Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous: Генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук Яненко, Александр Степанович

• Яненко, Александр Степанович
• доктор биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации доктор биологических наук Яненко, Александр Степанович

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СКРИНИНГА

БАКТЕРИЙ, СПОСОБНЫХ УТИЛИЗИРОВАТЬ НИТРИЛЫ.

Ь1. Таксономическое разнообразие изолятов.

1.2. Анализ путей утилизации нитрилов у отобранных изолятов.

2. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ ШОООСОССШШдООСИЯОШ М8: ОБЩАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА И ОСОБЕННОСТИ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ.

2.1. Общее описание штамма.

2.2. Свойства нитрилгидратазной активности штамма Я. гкоёосИгош М8.

2.3. Физико-химические и каталитические свойства амидазы из Я. гкоёосИгош М8.

3 .ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ У

Я. ЯИОООСИЯОШ М8.А.

3.1. Разработка систем клонирования и переноса генов для Якойососсш 8рр.

3.2. Исследование локуса хромосомы Я.ткойосктош М8, контролирующего утилизацию нитрилов.

3.3. Экспрессия клонированного гена НГ.

3.4. Выделение и свойства мутантов с измененной способностью утилизировать нитрилы.

4. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ У Я.гЬойосЬгош М8.

4.1. Амид-зависимая индукция синтеза НГ и АМ.

4.2. Кобальт-зависимая регуляция НГ активности в Я.гЬо^сЬгош М8.

4.3. Углеродная катаболитная репрессия метаболизма нитрилов у Я.ткойосктош М

4.4. Роль ионов аммония в регуляции метаболизма нитрилов у Я.гко4осИгош М8.

5. ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ.

5.1. Создание биокатализаторов на основе штамма Я.ткойосктош М8.

5.2. Получение акриламида с помощью биокатализа.

5.3. Бйокаталитический метод получения никотинамида.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous: Генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование»

В основе современных методов получения разнообразных синтетических соединений лежат каталитические процессы, которые, как правило, проводят при высоких температурах и давлении в присутствии сложных гетерогенных катализаторов. Использование в качестве катализаторов клеток микроорганизмов или их ферментов позволяет осуществить такие процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) с высокой селективностью и специфичностью. В отличие от традиционных катализаторов, биокатализаторы способны также осуществлять стереоселективные и регеоселективные реакции. Таким образом, биокаталитические процессы формируют новый облик химии, основанной на энергосберегающих, безотходных и экологически безопасных технологиях. Однако, в современной химической индустрии использование биокатализа все еще ограничено. Во многих случаях биокаталитические процессы неспособны конкурировать с традиционными технологиями по уровню себестоимости продукта. Большой прогресс в области изучения структуры и функций ферментов, массовое секвенирование геномов бактерий, успехи метаболической инженерии, исследование микробного биоразнообразия, развитие новых методов направленной эволюции позволяют надеятся, что биотехнологии все шире будут внедрятся в химическую промышленность, способствуя становлению новой отрасли-«зеленой химии».

Идеи о возможности использования в качестве биокатализаторов ферментов (нитрилгидратаз и нитрилаз), участвующих в метаболизме нитрилов, бьши высказаны уже в первых работах, посвященных изучению нитрилутилизирующих бактерий (в начале 70 годов). Первой реализовала эту идею компания Нитто (Япония), создав производство акриламида, основанное на биокатализе. В качестве биокатализаторов были использованы бактериальные штаммы -Corynebacterium (Rhodococcus) sp. N-774 и Pseudomonas chlor or aphis В-23, обладающие нитрилгидратазной активностью (Watanabe et al.,1987; Asano et al.,1982). Несмотря на значительные преимущества биокаталитического метода по сравнению с традиционными химическими технологиями, используемые биокатализаторы, обладали рядом недостатков: их активность ингибировалась акриламидом и, как следствие этого, с их помощью удавалось получать в промышленных условиях растворы, содержащие не более 27% акриламида. Для получения товарной формы (40-50% растворы) требовалась стадия концентрирования. Кроме того, биокатализаторы обладали достаточно высокой активностью амидазы, функционирование которой приводило к накоплению акриловой кислоты, что ухудшало качество получаемого акриламида.

Для совершенствования параметров биотехнологического процесса требовалось создание биокатализаторов нового поколения, лишенных указанных недостатков. Мы полагали, что эта задача может быть решена с помощью широкого поиска новых нитрилгидратаз с уникальными свойствами и изучения механизмов, контролирующих синтез нитрилгидратаз в клетках бактерий.

Настоящая работа обобщает результаты изучения бактерий, обладающих нитрилгидратазной активностью и является первым примером комплексного исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков на генном и клеточном уровне.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции метаболизма нитрилов у Ккойососсиз гкойоскгоиз и на этой основе развитие новых биокаталитических процессов с использованием ферментов, участвующих в утилизации нитрильных соединений.

В соответствии с этим в работе решались следующие задачи:

1. Создание представительной коллекции нитрилутилизирующих бактерий. Выбор штамма с нитрилгидратазной активностью, обладающего потенциалом для промышленного использования.

2. Изучение ключевых ферментов метаболизма нитрилов - нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ) у штамма К.гко(1оскгои5 М8, обладающего высоким потенциалом для промышленного использования. Идентификация и характеристика основных механизмов регуляции синтеза НГ и АМ.

3. Разработка системы генетического анализа для родококков.

4. Изучение генетического контроля утилизации нитрилов у К.гкос1оскгоиз М8.

5. Разработка стратегии повышения НГ активности и создание промышленных биокатализаторов для получения акриламида на основе штамма Кгкойоскгоиз М8.

6. Разработка биокаталитических процессов получения амидов, прежде всего, акриламида и никотинамида.

Научная новизна и практическая ценность работы. в работе впервые получены следующие результаты:

1. Показано, что бактерии рода Кко(1ососсиз составляют самую многочисленную группу (свыще 50%) среди нитрилутилизирующих бактерий, изолированных из разных биогеоцинозов.

2. Продемонстрирован коньюгативный перенос плазмид между щтаммами Е.соИ и Шойососсиз 5рр., что позволило создать серию мобилизуемых векторов, способных либо авнономно реплицироваться в родококках ( за счет уникального репликона криптической плазмиды) либо интегрировать в хромосому с помощью интегративной системы актинофага фС31 или за счет гомологичной рекомбинации.

3. Для бактерий рода Кко<Лососси8 разработаны оригинальные методы клонирования генов, введения их в клетки разных видов родококков, интеграции генов в хромосому, замещения аллелей гена в хромосоме и их инактивации.

4. Осуществлено клонирование и проведен структурно-функциональный анализ локуса хромосомы штамма М8, контролирующего катаболизм нитрилов. Показано, что его главной особенностью является отсутствие оперонной организации: гены НГ, АМ и регуляторные гены представляют собой единый регулон, обеспечивающий индуцибельное координированое образование двух ферментов НГ и АМ, вовлеченных в деградацию нитрилов.

5. Обнаружен принципиально новый механизм регуляции НГ, заключающийся в активации транскрипции гена НГ ионами кобальта, входящими в состав простетической группы фермента.

6. Показано, что синтез ферментов утилизации нитрилов в штамме М8 подвержен глюкозной репрессии, тем самьм, впервые продемонстрировано наличие у родококков углеродной катаболитной репрессии. Отсутствие в штамме М8 фосфотрансферазной системы для транспорта Сахаров, а также отсутствие эффекта сАМФ на репрессию продемонстрировало, что механизмы катаболитной репрессии у родококков отличаются от таковых у энтеробактерий и бацилл.

7. Получены доказательства, что синтез ферментов НГ и АМ в штамме К.гкойосНгоиз М8 подвержен сложной регуляции на транскрипционном уровне, элементами которой являются: координированная индукция обоих ферментов, вызываемая амидами; кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и репрессия аммонием.

8. Изучены пути ассимиляции аммония в штамме К.гко(!оскгоиз М8. В зависимости от концентрации аммония, в клетках М8 преимущественно функционирует либо путь с участием глутаматдегидрогеназы - при высоких концентрациях аммония либо с участием глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы -при низких конце нтр ациях.

9. Разработан селективный способ получения мутантов по метаболизму нитрилов и впервые получены мутанты с конститутивным синтезом НГ и AM. Практический аспект работы связан с созданием биокатализаторов и разработкой на их основе процессов получения амидов, в первую очередь, акриламида. Биокатализатор МЗЗ, созданный в настоящей работе, по уровню активности превышает все известные в мире аналоги. Разработанный на основе МЗЗ биотехнологический способ получения акриламида выгодно отличается от традиционных химических способов-сернокислотного и каталитического, высокой степенью селективности и конверсии гидратации акрилонитрила, мягкими условиями проведения процесса, чистотой получаемого продукта, низкими энергетическими затратами, экологической безопасностью. В настоящее время с помощью биокатализатора МЗЗ в России и в Южной Корее поизводится несколько тысяч тонн акриламида в год. Вся питьевая вода г. Москвы очищается с помощью флокулянтов, получаемых на основе биоакриламида, произведенного с использованием биокатализатора МЗЗ. Биокаталитический процесс получения акриламида является первым в России примером использования биотехнологии в крупнотоннажной химии.

Работа по созданию биокатализаторов и развитию технологии получения акриламида и полимеров на его основе была отмечена приемией Правительства России в области науки и техники за 1994 г.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в лаборатории генетики биодеградации в соавторстве с Астауровой O.A., Герасимовой Т.В., Лариковой Г.А., Погореловой (Леоновой) Т.Е., Поляковой И.Н., Пауковым В.Н., Рябченко Л.Е., Новиковым А.Д., Гордеевым В.К., Синеокой И.В., Акопянц К.Э., Кирсановым Н.Б., Мысловатой М.Л. Часть работы выполнялась в кооперации с сотрудниками лабораторий ГосНИИгенетика (заведующие: Вейко В.П., Честухина Г.А., Воейкова Т.А., Глазунов A.B.), с сотрудниками Саратовского филиала ГосНИИгенетика (ныне «Биоамид») Ворониным СП., Козулиным СВ., сотрудниками кафедры почвенной микробиологии МГУ Добровольской Т.Г. и Скворцовой И.Н, а также отдела микробиологии окружающей среды Национального центра по биотехнологии (Брауншвайг, Германия) К.Тимиссом и П.Голышиным. Всем коллегам автор выражает благодарность за участие в проведении представленного к 7 защите исследования. Автор выражает признательность чл.-корр. РАН, профессору В.Г. Дебабову за постоянный интерес, плодотворные дисскуссии и поддержку данной работы.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована на семинаре отдела молекулярной генетике ГосНИИгенетика в 2001 г. Материалы диссертации докладывались на отечественных и зарубежных конференциях, симпозиумах и семинарах, в том числе: на 7 Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); 5 Форуме по прикладной биотехнологии (Рент, Бельгия, 1991); 5 конференции по генетике и молекулярной биологии промышленных микроорганизмов Американского микробиологического общества (Блюмингтон, 1992); Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1994); 9 и 11 Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Москва, 1994; Сисси, Греция, 1999); 10 Международном биотехнологическом симпозиуме (Сидней, 1996); 8 Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Иерусалим, 1998); Международном семинаре "Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium" (Новосибирск, 1999); Кремлевском инвестиционном форуме "Продукция и технологии: продвижение на рынок" (Москва, 2000); Конференции по биодеградации и биокатализу Американского микробиологического общества (Сан Хуан, 2001).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Органические цианиды или нитрилы - это группа соединений с общей структурной формулой R-CsN. Характерной особенностью всех нитрилов является наличие в их составе функциональной группы -CsN, содержащей тройную связь между атомами углерода и азота. Нитрилы способны вступать в разнообразные реакции (гидролиз, восстановление, олигомеризация) и в качестве стартового материала используются в органическом синтезе для получения аминов, амидов, кислот, эфиров, альдегидов, кетонов, включая циклические кетоны, имины и др. Синтетические нитрильные соединения производят в значительных количествах (сотни тысяч тонн в год). Они широко используются в различных областях в качестве мономеров для полимеризации (акрилонитрил), растворителей (ацетонитрил), исходного сырья для производства гербицидов и др. Нитрилы также являются широко распространенными метаболитами клеток. Цианогликозиды, цианолипиды, индол-3-ацетонитрил, Р-циано-Ь-аланин образуются во многих видах растений и микроорганизмов (bCnowles, 1976). Наиболее многочисленной группой растительных нитрилов являются цианогликозиды, которые играют важную роль в механизме защиты у растений (путем освобождения цианида) (Conn, 1979).

Все нитрилы являются высокотоксичными соединениями и, в случае попадания в окружающую среду, представляют значительную угрозу для человека и животных.

Ряд микроорганизмов (псевдомонады, актиномицеты, грибы) способны метаболизовать нитрилы в качестве источников азота и/или углерода. Возрастающий интерес к группе микроорганизмов, способных метаболизировать нитрильные соединения, обусловлен возможностями их применения для биокатализа и детоксикации окружающей среды.

1. Биотрансформации нитрильной группы.

Три типа биохимических реакций способны элиминировать - C N группу в нитрилах- окисление, восстановление и гидролиз.

Многие растения и насекомые окисляют нитрилы до циангидринов (или альфа-оксинитрилов) с помощью оксигеназ. Циангидрины, в свою очередь, под действием оксинитрилаз превращаются в альдегиды и цианистый водород (Fawcett et al., 1958). Этот тип превращений не обнаружен у бактерий, однако показано, что грибы Trichoderma sp. способны деградировать диаминомалеонитрил с освобождением цианида (Kuwahara&Yanase, 1985).

Оксигеназа Оксинитрилаза

R-CH2-CN--R-CHOH-CN--R-CHO + HCN

Нитрил +О2 а- оксинитрил альдегид

Восстанавливать цианиды способны азотфиксирующие микроорганизмы, содержащие фермент нитрогеназу (Hardy et al.,1971). При этом нитрилы превращаются в углеводороды и аммоний.

Нитрогеназа

R-CN л R-CH3 + N H 3 АТФ

Наиболее распространенным у микроорганизмов типом превращений нитрильной группы является гидролиз. Однаружено две группы ферментов, гидролизующих нитрилы: нитрилазы (ЕСЗ.5.5.1), которые превращают нитрилы в карбоновые кислоты и аммоний в одну стадию (Hook & Robinson, 1964) и нитрилгидратазы (ЕС4.2.1.84), продуцирующие из нитрилов амиды, которые далее трансформируются в карбоновые кислоты и амминий под действием амидаз (ЕСЗ.5.1.4) (Asano et al., 1980).

Нитрилаза

R-CN--R-COOH + NH3

Нитрил +H2O Кислота

Нитрилгидратаза Амидаза

R-CN---R-CONH2--R-COOH + NH3

Н2О Амид +Н2О

Именно эта последняя группа ферментов [нитрилазы, нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ)] привлекает к себе повышенное внимание в качестве биокатализаторов для получения амидов и кислот. Учитывая, что целью настоящей работы было изучение бактерий, обладающих гидролитической активностью, подробнее рассмотрим свойства этих ферментов.

Нитрил азы

Нитрилазы впервые были обнаружены у псевдомонад, которые гидролизовали природный нитрил рицинин до соответствующей кислоты (Hook & Robinson, 1964). Позднее были изолированы микроорганизмы из разных таксономических групп с нитрилазной активностью, способные гидролизовать как природные так и синтетические нитрилы (Kobayashi & Shimizu, 1994). На основании различий в субстратной специфичности, нитрилазы распределены на три группы: ароматические, алифатические и арилацетонитрилазы. Ароматические нитрилазы преимущественно гидролизуют ароматические и гетероциклические нитрилы. Нитрилаза из R.rhodochrous Л является наиболее изученным ферментов из группы ароматических нитрилаз (Nagasawa et al., 1988b). Синтез нитрилазы в штамме Л индуцируется изовалеронитрилом. Позднее было показано, что капролактам также является мощным индуктором синтеза ароматических нитрилаз (Nagasawa et al, 1990b).

Алифатические нитрилазы, преимущественно катализирующие гидролиз алифатических нитрилов, удалось обнаружить совсем недавно. Долгое время считалось что нитрилы, цианогруппа которых находится рядом с двойной связью (например, бензонитрил), гидролизуются под действием нитрилаз, в то же время алифатические нитрилы гидрализуются с участием нитрилгидратаз. Кабаяши с coaBT.(Kobayashi et al., 1991 а) обнаружили штамм R. rhodochrous К22, нитрилаза которого проявляла высокую активность в отношении насыщенных алифатических нитрилов (таких как, ацетонитрил или кротононитрил). Эта нитрилаза способна также гидролизовать только одну циано группу в алифатических динитрилах (например, в глутаронитриле). Известно, что традиционными химическими методами такой селективный моногидролиз динитрилов осуществить трудно. Подобно нитрилазе в штамме Л, нитрилаза в штамме К22, также индуцировалась изовалеронитрилом.

Расширение круга субстратов при скрининге позволило обнаружить новый класс нитрилаз (арилацетонитрилазы), которые не атаковалаА ароматические и алифатические А/ нитрилы, кроме ацетонитрила, но действовали на арилацетонитрилы, такие как: индол-3-ацетонитрил, фенилацетонитрил, тиофен-ацетонитрил. Такие нитрилазы обнаружены в штаммах Alcaligenes faecalis JM3 и АТСС8750 (Nagasawa et al., 1990a; Yamamoto et al., 1992).

В таблице 1 суммированы свойства некоторых нитрилаз. Нитрилазы представляют собой мультимертные белки, состоящие из одинаковых субъединиц, размер и количество которых варьирует у разных ферментов. В отличие от НГ, нитрилазы не содержат ионов металлов. Все известные нитрилазы относятся к сульфгидрильным ферментам. Для всех изолированных нитрилаз продемонстрирована субстрат- зависимая активация фермента, впервые обнаруженная Harper (1977). Активация представляет собой агрегацию субъединиц с образованием мультимерного активного фермента.

Таблица 1. Микробные нитрилазы и их свойства (Bunch, 1996).

Штаммы

Rhodococcus rhodochrous Л Rhodococcus rhodochrous К22 Alcaligenesfaecalis JM3 Fusarium oxysporum

Rhodococcus sp. A T C C 39494

Arthrobacter sp.

Мол. вес. фермента, kDa

78

650

260 550

580 30

Мол. вес. субъединиц, kDa

41.5

41

44 37

41.5 30

Т рн опт., опт. с

45

50

45 40

7.7

5.5

7.5 6-10

40 7.5

40 5

Субстраты ароматические нитрилы алифатические нитрилы арилацетонитрилы ароматические и алифатические нитрилы ароматические нитрилы ароматические нитрилы

Для ряда нитрилаз показано, что цистеиновый остаток в составе фермента играет важнейшую роль для проявления каталитической активности (Kobayashi et al., 1992). Mahadevan & Thimann (1964), a также Harper (1977) предложили механизм нитрилазной реакции (Рис. 1).

ANH HjO

R-CsN + ESH

-R-c!

SE

HjO гО R-CNHj

SE /V

R-C' + ESH OH

R-CA + ESH NH, Ш

Рис.1. Предполагаемый механизм действия нитрилаз.

Согласно их гипотезе, углеродный атом нитрильной группы подвергается нуклеофильной атаке сульфгидрильной группы фермента, что приводит к образованию интермедиата (I). После высвобождения аммония образуется ацилфермент, который затем гидролизуется до кислоты. Эта схема было в последующем дополнена (реакции п и ш). Было показано, что нитрилаза способна с низкой скоростью использовать амиды в качестве субстратов (Kobayashi et al., 1998а). Авторы предполагают, что интермедиат (I) может также аномально разрушатся с образованием амида. Наличие небольшого количества амида (1-6%) в качестве побочного продукта при гидролизе нитрилов нитрилазами из Pseudomonas, Fusarium и Rhodococcus (Hook & Robinson, 1964; Goldlust & Bohak,1989; Stevenson et al., 1992) также подтверждает эту гипотезу.

Амидазы

Амидазы, участвующие в метаболизме нитрилов и амидов у бактерий, относятся к группе ациламид амидогидралаз (ЕС 3.5.1.4), катализирующих гидролиз ациламидов до соответствующих кислот и аммония. Амидазы обнаружены у многих видов бактерий и представляют собой белки разного молекулярного веса (от 60 до 360 kDa), состоящие из субъединиц одного типа (Maestracci et al., 1988). В отличие от нитрилгидратаз, амидазы не содержат ионы металлов. Эксперименты с ингибиторами показали, что алифатические амидазы относятся к сульфгидрильньш ферментам (Maestracci et al., 1988).

На основании субстратной специфичности амидазы отнесены к двум типам (Fournand & Amaud, 2001). Первый тип - это так называемые алифатические амидазы, гидролизуют только коротко-цепочечные алифатические амиды. Наилучшими для них субстратами являются ацетамид, акриламид, пропионамид. Алифатические амидазы обнаружены у бактерий следующих видов: Pseudomonas aeruginosa (Clarke, 1970), Rhodococcus sp.R312 (Maestracci et al, 1984), Arthrobacter sp.Jl (Asano et al., 1982a), Methylophilus methylotrophus (Wybom et al., 1996), Helicobacter pylori (Skouloubris et al.,1997), Bacillus stearothermophilus BR388 (Cheong & Oriel, 2000). Ко второму типу относятся амидазы, которые совместно с НГ вовлечены в метаболизм нитрильных соединений. Они преимущественно гидролизуют алифатические амида средней длины у (С4-Сб), такие как: пропионамид, изобутироамид, валерамид, гексаноамид, а также проявляют активность в отношении ариламидов, таких как бензамид, фенилацетамид, никотинамид и др. Ферменты этого типа являются энантиоселективными. Они обнаружены в штаммах Rhodococcus sp.R312 (Mayaux et al.,1990), R.erythropolis JCM (Duran et al., 1993), Rrhodochrous Jl (Kobayashi et al.,1993), P.chlororaphis B23 (Ciskanik et al.,1995).

Компьютерные методы анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей этих ферментов подтвердили разделение амидаз на два типа (Bork & Koonin, 1994; Chebrou et al, 1996). Алифатические амидазы составляют группу гомологичных белков, обладающих также выраженной гомологией с нитрилазами, цианид гидратазой, бета -аланин синтазой. Для всех этих ферментов характерно наличие цистеина в определенном положении цепи. Для нитрилаз и алифатической амидазы из псевдомонад показано, что цистеиновый остаток входит в состав каталитического центра фермента (Novo et al.,1995).

Амидазы второго типа составили другую группу гомологичных белков, не обладающих перекрестной гомологией с алифатическими амидазами. Амидазы второго типа обладали гомологией с индолацетамид гидролазой, амидазами из дрожжей и грибов (Chebrou et al., 1996). Аминокислотные последовательности этих ферментов содержали высоко консервативный мотив GGSS, аминокислотные остатки которого, как полагают, существенны для каталитической активности (Рис.2).

170 GGSSGGi

147 6GSSG

169 GGSS л5Ш1Ш1Ш£Ш/ШШСлШ13:лШ-ШАТШ1Г?,1Ш1ШВлШ 213

170 GGSSGG IA|LgAlADS2FglEGEQe52i-[SAA|Av3gH|2äg|FE 214

171 GGSS s!ЛИfSÄgÜKgnil I ISc dleg 11'Я-i'' 214 12 LrAQYFGKIYIATPPQEFT|5|LF12JEspFWVgglYQKSNAC|3NHQR 57 10 LDTEYFGTIGI@TPAQETFJ|lFA!2Es|NLWV[AYgSSLACSDHNQ 55

196 SITMDgETl|C-SACQ-|lV-|»2gT|LLTCATfAIAINIQSDlEA 238

197 svTisEwvic-Ei5co-A1b-Ta8TOKbycl5p1 - дыюпатва 238 222 MegjgfeLejEJALIAGiggSLaGMsRVABSRgL-™ 2 66

215 eaaasgiEALiABsPSGLEIEAlABP-b|A{Alcm3TaM 259

207 MägJgigigiEESL 1ЕАн15и101лтД1ШаШ1-гаг|дуо!сЯр|дК5ШрЯ 251

148 MagfgMesEA51?AALSPVJgi#JsfflA 192 144 Лg|SgSÄgSSAg|l|lASAl|53g|лJ2S-SAAi2glTgFIA'IA 188 146 »WaiilEielVAlAASЙSRLMLGGТЙТрИдАШЭfeгIЗААь0гШЯрRНЯT^i8 190

AASSAgs1gAAE1GTTgHgNJJ1HLJSW-gAHCNgVATIJSOg 191

2 03 SSAAEAMIAMIAGAIGlETElSAEäEv-SAAiNSljYglRSSHD 247 2 02 AA3SEA1BE1R|GVIGgETS1ASEv-|AAiNF3Yg|RgSHg 246 153 ЕАШЗЕЗ5У1ТААЙЬСYASlBГ^>VJcAefeA4;1рhЯлАА^I!сПтЙ1A;ШA 197 151 H|s|sgSv2(ARJg|A(C[SLTT2SA|iTJj|V-J3AALNN0ISIJ2A 195

Рис.2. Сравнение аминокислотных последовательностей амидаз из разных видов. Обозначения штаммов: R312- Rhodococcus sp. R312; Rho- Rhodococcus sp.; Jl-L-R.rhodochrous Jl; N-774 - Rhodococcus sp.N-774; B23 - P. chlor or aphis B23; Asp-f2, Asp-fl -N-терминальные участки химозина и пепсина; Asp-lln Asp-12 - С -терминальные участки пепсина и химозина; VDHAD-витамин D3 гидроксилаза; FAAH-олеамид гидролаза; Yeast- амидаза S. cerevisiae; El- El фермент из Flavobacterium; IND-P -индолацетамид гидролаза из Р. savastanoi; IND-A-индолацетамид гидролаза из Agrobacterium tumefaciens; IND-B -индолацетамид гидролаза из Bradyrhizobium japonicum; ACE-0 - ацетамидаза из Aspergillus oryzae; ACE-N - ацетамидаза из Aspergillus nidulans; COM - амидаза из Comamonas acidovorans; Urea- амидолиаза из Candida utilis.

R312

Rho

J1-L

N-774

В23

Asp-f2

Asp-f1

Аэр-11

Asp-12

VDHÄP

FAAH

Yeast

EI

IND-P

IND-A

IND-B

ACE-0

ACE-N

Com

Urea

Эти амидазы содержат несколько консервативных аминокислот -глицин, аспарагиновую кислоту и серии, локализованных на 17,19 и 23 позициях от GGSS мотива. С помощью сайт-специфического мутагенеза было продемонстрировано, что остатки Asp и Ser являются частью активного сайта стериоспецифических амидаз (Kobayashi et al., 1997). Сравнение амидаз с различными типами протеаз, гидролизующих пептидную связь, выявило наличие Asp и Ser остатков в активном сайте аспартильных протеиназ.

Таким образом, сравнение амидаз с различными гидролизующими ферментами показало, что амидазы обладают гомологией с двумя группами C-N гидролаз: алифатические амидазы с нитрилазами, а стереоселективные амидазы с аспартильными протеиназами. Вероятно, ферменты каждой группы эволюционировали от общих предшественников. Недавно было обнаружено, что амидаза из штамма R.rhodochrous Л способна использовать в качестве субстрата нитрилы, превращая в кислоты и аммоний, подобно нитрилазам (Kobayashi et al.,1998). Хотя между этой амидазой и нитрилазами нет гомологии, этот результат свидетельствует о более сложных эволюционных взаимоотношений в группе C-N гидролаз, чем это представлялось ранее.

Большинство изученных амидаз, помимо гидролитической проявляют также и ацилтрансферазную активность в присутствии гидроксиламина (Рис.3).

NHOH

Рис.3. Гидролизующая и ацилтрансферазная активности амидаз.

Механизм гидролитической и трансферазной реакции включает образование ацилфермента, который подвергается нуклеофильной атаке атомов кислорода воды или азота гидраксиламина, что приводит к образованию кислот или гидроксаматов (Рис.3).

Недавно было показано (Роигпапд е1 а 1., 1997), что акцептором ацильной группы может также выступать гидразин (МНг -ННг). Таким образом использование амидаз позволяет получать широкий круг гидразидов, которые также как гидроксамовые кислоты, являются прекрасными хелатирующими агентами. Не только амиды, но и кислоты и эфиры могут служить донорами ацильной группы для амидаз. Однако в последнем случае реакции потекают с низкой скоростью, поэтому в практическом плане интерес представляют реакции с амидами.

Нитрилгидратазы

В отличие от нитрилаз и амидаз, нитрилгидратазы (НГ) являются металлоферментами и содержат ионы железа или кобальта в качестве простетической группы.

Ферменты отличаются по физико-химическим свойствам и субстратной специфичности, но всегда состоят из двух типов субьединиц (а и Р), хотя число их может варьировать (Табл.2).

Таблица 2. Свойства нитрилгидратаз из различных микроорганизмов (Bunch, 1996).

Субстрат

Штаммы

Agrobacterium tumefaciens

IAMB-261

Brevibacterium sp.R312

Pseudomonas chlororaphis

B23

Pseudonocardia thermophila

JCM3095

Rhodococcus rhodochrous J l,

L-НГ

Rhodococcus rhodochrous J l, Н-НГ

Rhodococcus sp. N-774

Ионы

Co&Fe

Fe

Fe

Co

Co

Co

Fe

MB, kDa

102

85

100 ид

130

520

70

Число субъед. и их MB, kDa

4 (25)

3-4 а,26) (Р,27.5) 4 а,25) (РД5) нд

29)

18-20 (а,26 ((3,29)

4-5 (а,26) (13,29) 2 а,28.5) (Р,29)

Т опт. С

РН опт.

7.5

25 7.8

20 7.5

60

40 8.8

35-40 6.5

30 7.7 индол-3-ацетонитрил алифатические нитрилы алифатические нитрилы акрилонитрил ароматические нитрилы алифатические нитрилы алифатические нитрилы

Железо -содержащие НГ, изолированные из Rhodococcus sp. R312 и Р. chlor or aphis В23 были первыми ферментами, содержащими негемовое железо (Sugiura et al., 1987). Структура НГ из щтамма КЗ 12 довольно хорошо изучена с помощью различных спектральных методов (ЭПР, ЯМР, Романовской спектроскопии). Кристаллы НГ из R312 были исследованы с помощью ренгеноструктурного анализа (Huang et al., 1997). Результаты этих исследований показали, что центр связывания ионов железа находится в составе а субъединицы и что три цистеиновых остатка и серии участвуют в координации иона железа.

Уникальной особенностью железо-содержащих НГ из Rhodococcus sp. R312, Rhodococcus sp.N-774 и N-771 (все белки практически идентичны) является их реакция на свет. Активная форма фермента переходит в неактивную при культивировании клеток в темноте. Обработка клеток видимым светом приводит к восстановлению НГ активности. Исследование НГ из N-771 показали, что эндогенная окись азота N0 связана с ионом железа в неактивном ферменте, а фотодиссоциация приводит к активации фермента (Endo et al, 1999). Такая регуляция с помощью N0 и света также показана для НГ из R312 и Comamonas testosteroni (Bonnet et al, 1997;Sari et al., 1998).

Кобальт-СО держащие НГ впервые были обнаруженны в штамме R.rhodochrous Л (Nagasawa et al.,1991). Этот штамм синтезирует две НГ-высомолекулярную (Н) с молекулярным весом 520 kDa и низкомолекулярную (L) с молекулярным весом 130 kDa в зависимости от условий выращивания (Kobayashi et al.,1991b). Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности: Н -НГ преимущественно действует на алифатические нитрилы, а L - на ароматические нитрилы. Оба фермента содержат по одному иону кобальта на каждую альфа субъединицу. Кобальт прочно связан с ферментом и не освобождается при диализе. Около 10 лет (1988 - 1997) штаммы R. rhodochrous Л и R. rhodochrous М8 (объект настоящей работы) оставались уникальными, из-за наличия в них кобальт-содержащих НГ. В этот период бьшо изолировано большое число железосодержащих НГ, однако только в конце 90-ых годов были обнаружены еще два штамма с кобальт-зависимыми НГ. Нитрилгидратаза из P.putida 5В оказалась кроме того энантиоселективной в отношении нитрилов, например: 2(8)-(4'-хлорфенил) -3 -метилбутиронитрила (Payne et al., 1997). Термофильный штамм Bacillus sp RAPc8 содержал НГ с высоким уровнем термостабильности (Pereira et al., 1998).

Секвенирование генов НГ из разных бактерий показало, что в составе аминокислотной цепи каждой альфа-субъединицы содержится консервативный мотив CXXCSC. Он присутствует как у железо- так и кобальт -содержащих НГ. Входящие в состав этой последовательности остатки цистеина и серина вовлечены в формирование железо-связывающего центра. Высокий уровень гомологии между кобальт и железосодержащими НГ позволяет утверждать, что кобальт -связывающий центр имеет ту же структуру, что и железо-связывающий центр в НГ из КЗ 12 (Рис.4).

Удельная активность НГ значительно выще таковой у нитрилаз, хотя оба фермента атакуют нитрилы. Это может быть следствием различий в реакционных механизмах двух типов ферментов. У нитрилаз цистеиновый остаток вовлечен в гидролиз нитрилов, в то время как у НГ металл-содержащий центр выполняет каталитическую функцию (Вгеппап

Рис.4. Предполагаемая структура кобальт-связывающего центра НГ из R.rhodochrous Л. (Kobayashi &Shimizu, 1999).

Основываясь на данных по структуре и функциях кобальт и железо -содержащих НГ Kobayashi & Shimizu (1999) предложили для НГ следующий механизм гидролиза нитрилов (Рис.5). На первой стадии происходит взаимодействие нитрила с металл-связанной ОН группой, которая может выступать в качестве нуклеофила, атакующего атом углерода нитрильной группы (Рис.5, I схема). Альтернативный путь (II схема) -металл-связанный гидроксид ион активирует молекулу воды, которая затем атакует углерод нитрильной группы. В результате образуется имидат [R-C(-OH)=NH], который превращается в амид.

Структурное изучение НГ из Agrobacterium tumefaciens (Kobayashi et al., 1995), содержащей одновременно ионы кобальта и железа, а также НГ из гриба Myrothecium verrucaria (Maier-Greiner et al., 1991), содержащей ионы цинка, позволит лучще понять роль металлов в каталитическом механизме НГ. е1а1.,1996).

II

Cd. он 9-н и r-c = n

-HB

Со' -'он

HB

R - C А N

Со" "он он hb R- C = N H

Со" нон.

R- C = N H

Со* 'он о hb R-C-NHj

Со" "он

9 hb

R-C-NH2 I

Рис.5. Предполагаемый механизм действия НГ (Kobayashi & Shimizu, 1999). Схема I- нитрил взаимодействует с металл -связанный гидрокси-группой; схема II-нитрил взаимодействует с молекулой воды, активированной металл -связанной гидрокси-группой. В- катионная группа фермента.

2. Регуляция синтеза ферментов утилизации нитрилов.

Ген НГ из Rhodococcus sp. N774 (Ikehata et al.,1989) был первым клонированным геном НГ. В последующем этот ген бьш использован в качестве зонда для клонирований генов НГ и фланкирующих их областей из разных организмов {P.chlororaphis В23, R.rhodochrous Л, Brevibacterium sp.R312 и др.), образующих как железо- так и кобальт-содержащие НГ (Kobayashi et al.,1991b; Nishiyama et al.,1991; Mayaux et al., 1990). Сравнение аминокислотных последовательностей каждой из субъединиц НГ из разных штаммов выявило высокий уровень гомологии (Рис.6). Во всех изученных штаммах структурные гены для альфа и бета субъединиц сцеплены и формируют единый оперон, хотя взаимное расположение этих генов в опероне варьирует (aß или ßa) [Kobayashi & Shimizu, 1998а). Гены амидазы также сцеплены с генами НГ во всех штаммах (В23, N-774, N-771, Bacillus sp.BR449), кроме R.rhodochrous Л, и локализуются перед генами НГ (Kobayashi et al.,1992; Kim & Oriel, 2000). а - субъединица

Р-субъединица

Рис.6. Уровень гомологии аминокислотных последовательностей а и Р субъединиц различных НГ. Л-Н - Н- нитрилгидратаза из R.rhodochrous Л ; J1-L - L- нитрилгидратаза из R.rhodochrous Л; В23 - P.chlororaphis В23; N774- Rhodococcus sp. N-774.

Только в штамме Л ген амидазы не сцеплен с генами НГ и локализуется на расстоянии 1.9 тин за геном, кодирующим бета субъединицу L -нитрилгидратазы. В локусе H -НГ в штамме Л ген амидазы не обнаружен (Рис.7).

Гены НГ из псевдомонад (В23, 5В) и бацилл были экспрессированы в клетках Е.соИ под контролем lac промотора (Nishiyama et al., 1991; Wu et al., 1997; Kim & Oriel, 2000) . Было обнаружено, что для эффективной экспрессии гена НГ из В23 требуются гены, локализующиеся во фланкирующих областях (Р47К, orfE и 38 kDa белок). Функции этих генов не ясны. Гены НГ из родококков (штаммы Л и N-774) очень слабо экспрессируются в клетках Е.соИ. Ферменты присутствуют в Е.соИ в виде нерастворимых пептидов с минимальной активностью (Ikehata et al.,1989;Kobayashi et al,1991b).

Ha рис.7 показана генетическая организация локусов, контролирующих образование H и L -нитрилгидратаз в штамме Л. Локусы H и L помимо структурных генов, кодирующих аир субъединицы НГ {nhhh, nhhB и nhlA, nhlB, соответственно), содержат регуляторные и некоторые дополнительные гены. В локусе H перед геном НГ выявлено 2 гена- nhhC и nhhD, которые являются позитивными регуляторами экспрессии Н-НГ (Komeda et al., 1996а). Сравнение с базами данных показало, что продукт гена nhhC имеет значительную гомологию с негативньм регулятором алифатической амидазы из P.aeruginosa, который взаимодействует с амидами. На этом основании сделано предположение, что продукт этого гена необходим для индукции Н-НГ. Продукт гена nhhD имеет гомологию с регуляторным белком оперона множественной устойчивости

Е.соИ. Два дополнительных гена - пкИЕ и и/г/гР, не имеют отношения к регуляции Н-НГ. Они являются частью 181164 элемента, который интегрирован между структурными и регуляторными генами.

Локусы Ь и Н значительно отличаются (Котеёа е! а1., 1996Ь). В состав локуса Ь входит ген амидазы {атёА) и кобальтовый транспортер {пЫ¥) (Котес1а еХ а1., 1997). Гены НГ , транспортера и амидазы транскрибируются в виде единой мРНК. При индукции наблюдается координированная экспрессия НГ и амидазы. Как и в локусе Н, в локусе Ь, перед генами НГ имеется два регуляторных гена. Но если один из них, пЫС, имеет схожую функцию с пкЬС (позитивный регулятор), то второй ген - пЬЮ, отличается структурно и функционально. Показано, что он является негативным регулятором экспрессии Ь-НГ.

Ионы кобальта оказывают разное влияние на образование Н и Г нитрилгидратаз. В отсутствие ионов кобальта, Н-НГ не образуется вообще, а Ь-НГ синтезируется, но неактивна (Nagasawa е! а!., 1991; Котеёа е1 а1., 1996Ь).

1 кЬ и )гт&

I I© (иш

ПААСяМ/У дМС яМГвШ д*Мл*А6'

0 с

М" ? I м?» ^

Со'" Со''

Со' н-<чн«

К-СООН + NHз

Рис.7. Генетическая организация локусов, контролирующих образование Н и Ь нитрилгидратаз в штамме КгкойосЬгоиз Л. Вверху-локус Н, внизу -локус Ь.

Таким образом, структурно-функциональное изучение локусов НГ из разных штаммов продемонстрировало значительное разнообразие их организации и регуляторных элементов. Вместе с тем, молекулярные механизмы, регулирующие синтез ферментов утилизации нитрилов на генном и клеточном уровнях, изучены недостаточно.

3. Перспективы использования нитрилгидролаз в биотехнологии

Использование НГ для промышленного получения акриламида значительно усилило интерес ко всем ферментам, участвующим в утилизации нитрилов. В настоящее время в научной и патентной литературе имеются многочисленные примеры получения амидов и кислот с помощью разных нитрилгидролизующих ферментов-нитрилаз, нитрилгидратаз и амидаз (Kobayashi et al.,1992; Bunch, 1996; Ramakrishna et al.,1999). Среди продуктов крупнотоннажного синтеза, получаемых из нитрилов с помощью биокатализа, следует, в первую очередь, назвать акриламид, никотинамид, акриловую кислоту, адипиновую кислоту и др. Проблемы, связанные с получением акриламида с помощью биокатализа, подробно обсуждаются в разделе 5 «Результатов». В прошлом году началось промышленное производство никотинамида с использованием биокатализатора на основе R.rhodochrous П.

Новые области применения нитрилгидролизующих ферментов связаны с использованием стереоселективных ферментов. Macadam & Knowles (1985) продемонстрировали конверсию а-аминопропионитрила в L- аланин используя клетки Acinetobacter sp. APN. С помощью энантиоселективной нитрилазы изAlcaligenes feacalis АТСС8750 удается трансформировать манделонитрил с 95% селективностью в R (-) манделиновую кислоту- важный предшественник полу-синтетических Цефалоспоринов (Yamamoto et al., 1991). Гидролиз (Р,8)-(+)-ибупрофеннитрила с помощью нитрилазы из Acinetobacter sp. АК226 позволяет получить (8)-(+)-ибупрофен- противовоспалительное лекарство нестероидной природы (Yamomoto &Komatsu, 1991). Использование системы из двух ферментов нитрилгидратазы и стереоселективной амидазы также позволяет получать стереоизомеры органических кислот. Штамм Rhodococcus sp. R312, содержащий стереоселективную амидазу был использован для получения оптически активных аминокислот из а-аминонитрилов (Maestracci et al., 1988). Оптически чистые 2-арилоксипропионовые кислоты с высокой гербицидной активностью были получены из нитрилов с помощью штамма Brevibacteriwn imperiale СВ8, обладающего НГ и амидазной активностью (Bianchi et al, 1991).

Долгое время не удавалось получить стереоизомеры амидов. Однако ситуация изменилась с обнаружением стереоселективных НГ. Fallon et al. (1997) сообщили о S-селективной НГ из штамма Р.риМа NRRL18668, способной гидролизовать 2-(4-хлорфенил)- 3- метилбутиронитрил в соответствующий S- амид. На сегодняшний день уже изолировано несколько стереоселективных НГ (Bauer et al., 1998; Effenberger & Graef, 1998).

Гидролиз динитрилов с помощью биокатализаторов позволяет получать новый круг органических соединений. С помощью нитрилаз, НГ и амидаз из динитрилов могут быть получены цианокарбоновые или амидокарбоновые кислоты. Всего пять типов продуктов можно получить из динитрилов с помощью ферментов (Рис.8), в то время как традиционными способами удается получить только два типа-диамиды или дикарбоновые кислоты. Уже разработан комбинированный процесс получения из адипонитрила адипиновой кислоты и капролактама, предшественников нейлона (Moreau et al., 1993). Ароматическая нитрилаза из R.rhodochrous Л была использована для получения из терефталонитрила и изофталонитрила 4- и З-цианобензойных кислот, важных предшественников для органического синтеза (Kobayashi et al., 1988).

НГ цинитрил химичеркая реакция

CONH2 R цианамид НГ амидаза соон R

CN цианокарбоновая кислота

НГ

CONH2

R / л CONH2 диамид амидаза

СООН

R / л CONH2 амидокарбоновая кислота химическая реакция амидаза

СООН R СООН дикарбоновая кислота

Рис.8. Схема трансформации динитрилов.

23

Новые области применения нитрилгидролизующих ферментов открываются в связи с обнаружением нитрилгидратазы из Rhodococcus sp. DSM11397 и нитрилазы из Pseudomonas sp. DSM11387, способных работать в средах с низким содержанием воды (Layh& Willets, 1998).

Таким образом, микробные фементы утилизации нитрилов, способны осуществлять разнообразные трансформации синтетических нитрильных соединений. Широкий поиск ферментов среди различных групп микроорганизмов позволил расширить возможности биоконверсии нитрилов и продемонстрировал, что потенциал нитрилгидролизующих ферментов еще далеко не исчерпан.

МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. Основным объектом работы являлся штамм Ккос1ососси5 гкос1оскгоиз М8, выделенный из почвы на среде с изобутиронитрилом в качестве единственного источника азота. В работе также использованы различные штаммы Шо(Аососси8 и Е.соИ, полученные из ВКПМ (ГосНИИгенетика), ВКМ и других источников.

Выделение нитрилутилизирующих бактерий природных источников осуществляли методом накопительных культур. Образцы почвы, воды, ила, растительной подстилки и др. вносили в колбы со средой НС следующего состава (г/л): К 2НРО4 х 3 Н2О - 7.0; КН2РО4 - 3.0; МфОА х 7Н2О - 0.1; Ре804 х 7 Н2О- 0.005; СоСЬ х 6 Н2О- 0.01, цитрат натрия -0.5; глицерин -2 мл; раствор смеси витаминов-2 мл, рН7.2-7.4 и ацетонитрилом (1 г/л) или бензонитрилом (0,5 г/л) в качестве единственного источника азота. Затем колбы инкубировали при 30°С на качалках до появления роста. Путем многократных пересевов культур на среде того же состава и последующего высева на твердую среду были отобраны чистые культуры.

Среды и культивирование штамма R.rhodochrous М8. В качестве полноценных сред использовали Ь-бульон и триптозный агар (Регак). Минимальной средой служила среда МС, состоящая из минеральных солей (г/л): К 2НРО4 х 3 Н2О - 0.5; КН2РО4 - 0.5; ]^04 X 7Н2О - 0.5; Ре804 х 7 Нг О- 0.005; СоСЬ х 6 Н2О- 0.01 и источников углерода и азота, растворенных в 1 л дистиллированной воды при рН7.2-7.4. В качестве источников углерода использовалась глюкоза, фруктоза, пируват или ацетат. Мочевина, соли аммония или нитрат натрия использовались в качестве источников азота.

Штаммы выращивали в стандартных (40 мл) пробирках или в 750 мл колбах при 30 °С на круговых качалках (250 об/мин) в течении 48-72 час. Для культивирования штаммов использовали также ферментеры фирмы "Марубиши" (объемом 1,2, 100 и 250 л), оборудованные системами регистрации и контроля рН, р02 и температуры.

Определение активности ферментов. Нитрилгидратазная активность интактных клеток определялась по образованию амида в реакционной смеси объемом 2 мл, содержащей 10 мг/мл нитрила и 0.08 мг/мл клеток ( по сухому весу) в 10 мМ фосфатном буфере, рН7.6. Реакцию проводили при 20 "С в течении 5 мин. Концентрацию амида в надосадочной жидкости определяли с помощью газовой хроматографии или, в случае акриламида, также спектрофотометрически при 235 нм (НрЛ е! а!., 1990). Активность нитрилгидратазы выражали в следующих единицах: Удельную активность (УА) в цМ амида/мин/мг клеток по сухой массе. Общую активность (OA) в \iM амида /мин/мл культуры.

Гидролитическая активность амидазы определялась по образованию аммония в реакционной смеси объемом 2 мл, содержащей 10 мг/мл ацетамида и 0,2 мг/мл клеток ( по сухому весу) или 0,1 мг фермента в 10 мМ фосфатном буфере, рН7.0. Реакция проводилась в течении 30 мин при 37 °С и останавливалась добавлением 0.04 мл HCl. Количество, образующегося аммония, определяется с помощью реактива Неслера. Удельную амидазную активность выражали в цМ МН4/мин/мг клеток по сухой массе или мг белка. Трансферазную активность амидазы определяли по методу Брамера и Кларк (Brammar and Clarke, 1964) и выражали в мкмоль ацетилгидроксамата, образуемого за минуту 1 мг клеток (по сухому весу) или мг белка для изолированного фермента.

Коньюгативный перенос плазмид мелвду штаммами Rhodococcus и E.colL Перенос плазмид между Е. coli SI7-1, содержащим мобилизуемые плазмиды, и реципиентными щтаммами родококков проводили на фильтрах. Клетки донора и реципиента смещивали в соотнощении 4:1 и помещали на фильтр, который инкубировали на среде LB при 28°С в течении ночи. Затем клетки ресуспендировали и высевали на чащки с LB средой с тиострептоном (25 мкг/мл) или апрамицином (70 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (10 мкг/мл).

Электропорация штамма Rhodococcus sp. НХ7 проводилась в 2 мм кюветах (EquiBio) с использованием прибора Easyject Prima (EquiBio, Germany).

Манипуляции с ДНК и РНК. Вьщеление хромосомной и плазмидной ДНК, рестрикция и лигирование ДНК, Саузерн- и Нозерн- гибридизации проводились с использованием стандартных методов (Sambrook et al., 2001) с модификациями. Суммарную РНК вьщеляли с использованием стеклянных бус (420-600 мкм, Sigma). Электрофорез РНК в формальдегид-агарозном геле и перенос ДНК и РНК на Hybond-N мембраны осуществляли согласно рекомендациям производителя (Amersham Corp.).

Амплификация ДНК. Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили на приборе фирмы Eppendorf.

Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI373.

Электрофорез белков в 12,5 % полиакриламидном геле с SDS проводили согласно методике Лемли (Laemmli, 1970).

Транспорт ацетамида и глюкозы изучали с использованием радиоктивномеченных соединений- ['''С]иодацетамида и [",ЛС ]глюкозы. Отобранные пробы анализировали на сцинтилляционном счетчике "Tractor Analytic Delta 300".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СКРИНИНГА

БАКТЕРИЙ, СПОСОБНЫХ УТИЛИЗИРОВАТЬ НИТРИЛЫ

Для выбора стратегии скрининга микроорганизмов с определенной ферментативной активностью важное значение имеют данные о распространенности в окружающей среде субстратов (природньк и синтетических) и о таксономической принадлежности микроорганизмов, обладающих такой активностью.

Нитрильные соединения, содержащие функциональную группу (-CN), такие как цианогликозиды, цианолипиды, индол-З-ацетонитрил, р-циано-Ь-аланин, являются широко распространенными природными соединениями и образуются во многих видах растений и микроорганизмов (bCnowles, 1976). Наиболее многочисленной группой растительных нитрилов являются цианогликозиды, которые играют важную роль в механизме защиты у растений (путем освобождения цианида), а также могут использоваться в качестве источника азота (Conn, 1981).

Синтетические нитрильные соединения производятся в значительных количествах (сотни тысяч тонн) и широко используются в различных областях промышленности. Нитрильные гербициды, хлор- и бромпроизводные бензонитрила, такие как Касарон, Бентрол, Бромоксинил и др. широко используются в сельском хозяйстве. В результате хозяйственной деятельности синтетические нитрилы попадают в окружающую среду с промышленными сточными водами и накапливаются в почвах при использовании гербицидов. Таким образом, нитрилы довольно часто являются компонентами антропогенных и природных биогеоцинозов.

Исходя из распространенности нитрильных соединений в окружающей среде можно было предполагать, что основными нишами для выделения нитрилутилизирующих микроорганизмов являются участки с антропогенными загрязнениями-территории производств нитрилов, их сточные воды, а также природные биогеоцинозы, где активно происходит процесс разложения растительного опада и где присутствуют растительные нитрилы.

Для выделения нитрилутилизирующих бактерий были изучены свыше 50 образцов, отобранных из естественных и антропогенных биогеоценозов с 5 участков. Два участка имели высокий уровень антропогенных загрязнений и находились на территории производственных обьединений "Полимир" г.Новополоцк (Белоруссия) и "Нитрон" г.Саратов, производящих акрилонитрил. Образцы содержали ил, воду из отстойников, смывы баков, содержащих нитрилы а также почву, листья, траву из загрязненных мест.

Естественными биогеоцинозами служили участки хвойно-щироколиственного леса с дерново-подзолистьми почвами около г. Новополоцка, участок степной зоны под городом Саратовом и участок тундры вблизи Нарьян-Мара. На этих участках образцы отбирали из слоев лесной подстилки (опавщие листья, ферментативный слой и гумусовый слой), а также ветощь и верхние части растений.

Вьщеление нитрилутилизирующих бактерий проводилось методом накопительных культур на минеральной синтетической среде с алифатическими нитрилами (ацетонитрилом или изобутиронитрилом) или с ароматическим нитрилом (бензонитрилом) в качестве единственного источника азота.

Изучение новых изолятов проводили по следующей схеме:

1. Распределение на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

2. Идентификация рода, а в некоторых случаях и вида, на основании морфологических и физиологических тестов.

3. Изучение роста на нитрилах и амидах.

4. Анализ продуктов трансформации акрилонитрила. 1.1. Таксономическое разнообразие изолятов

Всего бьшо изолировано свыще 100 щтаммов, растущих на алифатических и ароматических нитрилах. Родовая принадлежность изолятов была установлена на основании микроскопии клеток и физиологических тестов (Табл.3). Таблица 3. Таксономическое разнообразие новых изолятов нитрилутилизирующих бактерий

Окраска по Граму Род Количество изолятов

Грам-положительные 26

Якойососсиз 3

Овг>ъкоу1а 1

Сиг1оЬас(егшт

Грам-отрицательные 7

Р5еис1отопа5 1

Е1ауоЬас1егшт

Alcaligenes

Изоляты были отнесены к 6 родам: Rhodococcus, Oerskovia, Curtobacterium, Pseudomonas, Flavobacterium и Alcaligenes. Первых три рода составляют группу грам-положительных бактерий, а остальные три -группу грамотрицательных бактерий. В количественном отношении среди изолятов превалировали родококки (более 50% от обш,его числа). В пределах этого рода доминировали представители вида Rhodococcus erythropolis, которые, как известно, являются эвритопными.

Не удалось выявить корреляции между местообитанием бактерий, )п:илизируюшим нитрилы и их таксономической принадлежностью. Однако расширение круга биогеоцинозов для отбора образцов позволили дополнить уже известный перечень родов новыми таксонами- Oerskovia, Curtobacterium, Flavobacterium и Alcaligenes.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Яненко, Александр Степанович

выводы

1. Продемонстрированы таксономическое разнообразие и широкое распространение в природных и антропогенных биогеоцинозах бактерий, утилизируюш;их нитрильные соединения. Создана большая коллекция штаммов нитрилутилизирующих бактерий (свыше 100 штаммов), в которой представлены бактерии из 6 таксономических групп (Rhodococcus, Oerskovia, Curtobacterium, Pseudomonas, Flavobacterium и Alcaligenes), обладающих разным набором ферментов -нитрилгидратазой, нитрилазой и амидазой, отличающих по субстратной специфичности. Показано, что бактерии рода Rhodococcus составляют самую многочисленнзто группу (свыше 50%) среди изолированных нитрилутилизирующих бактерий.

2. Селекционирован штамм Rhodococcus rhodochrous М8, нитрилгидратаза которого обладает комплексом уникальных свойств - высокой рН и термостабильностью и широкой субстратной специфичностью. Ферментная система утилизации нитрилов штамма М8, состоящая из двух ферментов -нитрилгидратазы и амидазы, представляет собой удобную модель для изучения механизмов регуляции синтеза белков у почвенных Грам-положительных микроорганизмов.

3. Разработана оригинальная система клонирования и переноса генов для бактерий рода Rhodococcus, основу которой составляют плазмидные вектора, способные передаваться из E.coli в Rhodococcus при коньюгации. Разработанная система открывает новые возможности для конструирования штаммов родококков, в том числе клонирование генов, введение их в клетки разных видов родококков, интеграцию генов в хромосому, введение мутантных алелей в хромосому путем замещение аллелей гена в хромосоме.

4. Осуществлено клонирование локуса хромосомы штамма М8, контролирующего катаболизм нитрилов. Секвенирование, компьютерный поиск гомологии, и функциональный анализ позволили установить основные элементы генетической организации НГ локуса: структурные гены двух субъединиц ИГ (nhmB и nhmA) и 0RF3 с неизвестной функцией составляют единый оперон. Ген амидазы в штамме М8, в отличие от изученных ранее штаммов, не входит в состав этого оперона и не обнаружен в областях, фланкирующих гены НГ. Общий для НГ и AM регуляторный ген, nhmC, контролирующий индукцию обоих ферментов, локализован на растоянии 2 тпн от гена НГ. Таким образом, особенностью НГ локуса в штамме М8 является отсутствие оперонной организации: гены НГ, АМ и регуляторные гены представляют собой единый регулон, обеспечивающий индуцибельное координированое образование двух ферментов НГ и А М, вовлеченных в деградацию нитрилов.

5. Показано, что синтез ферментов утилизации нитрилов в штамме R. rhodochrous М8 подвержен глюкозной репрессии, тем самым, впервые продемонстрировано наличие у родококков углеродной катаболитной репрессии. Отсутствие в штамме М8 фосфотрансферазной системы для транспорта Сахаров (глюкозы и фруктозы), а также отсутствие эффекта сАМР на репрессию свидетельствует, что механизмы катаболитной репрессии у родококков отличаются от таковых у энтеробактерий и бацилл.

6. Установлено, что основными элементами регуляции синтеза ферментов НГ и АМ являются: координированная индукция обоих ферментов, вызываемая амидами, кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и репрессия аммонием. Продемонстрировано, что все эти системы регулируют НГ активность на транскрипционном уровне.

7. С помощью оптимизации условий индукции и отбора мутантов уровень НГ активности штамма М8 повышен в 9000 раз, что позволило разработать на его основе промышленные биокатализаторы для получения амидов. Полученный новый биокатализатор МЗЗ по уровню активности превышает все известные в мире аналоги и используется в настоящее время для производства акриламида в России и Южной Корее. Вследствие широкой субстратной специфичности биокатализатор МЗЗ является универсальным катализатором для получения алифатических, ароматических и гетероциклических амидов из соответствующих цианосоединений.

8. Разработан биотехнологический способ получения акриламида на основе созданных биокатализаторов. Основными преимуществами нового способа являются высокое качество акриламида, прямое получение 50% растворов, которые без дополнительной очистки и концентрирования могут использоваться для полимеризации, экологическая безопасность и низкая себестоимость продукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важнейшим результатом представленной работы является создание новых типов биокатализаторов и развитие на их основе современного биотехнологического процесса получения акриламида. Практика промышленного использования этого процесса дала доказательства значительных преимуществ разработанной технологии по сравнению с традиционно используемой. При этом главными преимуществами процесса являются: высокое качество продукта, экологическая чистота, малая энергоемкость и низкие капитальные затраты на освоение. Высокое качество акриламида, полученного биотехнологическим методом, позволяет получать всю гамму полимеров, применяемых сегодня для очистки питьевой воды и сточных вод, для нефтедобычи, производства бумаги. Процесс получения акриламида с помощью биокатализа является первым примером в России использования биотехнологий в крупномасштабной химии.

Работа по созданию новых биокатализаторов опиралась на изучение природного разнообразия микробных нитрилгидратаз и на детальные исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков. Большое разнообразие природных ферментов свидетельствовало о перспективности дальнейшего поиска новых нитрилгидролизующих ферментов среди природных изолятах. Расширение круга биогеоцинозов для выделения нитрилутилизирующих бактерий позволило продемонстрировать, что доминирующей группой бактерий, обладающих способностью утилизировать нитрилы, являются бактерии из рода Ккоёососсиз. Следует отметить, что родококки обладают значительными преимуществами для их использования в качестве биокатализаторов, Родококки устойчивы к стрессовым факторам, обладают значительной механической прочностью, их клетки не разрушаются в ходе трансформации. Поэтому именно из родококков был выбран штамм, который в конечном счете стал основой для создания промышленных биокатализаторов.

Комплексный подход к изучению утилизации нитрилов в штамме К.гкос1оскгои$ М8 позволил выявить основные элементы регуляции синтеза ферментов НГ и АМ-ключевых ферментов для получения амидов из нитрилов. Нами было установлено, что основными элементами регуляции являются координированная индукция, вызываемая амидами, кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и азотная репрессия. Впервые было продемонстрировано, что в штамме М8 все эти системы регулируют НГ активность на транскрипционном уровне. Изучение влияния кобальта позволило обнаружить принципиально новый механизм регуляции НГ. Ионы кобальта, входящие в состав простетической группы фермента, усиливали транскрипцию гена НГ в

105 штамме М8. Такой механизм регуляции позволяет блокировать образование НГ уже на ранней стадии, если в среде отсутствуют необходимые условия для активности фермента. Такой механизм регуляции является эффективным в случае металло-зависимых ферментов.

Ряд особенностей образования НГ и АМ в клетках М8-необычный механизм индукции, в котором роль индуктора выполняет продукт реакции -амид, а не субстрат; кобальт-зависимый синтез НГ; катаболитная репрессия, а также значительные различия в уровне синтеза НГ и АМ, несмотря на координированную индукцию, позволяют рассматривать НГ/АМ ферментную систему штамма М8 в качестве удобной модели для изучения систем регуляции у родококков.

Штамм R.rhodochrous М8 и особенно его мутант МЗЗ в условиях индукции накапливают в клетках значительные количества белка НГ (до 40% от всех растворимых белков). Причем следует обратить внимание, что такой высокий урожай достигается не за счет увеличения копийности генов. Ген НГ присутствует к клетке в одной копии. При индукции НГ наблюдается мощная транскрипция генов НГ с индуцибельного сильного промотора. Таким образом, штаммы М8 и МЗЗ и их регуляторная система синтеза НГ могли бы использоваться для суперпродукции различных внутриклеточных ферментов. Сконструированные в настоящей работе оригинальные вектора и разработанные методы клонирования генов, их переноса между штаммами, замещения аллелей свидетельствуют о том, что это задача является реальной.

Таким образом, настоящая работа не только ввела штамм R.rhodochrous М8 в круг промышленных бактерий, но и создало предпосьшки для превращения этого штамма в модельный объект для изучения генетики и физиологии родококков.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Яненко, Александр Степанович, 2001 год

1. Абрамова Л.И., Байбурдов Т.А., Григорян Э.П., Зильберман Е.Н., Куренков В. Ф., Мягченков В.А. (1992) Полиакриламид. Под ред. Куренкова В.Ф.-М. Химия.-192 с.

2. Букин В.Н. (1982) «Биохимия витаминов», Наука, М.

3. Кирсанов Н., Сизова И., Тяглова Б., Яненко А. (1995) Количественное определение никотинамида и никотиновой кислоты в реакционных смесях. Биотехнология, N5-6:41-44.

4. Котлова Е.К., Честухина Г.Г., Астаурова О.Б., Леонова Т.Е., Яненко А.С., Дебабов В.Г. (1999) Вьзделение и первичная характеристика амидазы из Rhodococcus rhodochrous. Биохимия, 64 (4):384-389.

5. Нестеренко О. А., Квасников Е. И., Ногина Т. М. (1985) Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии Киев: Наук. Думка.

6. Окороков Л.А., Барышникова Л.М., Мясоедова Н.М. (1985) Транспорт глюкозы и фруктозы Rhodococcus minimus в периодической культуре. Микробиология, 54 (5):778-781

7. Синолицкий М., Полтавская С, Рогачева С, Севрюгина И., Воронин С. (1997) Выделение нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8 и определение N-концевых последовательностей ее субъединиц. Прикладная биохимия и микробиология 33 (4): 383-387.

8. Шлегель. (1987) Общая микробиология. «Мир», Москва.-566с.

9. Ambler R., Auffret А., Clarke P. (1987) The amino acid sequence of the aliphatic amidase from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 215:285-290.

10. Ankri S., Bouvier I., Reyes O., Predali P., Leblon G. (1996) A Brevibacterium linens pRBLl rephcon functional in Corynebacterium glutamicum. Plasmid. 36:36-41.

11. Asano Y., Tani Y. & Yamada H. (1980) A new enzyme "nitrile hydratase" which degrades acetonitrile in combination with amidase. Agric.Biol.Chem.46:l 183-1185.

12. Asano Y., Yasuda Т., Tani Y. & Yamada H. (1982) Microbial degradation of nitrile compounds -a new enaymatic method of acrilamide production. Agric. Biol. Chem. 46:1183-1189.

13. Asano Y., Tachibano M., Tani Y. & Yamada H. (1982a) Pщifюation and characterization of amidase which participates in nitrile degradation. Agric. Biol.Chem.46:l 175-1181

14. Baker D. et al. (1976) Nutr. Rep. Int. 14 (1):115-120.

15. Baltz R.H., Hosted T.J. (1996) Molecular genetic methods for improving secondary-metabolite production in actinomycetes. Trends in Biotechnol. 14:245-250.

16. Bauer R., Knackmuss H., Stolz A.(1998) Enantioselective hydration of 2-arylpropionitriles by a nitrile hydratase from Agrobacterium tumefaciens strain d3. Appl.Microbiol.Biotechnol. 49:89-95.

17. Bergey's Manual of Determinative bacteriology (1994) 9 edition. Ed.W.Hensyl et all., Williams & Wilkins, USA.

18. Bonnet D., Artaud I., Moali C, Petre D., Mansuy D.(1997) Highly efficient control of iron-containing nitrile hydratases by stoichiometric amounts of nitric oxide and light. FEBS Lett. 409: 216-220.

19. Breiman В., Alms G., Nelson M., Durney L., Scarrow R. (1996) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous Jl contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J.Am.Chem.Soc. 118: 9194-9195.

20. Bianchi D., Bosnetti P.,Cesti G.,Franzosi G., Spezia S. (1991) Biotecnol.Lett. 13:241.

21. Brammar, W. J. and Clarke, P. H. (1964). Induction and repression of Pseudomonas aeruginosa amidase. J. gen. Microbiol. 37:307-319.

22. Brownell G.H., Denniston K. (1984) Genetics of the nocardioform bacteria. In: Goodfellow M., Mordarski M., Williams S.T. (Eds) The biology of the Actinomycetes. Academic Press, New York:201-208.

23. Bunch A. (1996) Nitriles. In Biotechnology. Biotransformation I, vol.8a (ed.D.Kelly). Wiley. 277-324.

24. Bui K., Arnaud A., Galzy P. (1982) A new method to prepare amides by bioconversion of corresponding nitriles. Enzyme Microbiol. Technol. 4:195-197.

25. Chassin C. (1996) A biotechnological process for the production of nicotinamide. Spec. Chem. 16:102-103.

26. Chebrou H., Bigey P., Amaud A., Galzy P. (1996) Study ofthe amidase signature group. Biochimica and Biophysica Acta 1298:285-293.

27. Cheong T., Oriel P. (2000) Cloning a wide spectrum amidase from Bacillus stearothermophilus BR388 in E.coli and marked enhancement of amidase expression using directed evolution. Enzyme and Microb. Technol. 26:152-158.

28. Ciskanic L., Wilczeck J., Fallon R. (1995) Purification and characterization of an enantioselective amidase from Pseudomonas chlororaphis B23. Appl. Environ. Microbiol. 61:998-1003.

29. Clarke P. (1970) The aliphatic amidases of Pseudomonas aeruginosa. AdyM\cxoh\o\. Physiol.4:179-222.

30. Clarke P. and Tata R. (1973) Isolation of amidase negative mutants of Pseudomonas aeruginosa by a positive selection method using an acetamide analogue. J.Gen. Microbiol. 75:231-234.

31. Cohen S., Hachler H.,Levy S. (1993) Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in E.coli. J.Bacterioi. 175:1484-1492.

32. Collier D.N., Hager P.W., Phibbs P.V Jr. (1996) Catabolite repression control in the Pseudomonads.KtsMicxohioWAl-.551-561.

33. Commeyras A., Amaud A., Galzy P., Jallageas J. (1973) Demande de Brevet DTnvention, No. 73:33613;

34. Commeyras A., Amaud A., Galzy P., Jallageas J. (1977) U.S. Patent 4,00,081;

35. Coim E. (1979) Biosynthesis of cyanogenic glycosides. Naturwissenschafiten,66:28-34.

36. Corm E. (1981) Biosynthesis of cyanogenic glycosides. In Cyanide in Biology. Eds.Vennesland et al. london. Academic Press. 183-196.

37. Bork P., Koonin E. (1994) A new family of carbon-nitrogen hydrolases. Protein Science 3:1344-1346.

38. Duran R, Nishiyama M, Horinouchi S, Beppu T.(1993) Characterization of nitrile hydratase genes cloned by DNA screening from Rhodococcus erythropolis. Biosci Biotechnol Biochem. 57(8): 1323-8.

39. Effenberger F.,Graef B. (1998) Chemo- and enantioselective hydrolysis of nitriles and acid amides, respectively, with resting cells of Rhodococcus sp.C3II and Rhodococcus erythropolis MP50. J.Biotechnol. 60:165-174.

40. Endo I., Odaka M., Yohda M. (1999) An enzyme controlled by light: the molecular mechanism of photoreaactivity in nitrile hydratase. Trends Biotechnol. 17: 244-248.

41. Fallon R,, Stieglitz B., Turner I. (1997) A Pseudomonasputida capable of stereoselective hydrolisis ofnitriles Appl.Microbiol.Biotechnol. 47: 156-161.

42. Fawcett C, Seeley R., Taylor H., Wain R., Wightman F. (1958) Metabolism of certain acids, amides and nitriles within plant tissues. Proc.R.Soc. B148:543-570.

43. Foley S., Bron S., Venema G., Daley C, Fitzgerald G. (1996) Molecular analysis of the replication origin ofthe Lactococcus lactisplasmidpCI305. Plasmid. 36:125-141.

44. Fournand D., Arnaud A. (2001) Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity. J. Appl.Microbiol. 91:381-393.

45. Fournand D., Arnaud A., Galzy P. (1997) Study of the acyl transfer activity of a recombinant amidase ove^roduced in an E.coli strain. J.Molec. Catalysis -B:Enzymatic 4:77-90.

46. Goodfellow M., Alderson G., Chun J. (1998) Rhodococcal systematics: problems and developments. Antonie van Leeuwenhoek 74:3-20.

47. Goldlust A., Bohak Z. (1989).Induction, purification, and characterization of the nitrilase of Fusarium oxysporum f.sp.melonis. Biotech Appl Biochem. 11:581-601;

48. Ha^er DB. (1977). Microbial metabolism of aromatic nitriles: Enzymology of C-N cleavage by Nocardia sp. NCIB 11216. J. Biochem. 165:309-319;

49. Hardy R., Burns R., Parshall G.(1971) In Inorganic Biochemistry, v.2,pp.746-793. ed.K.Eichkora. Elsevier.

50. Hashimoto J., Nishiyama M., Yu I., Watanabe S., Horinouchi S. and Bebbu T. (1992) Development of a host vector system in a Rhodococcus strain and its use for expression of the cloned nitrile hydratase gene cluster. J.Gen.Microbiol. 138:1003-1010.

51. Helmann, J. D., Wang, Y., Mahler, I. and Walsh, C. T. (1989). Homologous metalloregulatory proteins from both gram-positive and gram-negative bacteria control transcription of mercury resistance opérons. J. Bacteriol. 171: 222-229.

52. Henkln T.M. (1996) The role of the CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillussubtilis. FEMS Microbiol Lett. 135:9-15.

53. Hjort, C. M., Godtfredsen, S.E. and Emborg, C. (1990). Isolation and characterization of a nitrile hydratase from a Rhodococcus sp. J. Chem. Tech. Biotechnol. 48: 217-226.

54. Hodgson DA. (1982) Glucose repression of carbon source uptake in Streptomyces coelicolor A3 (2) and its perturbation in mutants resistant to 2-deoxyglucose. J. Gen. Microbiol. 128:2417-2430.

55. Hook R., Robinson W. (1964) Ricinine nitrilase -II. Purification and properties. J.Biol.Chem. 239:4263-4267.

56. Huang W., Jia J., Cummings J., Nelson M., Schneider G., Lindqvist Y. (1997) Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centre in a novel fold. Structure 5:691699.

57. Hueck C.J., Hillen W. (1995) Catabolite repression in Bacillus subtilis: a global regulatory mechanism for the Gram-positive bacteria. Mol Microbiol. 15:395-401.

58. Ikehata O., Nishiyama M., Horinouchi S., Beppu T. (1989) Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in E.coH. Eur.J.Biochem. 181:563-570.

59. Jones B.E., Dossonnet V., Küster E., Hillen W., Deutscher J., Klevit R.E. (1997) Binding of the catabolite repressor protein CcpA to its DNA target is regulated by phosphorylation of its corepressor HPr. J Biol Chem. 272:26530-26535.

60. Kaneko T., Sato S., Kotani H., Tanaka A., Asamizu E., Nakamura Y., Miyajima N., Hirosawa M., Sugiura M., Sasamoto S., Kimura T., Hosouchi T., Matsuno A., Muraki A., Nakazaki N., Naruo K., Okumura S., Shimpo S., Takeuchi C, Wada T., Watanabe A.,

61. Kim S-H., Oriel P. (2000) Cloning and expression of nitrile hydratase genes from Bacillus sp. BR449 into E.coli. Enzyme Microbiol.Technol. 27:492-501.

62. Knowles C. (1976) Microorganisms and cyanide. Bacteriol.Rev. 40:625-680.

63. Kobayashi M., Shimizu S. (2000) Nitrile hydrolases. Curr.Opinion Chem.Biology 4:95102

64. Kobayashi M., Shimizu S. (1999) Cobah protein. Eur. J. Biochem. 261: 1-9.

65. Kobayashi M, Goda M, Shimizu S. (1998). Nitrilase catalyzes amide hydrolysis as well as nitrile hydrolysis. Biochem Biophys Res Commun. 253(3):662-666;

66. Kobayashi M, Shimizu S. (1998a) Metalloenzyme nitrile hydratase: structure, regulation, and application tobiotechnology. Nat Biotechnol. 16(8): 73 3-73 6.

67. Kobayashi M., Fujiwara Y., Goda M., Komeda H., Shimizu S (1997) Identification of active sites in amidase. Proceed.Nat.Acad.Sci. 94:11986-11991.

68. Kobayashi M., Shimizu S. (1994). Versatile nitrilases: Nitrile-hydrolysing enzymes. FEMS Microbiol Lett. 120;217-224;

69. Kobayashi M, Nagasawa T, Yamada H.(1992) Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over. Trends Biotechnol. 11:402-408.

70. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. (1991a). Hyperinduction of an aliphatic nitrilase by Rhodococcus rhodochrous K22. FEMS Microbiol Lett. 77:121-124;

71. Kobayashi M., Nagasawa T., Yamada H. (1988) Regiospecific hydrolysis of dinitrile compounds by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl. Appl.Microbiol.Biotechnol. 29:231 -233.

72. Komeda H, Kobayashi M, Shimizu S. (1996a) Characterization of the gene cluster of high-molecular-mass nitrile hydratase(H-NHase) induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous Jl.ProcNatl Acad Sci USA. 93(9):4267-72.

73. Komeda H, Kobayashi M, Shimizu S.(1996b) A novel gene cluster including the Rhodococcus rhodochrous Jl nhlBA genes encoding a low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product. J. Biol Chem. 271(26): 1579615802.

74. Komeda H, Kobayashi M, Shimizu S. (1997) A novel transporter involved in cobalt uptake. ProcNatl Acad Sci USA. 94(1):36-41.

75. Kulakov L.A., Larkin M.J., Kulakova A.N. (1997) The plasmid pKA22 isolated from the naphthalene degrading derivative of Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064. Plasmid. 38:61-69;

76. Kuwahara M., Yanase H. (1985) Liberation of hydrogen cyanide from diaminomaleonotrile by Trichoderma sp. MB519. Agric.Biol.Chem. 49:125-131.

77. Kwakman JHJM., Postma PW. (1994) Glucose kinase has a regulatory role in carbon catabolite repression in Streptomyces coelicolor. J. Bacterial, 176:2694-2698;

78. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277: 680-685.

79. Larkin M.J., De Mot R., Kulakov L.A., Nagy L (1998) Applied aspects of Rhodococcus genetics. Antonie van Leeuwenhoek 74:133-153;

80. Layh N., Willetts A. (1998) Enzymatic nitrile hydrolysis in low water systems. Biotechnol.Lett. 20:329-331.

81. Lomovskaya N., Chater K., Mkrtumian N. (1980) Genetics and molecular biology of Streptomyces bacteriophages. Microbial. Rev. 44:206-229;

82. Mahadevan S., Thimann KV. (1964). Nitrilase: IL Substrate specificity and possible mode of action. Arch Biochem Biophys. 107:62-68;

83. Maestracci M, Thiery A., Amaud A., Galzy P. (1984) Activity and regulation of an amidase with a wide substrate spectrum from a Brevibacterium sp. Archives of Microbiol. 138:315-320.

84. Maestracci M., Bui K., Thiery A., Arnaud A., Galzy P. (1988) The amidases from a Brevibacterium strain: study and applications. Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 36:67115;

85. Magasanik B. (1996) Regulation of nitrogen utilization. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology., Second Ed. (ed.F.Neidhardt) ASM.

86. Magasanik B. (1982) Genetic control of nitrogen assimilation in bacteria. Ann. Rev. Genet. 16:135-168;

87. Maier- Greiner et al. (1991) Isolation and properties of a nitrile hydratase from the soil fungus Myrothecium verrucaria that is highly specific for the fertilizer cyanamide and cloning of its gene. Proc Natl Acad Sci USA. 88:4260-4264.

88. Masadam A., Knowles C. (1985) The steriospecific bioconversion of a-aminopropionitrile to L-alanine by an immobilised bacterium isolated from soil. Biotechnol.Lett. 7:865-870.

89. Moreau J., Bernet N., Arnaud A., Galzy P. (1993) Isolation of Brevibacterium sp.R312 mutants potentially useful for the enzymatic production of adipic acid. Can. J.Microbiol. 39:524-528).

90. Nagasawa T, Takeuchi K, Yamada H. (1991) Characterization of a new cobalt-containing nitrile hydratase purified from urea-induced cells of Rhodococcus rhodochrous J l. Eur. J.Biochem. 196(3):581-9;

91. Nagasawa T, Mauger J, Yamada H. (1990a). A novel nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes faecalis JM3. Purification and characterization. Eur J Biochem. 194(3):765-72;

92. Nagasawa T., Nakamura T., Yamada H. (1990b). e-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous Jl nitrilase. Arch Microbiol. 155:13-17;

93. Nagasawa T., Ryuno K., Yamada H. (1989) Superiority of Pseudomonas chlororaphis B23 nitrile hydratase as a catalyst for the enzymatic production of acrylamide. Experientia 45: 1066-1070;

94. Nagasawa T., Mathew C, Mauger J., Yamada H. (1988) Nitrile hydratase catalysed production of nicotinamide from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous Jl. Appl.Env.Microbiol. 54:1766-1769;

95. Nagasawa T., Nanba H., Ryuno K., Takeuchi K., Yamada H. (1987) Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23 -purification and characterization. Eur. J.Biochem. 162:691-698;

96. Nishiyama M, Horinouchi S, Kobayashi M, Nagasawa T, Yamada H, Beppu T.(1991) Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23. JBacteriol. 173(8):2465-72;

97. Pastan L, Adhya S. (1976) Cyclic adenosine 5'-monophosphate in E.coli. Bacteriol.Rev.40:527-551.

98. Payne M.S., Wu S.J., Fallon R.D., Tudor G., Stieglitz B., Turner LM., Nelson M.J. (1997) A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase. Biochemistry. 36:54475454;

99. Parish,T., Mahenthiralingam,E., Draper,P., Davis,E.O. and Colston,M.J. (1997) Regulation of the inducible acetamidase gene of Mycobacterium smegmatis. Microbiology. 143 (Pt 7):2267-2276;

100. Pereira R., Graham D., Rainey F., Cowan D. (1998) A novel thermostable nitrile hydratase. Extremophiles. 2:347-357;

101. Postma PW., Lengeler JW., Jacobson GR. (1993) Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria. Microbiol Rev, 57:543-594;

102. Ramakrishna C, Dave H., Ravindranathan M. (1999) Microbial metabolism of nitriles and its biotechnological potential. J.Sci. Ind.Research 58:925-947.

103. Rauzier, J., Moniz-Pereira, J., Gicquel-Sanzey, B. (1988) Complete nucleotide sequence ofpAL5000, aplasmid from Mycobacterium fortuitum. Gene. 71:315-321;

104. Saier MH Jr., Chauvaux S., Cook GM., Deutscher J., Paulsen IT., Reizer J., Ye JJ. (1996) Catabolite repression and inducer control in Gram-positive bacteria. Microbiology, 142:217-230;

105. Sambrook J., Russell D. (2001) Molecular Cloning. CSHL Press.

106. Sari M., Moali C, Boucher J., Jaouen M., Mansuy D. (1998) Detection of a nitric oxide synthase possibly involved in the regulation of the Rhodococcus sp. R312 nitrile hydratase. Biochem Biophys Res Commun. 250: 364-368.

107. Scarrow RC, Brennan BA, Cummings JG, Jin H, Duong DJ, Kindt JT, Nelson MJ. (1996) X-ray spectroscopy of nitrile hydratase at pH 7 and 9. Biochemistry. 35(31):10078-88;

108. Schweizer H. (1993) Two plasmids, pX1918 and pZ1918, for easy recovery of the zylE and lacZ reporter genes. Gene. 134:89-91;

109. Simon R., Priefer U., Puhler A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria. Biotechnology. 1:784-794;

110. Singer M., Finnerty W. (1988) Construction of an Escherichia coli-Rhodococcus shuttle vector and plasmid transformation in Rhodococcus spp. J.Bacterial. 170:638-645;

111. Skouloubris S., Labigne A., De Reuse H. (1997) Identification and characterization of an aliphatic amidase in Helicobacter pylori. Molecular Microbiol. 25:989-998.

112. Soubrier P., Levy-Schil S., Mayaux J. P., Petre D., Amaud A., Crouzet J. (1992) Cloning and primary structure of the wide-spectrum amidase from Brevibacterium sp. R312: high homology to the amiE product from Pseudomonas aeruginosa. Gene^llS: 99-104;

113. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa T., Yamada H. (1987) Nitrile hydratase: the first non-heme iron enzyme with a typical low-spin Fe(III)-active center. J.Am.Chem.Soc. 109:5848-5850.

114. Stelkes-Ritter U., Wyzgol K., Kula M. R. (1995) Purification and characterization of a newly screened microbial peptide amidase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:393-398;

115. Stevenson DE, Feng R, Dumas F, Groleau D, Mihoc A, Storer AC. (1992). Mechanistic and structural studies on Rhodococcus ATCC 39484 nitrilase. Biotechnol Appl Biochem. 15(3):283-302;

116. Sttilke J., Arnaud M., Rapoport G., Martin-Verstraete I. (1998) PRD -a protein domain involved in PTS-dependent induction and carbon catabolite repression of catabolic operons in bacteria. Mol Microbiol, 28:865-874;

117. Stulke J., Hillen W. (1999) Carbon catabolite repression in bacteria Current Opinion in Microbiology, 2:195-201;

118. Titgemeyer F., Walkenhorst J., Reizer J., Stuiver M.H., Cui X., Saire M.H.Jr. (1995) Identification and characterization of phosphoenolpyruvate: fructose phosphotransferase systems in three Streptomyces species. Microbiology, 141:51-58;

119. Voeykova T., Tabakov V., Ryabchenko L., Mkrtumyan N., Yanenko A. (1994) Conjugative transfer of plasmid pTOl from Escherichia coli to Rhodococcus spp. Biotechnol Lett. 16:555-560;

120. Watanabe I., Satoh Y., Enomoto K. (1987) Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrile -hydrating activity. Agric. Biol Chem. 51:3193-3199;

121. Wilson S.A & Drew R. E. (1991) Cloning and DNA sequence of amiC, a new gene regulating expression of the Pseudomonas aeruginosa aliphatic amidase, and purification ofthe am/C product. J. 5ac?mo/. 173:4914-4921;

122. Wu S., Fallon R., Payne M. (1997) Overproduction of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in E.coli. Appl.Microbiol.Biotechnol. 48:704-708.

123. Wyborn N., Mills J., Williams S., Jones C. (1996) Molecular characterization of formamidase from Methylophilus methylotrophus. Eur.J. Biochemistry 240:314-322.

124. Yamaki T., Oikawa T., Ito K., Nakamura T. (1997) Cloning and sequencing of a nitrile hydratase gene from Pseudonocardia thermophila JCM3095. J.Ferm.Bioeng. 83:474477.115

125. Yamamoto K., Komatsu K-I. (1991) Purification of nitrilase responsible for the enantioselective hydrolysis from Acinetobacter sp.AK226. Agric. Biol.Chem. 55:14591466.

126. Yamamoto K., Fujimatsu I., Komatsu K-I. (1992). Purification and characterization of the nitrilase from Alcaligenes faecalis ATCC 8750 responsible for enantioselective hydrolysis of mandelonitrile. J. PermBioeng. 73:425-430;