.

4.1.4. Зависимость от клинических вариантов заболевания.

4.2. Активность актин-ингибированной фракции ДНКазы I в изучаемых группах.

4.2.1. Общая характеристика. Зависимость от пола и возраста.

4.2.2. Зависимость от активности патологического процесса.

4.2.3. Зависимость от продолжительности и характера течения заболевания, а также объема кумулятивного повреждения организма вследствие СКВ.

4.2.4. Зависимость от клинических вариантов заболевания.

4.3. Концентрация антител к ДНКазе I класса IgG в изучаемых группах.

4.3.1. Общая характеристика. Зависимость от пола и возраста.

4.3.2. Зависимость от активности патологического процесса.

4.3.3. Зависимость от продолжительности и характера течения заболевания, а также объема кумулятивного повреждения организма вследствие СКВ.

4.3.4. Зависимость от клинических вариантов заболевания.

4.4. Влияние актина и специфических антител на активность свободной фракции ДНКазы I в изучаемых группах.

4.5. Диагностическое значение антител к ДНКазе I при системной красной волчанке.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клинико-диагностическое значение определения антител к дезоксирибонуклеазе I типа у больных системной красной волчанкой с использованием иммобилизированной гранулированной формы фермента»

За пять десятилетий, минувших со времени появления концепции P. Klemperer о коллагенозах и последующего вхождения системной красной волчанки (СКВ) в круг ревматических заболеваний, достигнуты определенные успехи в диагностике и лечении этого тяжелого недуга. Создание В.А. Насоновой классификации и диагностических критериев СКВ существенно улучшило диагностику и определило основу для разработки лечебной тактики [52]. Широкое применение глюкокортикостероидов (ГКС) и цитостатических иммунодепрессантов в качестве основных элементов комплексной терапии расширило возможности воздействия на активность патологического процесса. В результате пятилетняя выживаемость при СКВ увеличилась с 40-50% в 1959 г. до 90% к концу XX века; двадцатилетняя выживаемость в настоящее время составляет около 70% [23, 24, 232, 257]. Вместе с тем в учении о СКВ всё ещё остаётся большое количество нерешенных проблем как теоретического, так и практического характера.

Установление диагноза СКВ часто является весьма сложной задачей даже для специалистов-ревматологов [34]. Основной причиной таких затруднений является недостаточная диагностическая значимость признаков, находимых при физикальном осмотре, рутинных лабораторных и инструментальных тестах. В частности, ни один отдельно взятый симптом не имеет одновременно и чувствительности и специфичности выше 60% [400]. Оценивая сочетание синдромов, широко используемые ныне диагностические критерии Американской коллегии ревматологии (ACR) 1997 года позволяют, по мнению авторов, добиться чувствительности 88%) и специфичности 95% для наличия четырех и более признаков [204]. Однако истинная чувствительность этих критериев, скорее всего, существенно меньше. Источником расхождения служат дебютные и хронические формы СКВ, манифестирующие преимущественно как моно- и олигосиндромные. Нередко встречаясь, они, как правило, ведутся под другими диагнозами на протяжении длительного времени вплоть до появления развернутой поли-синдромной клинической картины [24, 350]. Существующие параклинические тесты также не всегда могут служить достаточно прочной основой для диагноза СКВ. С учетом невысокой информативности инструментальных исследований [214], ведущее место в верификации диагноза СКВ принадлежит специализированным иммунологическим методам, в особенности — определению антинуклеарного фактора, антител к дсДНК, Sm-антигену и фосфолипидам. Требованиям клинической практики в большей степени отвечает тест на антитела к дсДНК, имеющий чувствительность 50-70% и специфичность 80-90% [192, 195, 338].

Несовершенство диагностики СКВ является одной из важнейших причин, затрудняющих разработку и внедрение новых, более избирательных методов коррекции аутоиммунного процесса. В настоящее время лечение СКВ основано на использовании ГКС, цитостатических иммуно-депрессантов, аминохинолиновых производных и некоторых экстракорпоральных методов - плазмафереза, гемо- и иммуносорбции [32, 33, 59, 62]. Подавление активности заболевания с помощью этих средств сопровождается частым возникновением опасных побочных эффектов [24]. О серьёзности данной проблемы свидетельствует изменение структуры летальности при СКВ. Если в 60-70-е годы XX века среди причин смерти лидировали люпус-нефрит и нейролюпус, то к началу XXI века на первый план наряду с кардиоваскулярной патологией вышли инфекционные осложнения [15, 23, 209, 279, 280]. Ввиду этого в последние годы активно ведется эмпирический поиск новых подходов к лечению СКВ [35, 65, 284, 287, 292, 399], что делает необходимость усовершенствования её диагностики ещё более актуальной.

Результативность разработки как более избирательных методов лечения, так и улучшенных способов иммунодиагностики СКВ, в значительной степени сдерживается недостаточной изученностью этиопатогенеза данного заболевания. К сожалению, до настоящего времени специфический для СКВ механизм активации аутоиммунитета достоверно не установлен [24]. Одним из наиболее перспективных направлений в этой области сейчас считается гипотеза о возможности взаимосвязи между индукцией иммунного ответа к аутоантигенам при СКВ и нарушением процессов апоп-тоза [43, 335]. Как удалось установить, важным условием поддержания толерантности к внутриклеточным молекулам, включая ДНК и нуклеопро-теиды, является эффективная элиминация апоптозного материала, осуществляемая в том числе с помощью дезоксирибонуклеазы I типа (далее -ДНКаза I ) [176, 301].

Принимая во внимание выявленное ранее снижение активности этого фермента при СКВ [79, 126], представляется актуальным уточнить возможную роль антител к ДНКазе I в генезе указанного феномена, а также перспективы их клинико-диагностического использования. Для достижения этой цели требуется одновременное измерение не только концентрации антител к ДНКазе I и активности сывороточной ДНКазы I, но и интенсивности ингибирования фермента актином (основным ингибитором ДНКазы I in vivo). С учетом низкой концентрации антител к другим ферментам в сыворотке крови больных СКВ [49, 63], для увеличения аналитической чувствительности непрямого иммуноферментного анализа представляется целесообразным модифицировать методику путем использования ДНКазы I, иммобилизированной на магнитоуправляемых гранулах [9].

Цель исследования

Цель данного исследования - усовершенствование иммунологической диагностики системной красной волчанки с помощью антител к ДНКазе I, а также уточнение вклада аутоантител в ингибирование активности ДНКа-зы I при системной красной волчанке.

Основные задачи исследования

1. Получить иммобилизированную форму ДНКазы I, определить оптимальные параметры проведения иммуноферментного анализа с ее использованием.

2. Применяя иммобилизированную форму энзима, изучить распространенность и концентрацию антител к ДНКазе I в сыворотках крови здоровых лиц, больных СКВ, а также контрольной группы, состоящей из пациентов с ревматоидным артритом, системной склеродермией, системными васку-литами, дерматомиозитом, болезнью Шегрена.

3. Исследовать активность ДНКазы I и интенсивность ингибирования фермента актином в сыворотках крови здоровых лиц, больных СКВ и пациентов контрольной группы.

4. Выявить наличие статистических взаимосвязей между клиническими особенностями СКВ и содержанием антител к ДНКазе I, активностью ДНКазы I, интенсивностью ингибирования фермента актином.

5. Количественно оценить эффективность использования антител к ДНКазе I для дифференциальной диагностики СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний.

6. Используя метод множественного регрессионного анализа, охарактеризовать зависимость активности сывороточной ДНКазы I от влияния аутоантител и актина у больных СКВ в сравнении с пациентами контрольной группы.

Научная новизна

1. Впервые продемонстрирована высокая эффективность определения сывороточных антител к ДНКазе I в ходе дифференциальной диагностики

СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиози-та, болезни Шегрена). Вычислены основные операционные характеристики данного теста (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов).

2. Впервые установлена доля больных СКВ со сниженной активностью сывороточной ДНКазы I. Кроме того, показана возможность не только снижения, но и повышения активности сывороточной ДНКазы I у пациентов с СКВ.

3. Впервые показано, что при СКВ активный люпус-нефрит и лимфо-аденопатия ассоциируются как с наличием сывороточных антител к ДНКазе I, так и с изменением активности сывороточной ДНКазы I. Для активного люпус-нефрита характерно повышение активности фермента, для лим-фоаденопатии - снижение.

4. Впервые выявлена связь между снижением активности сывороточной ДНКазы I при СКВ и совместным эффектом нескольких ингибирующих факторов, включая аутоантитела и актин.

Практическое значение

Разработан доступный для применения в клинических лабораториях способ определения уровня сывороточных антител к ДНКазе I, являющийся модификацией иммуноферментного анализа. Главное отличие этого способа - использование иммобилизированного на магнитоуправляемых гранулах фермента в качестве антигена.

Получены доказательства эффективности данного теста при дифференциальной диагностике СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиозита, болезни Шегрена). Определено пороговое значение и его операционные характеристики, позволяющие интерпретировать результат теста с позйций вероятности диагноза СКВ. Уточнена взаимосвязь клинико-иммунологических проявлений СКВ (активного люпус-нефрита, лимфоаденопатии, наличия антител к дсДНК) с наличием антител к ДНКазе I.

Основные положения, выносимые на защиту

Наличие сывороточных антител к ДНКазе I — признак, часто встречающийся при СКВ, в особенности у больных с активным люпус-нефритом, лимфоаденопатией и наличием сывороточных антител к дсДНК.

Результат определения сывороточных антител к ДНКазе I может быть использован для дифференциальной диагностики СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиозита, болезни Шегрена).

Антитела к ДНКазе I способны ингибировать сывороточный фермент, являясь одной из причин снижения активности энзима, наблюдаемого у части больных СКВ.

Внедрение в практику

Методы определения активности ДНКазы I, антител к ДНКазе I с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи №25» города Волгограда.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 4 -в центральной печати и 6 - в местной печати.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2004-2008 гг.), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г), XII и XIV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005 г., 2007 г), научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции» (Волгоград, 2005 г), I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006 г). Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Ученого совета ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 16 июня 2008 года (протокол №3).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением использованных методов исследования, клинической характеристики пациентов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 25 таблицами, содержит 2 выписки из истории болезни. Библиографический указатель включает 407 источников, в том числе 73 - на русском языке и 334 - на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Ревматология», Трофименко, Андрей Степанович

126 Выводы

1. При использовании иммуноферментного анализа с иммобилизирован-ной гранулированной формой ДНКазы I антитела к этому ферменту в сыворотках крови больных системной красной волчанкой выявляются значительно чаще (64,81%), чем в среднем при других аутоиммунных ревматических заболеваниях: ревматоидном артрите, системной склеродермии, системных васкулитах, дерматомиозите, болезни Шегрена (15,38%). У здоровых лиц антитела к ДНКазе I в сыворотке крови отсутствуют.

2. Измерение содержания сывороточных антител к ДНКазе I позволяет дифференцировать системную красную волчанку от других аутоиммунных ревматических заболеваний с высокой эффективностью, не уступающей определению антител к дсДНК. Чувствительность диагностики системной красной волчанки увеличивается при одновременном тестировании как антител к дсДНК, так и антител к ДНКазе I.

3. У больных системной красной волчанкой наличие сывороточных антител к ДНКазе I ассоциируется с присутствием сывороточных антител к дсДНК, активным люпус-нефритом, лимфоаденопатией. С двумя последними проявлениями системной красной волчанки также ассоциируется изменение активности сывороточной ДНКазы I. Для активного люпус-нефрита характерно повышение активности фермента, для лимфоадено-патии - снижение.

4. Изменение активности сывороточной ДНКазы I при системной красной волчанке имеет двойственный характер. С одной стороны, крайне низкие значения активности фермента встречаются при системной красной волчанке значительно чаще (29,63%) , чем у здоровых лиц (9,09%) и больных другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями (5,77%). С другой стороны, у основной части (70,37%) больных системной красной волчанкой средняя активность ДНКазы I выше, чем у здоровых лиц и больных другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями.

5. Снижение активности сывороточной ДНКазы I при системной красной волчанке обусловлено совместным влиянием нескольких факторов. Преимущественный эффект аутоантител и/или актина показан для 50% случаев крайне низкой активности фермента. У другой половины главная роль принадлежит неидентифицированному ингибитору ДНКазы I, действие которого усиливается при нарастании активности системной красной волчанки. У больных другими аутоиммунными заболеваниями признаков наличия такого ингибитора не отмечено.