Изучение возможностей применения технологии полупроводникового секвенирования в лабораторной диагностике синдрома Альпорта тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат наук Шагам, Лев Иосифович
Шагам, Лев Иосифович
кандидат наук
2017
- Специальность ВАК РФ14.03.10
- Количество страниц 177
Оглавление диссертации кандидат наук Шагам, Лев Иосифович
ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................10
1.1.Применение технологии высокопроизводительного секвенирования в диагностике наследственных заболеваний.........................................................................................10
1.2. Синдром Альпорта: общая информация и патогенез.................................................................11
1.2.1. Общая информация...........................................................................................................11
1.2.2. Базальная мембрана клубочков и ее строение...............................................................12
1.2.3. Структурные дефекты БМК и связанные с ними нарушения работы почек..............13
1.2.4. Сопутствующие нарушения слуха..................................................................................15
1.2.5. Сопутствующие нарушения зрения................................................................................15
1.2.6. «Догенетические» диагностические критерии СА........................................................16
1.3. Генетические основы СА...............................................................................................................16
1.3.1. Общая информация...........................................................................................................16
1.3.2. Х-сцепленная форма наследования.................................................................................17
1.3.3. Аутосомно-рецессивная форма наследования...............................................................17
1.3.4. Дигенная форма наследования........................................................................................18
1.3.5. Аутосомно-доминантная форма наследования..............................................................18
1.3.6. Гены и их мутации............................................................................................................19
1.3.7. Частые мутации.................................................................................................................20
1.3.8. Диагностические критерии с учетом генетического исследования.............................25
1.4. Корреляции генотипа и фенотипа при синдроме Альпорта......................................................25
1.4.1. Возраст тХПН....................................................................................................................25
1.4.2. Нарушения слуха..............................................................................................................28
1.4.3. Нарушения зрения............................................................................................................29
1.4.4. Другие клинико-лабораторные показатели....................................................................29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................................31
2.1. Разработка генной панели.............................................................................................................31
2.2. Сбор образцов и выделение генетического материала...............................................................32
2.3. Высокопроивзодительное секвенирование: работы в лаборатории..........................................32
2.3.1. Подготовка библиотек......................................................................................................32
2.3.2. Клональная амплификация..............................................................................................34
2.3.3. Секвенирование.................................................................................................................34
2.4. Анализ данных высокопроизводительного секвенирования.....................................................34
2.4.1. Первичный анализ данных...............................................................................................34
2.4.2. Контроль качества результатов секвенирования...........................................................35
2.4.3. Аннотация генетических вариантов................................................................................36
2.4.4. Выявление артефактов секвенирования.........................................................................37
2.5. Верификация генетических вариантов........................................................................................37
2.6. Негенетические лабораторные исследования............................................................................38
2.6.1. Показатели биохимического анализа крови...................................................................38
2.6.2. Показатели анализа кислотно-щелочного состояния крови.........................................39
2.6.3. Показатели общего анализа мочи....................................................................................39
2.7. Статистическая обработка материала.........................................................................................40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................41
3.1. Показатели качества секвенирования с использованием разработанной генной панели.......41
3.2. Характеристики разработанной генной панели..........................................................................45
3.2.1. Общие характеристики разработанной генной панели.................................................45
3.2.2. Полнота покрытия ампликонов по результатам проведенных исследований............46
3.3. Результаты анализа контрольной выборки образцов без патологии почек. Создание перечня непатогенных вариантов генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5..........................................................47
3.4. Результаты анализа пациентов с подтвержденным или предполагаемым диагнозом «синдром Альпорта» .............................................................................................................................50
3.4.1. Общая информация о выявленных генетических вариантах.................................51
3.4.2. Частые мутации, вызывающие синдром Альпорта в российской популяции......56
3.4.3. Патогенные и вероятно патогенные варианты нуклеотидной последовательности, описываемые нами впервые....................................................................................................... 62
3.4.4. Патогенные и вероятно патогенные варианты, найденные в выборке российских пациентов и ранее описанные в литературных источниках ................................................... 81
3.4.5. Генетические варианты, выявленные у пациентов с наследстенным нефритом и классифицируемые как вероятно непатогенные в настоящей работе...................................84
3.4.6. Пациенты с мутациями генов СОЬ4Л3 и СОЬ4Л4 в гетерозиготном состоянии: клиническая картина................................................................................................................... 86
3.4.7. Пациенты с двумя или более мутацями: клиническая картина.............................87
3.4.8. Опыт интерпретации патогенности согласно рекомендациям Американской коллегии медицинских генетиков. Предложение по дополнению рекомендаций ............... 90
3.5. Оценка диагностических характеристик разработанного теста .................................................................................................................................................................96
3.5.1. Теоретическая оценка диагностической чувствительности и специфичности теста ...................................................................................................................................... 96
3.5.2. Оценка диагностической специфичности разработанного генетического теста . 99
3.5.3. Оценка диагностической чувствительности разработанного генетического теста . ......................................................................................................................................99
3.6. Анализ корреляций генотипа пациентов с фенотипом ...............................................................................................................................................................102
3.6.1. Зависимость возраста выявления гематурии от вида мутации у пациента........102
3.6.2. Зависимость возраста выявления макрогематурии у пациента от вида мутации .... ....................................................................................................................................106
3.6.3. Зависимость среднего возраста тХПН в семье от вида мутации.........................107
3.6.4. Наличие и возраст выявления тугоухости в зависимости от вида мутации.......108
3.6.5. Наличие и возраст выявления гипертензии в зависимости от вида мутации.....108
3.6.6. Зависимость ответа на лечение эналаприлом от вида мутации...........................110
3.6.7. Концентрация креатинина в крови детей и ее связь с видом мутации.....................
....................................................................................................................................111
3.6.8. Количество белка в моче у детей и его связь с видом мутации...........................115
3.6.9. Количество эритроцитов в моче и его связь с видом мутации............................117
3.6.10. Концентрация альбумина в крови и ее связь с видом мутации........................120
3.6.11. Концентрация калия в крови и ее связь с видом мутации................................123
3.6.12. Водородный показатель крови: зависимость от вида мутации........................125
3.6.13. Особенности показателей биохимического анализа крови, анализа кислотно-щелочного состава крови и общего анализа мочи у пациентов с частой мутацией Со14а5 0624Б .................................................................................................................................127
3.6.14. Обсуждение полученных результатов................................................................127
3.7.Предлагаемый алгоритм клинико-лабораторной диагностики синдрома Альпорта
...............................................................................................................................................................129
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................................133
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................................................136
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ...........................................137
СПИСОК ТЕРМИНОВ......................................................................................................................139
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................142
ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................157
Приложение А. Последовательности праймеров разработанной генной панели.........................157
Приложение Б. Целевые фрагменты генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5 и их покрытие...........164
Приложение В. Результаты верификации генетических вариантов методом секвенирования по
Сэнгеру.................................................................................................................................................168
Приложение Г. Теоретический расчет чувствительности генетического теста.......................... 169
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», 14.03.10 шифр ВАК
Клинико-прогностическое значение матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов у детей с аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек и синдромом альпорта2023 год, кандидат наук Баширова Зиля Рамилевна
Генетическая гетерогенность несиндромальной и имитирующей ее синдромальной тугоухости2019 год, кандидат наук Миронович Ольга Леонидовна
Молекулярно-генетическое и фенотипическое разнообразие наследственных спастических параплегий2022 год, кандидат наук Кадникова Варвара Андреевна
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика врожденного и инфантильного нефротического синдрома2022 год, кандидат наук Милованова Анастасия Михайловна
Особенности клинического течения и прогностические факторы поражения почек при болезни Фабри2020 год, кандидат наук Тао Екатерина Александровна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение возможностей применения технологии полупроводникового секвенирования в лабораторной диагностике синдрома Альпорта»
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы
Наследственный нефрит (синдром Альпорта, СА) - наследственная гематурия, выявляемая в нашей стране у 1 человека на 6 тысяч жителей [1]. Развивается вследствие нарушения структуры базальной мембраны клубочков (БМК), связанного с дефектом сборки или отсутствием протомеров альфа-цепей коллагена IV типа. Данное нарушение приводит к изменению проницаемости гломерулярного фильтра, вследствие чего развивается гематурия, протеинурия и другие симптомы, характерные для наследственного нефрита [2,3].
Диагноз «синдром Альпорта» высоковероятен при наличии стойкой гломерулярной гематурии в сочетании с характерными нарушениями слуха, зрения или семейным анамнезом. Подтверждение диагноза может быть проведено при помощи электронной микроскопии нефробиоптата, однако данный метод является инвазивным и имеет ограниченную чувствительность, особенно в детском возрасте. В связи с развитием в последние годы и активным внедрением в диагностическую практику методов высокопроизводительного секвенирования, стал доступен другой способ подтверждения СА - генетический, являющийся малоинвазивным и обеспечивающий возможность верификации диагноза в любом возрасте [4].
Молекулярно-генетические основы заболевания изучены весьма хорошо (так, СА стал в 1990 году первым заболеванием почек, для которого выяснена генетическая природа [5]). На данный момент выявлены три гена, отвечающие за развитие заболевания. Тем не менее, до проведения настоящей работы в нашей стране не было разработано специализированного генетического теста для выявления СА методом секвенирования панели генов. Все генетические анализы пациентов с подозрением на СА в лучшем случае выполняются с помощью экзомного секвенирования, не всегда хорошо покрывающего целевые участки, чувствительность и специфичность которого достоверно не известна. Кроме того, не описана распространенность патогенных генетических вариантов различных типов, не изучено наличие частых мутаций, вызывающих СА.
Для наиболее распространенной, Х-сцепленной формы СА в зарубежных популяциях показан ряд корреляций вида мутации с ее наиболее важными фенотипическими проявлениями, а именно: возрастом терминальной стадии хронической почечной недостаточности (тХПН), тугоухостью, а также наличием характерных нарушений зрения [6-9]. В то же время, у детей данные нарушения (в первую очередь, тХПН и нарушения зрения) проявляются редко, при этом возникает вопрос, коррелирует ли тип мутации с другими клинико-лабораторными признаками и показателями, маркерами тяжести нефрита, которые возможно оценить у детей.
Что касается остальных маркеров тяжести и характерных признаков СА, зависимости их проявления от вида мутации описаны плохо. Это относится к возрасту выявления гематурии у пациента, значениям протеинурии, концентрации креатинина, альбумина и калия в крови, водородному показателю крови, количеству эритроцитов, концентрации белка в моче и артериальной гипертензии.
Таким образом, анализ литературы показывает актуальность углубленного изучения возможностей генетического анализа в применении к диагностике синдрома Альпорта и генетической природы различных его клинических проявлений.
Цель исследования
Установить диагностическую значимость технологии высокопроизводительного секвенирования в алгоритме клинического лабораторного исследования наследственного нефрита.
Задачи исследования
1. Разработать на основе принципа мультиплексной ПЦР набор для высокопроизводительного секвенирования кодирующих экзонов генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5.
2. С использованием разработанного набора выявить полиморфизмы и патогенные мутации генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5 в российской популяции у детей с персистирующей гематурией и в их семьях.
3. Сопоставить полученные данные об особенностях генетических нарушений при синдроме Альпорта с другими клинико-лабораторными показателями.
4. Провести комплексную оценку диагностической эффективности метода полупроводникового секвенирования кодирующих экзонов 3, 4 и 5 альфа-субъединиц коллагена IV.
Научная новизна
Разработана первая в Российской Федерации и одна из первых в мире генная панель для выявления СА. Определена ее диагностическая чувствительность и специфичность. Впервые описано распределение по типам мутаций при синдроме Альпорта в российской популяции и показано, что оно значимо не отличается от такового в лучше изученных зарубежных популяциях [10].
При этом в российской популяции детей с наследственным нефритом впервые описана частая мутация СОЬ4Л5 c.1871G>A, p.(Gly624Asp), обнаруживаемая в нашей выборке у 16%
неродственных пациентов генетически подтвержденным диагнозом X-сцепленного наследственного нефрита. Показано, что для данной мутации характерно позднее выявление гематурии и относительно легкое течение заболевания. Разработан алгоритм прогнозирования наличия данной мутации на основании данных общего анализа мочи и биохимического анализа крови пациента. Также, в российской популяции выявлено еще две мутации, частые по данным литературы в других популяциях.
Впервые описано 26 ранее не известных патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5.
Впервые установлены статистически значимые корреляции типа мутации с возрастом выявления гематурии, гипертензии, а также с концентрацией альбумина и креатинина в крови для пациентов с X-сцепленной формой СА.
Практическая значимость
Разработанный и внедренный в практику метод позволит с чувствительностью 83% и близкой к 100% специфичностью диагностировать наследственный нефрит, а также позволит диагностировать болезнь тонких базальных мембран (БТБМ).
У детей с легким течением Х-сцепленного синдрома Альпорта предложено вначале проводить молекулярно-генетическое обследование для исключения частой мутации (Col4a5 G624D), выявленной в российской популяции, что позволит заменять дорогостоящее высокопроизводительное секвенирование более бюджетным анализом частой мутации методом ПЦР в реальном времени или аналогичным и, таким образом, значительно снизить стоимость обследования. Разработан алгоритм прогнозирования наличия данной мутации на основании данных общего анализа мочи и биохимического анализа крови пациента. При ее исключении показано полное секвенирование генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5 на основании разработанной панели.
Для более эффективной организации обследования в случае возможности аутосомно наследуемого варианта заболевания предложено параллельно со взятием биоматериала у пробанда осуществлять забор аналогичного материала у родственников пациента.
Предложено дополнить рекомендованный Американской коллегией медицинских генетиков алгоритм классификации генетических вариантов по степени патогенности, что позволит более корректно классифицировать генетические варианты на Х-хромосоме.
Положения, выносимые на защиту
1. На основе метода мультиплексной ПЦР разработан набор для лабораторной диагностики наследственного нефрита (синдрома Альпорта) методом
высокопроизводительного секвенирования генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5. Чувствительность метода на выборке пациентов с подтвержденным диагнозом составила 83%, специфичность на контрольной выборке - 100%.
2. Впервые описано 26 патогенных и вероятно патогенных вариантов генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5.
3. Мутация СОЬ4Л5 с.187Ш>А, p.(Gly624Asp) является частой при наследственном нефрите в российской популяции.
4. Для Х-сцепленной формы наследственного нефрита впервые выявлена взаимосвязь типа мутации у пациента с возрастом выявления гематурии, артериальной гипертензии, а также концентрацией альбумина и креатинина в крови.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на международных и российских конференциях: международном симпозиуме по синдрому Альпорта (Геттинген, Германия, 2015), конференции Европейского общества по изучению генетики человека Е8Н0-2014 (Милан, Италия, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «NGS в медицинской генетике» - MGNGS'16 (Суздаль, 2016), IV Всероссийской научно-практическая конференции по геномному секвенированию N08-2016 (Москва, 2016), XIV Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2015), Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2015), Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2015), XVII Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2014), II Всероссийской научно-практической конференции по геномному секвенированию N08-2014 (Москва, 2014).
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Применение технологии высокопроизводительного секвенирования в диагностике
наследственных заболеваний
Генетические методы на сегодняшний день занимают очень важное место в диагностических алгоритмах ряда наследственных заболеваний [11-13].
Последние десятилетия в диагностике генетически обусловленных заболеваний активно применялись «традиционные» методы генетической диагностики - полимеразная цепная реакция (ПЦР), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, ПЦР в реальном времени, секвенирование по Сэнгеру, сравнительная геномная гибридизация, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (англ. SSCP), анализ гетеродуплексов, мультиплексная лигаза-зависимая амплификация зондов (англ. MLPA), анализ кривых плавления (англ. MCA), анализ микросателлитного полиморфизма и другие.
Завершение в 2003 году проекта по полной расшифровке генома человека создало необходимую базу для понимания генетических причин многих заболеваний человека [14]. Появление в открытом доступе последовательности генома человека послужило окном в новую эру медицины - эпоху геномной медицины [15-17]. Методы высокопроизводительного секвенирования (англ. NGS, секвенирование нового/следующего поколения) позволили значительно увеличить производительность секвенирования и снизить его стоимость, таким образом при разрешении в 1 п.н. считывая кодирующую последовательность отдельных генов, экзомов и геномов как в научных, так (в последние годы) и в медицинских целях [18]. Технологии NGS-секвенирования за 12 лет своего существования на рынке [19] прочно завоевали место в сфере генетической диагностики, продолжая вытеснять оттуда «традиционные» методы. На сегодняшний день, наиболее популярные в РФ и других странах технологии высокопроизводительного секвенирования - Illumina, Inc. и Ion torrent™. Обе технологии позволяют осуществлять секвенирование как экзомов, так и панелей генов [20-22], что имеет важнейшие применения в медицинской сфере.
Применяемая в настоящем исследовании технология полупроводникового секвенирования Ion torrent™ была разработана в 2007 году Д. Ротбергом, став первой платформой NGS, работающей без оптической системы считывания генетической информации [23]. Для считывания последовательности генов (от одного гена до экзома) в процессе пробоподготовки активно применяется технология AmpliSeq™, совместимая с последующим полупроводниковым секвенированием. Технология основана на мультиплексной ПЦР-амплификации и последующем секвенировании сотен или тысяч фрагментов генома человека. Реакция осуществляется с использованием нескольких сотен или тысяч пар праймеров,
собранных в специализированные наборы («панели»), специфичные в зависимости от генов, представляющих научный, либо диагностический интерес [24].
На данный момент для диагностики наследственных заболеваний применяют три основных подхода: секвенирование всего генома человека, секвенирование экзома и секвенирование отдельных генов (генных панелей). Полногеномное секвенирование ввиду высокой стоимости пока применяется в клинических целях очень редко и лишь для узкоспециализированных задач, последние же два метода имеют уже сегодня широкое распространение в диагностике наследственных заболеваний по всему миру [25]. В случае наличия клинических подозрений на определенное моногенное заболевание, на наш взгляд, последний подход является наиболее оправданным: генные панели позволяют обеспечить более высокие среднее покрытие и полноту покрытия секвенируемых генов при схожей или более низкой стоимости, чем экзомное секвенирование, что обусловливает более высокую чувствительность данного подхода.
1.2. Синдром Альпорта: общая информация и патогенез 1.2.1. Общая информация
Синдром Альпорта - наследственный нефрит, клинически проявляющийся гематурией, протеинурией, прогрессирующим снижением почечных функций и осложненный, как правило, нейросенсорной тугоухостью с потерей восприятия высоких тонов и глазной дисфункцией [26]. СА, наряду с ^А нефропатией и значительно более распространенной в популяции БТБМ, являются тремя основными причинами гематурии у детей и взрослых [27]. Распространенность синдрома Альпорта колеблется в зависимости от изучаемой популяции, составляя от приблизительно 1 случая на 5 000 человек в штате Юта и в южной части штата Айдахо, США, до 1 случая на 53 000 новорожденных в Финляндии [28]. Распространенность в России (по данным на 70е-80е годы XX века) составляет 17 случаев на 100 000 человек [1, с. 341]. Около 3% случаев хронической почечной недостаточности у детей связано с синдромом Альпорта; 2,3% почечных трансплантаций проводится пациентам с данным синдромом [4,29].
Синдром Альпорта был впервые описан в 1927 году как наследственный нефрит, характеризующийся гематурией, альбуминурией, низкой плотностью мочи, наличием в ней гранулярных и гиалиновых цилиндров, повышенным артериальным давлением, отеками и тугоухостью [30].
Морфологически заболевание характеризуется структурными дефектами базальной мембраны клубочков, которые приводят к развитию гематурии и/или протеинурии [31], а также, как правило, сопровождается нарушениями базальных мембран улитки уха и/или капсулы хрусталика, обусловливающих, соответственно, нарушения слуха и зрения [3].
1.2.2. Базальная мембрана клубочков и ее строение
Как известно, каждая почка содержит 1-1,3 млн сосудистых клубочков, а каждый клубочек содержит около 50 капиллярных петель. Стенка капилляра представляет собой клубочковый фильтр, состоящий из эпителия, эндотелия и расположенной между ними базальной мембраны [1, с. 12]. Эпителий клубочка состоит из подоцитов, включающих крупное клеточное тело и отростки, которые покрывают практически всю поверхность капилляра (зазоры между ними составляют 25-30 нм) [32]. Подоциты связаны между собой фибриллярными структурами, образующими щелевую диафрагму, принимающую участие в гломерулярной фильтрации. Эндотелиальные клетки имеют поры, занимающие около 30% эндотелиальной выстилки и также принимающие участие в ультрафильтрации [1, с. 12]. БМК представляет собой внеклеточный матрикс. Она в норме имеет толщину 250-400 нм и состоит из центрального плотного слоя (lamina densa), окруженного более тонкими слоями с наружной и внутренней стороны, являющимися, соответственно, гликокаликсом подоцитов и эндотелия [1, с. 12]. Внеклеточный матрикс соединяется с цитоскелетом смежных эндотелиальных клеток и подоцитов при помощи интегринов и других белков [2].
Как все базальные мембраны, БМК состоит из белков коллагена IV типа, ламининов, нидогена и протеогликанов [2]. Основной компонент зрелой БМК - коллаген типа IV [33]. Белки коллагена IV типа взаимодействуют друг с другом, образуя так называемые протомеры, состоящие из трех молекул. На сегодняшний день, известны три типа протомеров: a1a1a2(IV), a3a4a5(IV) и a5a5a6(IV) [34], из которых в базальной мембране зрелых клубочков преобладает a3a4a5(IV). Альфа-цепи 3,4 и 5 секретируются подоцитами [35]. Мономер коллагена IV состоит из трех доменов. Наиболее протяженный из них, состоящий примерно из 1400 аминокислот, -альфа-спиральный домен коллагенов, содержащий повторы последовательности Gly-X-Y (где X и Y - произвольные аминокислотные остатки, Gly - глицин). Этот домен отвечает за формирование тройной спирали с двумя коллагеновыми доменами соседних молекул. С N-конца белков Col4a3 и Col4a4 располагается домен 7S (у Col4a5 вместо него домен NC2), благодаря взаимодействию которого с 7S-доменами соседних коллагенов образуются его тетрамеры. Домены 7S также образуют тройную спираль. На C-конце коллагена располагается неколлагеновый домен NC1, состоящий из примерно 230 остатков и обусловливающий попарное взаимодействие молекул коллагена IV с образованием гексамерных структур (рисунок 1.1) [33,36,37]. Показано, что коллагеновый, 7S домены и NC1 домены различных моллекул белка взаимодействуют с образованием межмолекулярных дисульфидных связей [38].
Рисунок 1.1. Модель структуры сети, образуемой протомерами а-цепей 3,4 и 5 коллагена IV типа (по [36]). Белки Col4a3, Col4a4 и Col4a5 образуют протомер, протомеры объединяются C-концами (доменами NC1) по шесть, с N-конца протомеры взаимодействуют по четыре 7S-доменами. Образуемая таким образом сеть укрепляется суперспирализацией протомеров, образованием петель и межмолекулярными дисульфидными связями.
1.2.3. Структурные дефекты БМК и связанные с ними нарушения работы почек
Клубочковый фильтр является размер- и зарядспецифичным: крупные отрицательно заряженные молекулы проходят через него тяжелее, чем небольшие положительно заряженные. В нормальных условиях крупные белки не проходят через гломерулярный фильтр, через него частично проходят белки средней молекулярной массы (такие, как альбумин) и практически все белки небольших молекулярной массы и радиуса [39,40]. Ранние стадии ряда заболеваний, связанных с нарушенем гломерулярного фильтра, характеризуются увеличением его проницаемости для белков средней молекулярной массы (в основном, альбумина) при сохранении барьерной функции в отношении крупных белков. Прошедшие фильтр белки реабсорбируются лишь частично, что приводит к их появлению в урине [39].
СА связан с дефектами генов альфа-цепей коллагена IV типа (см. ниже). Мутации аминокислотной последовательности Col4a3, Col4a4 и Col4a5 приводят к пост-трансляционным аномалиям сборки протомеров коллагена. Считается [7], что подобный работе молнии механизм сворачивания тройной спирали коллагена IV типа начинается с C-конца белка. В случае тяжелой формы СА (в частности, инактивирующие мутации гена COL4A5 — описано в [41]) цепь протомеров а3а4а5 вовсе не формируется и не замещает присутствующую на более ранних этапах онтогенеза цепь а1а2а1, что приводит к сохранению последней. Нарушения структуры сети, состоящей из 3, 4 и 5 альфа-цепей коллагена IV типа, или ее отсутствие,
вызывает истончения, утолщения и расслоения БМК. Данные нарушения БМК влияют на рецепторы подоцитов и их цитоскелет, приводят к нарушению формы отростков подоцитов и повышению секреции подоцитами матриксных металлопротеаз [2]. Следует учитывать, что при СА внеклеоточный мактрикс БМК итак характеризуется большей подверженностью эндопротеолизу в связи с отсутствием некоторых межмолекулярных дисульфидных связей [3]. Кроме того, развивающаяся у пациентов АГ стимулирует секрецию эндотелина-1 клетками эндотелия, что активирует мезагиоциты [42]. Вышеперечисленные отклонения в совокупности нарушают барьерную функцию клубочкового фильтра [2], что вызывает возрастание концентрации альбумина, белков системы комплемента и иммуноглобулинов в клубочковом фильтрате [43]. Белки реабсорбируются клетками эпителия проксимального канальца. Это стимулирует синтез и высвобождение эпителиальными клетками цитокинов и медиаторов, которые приводят к тубулоинтерстициальному нефриту и позднее — к тХПН [43]. Избыток альбумина в клубочковом фильтрате сам по себе приводит к нарушениям функционирования клеток почечных канальцев [44] и подоцитов [45]. Недавно на мышиных моделях было показано [46], что фильтрация альбумина непосредственно и очень значительно влияет на прогрессирование синдрома Альпорта: мыши с нокаутом гена альбумина в гомозиготном состоянии и с CA жили на 64% дольше своих сородичей с нормальной концентрацией альбумина в крови, притом что артериальное давление у обеих генетических линий животных было схожим.
Гематурия является самым ранним проявлением нарушения (отсутствия) в БМК сети коллагена IV типа [3]. Показано, что в случае истончения БМК эритроциты способны просачиваться сквозь нее (в норме же данное событие является редким), принимая форму гантели, что обусловливает развитие гематурии [47].
Изменения структуры БМК могут быть выявлены с помощью гистологического исследования нефробиоптата методом иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии. Для БТБМ характерно истончение БМК [48]. В случае СА наблюдается, помимо истончения, также местами ее утолщение и расслоение lamina densa [27]. Тонкие базальные мембраны, характерные для БТБМ, могут наблюдаться без расслоения и у пациентов с СА на ранних стадиях заболевания. Иммуногистохимическое исследование нефробиоптата для пациентов с СА любого типа наследования обычно показывает значительное снижение или полное отсутствие экспрессии всех трех белков коллагена IV типа, в то время как для БТБМ оно значительно не отличается от нормы [27]. При этом в случае аутосомной формы СА или у женщин с X-сцепленной формой в 20 и 30% случаев, соответственно, экспрессия может не отличаться от нормы. Это же относится и к пациентам с миссенс заменами [41].
Чувствительность диагностики СА методом электронной микроскопии нефробиоптата почек зависит от критериев анализа микрофотографий и опыта исследователя. В частности, она составила 61% (66 из 108 образцов) в исследовании [49] при использовании строгих критериев оценки структурных нарушений БМК.
1.2.4. Сопутствующие нарушения слуха
Для подавляющего большинства пациентов с СА (кроме носителей аутосомо-доминантной формы) характерно развитие двусторонней нейросенсорной тугоухости в диапазоне высоких частот. Нарушения слуха развиваются с возрастом, и их наличие зависит от типа наследования СА, пола и возраста пациента (подробнее см. раздел 1.4.2), поэтому они выявляются в детском возрасте далеко не у всех больных.
Развитие тугоухости связано с нарушением нормальной экспрессии альфа-цепей коллагена IV типа в улитке уха, где они являются компонентом базальных мембран, при этом механизм потери слуха при данных нарушениях пока неясен [3,50]. Вероятно, патогенез связан с дисфункцией сосудистой полоски внутреннего уха (опосредованной эндотелином-1) и нарушением его микромеханики [3].
1.2.5. Сопутствующие нарушения зрения
Нарушения зрения при наследственном нефрите встречаются реже, чем нарушения слуха, при этом они являются высокоспецифичным признаком СА [4]. Характерные офтальмологические нарушения выявлены у представителей примерно половины семей с самой распространенной, Х-сцепленной формой СА [8,51]. Нарушения зрения у мужчин обычно впервые проявляются в возрасте 14 лет [52].
К характерным для СА офтальмологическим нарушениям относятся помутнение роговицы, передний лентиконус, катаракта, центральная перимакулярная и периферическая ретинопатии, сопровождающиеся пятнами, истончение сетчатки с височной стороны; редко -задняя полиморфная дистрофия роговицы, макулярное отверстие или макулопатия. Лентиконус, дистрофия роговицы, вышеописанные ретинопатии, истончение сетчатки с височной стороны и макулярное отверстие очень большого размера являются высокоспецифичными признаками СА [53].
Известен патогенез некоторых нарушений зрения при СА. Сеть протомеров альфа-цепей коллагена IV типа входит в состав капсулы хрусталика. Вследствие дефектов сети, образуемой протомерами, капсула хрусталика у пациентов с СА, особенно мужского пола, истончается и теряет целостность, а внутренняя часть капсулы растрескивается, что не позволяет ей поддерживать нормальную форму хрусталика (в первую очередь в дорсовентральном
направлении [54]) и с годами приводит к переднему лентиконусу — выпячиванию передней части хрусталика в переднюю камеру [55,56]. Также, данные нарушения могут привести к возникновению передней полярной катаракты [56]. Показано, что а3, а4 и а5 цепи коллагена IV типа у части пациентов с СА отсутствуют в капсуле хрусталика [57].
1.2.6. «Догенетические» диагностические критерии СА
Классические критерии СА описаны в 1988 году [58]. Для подтверждения СА требуется соблюдение по крайней мере 3 из 4 нижеперечисленных признаков (обязательное предварительное условие - наличие стойкой гематурии у пациента):
1. Семейный анамнез гематурии вне зависимости от наличия ХПН
2. Характерные нарушения БМК у пациента по данным исследования нефробиоптата (утолщение БМК, расслоение lamina densa)
3. Характерные нарушения зрения у пациента
4. Двусторонняя нейросенсорная тугоухость у пациента
В то же время, семейный анамнез доступен не всегда, нарушения зрения и слуха проявляются далеко не у всех пациентов, особенно в детском возрасте (см. разделы 1.4.2 и 1.2.5), что значительно осложняет диагностику СА с использованием данных критериев. Тем не менее, они сохраняют свою актуальность и по сей день, особенно в отсутствии возможности провести генетическое исследование.
1.3. Генетические основы СА
1.3.1. Общая информация
Генетическая основа наследственного нефрита была впервые продемонстрирована в 1985 г. Fiengold M. и соавторами [59]. Позднее, уже в начале 90х годов XX века, было показано, что СА может быть генетически обусловлен мутацией в одном из трёх генов, кодирующих альфа-цепи коллагена типа IV: COL4A3, COL4A4 или COL4A5 [60,61]. Выявление в 1990 году гена, связанного с СА, стало первым среди всех заболеваний почек [5].
Похожие диссертационные работы по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», 14.03.10 шифр ВАК
Клинико-нейрофизиологические и молекулярно-генетические характеристики наследственных периферических нейропатий с аутосомно-рецессивным типом наследования2021 год, кандидат наук Муртазина Айсылу Фанзировна
Клинический и молекулярно-генетический анализ болезни Штаргардта2017 год, кандидат наук Жоржоладзе, Нино Владимировна
Прогнозирование риска диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 1 типа и оценка нефропротективных эффектов терапии инкретинами2019 год, кандидат наук Зураева Замира Тотразовна
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика несиндромальных нарушений интеллектуального развития2021 год, кандидат наук Левченко Ольга Александровна
Анализ генетического контроля наследственной потери слуха в популяциях ряда регионов Сибири2022 год, кандидат наук Данильченко Валерия Юрьевна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шагам, Лев Иосифович, 2017 год
И ГО
И ^
й 96,0%
о к
к
95,5% 95,0%
0 50 100 150 200
Количество чтений, тыс
Рисунок 3.1 Полнота 10-кратного покрытия целевых участков генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5 (кодирующие экзоны и смежные участки интронов) в зависимости от количества чтений в пересчете на исследуемый образец.
3.3. Результаты анализа контрольной выборки образцов без патологии почек. Создание перечня непатогенных вариантов генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5
В контрольную выборку были включены пациенты из отделений пульмонологии, психоневрологии и эпилептологии-1, кардиологии Научно-Исследовательского Клинического Института Педиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева РНИМУ им.Н.И.Пирогова, а также здоровые родственники пациентов из отделений врожденных и приобретенных болезней почки, психоневрологии и эпилептологии-1. В выборку вошли 12 испытуемых без гематурии и почечной недостаточности, 7 мужского и 5 женского пола, возраста от 6 до 35 лет (средний возраст 17 лет).
Результаты генотипирования испытуемых из контрольной группы представлены в таблице 3.2. Классификация генетических вариантов по степени предполагаемой патогенности производилась согласно рекомендациям Американской коллегии медицинских генетиков [139].
Таблица 3.2. Результаты секвенирования генов СОЬ4Л3, СОЬ4Л4 и СОЬ4Л5 в контрольной выборке испытуемых без патологии почек. Представлены только генетические варианты, классификация которых как непатогенных была бы невозможна без априорного знания о здоровье пациента.
Код испытуемого Пол Возраст Выявленные генетические 12 варианты Клиническая значимость варианта
К1 муж 21 год СОЬ4Л4 с. 10750>А, р.(Уа1359Ме^ непатогенный
КЗ жен 9 лет не обнаружено -
K4 жен 34 года не обнаружено -
К5 муж 35 лет СОЬ4Л3 с.3807С>А, р.(Авр1269Ии) непатогенный
СОЬ4Л4 с.2367А>Т, р.(01у78901у) непатогенный
К7 жен 18 лет не обнаружено -
К8 жен 13 лет не обнаружено -
К9 муж 17 лет не обнаружено -
К10 муж 8 лет не обнаружено -
К11 жен 17 лет СОЬ4Л3 с.3807С>А, р.(АБр126901и) непатогенный
К12 муж 6 лет СОЬ4Л4 с.1833Т>С, р.(01у61Ю1у) вероятно непатогенный
К13 муж 17 лет не обнаружено -
К14 муж 7 лет не обнаружено -
Генетический вариант COL4A4 c.1075G>A, p.(Val359Met) обнаружен в гетерозиготном состоянии у испытуемого К1 двадцати одного года без патологии почек, а также у его родственницы К2 сорока двух лет без патологии почек. Данный вариант не был ранее описан в международных базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов, ClinVar, HGMD и LOVD. Данные предсказания патогенности in silico не дают согласованного положительного или отрицательного результата (PolyPhen2 0,56; SIFT 0,13; MutationTaster - полиморфизм с вероятностью >99,99%; консервативность участка по данным PhyloP 0,13). Если бы данный вариант был обнаружен у больного или испытуемого с неясным клиническим статусом, мы классифицировали бы его как вариант с неясной клинической значимостью. В нашем случае, контрольные испытуемые К1 и К2 являются здоровыми родственниками пациента KamAl с обнаруженным вероятно патогенным вариантом гена COL4A5 (глициновой заменой), обусловливающим наличие патологии. Совокупность вышеперечисленных сведений позволяет классифицировать данный вариант как непатогенный в отношении синдрома Альпорта
12 Все представленные в таблице генетические варианты выявлены в гетерозиготном состоянии
согласно следующим критериям [140]: BS2 - обнаружен у здорового взрослого пациента, BS4 -нет сегрегации варианта с заболеванием в семье пациента.
Генетический вариант COL4A3 c.3807C>A, p.(Asp1269Glu) обнаружен в гетерозиготном состоянии у двух неродственных друг другу испытуемых без патологии почек: К5 и К11. Данный вариант является весьма распространенным в популяциях человека (так, частота аллеля по данным ExAc достигает 4,4%, по данным ESP - 4,8%). Кроме того, данные предсказания патогенности in silico в целом (хотя и не очень уверенно) свидетельствуют в пользу его нейтральности (PolyPhen2 0,02; SIFT 0,79; MutationTaster - полиморфизм, однако с вероятностью всего 30%; консервативность участка по данным PhyloP 0,47). Если бы данный вариант был обнаружен у больного или испытуемого с неясным клиническим статусом, мы классифицировали бы его как вероятно непатогенный в связи с популяционной частотой (BS1) и результатами предсказания патогенности (BP4). В нашем же случае добавляется ещё один критерий - BS2: генетический вариант обнаружен у испытуемого без патологии почек, что позволяет классифицировать его как непатогенный в отношении СА и БТБМ. Кроме того, у пациента KrasD26 с наследственным нефритом данный генетический вариант был выявлен в гомозиготном состоянии. Наличие другого патогенного варианта у KrasD26 позволяет классифицировать данный вариант в гомозиготном состоянии как вероятно непатогенный согласно критерию популяционной частоты (BS1) и факту обнаружения его у пациента с другой молекулярно-генетической причиной заболевания (BP5).
Генетический вариант COL4A4 c.2367A>T, p.(Gly789Gly) обнаружен в гетерозиготном состоянии у пациента К5. Частота аллеля в популяции составляет 0,6% по данным ExAc и 0,8% по данным ESP (частота генотипа A/T, соответственно, 1,2-1,4%). Вариант не приводит к аминокислотной замене, тем не менее, согласно предсказаниям программ Human Splicing Finder и NetGene2, потенциально влияет на сплайсинг. Консервативность участка по данным PhyloP: -0,023. Если бы данный вариант был обнаружен у больного или испытуемого с неясным клиническим статусом, мы классифицировали бы его как вариант с неясной клинической значимостью. Поскольку он обнаружен у испытуемого без генетически обусловленной гематурии, мы можем классифицировать его как непатогенный в отношении СА и БТБМ согласно критериям BS1 и BS2. Кроме того, данный вариант был обнаружен у пациента ShukV16, который, помимо него, нес другой, патогенный генетический вариант.
Генетический вариант COL4A4 c.1833T>C, p.(Gly611Gly) обнаружен в гетерозиготном состоянии у пациента К12. Его частота в популяции составляет 0,45% по данным ExAc и 0,42% по данным ESP. Данный нуклеотид не является консервативным (PhyloP: -0,72) и не предсказывается как важный для сплайсинга участок гена. Если бы данный вариант был обнаружен у больного или испытуемого с неясным клиническим статусом, мы
классифицировали бы его как вероятно непатогенный в отношении СА вариант, руководствуясь критериями BS1 и BP7. Поскольку данный вариант выявлен у испытуемого без гематурии, к вышеописанным критериям непатогенности мог бы добавиться критерий BS2 - обнаружение у здорового взрослого человека. К сожалению, однако, испытуемый К12 еще не достиг взрослого возраста, поэтому данный критерий не может быть применен, имея в виду, что у 16% детей с коллагенопатиями из нашей выборки впервые выявляли гематурию в возрасте 6-15 лет.
Стоит отметить, что у испытуемого К1 была обнаружена непатогенная глициновая замена в коллагеновом домене белка СОЬ4Л4: c.1634G>C, p.(Gly545Ala). Данная замена была ранее описана как встречающаяся у испытуемых без патологии почек [141]. Кроме того, ее частота в популяции составляет, согласно базе данных ExAc, 2,82%, что позволяет классифицировать вариант как непатогенный в отношении СА и БТБМ согласно критериям BS1 и BS2. Данный генетический вариант был также обнаружен в гетерозиготном состоянии у трех испытуемых из выборки пациентов. Двое из пациентов имели другую генетическую причину заболевания, у третьего был дополнительно обнаружен вариант с неясной клинической значимостью.
Обсуждение полученных результатов
Таким образом, на контрольной выборке из 12 испытуемых не было выявлено ни одного ложноположительного результата, то есть патогенных или вероятно патогенных генетических вариантов, что говорит о высокой диагностической специфичности апробированного нами генетического исследования. У двух испытуемых были выявлены варианты с неясной клинической значимостью, которые, с учетом отсутствия у пациентов патологических изменений почек, были нами классифицированы как непатогенные. Также, нами был классифицирован как непатогенный вероятно непатогенный вариант СОЬ4Л3 c.3807C>A, p.(Asp1269Glu).
3.4. Результаты анализа пациентов с подтвержденным или предполагаемым диагнозом
«синдром Альпорта»
Всего мы проанализировали 76 неродственных друг другу пациентов с достоверным или предполагаемым диагнозом «синдром Альпорта», в том числе 30 пациентов с достоверным диагнозом наследственного нефрита согласно [4] до генетического исследования, а также 46 пациентов с не исключенным или предполагаемым диагнозом. Результаты представлены ниже.
3.4.1. Общая информация о выявленных генетических вариантах
Для классификации генетических вариантов по степени предполагаемой патогенности мы использовали критерии Американской коллегии медицинских генетиков [140]. Ниже описан результат выявления у испытуемых вариантов следующих категорий: патогенные, вероятно патогенные и варианты неясной клинической значимости. Всего в проанализированной выборке пациентов у 19 человек были обнаружены патогенные варианты, у 30 человек патогенных вариантов выявлено не было, но были выявлены вероятно патогенные варианты, еще у 11 человек были выявлены только варианты неясной клинической значимости, а у остальных 16 испытуемых не было выявлено ни одного варианта из вышеперечисленных категорий (рисунок 3.2). При этом у четырех испытуемых было обнаружено по два генетических варианта из вышеперечисленных категорий патогенности: у 2 детей было обнаружено по два варианта неясной клинической значимости, еще у 2 детей было обнаружено, соответственно: патогенный и вероятно патогенный вариант; два вероятно патогенных варианта (подробнее см. раздел 3.4.7.). Все выявленные варианты (патогенные, вероятно патогенные, с неясной клинической значимостью) гена COL4A5 у девочек находидись в гетерозиготном состоянии, у мальчиков - в гемизиготном. Варианты генов COL4A3 и COL4A4, кроме выявленных у пациентки ZagP8, находились в гетерозиготном состоянии.
В Патогенные
S Вероятно патогенные
ЕЭС неясной клинической значимостью
□ Не выявлено
Рисунок 3.2. Распределение пациентов по степени патогенности вариантов нуклеотидной последовательности, у них обнаруженных. В случае наличия более одного генетического варианта, от каждого пациента в статистику включали только один, наиболее патогенный.
Всего мы выявили у пациентов из обследованной выборки 13 патогенных вариантов, 31 вероятно патогенный вариант и 13 вариантов неясной клинической значимости. Из них 9 патогенных вариантов, 17 вероятно патогенных вариантов и 6 вариантов неясной клинической
значимости, по нашим данным, ранее не были описаны в литературе и базах данных, агрегирующих мутации при наследственных заболеваниях. При этом только за время написания настоящей работы по крайней мере 3 генетических варианта, до этого не описанных, были описаны в базах данных (среди них 2 патогенных и 1 вероятно патогенный), то есть на момент обработки данных секвенирования неописанных вариантов было больше.
Генетическим подтверждением диагноза «синдром Альпорта» мы считали выявление патогенной или вероятно патогенной мутации в гене СОЬ4Л5, в случае же генов СОЬ4Л3 и СОЬ4Л4 требовалось гомо- или компаунд гетерозиготное состояние мутаций при аутосомно-рецессивной форме СА; выявление единственной мутации в гетерозиготном состоянии требовалось для подтверждения аутосомно-доминантной формы СА, либо БТБМ. Всего из 76 неродственных пациентов, направленных в лабораторию на генетическое обследование, полное генетическое подтверждение дефекта изученных генов получено для 49 человек (64%), в том числе X-сцепленный вариант синдрома Альпорта подтвержден у 44 детей (у одного из них он осложнен мутацией гена СОЬ4Л3 в гетерозиготном состоянии), еще у 3 испытуемых детектированы мутации гена СОЬ4Л3 в гетерозиготном состоянии (4%). У 4 человек (5%) мы подозреваем аутосомно-рецессивную форму синдрома Альпорта, при этом для одной из пациенток диагноз подтвержден, для второй пациентки предполагается дигенное наследование (выявлено 2 вероятно патогенных варианта, требуется обследование родителей), а еще для 2 человек подтверждение диагноза совсем невозможно без анализа родственников.
Распределение пациентов по типам наследования патологии коллагенов IV типа в исследованной выборке из российской популяции приведено на рисунке 3.3. Стоит отметить, что при учете также вариантов с неясной клинической значимостью с наибольшей вероятностью патогенности, распределение по типам наследования изменяется: X-сцепленная -85,2% (46 чел), аутосомно-рецессивная и доминантная - по 7,4% (4 чел).
■ Х-сцепленная
■ Аутосомно-рецессивная
ШБТБМ или аутосомно-доминантная форма СА
Рисунок 3.3. Формы наследования патологии коллагенов IV типа в изученной выборке согласно результатам генетического обследования.
На обследованной выборке пациентов мы обнаружили генетические варианты следующих типов (рисунок 3.4): аминокислотные замены (в т.ч. самый популярный подвид -замены глицина в коллагеновых доменах белков), мутации сайтов сплайсинга, делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания белка, а также более крупные, размером от одного до нескольких экзонов, нонсенс-мутации, мутации стартового кодона. Всего был обнаружен 51 патогенный/вероятно патогенный генетический вариант, 65% из которых - это глициновые замены. Из 33 глициновых замен, 32 выявлены в коллагеновых доменах белков, и только одна -вероятно патогенная замена в гене СОЬ4Л4 c.4394G>A, p.(Gly1465Asp) - выявлена в ^ концевом домене N0, при этом и она находится на самой границе с коллагеновым доменом.
Рисунок 3.4. Распределение выявленных патогенных и вероятно патогенных вариантов по функциональным типам.
Распределение генетических вариантов по гену, в котором они были выявлены, соответствует данным литературы. Так, подавляющее большинство мутаций (86% среди патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов - рисунок 3.5) выявлены в гене СОЬ4Л5. Гены СОЬ4Л3 и СОЬ4Л4 совокупно отвечают только за 14% мутаций. Если добавить к вышеописанным варианты неясной клинической значимости, соотношение сдвинется в сторону мутаций генов СОЬ4Л3 и СОЬ4Л4, доля которых составит 19% и 9% соответственно.
Рисунок 3.5. Распределение патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов по генам, в которых они обнаружены (СОЬ4Л5 - 44, СОЬ4Л4 - 3 и СОЬ4Л3 - 4 варианта).
В гене СОЬ4Л5 варианты значимо чаще обнаруживали (относительно обшей длины кодирующей части гена и соответствующего белка) в положениях от 30% до 40% относительно общей длины (рисунок 3.6), чем в других положениях (9 из 44 вариантов, р=0,0213 согласно критерию хи-квадрат). Эти положения соответствуют коллагеновому домену белка, экзонам 2226. Объяснение данному феномену будет представлено ниже (раздел 3.4.2) - это связано с наличием в российской популяции частой мутации гена СОЬ4Л5. Кроме того, мутации реже ожидаемого встречаются со стороны С-конца белка (от 90% до 100% относительно общей длины, р=0,0486). Эти положения соответствуют домену КС-1, экзоны 48-51.
О 0,25
Й
О
к
£ 1
а 1 § 4 г 4
1 1 1 1 с 1 I 1 1 1 ^ § I
1 1 ^ § \ 1
0-10% 10-20% 20-30% 3040% 40-50% 50-60% 60-70% 70-80% 80-90% 90-100%
Положение в белке
Рисунок 3.6. Доля выявленных генетических вариантов в зависимости от положения в белок-кодирующей части гена СОЬ4Л5 (относительно ее общей длины). Учитывали выявленные генетические варианты следующих категорий: патогенные, вероятно патогенные. Для каждой категории указана погрешность наблюдения (вертикальные линии), а также число выявленных вариантов (в прямоугольниках над столбцами). Высота заштрихованного столбца соответствует доле генетических вариантов соответствующего участка в белка.
В гене СОЬ4Л4 выявлено всего 3 патогенных/вероятно патогенных варианта, в гене СОЬ4Л4 - 4, статистика по их распределению относительно длины белков не собиралась ввиду небольшого размера выборки.
У большинства пациентов были выявлены уникальные мутации, больше в выборке не обнаруженные, в то же время, одна из мутаций была обнаружена сразу у семи пациентов, а ещё одна - у пары неродственных пациентов.
3.4.2. Частые мутации, вызывающие синдром Альпорта в российской популяции Патогенный вариант нуклеотидной последовательности СОЬ4Л5 с.187Ю>Л, р.(01у624Азр)
Наиболее распространенной среди пациентов изученной выборки, страдающих синдромом Альпорта, оказалась патогенная мутация гена СОЬ4Л5: c.1871G>A, p.(Gly624Asp). Мутация выявлена сразу у семи неродственных друг другу пациентов из изученной выборки, что составляет 9,2% от всех направленных на обследование пациентов. Среди пациентов с генетическим подтверждением диагноза доля составляет 14,3% (7 из 49 испытуемых), а среди пациентов с генетически подтвержденным X-сцепленным синдромом Альпорта - 15,9%. При этом наиболее часто данный дефект обнаруживался у мальчиков (5 из 27 генетически подтвержденных случаев X-сцепленного СА, что составляет 18,5%). Мутация выявлена у пациентов из различных регионов европейской части России: Московская (3 чел), Нижегородская, Калужская и Липецкая области, а также республика Мордовия. Известно, что данная мутация также распространена в ряде стран Восточной и Южной Европы (см. разд. 1.3.7). Мы предполагаем, она является мутацией основателя и в российской популяции, при этом данный вопрос (наличие общего предка у пациентов, несущих данную мутацию) требует дальнейшего исследования.
Клиническая картина, наблюдаемая у пациентов с данной мутацией, представлена в таблице 3.3. Ниже мы показываем, что клиническая картина у пациентов с этой мутацией значимо отличается от клинической картины у других пациентов с X-сцепленной формой наследственного нефрита. Для объективности оценки, мы исключили из анализа пациента ^20 в связи с тем, что его клиническая картина осложняется наличием второй мутации (данный случай подробнее разобран в разделе 3.4.7).
Гематурия. Средний возраст выявления гематурии у пациентов с мутацией 624 глицина СОЬ4Л5 (6 чел) составляет 5 лет и 11 месяцев (у мальчиков - 7 лет и 4 месяца, а у девочек - 3 года и 1 месяц), тогда как для остальных пациентов с X-сцепленной формой наследственного нефрита (3 5 чел) - всего 2 года и 2 месяца (у мальчиков 2 года и 8 месяцев, у девочек - 1 год и 5 месяцев. Различие является статистически значимым (критерий Манна-Уитни - Z=-3,225, двусторонняя значимость 0,001, критерий Колмогорова-Смирнова - Z =1,932, двусторонняя значимость 0,001).
Макрогематурия не была выявлена ни у одного из 6 пациентов с описываемой мутацией (у пациента MolI37 она в стационаре выявлена не была, но, со слов матери, периодически наблюдается). Среди 35 пациентов с другими мутациями гена СОЬ4Л5 и известной клинической информацией, макрогематурия была выявлена у 15 человек (43%). Статистически значимого различия между выборками не выявлено как при исключении пациента MolI37, так и
даже при включении его как не страдающего макрогематурией (точный критерий Фишера, р=0,137 и 0,070, соответственно). Среди 4 пациентов-носителей мутации не моложе 7 лет макрогематурия не была выявлена ни у одного пациента, при этом среди 27 пациентов с другими мутациями гена СОЬ4Л5 макрогематурия была выявлена у 12 человек (44%). Ввиду небольшого размера выборки, статистической значимости данное различие также не достигло (р=0,14, подсчитанная с помощью точного двустороннего критерия Фишера). Среди 5 пациентов-носителей мутации не моложе 5 лет макрогематурия не была выявлена ни у одного человека, при этом среди 30 пациентов с другими мутациями гена СОЬ4Л5 макрогематурия была выявлена у 13 человек (43%), причем у всех до достижения возраста 5 лет. Данное различие также не достигло порога статистической достоверности (р=0,13, подсчитанная с помощью точного двустороннего критерия Фишера), однако все же не исключается его значимость, которая может быть показана при расширении выборки обследованных пациентов.
Протеинурия Из 6 пациентов с заменой 624 глицина со14а5 ни у кого не было выявлено протеинурии. При этом среди остальных пациентов с Х-сцепленным наследственным нефритом из 35 человек протеинурия была выявлена у 25 (71%). Полученные данные говорят о том, что протеинурия у носителей даной мутации выявляется значимо реже (р=0,0018, подсчитанная с помощью критерия хи-квадрат в точном двустороннего критерия Фишера). Среди пациентов старше 5 лет: из 6 пациентов с заменой 624 глицина протеинурии выявлено не было ни у кого, из 30 пациентов с иными мутациями - у 25 человек (р=0,00024, подсчитанная с помощью точного двустороннего критерия Фишера).
Артериальная гипертензия, терапия эналаприлом. В среднем, пациентов с заменой 624 глицина начинали лечить эналаприлом позже, чем других пациентов с Х-сцепленным наследственным нефритом: среди 5 испытуемых с данной мутацией, которые вообще получали соответствующую терапию, средний возраст ее начала составил 12,8 лет, тогда как для остальных пациентов (31 чел) - 8,1 года. Данное различие между группами является статистически значимым на уровне 0,05 при использовании критерия Манна-Уитни ^=-1,999, двусторонняя р=0,047), правда, не достигает значимости при использовании критерия Колмогорова-Смирнова ^=0,870, двусторонняя р=0,435). Средний возраст выявления гипертензии среди пациентов с заменой 624 глицина (4 чел) составляет 11,3 года, в то время как для остальных пациентов (19 чел) с Х-сцепленным наследственным нефритом - 9,8 года. Однако, данное различие не достигло порога статистической достоверности (критерий Манна-Уитни Z=-0,651, двусторонняя р=0,557; критерий Колмогорова-Смирнова Z=0,813, двусторонняя р=0,523).
Двусторонняя нейросенсорная тугоухость выявлена у 1 из 6 пациентов с мутацией 624 глицина (Ьа20 был исключен из анализа), а среди пациентов с прочими мутациями СОЬ4Л5 - у
13 из 30 человек. Статистически значимого различия между выборками по частоте наличия тугоухости не выявлено (p=0,370, точный двусторонний критерий Фишера). Среди пациентов с мутациями гена COL4A5 не моложе 5 лет двусторонняя нейросенсорная тугоухость (НСТ) выявлена у 13 человек из 29 (статистически значимой разницы также нет, p=0,366).
Пяти из семи пациентов с данной мутацией проводили пункционную нефробиопсию почек. У тех испытуемых, кому биопсия проводилась в относительно раннем возрасте, расслоения базальной мембраны выявлено не было (мальчики 12 и 7 лет - Isa20 и MolI37). У тех же пациентов, у кого анализ был проведен в более позднем возрасте (мальчики LevN14 и KorS18 15 и 17 лет, девочка MishD26 13 лет), были выявлены единичные участки расслоения базальной мембраны, то есть и у них расслоение было выражено весьма слабо. Результаты электронной микроскопии нефробиоптата также говорят о позднем прогрессировании заболевания у пациентов с данной мутацией.
Таблица 3.3. Клиническая картина синдрома Альпорта у пациентов с частой мутацией COL4A5 c.1871G>A, p.(Gly624Asp)13.
Пациент Shuk V16 MisD 26 MolI 37 OrlR 34 Isa 20 KorS 18 LevN 14
Возраст 5 л. 9 мес, 13 л., 8 л. 3 мес., 13 л. 1 мес. , 16 л., 17 л., 17 л. 10 мес. ,
Пол жен жен муж муж муж муж муж
Наличие другой патогенной или вероятно патогенной мутации +
Наличие гематурии более 100 эритроцитов в п/з + + + +
Возраст выявления гематурии, мес 56 18 83 53 80 60 156
Возраст выявления макрогематурии, мес ? 84
НСТ, возраст выявления, мес - - - 36 - - -
Возраст выявления - - - - 156 - -
«-» означает «не выявлено»
протеинурии
Возраст, когда протеинурия превысила 500 мг/сут
Возраст выявления АГ, лет 5 - 7 - 14 16 17
Начало терапии эналаприлом - 13 7 10 7 17 17
Семейный анамнез гематурии + + + + + + +
Семейный анамнез нарушений слуха на фоне гематурии или синдрома Альпотра да
Семейный анамнез тХПН, возраст 55 лет
Различия пациентов с мутацией 624 глицина от других пациентов с Х-сцепленным наследственным нефритом собраны в таблице 3.4.
Таблица 3.4. Клинические показатели пациентов с мутацией СОЬ4Л5 с.187Ш>А, p.(Gly624Asp) в сравнении с другими пациентами с Х-сцепленным наследственным
нефритом14.
Пациенты с мутацией COL4A5 p.(Gly624Asp) Пациенты с другими мутациями гена COL4A5 Все пациенты с мутациями гена COL4A5
да нет да нет да нет
Наличие макрогематурии к возрасту 5 лет 0 5 13 17 13 22
Наличие протеинурии (>100 мг/сут) для пациентов не моложе 5 лет 0 6 25 5 25 11
14 Пациенты, по которым не было данных по определенным показателям, исключались из анализа соответствующих показателей. Пациент Ьа20, несущий помимо замены 624 глицина другую мутацию, из анализа исключен.
Наличие двустороннней НСТ для пациентов не моложе 5 лет 1 5 13 16 14 21
Возраст обнаружения гематурии -15 ( мальчики (в скобках -среднеквадратичное отклонение) 88 мес (47,1) 31,9 мес (27,5) 42,4 мес (36,8)
На основании представленных в таблице данных, а также описанных выше отличий, мы предлагаем алгоритм по клинико-лабораорному выявлению пациентов, несущих мутацию 624 глицина в белке Со14а5. Алгоритм может быть применен к пациентам, для которых:
1. Клиническая картина заболевания соответствует синдрому Альпорта
2. Есть семейный анамнез синдрома Альпорта и/или гематурии, не связанной с другим выявленным заболеванием
3. Паттерн наследования в семье соответствует Х-сцепленному. Критерии:
а. У мужчин заболевание протекает тяжелее, чем у женщин
б. Нет передачи от отца к сыну
в. В семейном анамнезе (в основном, у мужчин) может быть тХПН, тугоухость, лентиконус или макулопатия (а может и не быть)
Алгоритм построен на выявлении пациентов с легкой формой СА на основании возраста дебюта гематурии (поздний), протеинурии (низкая) и других показателей. Подана заявка на патент по данному алгоритму.
Вероятно патогенный генетический вариант COL4A5 c.2605G>A, p.(Gly869Arg)
Мутация СОЬ4Л5 c.2605G>A, р.^1у869А^) является распространенной среди пациентов с СА в Европе, США и Китае (см. разд. 1.3.7). В настоящем исследовании она выявлена у двух неродственных пациентов в российской популяции с предполагаемым диагнозом наследственного нефрита. Согласно классификации [140], данный генетический вариант может быть отнесен к категории вероятно патогенных. Он относящийся к классу
15 Статистика по девочкам не указана ввиду небольшого размера выборки - 2 чел
характерных для наследственного нефрита замен глицина в коллагеновом домене COL4A5, является редким в популяции (отсутствует в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов). Данный вариант картируется на высококонсервативную позицию генома (PhyloP 8,958); кроме того, его патогенность предсказывается программи Polyphen2 (1,0), SIFT (0,0) и MutationTaster (1,0).
Данный генетический вариант выявлен у пациента KapG21 17 лет и 2 мес. из Москвы и у пациентки BariA23 11 лет и 1 мес. из Московской области.
У пациента BariA23 вариант находится в гемизиготном состоянии, в связи с чем предполагается более тяжелое течение заболевание. Кроме того, у него выявлен вариант гена COL4A3 c.1992delT, p.(Gly665Alafs*82) в 27 экзоне. Последний вариант, несмотря на то, что является делецией, имеет довольно большую популяционныю частоту - 8 случаев на 60 тыс человек в популяционной выборке ExAC (из которой, согласно заявленной информации [142], были максимально исключены испытуемые с наследственными заболеваниями, проявляющимися в детстве), в связи с чем благодаря обнаружению его вместе с мутацией гена COL4A5 мы смогли отнести его к вероятно непатогенным вариантам, во всяком случае в гетерозиготном состоянии в отношении аутосомно-доминантного синдрома Альпорта (см. ниже таблицу 3.11).
У пациентки BariA23, в связи с гетерозиготным состоянием данного генетического варианта, предполагается более легкое течение заболевания. Клиническая картина у обоих пациентов представлена в таблице 3.5. Отметим, что у обоих пациентов гематурия была выявлена несколько раньше, чем в среднем у пациентов с X-сцепленным типом СА как по стране (3 г. 7 мес для мальчиков и 1 г. 8 мес для девочек), так и по Московскому региону (3 г 7 мес. для мальчиков и 1 г. 7 мес для девочек), а также раньше, чем в среднем у пациентов с глициновыми заменами (3 года и 6 мес. - см. разд. 3.6.1).
Таблица 3.5. Клиническая картина, наблюдаемая при синдроме Альпорта, вызванном мутацией гена СОЬ4Л5 е.26050>Л, р.(Иу869Лг§) у неродственных друг другу подростков мужского и женского пола.
КарС21 БапЛ23
Возраст 17 лет 11 лет
Пол муж жен
Наличие гематурии > 100 эритроцитов в п/з + +
Возраст выявления гематурии 2 г. и 7 мес. 1 г. и 0 мес
Возраст выявления макрогематурии 2 г. и 7 мес. 16
НСТ, возраст выявления 14 л. и 8 мес. -
Возраст выявления протеинурии 13 л. -
Возраст, когда протеинурия превысила 500 мг/сут 13 л не превысила
Возраст выявления АГ 10 л. -
Семейный анамнез у деда -неуточненное заболевание почек. гематурия у бабушки по линии отца. Без тХПН.
3.4.3. Патогенные и вероятно патогенные варианты нуклеотидной последовательности, описываемые нами впервые Ген COL4A5
В Таблице 3.6 приведены патогенные и вероятно патогенные мутации гена СОЬ4Л5, выявленные нами впервые и, согласно имеющейся у нас информации, ранее не описанные в мировой научной литературе и в базах данных открытого доступа.
16 «-» здесь и далее означает «не выявлено»
Генетический вариант аллельное состояние Пробанд патогенность варианта Критерии Экзон
c.-3_14del гетерозиготное Li28 патогенный PVS1, PM2, PP4 1
c.102delA, p.(Pro34fs) гетерозиготное BujM12 патогенный PVS1, PM2, PP4 2
c.440G>A, p.(Gly147Glu) гетерозиготное AnisT24 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 8
c.463A>T, p.(Lys155Ter) гетерозиготное Nik18 патогенный PVS1, PM2, PP4 8
c.(546+1_610-1)_ (780+1_781-1) del геми-зиготное SharCh18 вероятно патогенный PVS1, 17 PM2 , PP4 10-13
c.671G>A, p.(Gly224Glu) гетерозиготное ParE12 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 12
c.680G>C, p.(Gly227Ala) гетерозиготное GazA11 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3,PP4 12
c.865G>T, p.(Gly289Cys) гетерозиготное Kir29 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 15
c.936+2T>A геми-зиготное ShamM18 патогенный PVS1, PM2, PP4 16-17
c.1210G>T: p.(Glu404Ter) гетерозиготное NikD17 патогенный PVS1, PM2, PP4 20
c.1424-2A>G гетерозиготное GurK11 патогенный PVS1, PM2, PP4 22
c.1799G>T, p.(Gly600Val) геми-зиготное BonA1 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 25
c.(1948+1_1949-1)_ геми-зиготное ProA17 вероятно патогенный PVS1, PM2', PP4 26-28
17 Критерий PM2' вводится в разделе 3.5.8
(2244+1_2245-1) del
c.2041G>A, p.(Gly681Ser) геми-зиготное SabI14 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 26
c.2396-1G>C гетерозиготное ZahS22 патогенный PVS1, PM2, PP4 30
c.2678G>A, p.(Gly893Asp) геми-зиготное BarE5 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 32
c.3098G>A, p.(Gly1033Asp) гетерозиготное ParP76 вероятно патогенный PM1, PM2, PP1, PP3, PP4 35
c.3265G>A, p.(Gly1089Arg) геми-зиготное DanA4 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 37
c.3293G>A, p.(Gly1098Asp) геми-зиготное TerD32 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 37
c.(3373+1_3374-1)_ (3553+1_3554-1) del геми-зиготное KalD17 вероятно патогенный PVS1, PM2', PP4 38-39
c.3704G>A, p.(Gly1235Asp) геми-зиготное SemS37 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 41
c.4306_4307delC C, p.(Arg1436fs) геми-зиготное ChiD23 патогенный PVS1, PM2, PP4 47
Все нижеописанные генетические варианты не обнаружены в базах данных генетических вариантов: ClinVar, LOVD, ARUP (данные за март 2017 года), а также HGMD (данные на март 2016 года).
Генетический вариант COL4A5 c.-3_14del был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 16 лет и 1 месяца из Республики Калмыкии с макрогематурией18, протеинурией и тонкими базальными мембранами по данным пункционной нефробиопсии (проведена в возрасте 7 лет). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
18 Здесь и далее в разделе 3.4.3 у всех описываемых пациентов была выявлена стойкая гематурия
1. PVS1: делеция затрагивает стартовый кодон белка
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента соответствует наследственному нефриту
Семейный анамнез гематурии отсутствует. У пациентки к 16 годам не выявлено тугоухости, однако диагностирован правосторонний тубоотит. Исследования на наличие лентиконуса или макулопатии не проводилось, однако офтальмолог выявил прогрессирующую миопию средней степени, склеральный конус и хориоретинальную дистрофию. В 6 лет выявлена гипертензия, в 7 лет - протеинурия.
Генетический вариант COL4A5 c.102delA, p.(Pro34Profs*9) был выявлен в
гетерозиготном состоянии у пациентки 4 лет и 10 месяцев из Московской области с гематурией
19
(менее 100 эритроцитов в поле зрения) и семейным анамнезом гематурии и тХПН. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сдвига рамки считывания
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствует синдрому Альпорта Гематурия у пациентки была обнаружена в 3 года, к 4 годам макрогематурии,
протеинурии или артериальной гипертензии выявлено не было. У отца пациентки -микрогематурия с раннего возраста, двусторонняя НСТ, тХПН в 30 лет. Ему, по всей видимости, ошибочно, был поставлен диагноз «мезангиопролиферативный гломерулонефрит». У бабушки по линии отца - тХПН в 30 лет с летальным исходом в 57 лет.
Генетический вариант COL4A5 c.440G>A, p.(Gly147Glu) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 4 лет и 3 месяцев из Республики Мордовии со стойкой гематурией (менее 100 эритроцитов в поле зрения) и семейным анамнезом синдрома Альпорта у отца. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
19 здесь и далее подразумевается, что не было достоверно диагностировано иных заболеваний, кроме СА/БТБМ, которые могли бы вызвать гематурию у родственников
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 6,42), патогенный по данным предсказания патогенности in silico (Polyphen2 0,88; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
У пациентки к возрасту 4 лет не выявлено нарушений слуха, протеинурии или гипертензии. Ее отец перенес тХПН в возрасте 35 лет.
Генетический вариант COL4A5 c.463A>T, p.Lys155Ter был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 17 лет и 11 месяцев из Архангельской области со стойкой гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения), семейным анамнезом тХПН, двусторонней НСТ, протеинурией, превышающей 500 мг/сут. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: нонсенс-мутация
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствует синдрому Альпорта Гематурия была выявлена у пациентки в 18 месяцев (эпизодов макрогематурии до
настоящего момента не зафиксировано), двусторонняя НСТ - в 16 лет. Протеинурия была выявлена в 18 месяцев, а в 16 лет превысила 500 мг/сут. В 13 лет диагностирована артериальная гипертензия. Выявленная патология зрения: пигментный невус конъюктивы. Синдром
Альпорта был ранее диагностирован у отца пациентки, возраст тХПН у него составил 24 года.
20
Делеция экзонов 10-13 гена COL4A5 c.(546+1_610 -1)_
(783+1_784-1)del была выявлена у пациента SharCh18 из Республики Калмыкии 17 лет 8 месяцев с подтвержденной до проведения генетического исследования патологией коллагена IV типа. У испытуемого была зафиксирована стойкая гломерулярная гематурия (дизморфных эритроцитов 85%), семейный анамнез гематурии, двусторонняя НСТ; коллагенопатия была подтверждена электронной микроскопией нефробиоптата, проведенной в 12 лет и зафиксировавшей истончение гломерулярной базальной мембраны почки. Данный генетический вариант классифицируется нами как вероятно патогенный:
1. PVS1: делеция нескольких экзонов
2. PM2': предполагается минимальная популяционная частота данной делеции, точные популяционные данные отсутствуют (см. разд. 3.4.8)
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствует синдрому Альпорта Гематурия была выявлена у пациента в 2 года (менее 100 эритроцитов в поле зрения;
эпизодов макрогематурии не отмечено). Снижение слуха отмечалось с 11 лет, при этом
20 Предположительно, десятый экзон также делетирован, однако, в связи с его низким покрытием генной панелью у всех пациентов, не исключается и делеция 11-13 экзонов.
двусторонняя НСТ диагностирована в 17 лет и 2 месяца. Данные осмотра офтальмолога: Ds: анизометропия, OS - миопия слабой степени. Протеинурия выявлена в 10 лет и превысила порог в 500 мг/сут в 13 лет, артериальная гипертензия диагностирована в 11 лет. Матери пациента был поставлен диагноз «гломерулонефрит» с эпизодами макрогематурии, протеинурия до 0,25 г/л. Дед по линии матери с 45 лет страдал тугоухостью без мочевого синдрома (рисунок 3.7, а). По словам матери, тугоухость отмечалась у всех родственников деда пациента по линии матери.
Генетический вариант COL4A5 c.671G>A, p.(Gly224Glu) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 15 лет 10 месяцев из Нижегородской области. У испытуемой была выявлена макрогематурия, а ее родственники страдали гематурией и тХПН. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 9,22), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 0,999; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия была выявлена у пациентки в 3 года и 10 месяцев, протеинурия (не более 500
мг/сут) - в 4 года, артериальная гипертензия - в 15 лет. К 15 годам у испытуемой не было выявлено нарушений слуха, из нарушений зрения, выявленных при стандартном осмотре окулиста - миопия. Семейный анамнез почечной недостаточности осложнен по материнской линии (рисунок 3.7, б): тХПН у деда в 24 года, у его братьев - в 35 и 60 лет, у самой матери -эпизодическая микрогематурия.
Генетический вариант COL4A5 c.680G>C, p.(Gly227Ala) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 3 лет из Кабардино-Балкарии. У испытуемой была выявлена гематурия, у ее брата - гематурия и протеинурия. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 9,22), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 0,996; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
Генетический вариант COL4A5 c.865G>T, p.(Gly289Cys) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки 4 лет и 2 месяцев из Московской области. У испытуемой выявлена гематурия, зафиксирован семейный анамнез гематурии. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 8,27), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия выявлена у пациентки в возрасте 2 лет (более 100 эритроцитов в поле зрения;
эпизодов макрогематурии не отмечено). Нарушений слуха, протеинурии и АГ не выявлено. У матери и у сибса выявлена микрогематурия.
Генетический вариант COL4A5 c.936+2T>A был выявлен в гемизиготном состоянии у пациента ShamM18 10 лет и 10 месяцев из Москвы. У пациента выявлена макрогематурия и катаракта, по данным электронной микроскопии нефробиоптата (возраст нефробиопсии 5 лет) -наличие утонченных и утолщенных участков БМК. В семейном анамнезе - гематурия. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сайта сплайсинга
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия была выявлена у пациента в возрасте 2 лет и 2 месяцев, первый эпизод
макрогематурии зафиксирован в 3 года. Доля дизморфных эритроцитов составляет более 85%. Протеинурия (более 500 мг/сут) выявлена в возрасте 3 лет. Нарушений слуха и АГ не зафиксировано. У матери диагностирован хронический гломерулонефрит, изолированный мочевой синдром, сохранная функция почек.
Генетический вариант COL4A5 c.1210G>T: p.(Glu404Ter) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки NikD17 16 лет и 3 месяцев из Московской области. У испытуемой выявлена гематурия, а также семейный анамнез СА. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев: 1. PVS1: нонсенс-мутация
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия (более 100 эритроцитов в поле зрения; эпизодов макрогематурии не
отмечено) впервые выявлена у пациентки в возрасте 6 месяцев. В 12 лет выявлена протеинурия (не превысила 500 мг/сут) и АГ. В 12 лет также выявлена кондуктивная тугоухость (при этом в последующих исследованях она подтверждена не была). У отца выявлен СА, проявляющийся тугоухостью, АГ и тХПН в возрасте до 34 лет.
Генетический вариант COL4A5 c.1424-2A>G был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки GurK11 из Москвы 17 лет и 8 месяцев с гематурией, семейным анамнезом гематурии, ангиопатией сетчатки и утончением БМК по данным электронной микроскопии нефробиоптата (проведена в 8 лет, диагноз - МЗГН на фоне БТБМ). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сайта сплайсинга
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия выявлена у пациентки в 5 месяцев, макрогематурия и протеинурия (более
500 мг/сут) - в 2 года и 6 месяцев. АГ и нарушений слуха не обнаружено. У бабушки по линии матери обнаружена непостоянная гематурия, у матери - гематурическая форма гломерулонефрита, у сибса - гематурия.
Генетический вариант COL4A5 c.1799G>T, p.(Gly600Val) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента BonAl из Воронежа 11 лет и 4 месяцев с макрогематурией, семейным анамнезом гематурии. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 9,12), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия у пациента обнаружена в год и 7 мес., макрогематурия - в 3 года и 9 мес.
Доля дизморфных эритроцитов составила 65%. АГ и нарушений слуха не выявлено. Протеинурия обнаружена в 11 лет и 4 мес. (менее 500 мг/сут). Семейный анамнез заболеваний почек отягощен по материнской линии: у матери и у бабушки со стороны матери выявлена
микрогематурия (до 10 эритроцитов в поле зрения), у брата бабушки - гематурия и НСТ, у его дочери - гематурия (рисунок 3.7, в).
Делеция экзонов 26-28 гена COL4A5, c.(1948+1_1949-1)_ (2244+1_2245-1)del, выявлена в гемизиготном состоянии у пациента ProA17 из Тамбовской области 11 лет и 2 мес. У испытуемого выявлена гематурия (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии), двусторонняя НСТ (с 6 лет и 5 мес.). Наследственный нефрит был подтвержден характерными для СА нарушения БМК по данным электронной микроскопии нефробиоптата (возраст проведения пункционной нефробиопсии 10 лет). Генетический вариант был классифицирован как веротяно патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: делеция нескольких экзонов
2. PM2': предполагается минимальная популяционная частота данной делеции, точные популяционные данные отсутствуют (см. разд. 3.4.8)
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия обнаружена в 2,5 года, протеинурия - в 7 лет, АГ не выявлено. У бабушки
пациента по линии матери выявлена протеинурия (130 мг/л), у матери - гематурия до 25 эритроцитов в поле зрения и пиелонефрит во время беременности (рисунок 3.7, г).
Генетический вариант COL4A5 c.2041G>A, p.(Gly681Ser) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента SabI14 из Северной Осетии 17 лет с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии) и двусторонней НСТ, а также утонченными БМК и IgA-нефропатией по данным электронной микроскопии нефробиоптата (возраст проведения пункционной нефробиопсии - 15 лет). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 2,24), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Возраст выявления гематурии у пациента составил 3 года и 8 мес, тугоухости - 12 лет.
Испытуемый также страдает спазмом аккомодации, протеинурией (обнаружена впервые в 3 года и 8 мес., в 12 лет превысила 500 мг/сут) и АГ (с 13 лет). Данные семейного анамнеза отсутствуют.
Генетический вариант COL4A5 c.2396-1G>C выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки ZahS22 из Московской области 17 лет с макрогематурией, семейным анамнезом гематурии и МЗГН на фоне истончения БМК по данным электронной микроскопии
нефробиоптата (нефробиопсия проведена в возрасте 10 лет). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сайта сплайсинга
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Возраст выявления гематурии (микро-) у пациентки составил 3,5 мес., в возрасте 6 лет у
нее диагностирована кондуктивная тугоухость (при этом в последующих измерениях нарушений слуха не выявлено) и протеинурия (она к 17 годам не превысила 500 мг/сут), АГ обнаружена в возрасте 9 лет. Семейный анамнез отягощен гематурией, матери был поставлен диагноз МЗГН.
Генетический вариант COL4A5 c.2678G>A, p.(Gly893Asp) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента BarE5 из Московской области пятнадцати лет с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии), гиперметропическим астигматизмом, двусторонней НСТ и семейным анамнезом СА. Дигноз наследственного нефрита у испытуемого был подтвержден методом электронной микроскопии нефробиоптата (возраст взятия анализа 8 лет). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 8,52), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Возраст выявления гематурии и протеинурии у пациента составил 4 года и 10 мес. (а в 6
лет протеинурия превысила 500 мг/сут), НСТ - 9 лет, АГ - 10 лет. В семейном анамнезе - СА у матери (тХПН в 30 лет) и брата (тХПН в 10 лет).
Генетический вариант COL4A5 c.3098G>A, p.(Gly1033Asp) выявлен в гетерозиготном состоянии у пациентки ParP76 из Москвы 8 лет и 3 мес. с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии) и семейным анамнезом СА. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP1: косегрегация генетического варианта с заболеванием в семье
4. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 8,97), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
5. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
Гематурия была выявлена у пациентки в 2 мес., протеинурия - в 4 мес. (более 500 мг/сут), АГ - в 5 лет. Нарушений слуха не выявлено. СА диагностирован также у матери (микрогематурия, протеинурия 300 мг/сут) и ее брата (тугоухость, протеинурия до 8,8 г/сут, ангиопатия сетчатки; тХПН в 26 лет) - рисунок 3.7, д.
Генетический вариант COL4A5 c.3265G>A, p.(Gly1089Arg) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента DanA4 из Московской области 16 лет и 4 мес. с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии), семейным анамнезом гематурии и истончением БМК по данным электронной микроскопии нефробиоптата (исследование проведено в возрасте 16 лет). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 6,94), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия выявлена в 4 года, АГ - в 16 лет. Протеинурии и нарушений слуха не
выявлено. Доля дизморфных эритроцитов у пациента составляет 79%. Гематурия также выявлена у маминой тети и ее сыновей (рисунок 3.7, е).
Генетический вариант COL4A5 c.3293G>A, p.(Gly1098Asp) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента TerD32 из Московской области 18 лет с макрогематурией, катарактой и утолщениями БМК (без истончения) по данным электронной микроскопии нефробиоптата (исследование проведено пациенту в возрасте 15 лет, выявлен также МЗГН). Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 6,97), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 1; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
Гематурия у пациента была выявлена в 3 года, первый эпизод макрогематурии - в 3 года и 4 мес. Протеинурия была выявлена в 10 лет, а в 14 лет и 5 мес. она превысила 500 мг/сут. Семейный анамнез испытуемого гематурией не отягощен.
Делеция экзонов 38-39 гена COL4A5 c.(3373+1_3374-1)_(3553+1_3554-1) del выявлена в гемизиготном состоянии у пациента KalD17 из Тверской области 13 лет и 3 мес. с гематурией (менее 100 эритроцитов в поле зрения), гиперметропическим астигматизмом и двусторонней НСТ и подтверждением СА методом электронной микроскопии нефробиоптата (возраст проведения анализа 7 лет). Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: делеция нескольких экзонов
2. PM2': предполагается минимальная популяционная частота данной делеции, точные популяционные данные отсутствуют (см. разд. 3.4.8)
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
Гематурия была впервые выявлена у пациента в 1,5 года, протеинурия (более 500 мг/сут) - в 4 года и 3 мес., двусторонняя НСТ и АГ - в 7 лет. Семейный анамнез гематурией не отягощен.
Генетический вариант COL4A5 c.3704G>A, p.(Gly1235Asp) выявлен в гемизиготном состоянии у пациента SemS37 из республики Марий Эл 15 лет и 4 мес. с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения, без эпизодов макрогематурии), двусторонней НСТ, спазмом аккомодации и семейным анамнезом СА. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A5
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 9,34), патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 0,97; SIFT 0; MutationTaster 1)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия была выявлена у пациента в 3 года, протеинурия (более 500 мг/сут) - в 5 лет,
двусторонняя НСТ - в 6 лет, АГ - в 14 лет. Семейный анамнез отягощен СА с ранним возрастом развития тХПН у ряда родственников мужского пола по материнской линии (рисунок 3.7, ж), средний возраст тХПН составляет 17 лет.
Генетический вариант COL4A5 c.4306_4307delCC, p.(Arg1436fs) выявлен в гемизиготном состоянии у пациентаСЫВ23из Белгородской области 3 лет с макрогематурией, гиперметропическим астигматизмом и семейным анамнезом тХПН. Частота данного варианта в
популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сдвига рамки считывания
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта Гематурия (макро-) была выявлена у пациента в возрасте 2 лет и 7 мес. На момент
последнего обследования, у пациента не было выявлено нарушений слуха, протеинурии и АГ. В семейном анамнезе тХПН в 32 и 34 года у бабушки и прадеда по материнской линии, соответственно (рисунок 3.7, з).
1.1 - Тугоужкть с 45 лет
II. 2 - Гематурия, протеинурия
L1-L2-
тХПН тХПН
24 года 35 лет
1.3-тХПН 60 лет П. 2 - гематурия
1.1 - тХПН 20 лет Ш.З - тХПН 15 лет Ш.9- здорова IV. 1 - НСТ. тХПН 16 лет
К. 2-НСТ
ШЗ - без тугсужюи
TV.fi IV.7 - НСТ
1.1 - тХПН 32 года, тугсужюь П.4 - тХПН 34 года, ОНМК Рисунок 3.7. Медицинские родословные некоторых пациентов с Х-сцепленным типом наследования СА. Черными квадратами/кругами отмечены больные с СА, белыми кругами с
точной внутри - асимптоматические носительницы, черными треугольниками - спонтанные аборты, стрелками - пробанды, восклицательными знаками - индивидуумы, помимо пробандов, обследованные в отделении нефрологии. А, пациент 8ЬагСЫ8; Б, пациентка РагЕ12; В, пациент ВопА1; Г, пациент РгоА17; Д, пациентка РагР76; Е, пациент БапА4; Ж, пациент 8еш837; З, пациент СЫБ23.
Ген СОЬ4Л4
В гене СОЬ4Л4 патогенные/вероятно патогенные мутации выявлены у двух пациентов: 2а§Р8 и Беп25. В случае первого пациента, мутация находится в гомозиготном состоянии и описывается нами впервые (таблица 3.7). В случае второго пациента, выявлены 2 ранее описанные мутации гена СОЬ4Л4 в гетерозиготном состоянии (подробное описание случая см. в разделе 3.4.7).
Таблица 3.7. Патогенные и вероятно патогенные мутации гена СОЬ4Л4, описываемые нами впервые
Генетический вариант аллельное состояние пробанд патогенность варианта Критерии Экзон
c.2025_2031delG CATGGCinsAG AATG Гомозиготное ZagP8 патогенный PVS1, PM2, PP4 26
Генетический вариант COL4A4 c.2025_2031delGCATGGCinsAGAATG,
p.(Arg675Argfs*25) был выявлен у пациентки 7 лет из Республики Дагестан с гломерулярной макрогематурией, протеинурией, семейным анамнезом синдрома Альпорта и подтверждением данного диагноза методом пункционной нефробиопсии. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как патогенный на основании следующих критериев:
1. PVS1: мутация сдвига рамки считывания
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют синдрому Альпорта
Семья пациентки была образована в результате близкородственного брака, где мужчина взял в жены свою троюродную племянницу (рисунок 3.8). Родители являются носителями данной мутации в гетерозиготном состоянии, и страдают только гематурией. При этом синдром Альпорта диагностирован и генетически подтвержден также у двух братьев испытуемой ZagP8.
VI - острое нарушение мозгового кровообращения, 38 лет \т.4, \г_5 -гематурия Рисунок 3.8. Аутосомно-рецессивное наследование синдрома Альпорта в семье пациентки 2а§р8, образованной в результате близкородственного брака (указан двойной линией). Пациентка (указана стрелкой), ее сибсы и родители прошли генетическое обследование. Ее родители - носители мутации в гетерозиготном состоянии.
У пациентки ZagP8 выявлен гиперметропический астигматизм, кондуктивная тугоухость (в 6 лет). По результатам пункционной нефробиопсии, проведенной довольно рано - в 6 лет, -уже видны не толко истончения базальной мембраны, но и утолщения, а также нарушения lamina densa. Протеинурия выявлена с 4 лет 9 месяцев, а уже в 6 лет ее значение превысило 500 мг/сут. Артериальной гипертензии (как и тХПН) пока не выявлено. У брата пациентки возраста 5 лет макрогематурия и протеинурия выявлены в 2 года и 10 месяцев, односторонняя НСТ и артериальная гипертензия - в 5 лет. Клиническая картина, как и генетическая (мутация сдвига рамки считывания в гомозиготном состоянии) говорят о тяжелой форме заболевания у пациентки и ее братьев, предполагая весьма ранний возраст тХПН.
Ген СОЬ4А3
В гене СОЬ4Л3 вероятно патогенные генетические варианты были выявлены у четверых пациентов, патогенных вариантов выявлено не было. Все четыре генетических варианта являются глициновыми заменами, выявленными в гетерозиготном состоянии, три из них ранее не были описаны в литературных источниках и базах данных (таблица 3.8). Четвертая же
Таблица 3.8. Патогенные и вероятно патогенные мутации гена СОЬ4Л3, описываемые нами впервые
Генетический вариант Аллельное состояние Пробанд Патогенность варианта Критерии Экзон
c.1495G>A: p.(Gly499Arg) гетерозиготное KuzN16 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 23
c.1864G>A, p.(Gly622Arg) гетерозиготное Mir21 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 26
c.3247 G>C, p.(Gly1083Arg) гетерозиготное Isa20 вероятно патогенный PM1, PM2, PP3, PP4 38
Генетический вариант COL4A3 c.1495G>A, p.(Gly499Arg) был выявлен у пациентки KuzN16 из Московской области 11 лет и 4 месяцев с двусторонней НСТ, протеинурией и семейным анамнезом гематурии. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A3
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: консервативный нуклеотид (PhyloP 4,95), патогенный по данным предсказания патогенности in silico (Polyphen2 1; SIFT 0)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют СА/БТБМ
У пациентки гематурия выявлена в 3 года и 4 месяца (эпизодов макрогематурии до настоящего времени не зафиксировано), двусторонняя НСТ - в 11 лет и 4 месяца. Протеинурия зафиксирована в возрасте 10 лет и 6 месяцев, при этом к 11 годам она не превысила 500 мг/сут, артериальной гипертензии зафиксировано также не было. В семейном анамнезе (рисунок 3.9, а) - небольшая гематурия у отца и у бабушки по линии отца (5-7 эритроцитов в поле зрения), без тХПН. У отца выявлена та же мутация, что и у дочери, в гетерозиготном состоянии.
А
I
Б
2
II
■
О
о,
2
III
II
■
1.2 - гематурия П. 1 - гематурия
1.1 - гематурш, протеинурия
Рисунок 3.9. Наследование патологии гена COL4A3. А, пациентка KuzN16 и ее семья: у пациентки и отца выявлена мутация COL4A3 p.(Gly499Arg) в гетерозиготном состоянии. Б., пациент Mir21 и его семья. У пациента была выявлена мутация COL4A3 p.(Gly622Arg) в гетерозиготном состоянии.
Генетический вариант COL4A3 c.1864G>A, p.(Gly622Arg) был выявлен в гетерозиготном состоянии у пациента Mir21 из Томска 16 лет и 8 месяцев с гематурией (более 100 эритроцитов в поле зрения), протеинурией, семейным анамнезом гематурии и подтвержденным методом пункционной нефробиопсии (проведена в возрасте 16 лет) истончением базальной мембраны клубочков. Частота данного варианта в популяционных базах данных ExAc, ESP и 1000 геномов равна нулю. Данный вариант был классифицирован нами как вероятно патогенный на основании следующих критериев:
1. PM1: является заменой глицина в коллагеновом домене COL4A3
2. PM2: отсутствует в базах данных ExAc, ESP, 1000 геномов
3. PP3: весьма консервативный нуклеотид (PhyloP 1,43), патогенный/предположительно патогенный по данным предсказания in silico (Polyphen2 0,59; SIFT 0)
4. PP4: фенотип пациента и семейный анамнез соответствуют СА/БТБМ
У пациента гематурия выявлена в 6 лет (со слов матери - были эпизоды макрогематурии), нарушений слуха (а также зрения, при стандартном осмотре окулиста) не выявлено. Протеинурия выявлена в 16 лет, она не преодолела порога в 500 мг/сут. Артериальной гипертензии не зафиксировано. У отца выявлена микрогематурия и протеинурия до 300 мг/сут. Стоит отметить, что подобный тип наследования - от отца к сыну (рисунок 3.9, Б) исключает наиболее распространенную X-сцепленную форму наследственного нефрита, что согласуется с результатом генетического исследования.
Для независимого подтверждения генетических вариантов COL4A3, COL4A4 и COL4A5, выявленных у исследованных пациентов, из двадцати девяти вариантов, ранее не описанных в
литературе и базах данных, нами были случайным образом отобраны шесть. Пять вариантов -однонуклеотидные замены - были верифицированы методом секвенирования по Сэнгеру (приложение В). Делеция экзонов гена СОЬ4Л5 у пациента Ма1Ь015 была верифицирована методом ПЦР-амплификации экзона 51 в лаборатории ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург. Кроме того, варианты с неясной клинической значимостью СОЬ4Л3 е.30_53ёе1, р.(Уа111_ЬеиШе1) и СОЬ4Л3 е.4710Т>0, р.(СуБ1570Тгр) были верифицированы методом секвенирования по Сэнгеру в МГНЦ РАМН, г. Москва.
3.4.4. Патогенные и вероятно патогенные варианты, найденные в выборке российских пациентов и ранее описанные в литературных источниках Ген СОЬ4Л5
Патогенные и вероятно патогенные генетические варианты гена СОЬ4Л5 приведены в таблице 3.9 наряду с литературными источниками, ранее их описавшими.
Таблица. 3.9. Патогенные и вероятно патогенные варианты гена СОЬ4Л5, обнаруженные на выборке российских пациентов и ранее описанные литературными источниками
Генетический вариант Эк- зон Аллельное состояние Пробанд Патоген- ность варианта Критерии Ранее описан в (источник)
с.(?_1)_ (81+1_82-1)ёе1 1 гемизиготное КгавБ2б вероятно патогенный РУБ1, РР4, 21 РМ2'21 [143,144]
е.71бО>А, р.(01у23901и) 13 гемизиготное ШР27 вероятно патогенный РМ1, РМ2, РР3, РР4 [88]
е.7900>С, р.(Иу264Аг§) 14 гетерозиготное ОигА вероятно патогенный РМ1, РМ2, РР3, РР4, РР5 [88]
е.1397С>А, р. (01у46601и) 21 гемизиготное Та§Е10 вероятно патогенный РМ1, РМ2, РР1, РР4 [102]
21 Критерий РМ2' вводится в разделе 3.5.8
c.1871G>A, 25 гемизиготное, ShukV16, патогенный PS4, [51,145]
p.(Gly624Asp) гетерозиготное MisD26, MolI37, OrlR34, Isa20, KorS18, LevN14 PM1, PM2, PP3, PP4, PP5
c.2041+1G>T 2627 гетерозиготное BarU10 патогенный PVS1, PM2, PP3, PP4 [62,146]
c.2146+1G>A 27- геми- LebF3 патогенный PVS1, База
28 зиготное PM2, PP4 данных ARUP [147]
c.2210G>A, 28 гетеро- KrasA26 вероятно PM1, База
p.(Gly737Asp) зиготное патогенный PM2, PP3, PP4 данных LOVD [148]
c.2395+1G>A 2930 геми-зиготное LegA25 патогенный PVS1, PM2, PP4 [149]
c.2605G>A, 31 гетеро- KapG21, вероятно PM1, [89,90]
p.(Gly869Arg) зиготное BariA23 патогенный PM2, PP3, PP4
c. 3544G>A, 39 геми- MakV35 вероятно PM1, База
p. зиготное патогенный PM2, данных
(Gly1182Ser) PP3, PP4 LOVD [148]
c.3695G>T, 41 гемизиготное KamA1 вероятно PM1, [147]
p.(Gly1232Val патогенный PM2,
) PP3, PP5
с.372Ш>Т, р. 41 гемизиготное ВигМ36 вероятно РМ1, [6,90,143,1
(Иу1241СуБ) патогенный РМ2, РБ4, РР3, РР5 50]
с.(4069+1_40 45- гемизиготное МшЬС15 патогенный РУБ1, [143]
70-1)_ 51 РМ2',
(5058+1_?) РР4
с.50300>А, р. 51 гемизиготное 2иеУ49 вероятно РМ2, [104]
(Аг§1677Ип) патогенный 23 РБ4, РР3, РР4
Стоит отметить, что генетические варианты СОЬ4Л5 с.2146+Ш>А, с.2395+Ш>А и с. 35440>А, р.(01у1182Бег) были описаны в мировой научной литературе и базах данных совсем недавно: в момент анализа данных пациентов они опубликованы еще не были. Это говорит об ожидаемо довольно высокой скорости описания новых генетических вариантов и классификации их по степени патогенности.
Гены СОЬ4Л3, СОЬ4Л4
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.