Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Павлова, Юлия Андреевна

• Павлова, Юлия Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Павлова, Юлия Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Организмы - продуценты амидаз

1.3. Ферментативная активность амидаз

1.4. Классификация и характеристика нитрилгидратаз и нитрилаз

1.5. Стереоселективность амидаз

1.6. Использование штаммов- продуцентов ферментов метаболизма нитрилов и амидов

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Среда и условия культивирования бактерий

2.3. Идентификация выделенных культур

2.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов

2.5. Трансформация нитрилов и амидов карбоновых кислот

2.6. Методы энзиматического анализа

2.7. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция

2.8 Праймеры и условия ПЦР-анализа

2.9. Секвенирование ДНК

2.10. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. СЕЛЕКЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ВЫСОКУЮ ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

3.1 Отбор и характеристика образцов почв для выделения микроорганизмов

3.2. Изучение аэробной гетеротрофной почвенной микрофлоры. Выделение и селекция штаммов, метаболизирующих амиды и нитрилы

3.3 Селекция штаммов, проявляющих высокую гидролитическую активность

3.4. Идентификация почвенных изолятов, проявляющих высокую гидролитическую активность

3.5. Зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности изолятов от фазы роста на среде с ацетонитрилом

3.6. Оценка минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов

3.7. Трансформация амидов и нитрилов выделенными штаммами

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ ШТАММОВ ШОООСОССиБ

4.1. Влияние температуры на активность амидаз

4.2. Влияние рН на активность амидаз

4.3. Действие ряда ингибиторов на активность амидаз

4.4. Субстратная специфичность амидаз

4.5. Стабильность препарата амидазы после замораживания

4.6. Свойства ферментов метаболизма нитрилов

ГЛАВА 5. ПЦР-ДЕТЕКЦИЯ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ

5.1. ПЦР-анализ генов амидаз

5.2. ПЦР-детекция генов нитрилгидратаз и нитрилаз

5.3. Анализ последовательности нуклеотидов, гомологичных генам амидаз

Я. егуЖгороШ, ОепВапк, М88614

5.4. Анализ последовательности нуклеотидов генов энантиоселективных амидаз, гомологичных ферментам из Шюйососст ер. N-774, Я. егуЖгороНя АУ026386, Е12517 вепВапк

5.5. Сравнение аминокислотных последовательностей амидаз

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Амидазы (КФ 3.5.1.4) - ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Амидазы участвуют в метаболизме азота в клетках и широко распространены в природе, обнаружены у про- и эукариот. У бактерий появление амидазной активности часто связано с метаболизмом нитрилов. Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью. Некоторые из них катализируют гидролиз амидов алифатических кислот, другие расщепляют ароматические амидосоединения, третьи гидролизуют амиды аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью. Однако наличие у бактерий ферментов разных видов и их способность трансформировать различные типы субстратов не являются родо- или видоспецифичными признаками [15]. Амидазную активность часто обнаруживают у протеобактерий, а также у актинобактерий (Nocardia, Rhodococcus, Arthrobacter).

Актуальность изучения амидаз и их продуцентов обусловлена значительной разнородностью структуры этих ферментов, свойств, генетической организации и регуляции активности, интеграции с другими процессами метаболизма, а также широкой субстратной специфичностью данных ферментов и стереоселективностью некоторых из них [4, 33, 43, 55]. Культуры, активно использующие амиды в качестве ростовых субстратов, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. [9, 10, 43,55].

К настоящему времени амидазы остаются недостаточно изученными на молекулярном уровне, и их классификация окончательно не сформулирована. В классификации, основанной на субстратной

специфичности, объединены ферменты, различающиеся по структурной организации, механизму действия и каталитическим свойствам [55].

В связи с этим большой интерес представляет поиск продуцентов новых амидаз, различающихся каталитическими свойствами, сравнение генов и аминокислотных последовательностей данных ферментов с целью изучения их разнообразия и распространения определённых структурных типов у различных бактерий, эволюционной изменчивости, последующего определения взаимосвязи структуры и функции, механизмов экспрессии белков, уточнения механизмов их действия, структуры фермента и ее роли в катализе [93].

В последнее время пристальное внимание уделяется исследованиям в области стереоселективной трансформации субстратов клетками. Стереоселективность позволяет использовать биокатализаторы для эффективного синтеза некоторых чистых энантиомеров, фармакологических препаратов, а также для получения и других продуктов, которые трудно синтезировать традиционными химическими способами. Некоторые амидазы проявляют энантиоселективность по отношению, например, к производным арилпропионовых кислот. Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, аммонииных солеи акриловои и никотиновой кислот, нестероидных противовоспалительных препаратов [24].

Успешное применение микроорганизмов в биокаталитических технологиях зависит от свойств биокатализаторов: скорости гидролиза субстрата, рН- и температурного оптимумов активности ферментов, субстратной избирательности, оптимального состава рабочей среды. Разные ферменты существенно различаются по этим свойствам, поэтому подобная характеристика фермента помогает оценить перспективы использования продуцентов. В связи с вышеизложенным, селекция и изучение бактерий -активных продуцентов амидаз является актуальным направлением микробиологических исследований [2, 15, 146].

Цель настоящего исследования - выделение, морфологическая и биохимическая характеристика почвенных бактерий, активно метаболизирующих амиды карбоновых кислот, исследование генов амидаз.

Основные задачи исследования:

1) Выделить и идентифицировать микроорганизмы, метаболизирующие амиды и нитрилы, из различных образцов характерных почв Пермского края. Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно-амидазный).

2) Провести ПЦР-анализ генов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз. Получить ПЦР-фрагменты, соответствующие белок-кодирующим последовательностям генов амидаз.

3) Провести BLAST-шалш и сравнение секвенированных последовательностей с известными генами амидаз разных типов. Определить аминокислотные последовательности амидаз. Провести сравнение с первичной структурой известных ферментов.

4) Охарактеризовать влияние факторов среды (pH, температуры, ингибиторов) на активность ферментов амидазы и нитрилгидратазы.

Состояние вопроса.

В последние годы возрос научный интерес к изучению микроорганизмов, конвертирующих амиды и нитрилы карбоновых кислот, что обусловлено успешным опытом их применения в производстве акрилатов и акриламида, а также возможностью использования в качестве биокатализаторов для получения других полезных химических продуктов.

По первичной структуре амидазы подразделяются на четыре семейства:

I. Ферменты, содержащие в первичной структуре GGSS -мотив (глицин-глицин-серин-серин);

II. Нитрилазы/цианидгидратазы;

III. Ацилтрансферазы;

IV. Уреазы [15,55].

Среди амидутилизуирущих микроорганизмов известны бактерии, принадлежащие к родам Rhodococcus, Corynebacterium [17, 148], Mycobacterium [94], Pseudomonas [36, 111], Bacillus, Micrococcus, Brevibacterium [73, 100, 110], Nocardia [42, 46, 76, 77], Streptomyces, Blastobacter, Arthrobacter, Achromobacter [35], Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus, и Methylophilus [21].

Амидазы обладают амидгидролазной и ацилтрансферазной активностями. Разные амидазы проявляют различную субстратную специфичность. Например, была выделена никотинамидаза Mycobacterium avium, которая проявляла специфичность к никотинамиду. А амидаза Rhodococcus rhodochrous J1 [83] обладала широким спектром действия. Важно отметить то, что один микроорганизм может содержать несколько структурно не родственных амидаз. Например, штамм Rhodococcus sp. R312, описанный Arnaud и коллегами, содержит L-альфа-аминоамидазу, энантиоселективную амидазу, алифатическую амидазу и несколько абсолютно специфичных амидаз для никотинамида, формамида или мочевины [18].

Существует предположение, что наличие амидаз у бактерий связано с метаболизмом нитрилов. В природе реализуются различные пути метаболизма нитрилов, распространенные как у бактерий, так и у эукариот: 1) гидролиз в котором участвуют ферменты - нитрилаза или нитрилгидратаза и амидаза; 2) окисление, катализируемое оксигеназой, с последующим гидролизом оксинитрилазой; 3) восстановление с участием нитрогеназы.

В последние годы бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, привлекают внимание возможностью применения в производстве различных фармацевтических препаратов, что обусловлено регио- и стереоселектив-ностью биотрансформации [108, 130, 137, 162].

Наиболее часто способность к утилизации нитрилов обнаруживают среди бактерий. У бактерий существует два альтернативных пути метаболизма нитрилов [22, 52, 97]:

1) гидролиз до соответствующей карбоновой кислоты и аммония, катализируемый одним ферментом - нитрилазой (КФ 3.5.5.1);

2) катализируемая нитрилгидратазой (КФ 4.2.1.84) гидратация нитрила до амида, с последующим гидролизом до кислоты и аммония под действием амидазы (КФ 3.5.1.4).

Охарактеризовано несколько типов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз [79, 81, 89, 95, 157]. Установлено, что нитрилазы и амидазы являются гомомультимерными тиольными ферментами, обычно содержащими от 2 до 16 субъединиц [55]. Нитрилгидратазы относятся к металлоферментам и различаются простетическими группами (ионы железа или кобальта) [25, 84]. Практически все известные нитрилгидратазы являются гетеромультимерами, состоящими из двух субъединиц аир, соединенных в эквимолярном соотношении [43]. На основании биофизических исследований предложены модели механизмов ферментативной трансформации амидов [22].

Интенсивный поиск позволил выделить новые штаммы бактерий, обладающие уникальными ферментами, способными к региоспецифичному и высокоселективному гидролизу нитрилов [143, 156, 159]. Применение таких биокатализаторов позволяет получать химические соединения, которые невозможно синтезировать традиционными химическими способами [2, 5, 22, 23, 24, 45, 55, 130].

До настоящего времени мало изучены структурные варианты амидаз известных видов. Описаны лишь отдельные представители амидаз различных структурных групп.

Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой амидазной активностью, которые идентифицированы на основании

физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как представители Якойососст егуЧкгороШ. С помощью праймеров к генам, кодирующим амид- и нитрилгидролизующие ферменты, у изолятов подтверждено наличие генов амидазы и Ре-зависимой нитрилгидратазы. Показано, что амидазы катализируют гидролиз как алифатических, так и ароматических амидов, проявляют активность в широком диапазоне температуры и рН. Для экспрессии этих ферментов не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Селекционированы штаммы Я. егу^гороШ, характеризующиеся высокой активностью амидазы (до 14 мкмоль/мг/мин при 25°), амидазная активность которых ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.

Впервые проведено сравнение нуклеотидных последовательностей ряда энантиоселективных амидаз из разных штаммов Ккойососсш, установлены их отличия от ранее известных гомологов. Секвенированы и депонированы в базу данных ОепВапк новые последовательности генов амидаз.

Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, метаболизирующих амиды до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих амидазы разных структурных групп. Разработаны протоколы полимеразной цепной реакции, позволяющие дифференцировать наличие амидаз различных структурных групп.

Секвенированы гены амидаз из новых штаммов. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами и филогенетический анализ. Показано, что исследованные амидазы могут быть использованы для биокаталитической трансформации амидов, в т.ч. для энантиоселективного синтеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные и идентифицированные штаммы бактерий эффективно трансформируют алифатические и ароматические амиды в соответствующие карбоновые кислоты и обладают высокой амидазной активностью.

2. Амидазы исследованных штаммов Rhodococcus активны в широким диапазоне температур, имеют максимумом активности при рН 7 и стабильны при хранении.

3. Штаммы Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью, имеют гены, гомологичные известным последовательностям, кодирующим амидазы сигнатурного типа.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Межрегиональной научной конференции "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (Пермь, 2007), VII Международной конференции "Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет" (Н. Новгород, 2008), III Международой конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал" (Н. Новгород, 2008), V молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2009), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2009" (Пермь, 2009), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2010" (Н. Новгород, 2010), VII Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 2010), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), I молодёжной научной школе-конференции "Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах" (Оренбург, 2011), Всероссийской научной конференции с международным участием "ЭКОБИОТЕХ-2011" (Уфа, 2011).

Результаты проведенных исследований опубликованы в 15 научных работах: 8 статей, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 166 наименований работ, в том числе 16 отечественных и 150 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» и гранта поддержки молодых ученых УрО РАН.

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Список принятых сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ - газовая хроматография; ЕД - единица активности фермента, мкмоль/мг/мин; КОЕ - колониеобразующие единицы; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; МПА - мясопептонный агар; ОП - оптическая плотность; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ЬВ -среда Луриа-Бертани, НГ - нитрилгидратаза, СЕ - субъединица.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Павлова, Юлия Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что бактерии, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот, представлены во всех изученных типах почв Пермского с о края в количестве 10'-10° КОЕ/г сухой почвы. Среди культур, обладающих высоким уровнем амидазной активности, преобладают актинобактерии рода Якойососст.

2. Селекционированы штаммы ЛЬойососсш с высокой активностью амидазы (более 5 мкмоль/мг/мин), имеющие нитрилгидратазно-амидазную систему метаболизма нитрилов.

3. Установлено, что высокая активность амидаз исследованных штаммов ЯЬосИососст проявляется в диапазоне 25-60°С с максимумом при 50°С. Оптимальная рН реакционной среды составляет от 5 до 8 с максимумом 7.

4. Показано, что исследованные штаммы Якойососсш эффективно трансформируют амиды карбоновых кислот. При трансформации ибупрофенамида продуктом является 8-ибупрофен с энантиомерным избытком 97%.

5. У большинства изолятов ЯкоЛососсш, обладающих высокой амидазной активностью, обнаружены фрагменты ДНК размером ок. 1566 пн, на 98-99,3% гомологичные гену энантиоселективной амидазы Я. егу^гороИБ, ОепВапк Е12517 и на 96-97% последовательности Яко^соссш эр. N-774, вепВапк Х54074. У ряда изолятов обнаружены фрагменты размером 1100 пн, на 95-99,7% совпадающие с последовательностью амидазы Я. егу^гороШ, ОепВапкМ88614.

6. Установлено, что гомология аминокислотных последовательностей исследуемых энантиоселективных амидаз относительно известной последовательности Е12517 из Я. егуЖгороШ составляет от 98,27 до 98,85%.

7. В геноме исследуемых штаммов обнаружены гены а- и (3-субъединиц Бе-зависимых нитрилгидратаз, гомологичные описанным ранее у штаммов ЯкосИососсия ер. N-771, N-774 и 11-312.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что бактерии, активно утилизирующие амиды и нитрилы карбоновых кислот, широко представлены в почвах естественной среды. Их содержание варьирует в пределах 105-108 КОЕ/г сух. почвы, что составляет не более 2% от общего числа гетеротрофов. Наибольшее количество таких бактерий отмечено в верхних горизонтах почв и в ризосферной зоне растений. Более высокое количество активных изолятов было выделено из образцов дерново-луговой почвы. Наибольшее таксономическое разнообразие также отмечено в образцах верхнего слоя гумусового горизонта. Аналогичные данные получены при анализе других типов почв. Этот факт вероятно связан с наличием развитой ризосферы травянистых растений, являющейся источником фитогенных нитрильных метаболитов. Полученные результаты указывают на связь происхождения системы метаболизма нитрилов и амидов у бактерий с поступлением в почву экссудатов корней растений, содержащих метаболиты нитрильной природы, в частности, индол-3-ацетонитрил -предшественник индолилуксусной кислоты (ауксина) в альтернативном пути биосинтеза [26].

В результате селекции из образцов почв выделено более 400 культур грамположительных бактерий, активно метаболизирующих амиды и нитрилы, из них 38, обладающих амидазной активностью более 5 мкмоль/мг/мин. Методами полифазной таксономии, а также путем анализа генов 16S рРНК изоляты идентифицированы как представители рода Rhodococcus, главным образом R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber.

Показано, что большинство амидаз Rhodococcus высокоактивны при повышенной температуре (50°С), что свидетельствует также об их технологической стабильности и является ценным признаком для биотехнологического применения.

Показано, что ферменты исследуемых культур способны активно трансформировать большой ряд амидосоединений, включая алифатические, разветвленные, непредельные и некоторые ароматические амиды. Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид (наиболее простые по структуре и легко метаболизируемые субстраты). Однако некоторые штаммы также активно трансформировали изобутиронитрил и изобутирамид - субстраты с пространственно затрудненным доступом к амидной группе. Известно, что штаммы, выделенные методом накопительной культуры, часто проявляют высокую конвертирующую активность в отношении именно того субстрата, который использовался для селекции. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.

Установлено, что среди культур, обладающих высокой амидазной и нитрилгидратазной активностью, преобладают представители рода Rhodococcus, что согласуется с данными литературы о метаболической активности представителей этого рода [5, 31].

В ходе селекции было получено 5 культур, проявляющих нитрилгидратазную активность более 10 Ед. (4-1- 6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2, 11-1-3, 11-8). По результатам таксономических тестов, а также по данным ПЦР-анализа штаммы 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-1-3, 11-2 отнесены к виду R. erythropolis, штамм 11-8 идентифицирован как R. rhodochrous.

Показано, что все штаммы устойчивы к высоким концентрациям насыщенных алифатических нитрилов - ацетонитрила, пропионитрила и бутиронитрила, а штаммы R. erythropolis 4-1-6 и R. rhodochrous 11-8 также к изобутиронитрилу, который использовался в качестве селективного агента при выделении изолятов. Наиболее сильное ингибирующее действие на исследуемые культуры оказывали акрилонитрил, лактонитрил и бензонитрил. Амиды были менее токсичны, чем соответствующие нитрилы.

Установлено, что в ходе культивирования максимальная нитрилгидролизующая активность исследуемых штаммов проявляется только в первой половине экспоненциальной фазы при относительно низкой плотности бактериальной культуры. После выхода культуры в стационарную фазу наблюдается быстрое снижение каталитической активности.

В нашей работе наилучшими субстратами для нитрилгидратаз большинства штаммов {R. erythropolis 4-1-6, 11-2, R. rhodochrous 11-8 др.) оказались бутиронитрил и изобутиронитрил. Скорость гидролиза амидов клетками некоторых штаммов при высоких значениях температуры превышала скорость гидратации нитрилов. Активность амидазы клеток культур R. erythropolis 4-1-6, 6-2-1, 11-2, значительно превышала нитрилгидратазную в широком интервале температур. Наилучшим субстратом для амидазы был короткоцепочечный ацетонитрил. У штамма 62-1 гидролиз ароматического бензамида проходил с большей скоростью, чем у других культур. Гидратация с большей скоростью проходила при высоких значениях темепературы (50°С).

Исследованы свойства амидаз и нитрилгидратаз выделенных штаммов. Оптимум активности нитрилгидратазы лежит в интервале средних значений температур, в то время как амидаза более активна при 45-50°С. Это согласуется с литературными данными о термостабильности данных ферментов [15, 55, 93]. Показано, что амидазы большинства выделенных из почвы штаммов при культивировании имеют высокую активность на среде, содержащей глюкозу и аммоний, что свидетельствует об отсутствии илли слабой выраженности катаболитной репрессии и азотного контроля, вызываемого этими веществами. Очевидно, что с высокой активностью амидаз связано то, что при трансформации нитрилов клетками не происходит накопления амидов как промежуточных продуктов.

При повышенной температуре (50-55°С), амидазы были более активны, чем нитрилгидратазы.

Некоторые нитрильные и амидные соединения являются промежуточными продуктами метаболизма или распада тканей у растений и ряда других организмов. По-видимому, с этим связано разнообразие и широкое распространение в почве и водной среде микроорганизмов, главным образом прокариотических, активно утилизирующих нитрилы и амиды карбоновых кислот. В то же время, сообщества бактерий очень чувствительны к токсическому действию нитрилов и некоторых амидов антропогенного происхождения (акриламид, бензамид) и их присутствие в среде может сильно изменять состав почвенной и водной микрофлоры [5, 31, 82]. Поэтому представляют интерес культуры бактерий - активные деструкторы нитрилов и амидов, толерантные к их высоким концентрациям. Повышенная активность ферментов у исследуемых штаммов Rhodococcus вероятно и способствует обнаруженной устойчивости этих бактериальных культур к высоким концентрациям нитрилов и амидов.

По результатам ПЦР-анализа с праймерами, специфичными к ферментам разных структурных групп и секвенирования полученных ПЦР-фрагментов, у высокоактивных изолятов выявленые нуклеотидные последовательности энантиоселективных амидаз гомологичны генам ферментов из Rhodococcus sp. N-771 (ABO 16078, GenBank), N-774 (X54074, GenBank), R. erythropolis (AY026386, GenBank) R. rhodochrous (El2517, GenBank). Установлено, что гены амидаз селекционированных штаммов обладают наибольшей гомологией (на 98-99,3%) последовательности Е12517, в то время, как гомология гену фермента Rhodococcus sp. N-771 составляла от 95,98 до 97% .

В селекционированных культурах детектированы фрагменты ДНК, соответствующие консервативной последовательности а-субъединицы, a также полные последовательности генов а- и (3-субъединиц Fe-зависимой нитрилгидратазы (=1300 пн). Установлено, что более 94% почвенных изолятов, обладающих нитрилгидратазной активностью, выделенных методом прямого высева, содержат гены железозависимой нитрилгидратазы.

Ни в одном из высокоактивных по амидазе изолятов не было обнаружено кобальтсодержащего фермента. Это согласуется с литературными данными о редкой встречаемости кобальтсодержащей нитрилгидратазы и редком сочетании её наличия с высокой активностью амидазы [3, 5, 9, 15, 31].

По результатам секвенирования определены полные последовательности изучаемых генов и соответствующие им аминокислотные последовательности.

Показано, что последовательности, полученные в ПЦР-реакции с праймерами AmiReR, на 82-99% гомологичны гену амидазы R. erythropolis, приведенному в базе данных GenBANK под номером М88614, относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз [15].

Нуклеотидные последовательности энантиоселективных амидаз были гомологичны генам ферментов из Rhodococcus sp. N-771 (ABO 16078, GenBank), N-774 (X54074, GenBank), R. erythropolis (AY026386, GenBank) R. rhodochrous (El2517, GenBank). Установлено, что гены амидаз селекционированных штаммов обладают наибольшей гомологией (на 9899,3%>) последовательности El2517, в то время, как гомология гену фермента Rhodococcus sp. N-771 составляла от 95,98 до 97% .

Филогенетический анализ секвенированных последовательностей показал, что большинство амидаз независимо выделенных штаммов из почв, взятых в географически различных точках, более близки между собой, чем к гомологичным последовательностям Е12517 и М88614, депонированным в GenBank и ближе к консенсусной последовательности.

Проведено сравнение полученных аминокислотных последовательностей с гомологичными известными генами амидаз. При сравнении с белковой цепочкой гомологов установлено, что ключевые три аминокислоты активного центра амидаз присутствуют у ферментов рассматриваемых штаммов без изменений. Однако имеющиеся расхождения в аминокислотах других областей также могут отражаться на активности, субстратной специфичности и стабильности фермента за счёт изменения конформации.

По совокупности исследованных свойств можно заключить, что выделенные штаммы с высокой амид- и нитрилконвертирующей активностью представляются перспективными для разработки биокаталитических технологий, а также для детоксикации сточных вод и биоремедиации почв, загрязненных техногенными амидами и нитрилами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Павлова, Юлия Андреевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акрилонитрил. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Женева: Всемирная организация здравоохранения. 1987. Вып. 28 С. 28-114.

2. Аликин В.Н., Кузьмицкий Т.Э., Забелин Л.В. [и др.] Конверсия специальной технической химии. Москва, 1999. С. 176.

3. Астаурова О.Б., Ларикова Г.А., Полякова И.Н., Яненко A.C. Ассимиляция аммония у продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 // Микробиология. 1993. № 11-12. С. 68.

4. Вейко В.П., Яненко A.C., Алексеева М.Г. [и др.] Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена Rhodococcus rhodochrous М8 // Биотехнология. 1995. № 5-6. С. 3-5.

5. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В. [и др.] Биологическое разнообразие нитрилметаболизирующих бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края // Экология. 2007. № 3. С. 1-6.

6. Ившина И.Б., Пшеничнов P.A., Оборин A.A. Пропанокисляющие родококки. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. С. 126.

7. Клонирование ДНК. Методы. Пер. с англ.; под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. С. 538.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая шк., 1990. С. 352.

9. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов C.B., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt 1 // Прикладная биохимия и микробиология, 2003. Т. 39. № 1. С. 63-68.

10. Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В. [и др.] Иммобилизация на углеродных сорбентах клеток штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего нитрилгидратазной активностью // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43. № 2. С. 193-198.

11. Методы общей бактериологии / Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт. М.: Мир, 1983. Т. 1,2,3.

12. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ, 1991. С. 304.

13. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев: Наукова думка. 1985. С. 336.

14. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ.; под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997. Т. 1,2.

15. Перцович С.И., Гуранда Д.Т., Подчерняев Д.А. [и др.] Алифатическая амидаза Rhodococcus rhodochrous - представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз // Биохимия. 2005. Т. 70. № 11. С. 1556-1565.

16. Ремезовская Н.Б. Микрометод определения бактериостатического действия антибиотиков // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии» Томск. 1991. 4.1. С. 46.

17. Amarant Т., Vered Y., Bohak Z. Substrates and inhibitors of the nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrilophilus II J. Biotechnol. Appl. Biochem. 1989. V. 11. P. 49-59.

18. Arnaud A., Galzy P., Jallageas J.-C. Remarques sur l'activite nitrilasique de quelques bacteries // Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. 1976. V. 283. P. 571-573.

19. Asano Y. A new enzyme nitrile hydratase which degrades acetonitrile in combination with amidase // Agric. Biol. Chem. 1980. V. 9. P. 2251-2252.

20. Asano Y., Fujishiro K., Tani Y., Yamada H. Aliphatic nitrile hydratase from Arthrobacter sp. J-l. Purification and characterization // Agric. Biol. Chem. 1982. V. 46. P. 1165-1181.

21. Asano Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis - selection and optimization of biocatalysts // J. Biotechnol. 2002. V. 94. P. 65-72.

22. Banerjee A., Sharma R., Banerjee U.C. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 7. P. 33-44.

23. Bauer R., Hirrlinger B., Layh N., Stolz A., Knackmuss H.-J. Enantioselective hydrolysis of racemic 2-phenylpropionitrile and other (R,S)-2-arylpropionitriles by a new bacterial isolate, Agrobacterium tumefaciens strain d3 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 42. P. 1-7.

24. Bauer R., Knackmuss H.J., Stolz A. Enantioselective hydration of 2-arylpropionitriles by a nitrile hydratase from Agrobacterium tumefaciens strain d3 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P. 89-95.

25. Beard T.M., Page M. Enantioselective biotransformations using Rhodococci //Anton. Leeuw. Int. J. G. 1998. V.74. P.199-206.

26. Bestwick L.A., Gronning L.M., James D.C. et al. Purification and characterization of nitrilase from Brassica nupus II Phisiol. Plant. 1993. V. 89. P. 611-816.

27. Bigey F., Chebrou H., Fournand D. Arnaud A. Transcriptional analysis of the nitrile-degrading operon from Rhodococcus sp. ACV2 and high level production of recombinant amidase with an Escherichia coli - T7 expression system // J. Appl. Microbiol. 1999. V. 86. P. 752-760.

28. Bork P., Koonin E.V. A new family of carbon-nitrogen hydrolases // Prot. Sc. 1994. V. l.P. 1344-1346.

29. Bray H.G., James S.P., Thorpe W.V. The fate of certain organic acids and amides in the rabbit. Further observations on the hydrolysis of amides by tissue extracts // J. Biochem. 1950. V. 3. P. 294-299.

30. Brady B.L. The acylamide amidohydrolase of Candida utilis: purification and properties 11 J. Gen. Microbiol. 1969. V. 6. P. 47-55.

31. Brandao P.F.B., Clapp J.P., Bull A.T. Discrimination and taxonomy of geographically diverse strains of nitrile-metabolizing actinomycetes using chemometric and molecular sequencing techniques // Environ. Microbiol. 2002. V. 4-5. P. 262-276.

32. Brenner C. Catalysis in the nitrilase superfamily // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 775-782.

33. Bunch A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci // Anton. Leeuw. Int. J. G.1998. V. 74, N. 1-3. P. 89-97.

34. Cantarella M., Cantarella L., Gallifuoco et al. Amidase - catalyzed production of nicotinic acid in bate and continuous stirred membrane reactors // Enzyme Microbial. Technol. 2008. V.42. P. 222-229.

35. Cai G., Zhu S., Wang X., Jiang W. Cloning, sequence analysis and expression of the gene encoding a novel wide-spectrum amidase belonging to the amidase signature superfamily from Achromobacter xylosoxidans II FEMS Microbiol. Lett. 2005. V. 249. P. 15-21.

36. Ciskanik L.M., Wilczeck J.M., Fallon R.D. Purification and characterization of an enantioselective amidase from Pseudomonas chlororaphis B23 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 998-1003.

37. Chauhan S., Wu S., Blumerman S. et al. Purification, cloning, sequencing and over-expression in Escherichia coli a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 61. P. 118-122.

38. Chebrou H., Bigey F., Arnaud A. Study of the amidase signature group // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 8. P. 285-293.

39. Cheong T.K., Oriel P.J. Cloning of a wide-spectrum amidase from Bacillus stearothermophilus BR388 in Escherichia coli and marked enhancement of amidase expression using directed evolution // Enzyme Microbial. Technol. 2000. V. 26. P. 152-158.

40. Clarke P., Tata R. Isolation of amidase-negative mutants of Pseudomonas aeruginosa by a positive selection method using an acetamide analogue // J. Gen. Microbiol. 1973. V. 73. P.231-234.

41. Clarke P.H. The aliphatic amidases of Pseudomonas aeruginosa II Adv. Microb. Physiol. 1970. V. 4. P. 179-222.

42. Collins P.A., Knowles C.J. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochrous II J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 711-718.

43. Cowan D., Cramp R., Pereira R. et al. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles.

1998. V. 2, N. 3.P. 207-216.

44. Cravatt B.F., Giang D.K., Mayfield S.P., Boger D.L., Lerner R.A., Gilula N.B. Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides // Nature. 1996. V. 384. P.83-87.

45. Crosby J., Moilliet J., Parratt J.S., Turner N.J. Regioselective hydrolysis of aromatic dinitriles using a whole cell catalyst // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1994. V. l.P. 1679-1687.

46. DiGeronimo M.J., Antoine A.D. Metabolism of acetonitrile and propionitrile by Nocardia rhodochrous LL100-21 // Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 31. P. 900-906.

47. Dhillon J., Châtre S., Shanker R. et al. Transformation of aliphatic and aromatic nitriles by a nitrilase from Pseudomonas sp. // Can. J. Microbiol.

1999. V. 45. P. 811-815.

48. Dhillon J., Shivaraman N. Biodegradation of cyanide compounds by a Pseudomonas species (SI) // Can. J. Microbiol. 1999. V. 45. P. 201-208.

49. Duran R., Nishiyama M., Horinouchi S., Beppu T. Characterisation of nitrile hydratase genes cloned by DNA screening from Rhodococcus erythropolis II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. V. 57. P. 1323-1328.

50. Endo I., Watanabe I. Nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-774-purification and amino acid sequences // FEBS Lett. 1989. V. 243. P. 64616497.

51. Endo I., Odaka M., Yohda M. An enzyme controlled by light: the molecular mechanism of photoreactivity in nitrile hydratase // Trends Biotechnol. 1999. V. 17. N. 6. P. 244-248.

52. Firmin J.L., Gray D.O. The biochemical pathway for breakdown of methyl cyanide (acetonitrile) in bacteria // J. Biochem. 1976. V. 158. P. 223-229.

53. Fournand D., Arnaud A., Galzy P. Study of the acyl transfer activity of a recombinant amidase overproduced in an E. coli strain. Application for

short-chain hydroxamic acid and acid hydrazide synthesis // J. Mol. Cat. 1998. V. 4. P. 77-90.

54. Fournand D., Bigey F., Arnaud A. Acyl Transfer Activity of an Amidase from Rhodococcus sp. Strain R312: Formation of a Wide Range of Hydroxamic Acids // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P.2844-2852.

55. Fournand D., Arnaud A. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity // J.Appl.Microbiol. 2001. V. 91. P.381-393.

56. Gilligan T., Yamada H., Nagasawa T. Production of S,( + )-2-phenylpropionic acid from (R,S)-2-phenylpropionitrile by the combination of nitrile hydratase and stereoselective amidase in Rhodococcus equi TG328 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 720-725.

57. Gorr G., Wagner J. Uber das Amidspaltungsvermogen der Torula utilis, eine Untersuchung über die Abhängigkeit pflanzlicher Enzymausbildung von der Stickstoffernahrung // Biochem. 1933. V. 166. P. 96-101.

58. Gradley M.L., Deversom C.J.F., Knowles CJ. Asymmetrie hydrolysis of R-(2) S-(l)-2-methylbutyronitrile by Rhodococcus rhodochrous NCIMB-11216 // Arch. Microbiol. 1994. V. 161. P. 246-251.

59. Gradley M.L., Knowles C J. Asymmetrie hydrolysis of chiral nitriles by Rhodococcus rhodochrous NCIMB-11216 nitrilase // Biotechnol. Lett. 1994. V. 16. P. 41-46.

60. Grossowicz N., Wainfan E., Borek E., Waeisch H. The enzymatic formation of hydroxamic acids from glutamine and asparagines // J. Biol. Chem. 1950. V. 187. P. 111-125.

61. Harper D.B. Characterization of a nitrilase from Nocardia sp. (Rhodochrous group) N.C.I.B. 11215, using p-hydroxybenzonitrile as sole carbon source // Int. J. Biochem. 1985. V. 17. P. 677-683.

62. Hashimoto Y., Nishiyama M., Ikehata O., Horinouchi S., Beppu T. Cloning and characterization of an amidase gene from Rhodococcus sp. N-774 and its

expression in Escherichia coli / Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1088. P. 225-233.

63. Hashimoto Y., Nishiyama M., Yu F. et al. Development of a host-vector system in a Rhodococcus strain and its use for expression of the cloned nitrile hydratase gene cluster // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 10031010.

64. Hirrlinger B., Stolz A., Knackmuss H.-J. Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyses 2-aryl-propionamides // J. Bacteriol. 1996. V.178. P. 3501-3507.

65. Hirrlinger B., Stolz A. Formation of a chiral hydroxamic acid with an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 and subsequent chemical Lossen rearrangement to a chiral amine // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3390-3393.

66. Hughes J., Armitage Y.C., Symes K.C. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrylic polymer manufacture // Anton. Leeuw. Int. J. G. 1998. V. 74. N. 1-3. P. 107-108.

67. Hynes M.J., Pateman J.A. The genetic analysis of regulation of amidase synthesis in Aspergillus nidulans. Mutants resistant to fluoroacetamide // Molec. Gen. Genet. 1970. V. 108. P. 107-116.

68. Ikehata O., Nishiyama M., Horinouchi S., Berru T. Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence Rhodococcus species and its expression in Esherichia coli II Biochem. 1989. V. 181. P. 563-570.

69. Joo P., Uhm K., Kim H. Biotransformation of amides to acid using a Co-cross-linked enzyme aggregate of Rhodococcus erythropolis amidase // J. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 20(2). P. 325-331.

70. Joshi J.G., Handler P. Purification and properties of nicotinamidase from Torula cremoris II J. Biol. Chem. 1962. V. 237. P. 929-935.

71. Kakeya H., Sakai N., Sugai T., Ohta H. Microbial hydrolysis as a potent method for the preparation of optically active nitriles, amides, and carboxylic acids // Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. P. 1343-1346.

72. Kammermeier-Steinke D., Schwarz A., Wandrey C., Kula M.-R. Studies on the substrate specificity of a peptide amidase partially purified from orange flavedo // Enzyme Microb. Technol. 1993. V. 15. P. 764-769.

73. Kieny-L'Homme M. P., Arnaud A., Galzy P. Etude d'une L-alpha-aminoamidase particulate de Brevibacterium sp. en vue de l'obtention d'acides alpha-amines optiquement actifs //J. Gen. Appl. Microbiol. 1981. V. 27. P. 307-325.

74. Kim S., Oriel P. Cloning and expression of the nitrile hydratase and amidase genes from Bacillus sp. BR449 into Escherichia coli II Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 27, N. 7. P. 492-501.

75. Kimura T. Studies on metabolism of amides in Mycobacteriaceae: formation and hydrolysis of hydroxamate // J. of Biochem. 1959. V. 46. P. 1399-1410.

76. Knowles C.J., Linton E.A. The utilisation nitriles and amides by Nocardia rhodochrous LL 100-121 //J. Gen. Microbil. 1983. V. 129. P. 711-718.

77. Knowles C.J., Linton E.A. Utilisation of aliphatic amides and nitriles by Nocardia rhodochrous LL 100-21 // J. Gen. Microbil. 1986. V. 132. P. 1493-1501.

78. Kobayashi M., Nagasawa T., Yamada H. Nitrilase of Rhodococcus rodochrous Jl. Purification and characterization // Eur. J. Biochim. 1989. V. 182. P. 349-356.

79. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. Monohydrolysis of an aliphatic dinitrile compound by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous K22 // Tetrahedron. 1990. V. 46. P. 5587-5590.

80. Kobayashi M., Nishiyama M., Nagasawa T. et al. Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobaltcontaining nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous Jl // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1129. P. 23-33.

81. Kobayashi M., Komeda H., Yanaka N. et al. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl. Sequencing and overexpression of the gene and

identification of an essential cysteine residue // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. N. 29. P. 20746-20751.

82. Kobayashi M., Nagasawa T., Yamada H. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over... // Trends Biotechnol. 1992. V. 10. P. 402-408.

83. Kobayashi M., Komeda H., Nagasawa T., Nishiyama M., Horinouchi S., Beppu T., Yamada H., Shimizu S. Amidase coupled with low molecular -mass nitrile hydratase from R. rhodochrous J1 // Europ. J. Biochem. 1993. V. 217. P. 327-336.

84. Kobayashi M., Shimizu S. Versatile nitrilases: nitrile hydrolyzing enzymes // FEMS Microbiol. Lett. 1994. P. 120.

85. Kobayashi M., Komeda H., Shimizu S. et al. Characterization and distribution of IS 1164 that exists in the high molecular mass nitrile hydratase gene cluster of the industrial microbe Rhodococcus rhodochrous J1 // Proc. Jpn. Acad. 1997. V. 73. P. 104-108.

86. Kobayashi M., Fujiwara Y., Goda M., Komeda H., Shimizu S. Identification of active sites in amidase: Evolutionary relationship between amide bond-and peptide bond-cleaving enzymes // Evolution. 1997. V. 94. P. 1198611991.

87. Kobayashi M., Goda M., Shimizu S. The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis // FEBS Lett. 1998. V. 439. N. 3. P. 325-328.

88. Kobayashi M., Shimizu S. Metalloenzyme nitrile hydratase: structure, regulation, and application to biotechnology // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 733-736.

89. Kobayashi M., Shimizu S. Nitrile hydralases // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 95102.

90. Komeda H., Kobayashi M., Shimizu S. A novel gene cluster including the Rhodococcus rhodochrous J1 nhlBA genes encoding a low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 15796-15802.

91. KomedaH., Kobayashi M., Shimizu S. Characterisation of the gene cluster of high-molecular-masse nitrile hydratase induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous J1 // Appl. Biol. Sci. 1996. V. 93. P. 4267-4272.

92. Komeda H., Kobayashi M., Shimizu S. A novel gene cluster including the Rhodococcus rhodochrous J1 nhlBA genes encoding a low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 15796-15802.

93. Kotlova E.K., Chestukhina G.G., Astaurova O.B., Leonova T.E., Yanenko A.S., Debabov V.G. Isolation and primary characterization of an amidase from Rhodococcus rhodochrous II Biochemistry. 1999. V. 64. N. 4. P. 384389.

94. Kimura T. Studies on metabolism of amides in Mycobacteriaceae: formation and hydrolysis of hydroxamate // J. of Biochem. 1959. V. 46. P. 1399-1410.

95. LayhN., Hirringer B., Stolz A., Knackmuss H.-J. Enrichment strategies for nitrile-hydrolysing bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P. 668-674.

96. Levy-Schil S., Soubrier F., Crutz-Le Coq A.M. et al. Aliphatic nitrilase from a soil-isolated Comamonas testosteroni sp.: gene cloning and overexpression, purification and primary structure // II Gene. 1995. V. 161. N. 1. P. 15-20.

97. Liu J., Liu C., Lin C. The role of nitrogenase in a cyanide degrading Klebsiella oxytoca strain // Proc. Natl. Sci. Count. Repub. China. 1997. V. 21. P. 37-42.

98. Maestracci M., Thiery A., Bui K., Arnaud A., Galzy P. Activity and regulation of an amidase, acylamide amidohydrolase EC 3.5.1.4, with a wide substrate spectrum from a Brevibacterium sp. // Arch. Microbiol. 1984. V. 138. P. 315-320.

99. Maestracci M., Thiery A., Arnaud A., Galzy P. A study of the mechanism of the reactions catalyzed by the amidase from Brevibacterium sp. R312 // Agricultural Biol. Chem. 1986. V. 50. P. 2237-2241.

100. Maestracci M., Bui K., Thiery A. The amidases from a Brevibacterium strain: study and applications // Agric. Biol. Chem. 1989. V. 9. P. 69-111.

101. Maier-Greiner U.H., Obermaier-Strobranek L.M., Estermaier L.M. et al. Isolation and properties of nitrile hydratases from the soil fungus Myrothecium verrucaria that is highly specific for the fertilizer cyanamide and cloning of its gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 42604264.

102. Mascharak P.K. Structural and functional models of nitrile hydratases // Coord. Chem. Rev. 2002. V. 225. P. 201-214.

103. Masutomo S., Inoue A., Kumagai K., Murai R., Mitsuda S. Enantioselective hydrolysis of (RS)-2-isopropyl-4'-chlorophenylacetonitrile by Pseudomonas sp. B21C9 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 720-722.

104. Mathew CD., Nagasawa T., Kobayashi M., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous Jl //Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1030-1032.

105. Mayaux J.F., Cerbelaud E., Sourbrier F., Faucher D., Petre D. Purification, cloning, and primary structure of an enantiomer-selective amidase from Brevibacterium sp. strain R312: structural evidence for genetic coupling with nitrile hydratase // J. Bacteriol. 1990. V. 173. P. 6694-6704.

106. Mayaux J.F., Cerbelaud E., Sourbrier F., Yeh P., Blanche F., Petre D. Purification, cloning, and primary structure of a new enantiomer-selective amidase from a Rhodococcus strain: structural evidence for a conserved genetic coupling with nitrile hydratase. J. Bacteriology. 1991. V. 173. P. 6694-6704.

107. McBride K.E., Kenny J.W., Stalker D.M. Metabolism of the herbicide bromoxynil by Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 52. P. 325-330.

108. MylerovaY., Martinkova L. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes // Curr. Organic Chem. 2003. V. 7. P. 1-17.

109. Nagamune T., Kurata H., Hirata M., Endo I. Photosensitive phenomena of nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-771 11 Photochem. Photobiol. 1990 V. 51. P. 87-90.

110. NagasawaT., Ryuno K., Yamada H. Nitrile hydratase of Brevibacterium R312 - purification and characterization // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 139. P. 1305-1312.

111. NagasawaT., Nanba H., Ryuno K. et al. Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23 //Eur. J. Biochem. 1987. V. 162. P. 691-698.

112. Nagasawa T., Takeuchi K., Yamada H. Occurrence of a cobalt-induced and cobalt containing nitrile hydratase in Rhodococcus rhodochrous J1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 155. P. 1008-1016.

113. Nagasawa T., Mathew CD., Mauger H., Yamada H.Nitrile hydratasecatalyzed production of nicotinamide from 3'-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 / Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1766-1769.

114. Nagasawa T., Kobayashi M., Yamada H. Optimum culture conditions for the production of benzonitrilase y Rhodococcus rhodochrous J1 // Arch. Microbiol. 1988. V. 105. P. 89-94.

115. Nagasawa T., Nacamura T., Yamada H. e-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Arch. Microbiol. 1990. V. 155. P. 13-17.

116. Nagasawa T., Shimizu S., Yamada H. The superiority of the third generation catalyst Rhodococcus rhodochrous J1 nitrile hydratase for industrial production of acrylamide // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 40. P. 189-195.

117. Nagasawa T., Yamada H. Microbial production of commodity chemicals // Pur. Appl. Chem. 1995. V. 67. P. 1241-1256.

118. Nagasawa T., Wieser M., Nacamura T. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous J1 //Eur. J. Biochem. 1998. V. 267. P. 138-144.

119. Nagashima S., Nakasako M., Kamiya N., et al. X-ray crystallographic analysis of photoreactive nitrile hydratase // J. Inorgan. Biochem. 1997. V. 67. N. 1-4. P. 334.

120. NakajimaY., Doi T., Satoh Y., Watanabe I. A photoresponsive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N771 // Chem. Lett. 1987. V. 9. P. 17671779.

121. Narayanasamy K., Shukla S., Parekh L.J. Utilization of acrylonitrile by bacteria isolated from petrochemical wastewaters // Indian J. Exp. Biol. 2000. V. 28. P. 968-971.

122. Novo C., Tata R., Clemente A., Brown PR. Pseudomonas aeruginosa aliphatic amidase is related to the nitrilase/cyanide hydratase enzyme family and Cysl66 is predicted to be the active site nucleophile of the catalytic mechanism // Biochem. J. 1995. V. 367.P. 275-279.

123. Farnaud S., Tata R., Sohi M.K., Wan T., Brown P.R., Sutton B.J. Evidence that cysteine-166 is the active-site nucleophile of Pseudomonas aeruginosa amidase: crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the enzyme //Biochem. J. 1999. V. 340. P.711-714.

124. Novo C., Farnaud S., Tata R., Clemente A., Brown P.R. Support for a three-dimensional structure predicting a Cys-Glu-Lys catalytic triad for Pseudomonas aeruginosa amidase comes from site-directed mutagenesis and mutations altering substrate specificity // Biochem. J. 2002. V. 365. P. 731-738.

125. Odaka M., Yohda M., Endo I. An enzyme controlled by light: the molecular mechanism of photoreactivity in nitrile hydratase // Trends Biotechnol. 1999. V. 17. N. 6. P. 244-248.

126. Ohtaki A., Murata K., Sato Y. Structure and characterization of amidase from Rhodococcus sp. N-771: insight into the molecular mechanism of substrate recognition // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V. 7. P. 184-192.

127. OsprianL, Jarret С., Strauss U. Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R312 (CBS 717.73) // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1999. V. 6. N. 6. P. 555-560.

128. O'Reilly C., Turner P.D. The nitrilase family of CN hydrolysing enzymes a comparative study // J. Appl. Microbiol. 2003. V. 95. P. 1161-1174.

129. Patricelli M., Cravatt B. Clarifying the catalytic roles of conserved residues in the amidase signature family // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N. 25. P. 177-184.

130. Payne M.S., Wu S.J., Fallon R.D. et al. A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 5447-5454.

131. Pereira R.A., Graham D., Rainey F.A., Cowan D.A. A novel thermostable nitrile hydratase // Extremophiles. 1998. V. 2. N. 3. P. 347-357.

132. Pogorelova Т.Е., Ryabchenko L.E., Sunzov N.I., Yanenko A.S. Cobalt-dependent transcription of the nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8 11FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 144. P. 191-195.

133. Pollmann S., Muller A., Piotrowski M. et al. Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana // Planta. 2002. V. 216. P. 155161.

134. Preparation process of optically active alpha-aminated acids by biological hydrolysis of nitriles: patent 4366250 U.S. № US/06/209402; заявл. 27.11.1991; опубл. 01.02.1994.

135. Process for producing optically active .alpha.-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefore: patent 5283193 U.S. № US/07/799879; заявл. 24.09.1980; опубл. 28.12.1982.

136. Rasor J., Voss E. Enzyme - catalyzed processes in pharmaceutical industry //Appl. Catalysis. 2001. V. 221. P. 145-158.

137. RimmingtonA. Russian biotechnologists target chemical industry // Microbiol. Europe. 1994. V. 2. P. 18.

138. Robinson W.G., Hook R.H. Ricine nitrilase // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 4257-4267.

139. Shell D., Colby J. Enantioselective hydrolysis of racemic ibuprofen amide to S-(+)-ibuprofen by Rhodococcus AJ 270 // Enzyme Microbial. Technol. 1999. V. 24. P. 160-163.

140. Scotto d'Abusco A., Ammendola S., Scandurra R., Politi L. Molecular and biochemical characterization of the recombinant amidase from hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus II Extremophiles. 2001. V. 5 P. 183-192.

141. Skouloubris S., Labigne A., Reuse H. Identification and characterization of an aliphatic amidase in Helicobacter pylori II Mol. Microbiol. 1997. V. 25. P. 989-998.

142. Sibbesen O., Koch B., Rouze P. et al. Biosynthesis of cyanogenic glucosides. Elucidation of the pathway and characterization of the cytochrome P-450 involved in amino acids and their derivatives in higher plants // Wallsgrove R.M. (ed.). Cambridge: University Press. 1995. P. 227241.

143. Song L., Wang M., Yang X., Qian S. Purification and characterization of the enantioselective nitrile hydratase from Rhodococcus sp. AJ270 // Biotechnol. 2007. V. 2 P. 717-724.

144. Soubrier F., Levy-Schil S., Mayaux J.F., Petre D., Arnaud A., Crouzet J. Cloning and primary structure of the wide-spectrum amidase from Brevibacterium sp. strain R312: high homology to the amiE product from Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1992. V. 116. P.99-104.

145. Stelkes-Ritter U., Beckers G., Bommarius A. Kinetics of peptide amidase and its application for the resolution of racemates // Biocat. Biotransform. 1997. V. 15. P. 205-219.

146. Syed M., Ahmad S., Kusnin N. Shukor M. Purification and characterization of amidase from acrylamide-degrading bacterium Burkholderia sp. strain DR.Y27 // Afr. J. Biotechnol. 2011. V. 11(2). P. 329-336.

147. Takashima Y., Yamaga Y., Mitsuda S. Nitrile hydratase from a thermophilic Bacillus smithii II J. Industr. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 20. P. 220-226.

148. Tani Y., Kurihara M., Nishise H. Characterisation of nitrile hydratase and amidase, which responsible for conversion of dinitriles to mononitriles, from Corinebacterium sp. // Agric. Biol. Chem. 1989. V. 53. P. 3151-3158.

149. Tauber M.M., Cavaco-Paulo A., Robra K.-H., Gubitz G.M. Nitril hydratase and amidase from Rhodococcus rhodochrous hydrolyse acrylic fibers and granular polyacrylonitriles // J. Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 4. P. 1634-1638.

150. The Pesticidal Manual. CR. Worthing //6th ed. London: BCP, 1979. P. 329332.

151. Thiery A., Maestracci M., Arnaud A., Galzy P. Acyltransferase activity of the wide spectrum amidase of Brevibacterium sp. R312 // J. Gen. Microb. 1986. V. 132. P. 2205-2208.

152. Thimann K.V., Mahadevan S. Nitrilase I. Occurrence preparation and general properties of the enzyme // Arch. Biochem. Biophys. 1964. V. 105. P. 133-141.

153. TsujimuraM., Dohmae N., Odaka M. et al. Structure of the photoreactive iron center of the nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771: evidence of a novel post-translational modification in the cysteine ligand // J. Biol. Chem. 1997a. V. 272. P. 29454-29459.

154. Tsujimura M., Dohmae N., Chijimatsu M. et al. Photoreactive nitrile hydratase: posttranslational modification of photoreactive site // J. Inorgan. Biochem. 1997b. V. 67. N. 1-4. P. 335.

155. Vejvoda V., Kaplan O., Kubac D., Kren V., Martinkova L. Immobilization of fungal nitrilase and bacterial amidase - two enzymes working in accord // Biocat. Biotransform. 2006. V. 24 (6). P. 414-418.

156. Wang M.X. Enantioselective biotransformations of nitriles in organic synthesis // Chem. Mater. Sci. 2005. V. 35. N. 1-2. P.l 17-130.

157. Warhurst A.M., Fewson C.A. Biotransformations catalysed by the genus Rhodococcus 11 Crit. Rev. Biotech. 1994. V. 14. P. 29-73.

158. Watanabe I., Satoh Y., Enomoto K. et al. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells // Agric. Biol.Chem. 1987. V. 51. P. 3201-3206.

159. Wu S., Fallon R.D., Payne M.S. Over-production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 704-708.

160. Wyborn N.R., Mills J., Williams S.G., Jones C.W. Molecular characterization of formamidase from Methylophilus methylotropus. // Europ. J. Biochem. 1996. V. 240. P.314-322.

161. Ueda N., Kurahashi Y., Yamamoto S., Tokunaga T. Partial purification and characterization of the porcine brain enzyme hydrolyzing and synthesizing anandamide // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N. 23. P. 823-827.

162. Yamada H., Kobayashi M. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. V. 60. P. 13911400.

163. Yamada H., Asano Y., Hino T., Tani Y. Microbial utilization of acrylonitrile // J. Ferment. Technol. 1979. V. 57. P. 8-14.

164. Yamamoto K., Ueno Y., Otsubo K. Production of S-(+)-ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. strain AK 226 // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. N. 10. P. 3125-3129.

165. Yanenko A.S., Astaurova O.B., Gerasimova T.V. et al. Regulation of nitrile utilization in Rhodococcus II Biotechnologia. 1995. V. 7-8. P. 139-144.

166. Zheng R., Zheng Y., Shen Y. A screening system for active and enantioselective amidase based on its acyl transfer activity // Appl. Microbiol. Biotech. 2007. V. 7. P. 256-262.