Роль границ в установлении специфических взаимодействий между энхансерами и промотором гена Abd-B Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Постика Николай Евгеньевич

• Постика Николай Евгеньевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Постика Николай Евгеньевич

Введение

Актуальность работы

Цель и задачи исследования

Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад соискателя

Степень достоверности и апробация результатов

Структура и объем работы результатов

1 Обзор литературы

1.1 Цис-регуляторные элементы

1.1.1 Идентификация цис-регуляторных элементов

1.1.2 Промоторы

1.1.3 Энхансеры

1.1.4 Инсуляторы

1.2 Пространственная организация хроматина

1.2.1 Топологически ассоциированные домены млекопитающих

1.2.2 ТАДы дрозофилы

1.3 Гомеозисные гены как модель для исследования дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами

1.3.1 Нох-гены

1.3.2 Bithorax-комплекс Drosophila melanogaster

1.3.3 Модели регуляции генов Ь/йогах-комплекса

2 Материалы и методы

2.1 Получение платформы МсраиР при помощи CRISPR/Cas9-индуцированной гомологичной рекомбинации

2.2 Делеция IаЬ-4 при помощи CRISPR/Cas9-индуцированной гомологичной рекомбинации

2.3 Получение конструкций для встраивания в платформу МсраПР

2.4 Получение конструкций для исследования инсуляторных свойств СТСР4 в трансгенных модельных системах

2.5 Генетические скрещивания и фенотипический анализ трансформантов

2.6 Иммунопреципитация хроматина

2.7 Приготовление кутикулярных препаратов

2.8 Иммуноокрашивание эмбрионов

3 Результаты

3.1 Создание модельной системы для проверки способности границ регуляторной области гена Abd-B специфично взаимодействовать с промотором

3.1.1 Стратегия замещения границы Mcp

3.1.2 Проверка модельной системы McpattP

3.2 Исследование инсуляторной активности сайтов связывания белка dCTCF

3.2.1 Исследование способности сайтов dCTCF блокировать активность энхансеров в трансгенных модельных системах дрозофилы

3.2.2 Исследование барьерной функции CTCFx4 в трансгенных модельных системах дрозофилы

3.2.3 Исследование активности CTCFx4 в контексте ВХ-С

3.3 Исследование роли границ в организации специфичных дистанционных взаимодействий между /ab-энхансерами и промотором гена Abd-B

3.3.1 Замена Mcp на границу Fab-7 приводит к эктопической активации гена Abd-B в сегменте А4

3.3.2 Замена Mcp на границу Fab-8 приводит к эктопической активации гена Abd-B в сегменте А4

3.4 Эктопическая экспрессия Abd-B в сегменте А4 происходит за счёт энхансеров в домене iab-4

4 Обсуждение

4.1 Инсуляторная активность четырёх сайтов связывания dCTCF зависит от контекста генома

Заключение

Выводы

Список литературы

76

Список использованных сокращений и терминов

abd-A - abdominal-A, ген в составе BX-C Abd-B - Abdominal-B, ген в составе BX-C

AB-I - последовательность, прилегающая к промотору гена Abd-B, участвующая в дистанционных взаимодействиях

BEAF32 - Boundary element associated factor 32kDa, архитектурный белок дрозофилы

BX-C - bithorax-комплекс

CGI - CpG-островок, последовательность в промоторных областях генов млекопитающих, обогащённая CpG -динуклеотидами, гиперметилирование которых приводит к устойчивой репрессии транскрипции.

CP190 - Centrosome-associated protein 190kDa, ассоциированный с инсуляторами белок дрозофилы

CTCF - СССТС-связывающий фактор, инсуляторный белок

DPE - downstream promoter element, мотив в составе корового промотора

Fab-3 - Fab-8 - Frontabdominal, границы между регуляторными доменами BX-C

Fub - Front-ultraabdominal, граница между регуляторными областями генов Ubx и

abd-A

GOF - gain of function - мутация усиления функции

iab-2 - iab-8 - infraabdominal- регуляторные домены в составе BX-C

Inr - initiator, мотив в составе корового промотора

LOF - loss of function - мутация потери функции

Mcp - Miscadastral pigmentation, граница между регуляторными областями генов abd-A и Abd-B

Mod(mdg4) - Модификатор МДГ4, ассоциированный с инсуляторами белок дрозофилы

MTE - motif ten element, мотив в составе корового промотора

Pc-G - Polycomb group, белки группы Polycomb

PIC - preinitiation complex, преинициаторный комплекс

PRE - Polycomb response elements, регуляторные элементы, сайленсеры,

связывающие Pc-G белки

PTE - promoter tethering element, последовательность в промоторной области гена Abd-B, участвующая в дистанционных взаимодействиях PTS - promoter targeting sequence, прилегающая к границам iab-доменов последовательность, способствующая дистанционным взаимодействиям энхансеров с промотором

scs и scs' - specialized chromatin structures, инсуляторы из локуса hsp70 Su(Hw) - suppressor of hairy wing, инсуляторный белок дрозофилы TARD - Transcription Associated Regulatory Domain, транскрипционные регуляторные домены

TCT - полипиримидиновый инициатор, мотив в составе корового промотора TFIIA - TFIIH - transcription factor II A-H, транскрипционные факторы РНК полимеразы II

TFIIIC - транскрипционный фактор РНК полимеразы III С

TRE - trithorax response elements, регуляторные элементы, связывающие trx-G

белки

trx-G - trithorax group, белки группы trithorax

TSS - transcription start site, точка старта транскрипции

Ubx - Ultrabithorax, ген в составе BX-C

Zw5 - Zeste-white 5, инсуляторный белок дрозофилы

МДГ4 - мобильный диспергированый генетический элемент 4, он же gypsy п.н. (т.п.н). — пар нуклеотидов (тысяч пар нуклеотидов)

ТАД (TAD - Topologically Associated Domain), топологически ассоциированный домен

ТФ - транскрипционные факторы, белки, контролирующие транскрипцию путём прямого связывания со специфичными сайтами ДНК

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль границ в установлении специфических взаимодействий между энхансерами и промотором гена Abd-B Drosophila melanogaster»

Актуальность работы

Обеспечение правильной программы экспрессии генов в процессе развития многоклеточных организмов требует точной и эффективной системы регуляции. На уровне транскрипции такая регуляция осуществляется в результате взаимодействия нескольких типов цис-регуляторных элементов: промоторов, энхансеров, сайленсеров и инсуляторов. Промотор определяет начало и базовый уровень транскрипции гена. Энхансеры (усиливающие транскрипцию) и сайленсеры (репрессирующие транскрипцию) обычно присутствуют в регуляторных областях генов развития и часто находятся на очень больших расстояниях, достигающих сотен тысяч пар нуклеотидов, от регулируемых ими промоторов (Frankel et al., 2010; Lettice et al., 2014). Было показано, что энхансеры и сайленсеры физически взаимодействуют с промоторами при их регуляции (Deng et al., 2012; Mifsud et al., 2015). Без ответа пока остаются вопросы о том, каким образом происходит взаимодействия между регуляторными элементами, и что определяет специфичность взаимодействия между только определёнными энхансерами и промоторами.

В последнее время считается, что координация дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами осуществляется за счёт формирования топологически ассоциированных доменов (ТАДов). Согласно существующим моделям взаимодействия между регуляторными элементами происходят внутри ТАДов (Dekker and Mirny, 2016; Schoenfelder and Fraser, 2019). У млекопитающих часть границ ТАДов часто формируются при помощи белка CTCF, который относится к классу инсуляторных белков (Nora et al., 2017; Rao et al., 2014). Было предположено, что инсуляторы, основным свойством которых является способность неспецифично блокировать взаимодействия между энхансерами и промоторами, участвуют в формировании границ доменов (Rao et al., 2014). У дрозофилы было открыто множество инсуляторов (Kyrchanova and Georgiev, 2014), однако, однако известные инсуляторные белки, такие как Su(Hw), или dCTCF, на границах ТАДов дрозофилы не представлены (Hou et al., 2012; Ulianov et al., 2016).

Комплекс bithorax (BX-C), состоящий из трёх гомеозисных генов: Ubx, abd-A иAbd-B, является удобной моделью для исследования механизмов, обеспечивающих специфичность дистанционных взаимодействий между энхансерами и промоторами. Регуляторная область ВХ-С делится на девять iab-доменов, содержащих сегмент-специфичные энхансеры, отвечающие за морфологические особенности девяти задних сегментов тела дрозофилы. Каждый из трёх генов регулируется своим набором iab-энхансеров, активирующихся в разных сегментах. Соседние iab-домены, находящиеся в разном статусе активности (активный и репрессированный) в пределах одного сегмента, изолированы границами, которые имеют свойства инсуляторов. Возникает парадокс: iab-энхансеры, несмотря на изоляцию инсуляторами границ преодолевают их действие и способны активировать нужный промотор. Была выдвинута модель регуляции ВХ-С, по которой границы доменов выполняют не только изолирующую функцию, но и путём взаимодействия с предпромоторной областью соответствующего гена обеспечивают правильное взаимодействие сегмент-специфичных энхансеров с промотором (Kyrchanova et al., 2015). Ранее было показано, что инсуляторы Fab-7 и Fab-8 из регуляторной области Abd-B выполняют две функции: инсуляторную (барьерную) и коммуникационную, которая выражается в организации специфичного взаимодействия с промотором Abd-B, а также способны взаимозаменять друг друга в контексте генома (Kyrchanova et al., 2011; Kyrchanova et al., 2016). Однако, до настоящего времени прямых доказательств функциональной значимости границ в обеспечении специфичной доставки энхансеров доменов к промотору показано не было. В данной работе впервые показано, что замена границы одной регуляторной области на границу другой приводит к перенаправлению энхансеров на другой промотор.

В составе большинства подтверждённых и предполагаемых границ ВХ-С были обнаружены сайты связывания белка dCTCF (Holohan et al., 2007). Белок dCTCF, консервативный для большей части высших эукариот, является гомологом единственного известного на данный момент инсуляторного белка млекопитающих CTCF. У млекопитающих CTCF расположен на границах ТАДов и вместе с когезиновым комплексом участвует в формировании архитектуры хромосом (Dekker and Mirny, 2016). Несмотря на существенную роль у млекопитающих, у дрозофилы dCTCF, по-видимому, не требуется для образования крупных ТАДов.

Тем не менее, было показано, что dCTCF играет ключевую роль в функционировании границ ВХ-С (Bonchuk et al., 2015; Gambetta and Furlong, 2018). В данной работе было показано, что четыре сайта связывания dCTCF не могут самостоятельно функционировать в качестве инсулятора в традиционно используемой трансгенной модельной системе с генами yellow и white, но в то же время их достаточно для обеспечения инсуляции в контексте BX-C, в том числе и для того, чтобы полностью функционально заместить инсулятор границы Mcp.

Цель и задачи исследования

Цель работы: изучить роль границ в организации специфичных дистанционных взаимодействий между iab-энхансерами и промотором гена на примере регуляторной области гена Abd-B комплекса bithorax.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельную систему для проверки способности границ регуляторной области гена Abd-B специфично взаимодействовать с промотором.

2. Исследовать способность сайтов связывания белка dCTCF самостоятельно формировать инсулятор в трансгенных модельных системах дрозофилы и в контексте комплекса bithorax.

3. Исследовать влияние замены границы Мср, разделяющей регуляторные области генов abd-А и Abd-B, на границы Fab-7 или Fab-8 регуляторной области гена Abd-B на экспрессию гена Abd-B.

4. Изучить функциональную роль ориентации последовательности границ Fab-7 и Fab-8 при замене Мср.

5. Доказать участие энхансера iab-4 в активации гена Abd-B при замене границы Мср на Fab-8.

Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы

В рамках данной работы была создана модельная система, позволяющая тестировать различные регуляторные элементы на месте границы Mcp. С помощью этой системы впервые было продемонстрировано, что границы Fab-7 и Fab-8 активно участвуют в формировании специфичных дистанционных взаимодействий

между iab-энхансерами и промотором гена Abd-B. Встраивание этих границ вместо границы Mcp приводит к эктопической активации Abd-B энхансерами из регуляторного домена iab-4 в сегменте А4. Впервые показано, что в контексте ВХ-С Мср не обеспечивает энхансер-промоторные взаимодействия, а служит исключительно для изоляции доменов и гетерологичный инсулятор, состоящий из четырёх сайтов связывания dCTCF, способен функционально полностью заместить инсулятор Мср. Однако, четыре сайта связывания dCTCF не способны формировать инсулятор в трансгенных системах на взрослой стадии развития дрозофилы.

Полученные результаты вносят вклад в исследование общих принципов энхансер-промоторных взаимодействий и регуляции транскрипции в целом. Понимание этих принципов позволит в дальнейшем найти подходы к изучению заболеваний, обусловленных нарушением тканеспецифичной регуляции экспрессии генов.

Методология и методы диссертационного исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и широкого спектра методов молекулярной биологии и генетики: выделение плазмидной и геномной ДНК, молекулярное клонирование, ПЦР, получение трансгенных линий D. melanogaster путём направленного редактирования генома (CRISPR/Cas9), иммуноокрашивание эмбрионов дрозофилы, методы микроскопических исследований и другие. В качестве объекта исследования в работе были использованы линии Drosophila melanogaster.

Положения, выносимые на защиту

1. Четыре сайта связывания dCTCF не блокируют взаимодействия энхансеров или сайленсеров с промоторами репортерных генов yellow и white в трансгенных модельных системах дрозофилы, в то же время, они эффективно изолируют регуляторные домены iab-4 и iab-5 bithorax-комплекса.

2. Fab-7 или Fab-8 блокируют коммуникацию между соседними доменами iab-4 и iab-5.

3. Замена границы Мср на границы Fab-7 или Fab-8 регуляторной области гена Abd-B приводит к эктопической активации Abd-B за счёт энхансеров iab-4 в сегменте А4.

4. Ориентация границы Fab-8 и, в меньшей степени, Fab- 7, встроенных вместо Мср, влияет на уровень эктопической экспрессии Abd-B.

Личный вклад соискателя

Основной объём экспериментальной работы, включающий создание трансгенных конструкций, произведение делеции iab-4 при помощи системы CRISPR/Cas9, фенотипический анализ мух вместе с приготовлением кутикулярных препаратов и иммуноокрашиванием эмбрионов, был выполнен автором лично. Модельная система с делецией границы Mcp была создана М. Метцлером (Базельский университет, Швейцария). Получение трансгенных линий мух и иммунопреципитация хроматина проводились совместно с О. В. Кырчановой. Другие соавторы указаны в соответствующих опубликованных работах. Автор участвовал в обсуждении и интерпретации результатов и подготовке данных для публикации.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах: Postika N, Metzler M, Affolter M, Müller M, Schedl P, Georgiev P, Kyrchanova O Boundaries mediate long-distance interactions between enhancers and promoters in the Drosophila Bithorax complex / PLoS Genet. 2018. 14(12):e1007702. doi: 10.1371/journal.pgen.1007702.

Н. Е. Постика, Т. А. Ивлиева, П. Г. Георгиев, О. В. Кырчанова. Исследование инсуляторной активности dCTCF в модельных трансгенных линиях дрозофилы / ДАН. 2019.486(1):187-191. doi: 10.1134/S1607672919030074. и представлены автором на конференции:

N. Postika, O. Kyrchanova. Cooperation between architectural proteins is required for boundary function in Drosophila bithorax complex // 44th FEBS Congress, Krakow, Poland, 2019, FEBS Open Bio 9 (Suppl. 1) (2019) 65-431, с 147-148

Структура и объем работы результатов

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение»), выводов и списка литературы. Работа изложена на 91 странице, содержит 32 рисунка. Список литературы включает 200 источников.

1 Обзор литературы 1.1 Цис-регуляторные элементы 1.1.1 Идентификация цис-регуляторных элементов

Цис-регуляторные элементы — это участки ДНК, регулирующие экспрессию генов, находящиеся на одной хромосоме. Важнейшим свойством цис-регуляторных элементов является то, что они рекрутируют различные транскрипционные факторы (ТФ), белки, контролирующие транскрипцию путём связывания со специфичными участками ДНК. Как правило, ТФ специфично связывают мотивы длиной 6-10 п.н., однако для большинства ТФ мотивы, которые они связывают неизвестны (1о1ша е! а1., 2015, 2013; ШекаисИ ^ а1., 2014).

Определение регуляторных элементов в больших геномах как мест скопления различных сайтов связывания ТФ представляет проблему за счёт малой длины мотивов и приводит к большому количеству ложноположительных или ложноотрицательных результатов (8Ыуиеуа е! а1., 2014). Идентификация сайтов связывания ТФ в геноме при помощи иммунопреципитации хроматина является более надёжным методом определения цис-регуляторных элементов, связывающих какой-либо конкретный ТФ, однако следует помнить, что ТФ могут связываться со многими геномными сайтами без очевидной регуляторной функции (Сао е! а1., 2010; Ы е! а1., 2008). Кроме того, одни и те же ТФ могут связываться как с энхансерами, так и с репрессорами (Уоке8 е! а1., 2008), из чего следует, что связывание одного ТФ ещё не определяет функцию цис-регуляторного элемента. С другой стороны, ТФ рекрутируемые, например, на тканеспецифичные энхансеры привлекают общие кофакторы, по которым можно идентифицировать энхансеры не зная, какие ТФ они связывают (У18е1 е! а1., 2009). Другой подход к исследованию цис-регуляторных элементов предполагает оценку их влияния на транскрипцию репортерного гена в трансгене. Например, размещение энхансера перед промотором маркерного гена в трансгенной системе позволяет получить информацию о том в какой момент времени и где он активируется и о силе этого энхансера. Аналогичным образом можно получить информацию о функциональных свойствах промоторов,

сайленсеров и инсуляторов. Несмотря на то, что производство и последующий анализ трансгенных животных в целом затратный и медленный процесс, данный подход предоставляет ценные функциональные и количественные данные об участии цис-регуляторного элемента в регуляции транскрипции.

1.1.2 Промоторы

В данном разделе рассмотрена структура промоторов, которые связаны с РНК-полимеразой II, которая синтезирует предшественников мРНК и большинство мяРНК и микроРНК.

Транскрипция начинается в определённой позиции, называемой точкой старта транскрипции (transcription start site, TSS). TSS является центральной частью корового промотора, который обычно имеет размеры около 100 п.н. (Hampsey, 1998).

На коровых промоторах происходит сборка преинициаторного комплекса (PIC), который включает в себя базальные факторы транскрипции TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, совместно определяющие точку начала транскрипции и участвующие в привлечении РНК-полимеразы II (Thomas and Chiang, 2006). Кроме TSS в коровых частях промоторов часто обнаруживаются другие консервативные последовательности - мотивы, связывающие ТФ. Для многих из этих мотивов (таких как TATA-бокс (TATA), initiator (Inr), downstream promoter element (DPE), motif ten element (MTE) и др.) известны связывающие их ТФ. Мотивы BREu (TFIIB recognition element, upstream), TATA, Inr, MTE, DPE и TCT (полипиримидиновый инициатор) были обнаружены как у дрозофилы, так и у человека. Однако нет таких универсальных мотивов, которые встречаются во всех промоторах. Наличие или отсутствие специфических мотивов определяет функциональные свойства коровых промоторов.

Анализ транскрипции эукариот показал, что инициация транскрипции разных генов происходит двумя разными способами. Если промотор содержит один или несколько TSS на небольшом участке в несколько нуклеотидов, то наблюдается "сфокусированная" инициация транскрипции (Juven-Gershon and Kadonaga, 2010). Такая транскрипция происходит, например, с большинства вирусных промоторов, Р-глобиновых и промоторов гистоновых генов (Carninci et al., 2006; Ni et al., 2010).

В промоторах, показывающих "рассеянную" инициацию транскрипции, обнаруживается несколько слабых TSS, распределённых по области в 50-100 п.н (Juven-Gershon and Kadonaga, 2010). Такая рассеянная транскрипция была обнаружена у промоторов генов "домашнего хозяйства", которые участвуют в поддержании основных клеточных функций (Ni et al., 2010).

На основании таких свойств, как характер инициации, последовательность мотивов, конфигурации хроматина и функции генов было выделено три типа коровых промоторов (Lenhard et al., 2012). К первому типу относятся промоторы с нерегулярно расположенными нуклеосомами (Rach et al., 2011) и содержащие мотивы TATA-бокс и Inr (Рис. 1.1а). Для них характерна сфокусированная инициация транскрипции. Ключевые регуляторные элементы в промоторах данного типа расположены рядом с TSS (Roider et al., 2009). Это промоторы тканеспецифичных генов, которые активны, как правило, в полностью дифференцированных клетках, где они приобретают гистоновые метки H3K4me3 (триметелирование гистона Н3 по лизину 4) и H3K27ac (ацетилирование гистона Н3 по лизину 27), связанные с активной транскрипцией.

Второй тип объединяет промоторы, которые контролируют гены, кодирующие белки домашнего хозяйства. Такие промоторы активно работают во всех клетках и показывают рассеянную инициацию транскрипции (Hoskins et al., 2011) (Рис. 1.1б). Их коровый участок обычно остаётся полностью свободным от нуклеосом, и на границах такого участка находятся позиционированные нуклеосомы, имеющие характерные модификации H3K4me3 и H3K27ac (Rach et al., 2011). У млекопитающих эти промоторы содержат обогащённые CpG последовательности (CpG островки или CGI). У дрозофилы промоторы содержат специфический набор мотивов, включая мотивы Ohler 1, Ohler 6, и DRE (Rach et al., 2009).

Третий тип промоторов находят часто у генов, кодирующих ключевые транскрипционные факторы развития, участвующих в ранних этапах эмбриогенеза в том числе в сегментации и морфогенезе. У млекопитающих такие промоторы имеют сходство с коровыми промоторы генов домашнего хозяйства, но отличаются от них тем, что нуклеосомы, расположенные на границах коровой части, имеют как активационную метку H3K4me3, так и репрессионную H3K27me3

(триметилирование гистона Н3 по лизину 27) (Bernstein et al., 2006) (Рис. 1.1в). Это связано с тем, что такие промоторы работают только в части клеток и в других должны быть полностью ингибированы. У млекопитающих такие промоторы, также как и промоторы генов домашнего хозяйства, обладают рассеянной инициацией транскрипции. Также у млекопитающих промоторы данного типа связаны с одним или несколькими CpG островками (Akalin et al., 2009). У дрозофилы такие промоторы имеют мотив DPE в положении +25 и мотив Inr (Engström et al., 2007) и обладают сфокусированной инициацией транскрипции.

а Тка не специфичные гены

"Сфокусированная" инициация

TSS

Нуклеосома

б гены домашнего хозяйства

"рассеянная" инициация

кшш m

точно

позиционированные нуклеосомы

В транскрипционные факторы развития

"рассеянная" инициация

точно

позиционированные нуклеосомы

ЖЖ _ЛмШЖ

Млекопитающие и дрозофила

CCI

Млекопитающие

il

Млекопитающие

|ТАТА-Ьох|--Inr

— Ohler 6

h

Дрозофила Óhler 11—I DRE

CCI h CGI

Дрозофила

1

Inr

DPb

НЗК4теЗ НЗК4теЗ НЗК4теЗ

НЗК27ас НЗК27ас J НЗК27ас [

H3K27me3

Рисунок 0.1 Три типа коровых промоторов. На схемах показано расположение нуклеосом на промотерах, характер инициации транскрипции, некоторые мотивы, характерные для конкретных типов промоторов (TATA, Inr, Ohler 1, Ohler 6, DRE, DPE) и CpG островки (CGI). Внизу показано распределение активационных (H3K4me3 и H3K27ac) и репрессионных (НЗК27шеЗ) меток хроматина. (Haberle and Stark, 2018)

Корового промотора может быть достаточно для непосредственной инициации транскрипции (Kadonaga, 2012), но, как правило, он имеют низкую базальную активность, которая может быть активирована регуляторными элементами, часто расположенными удалённо, называемыми энхансерами (Shlyueva et а1., 2014).

1.1.3 Энхансеры

В формировании специфичного паттерна экспрессии генов решающее значение имеют энхансеры, которые определяют место и время активации конкретного гена. Энхансеры - это участки ДНК небольшой протяжённости, на которых собирается белковый комплекс, активирующий экспрессию генов. Как правило, активность энхансера не зависит от его ориентации. Экспрессия генов, контролирующих развитие, определяется набором энхансеров, которые могут находится от регулируемого промотора на расстоянии, достигающем нескольких десятков т.п.н. В относительно компактном геноме дрозофилы есть энхансеры, работающие на расстояниях от 70 до 100 т.п.н. (Frankel et al., 2010), в то время как у млекопитающих расстояния между энхансером и промотором могут достигать 1 м.п.н. (Lettice et al., 2014).

Как правило, энхансеры лишены нуклеосом и представляют собой открытый хроматин. Наличие специфичных модификаций гистонов, таких как H3K27ac/H3K4me1 может также быть признаком энхансера. Было показано, что с энхансеров может идти транскрипция некодирующих РНК (Kim et al., 2010), что позволяет обнаружить активные энхансеры (Wu et al., 2014). Данные методы позволяют предсказать наличие энхансеров основываясь на их свойстве, но не позволяют оценить их функциональную роль в транскрипции.

Энхансеры связывают ТФ и рекрутируют коактиваторы, увеличивающие транскрипцию с промотора независимо от расстояния до него (Banerji et al., 1981; Shlyueva et al., 2014; Spitz and Furlong, 2012). Коактиваторы, привлекаемые связанными с энхансерами ТФ, могут представлять собой комплексы ремоделирования хроматина для формирования свободных от нуклеосом областей, комплексы, модифицирующие гистоны, базальные факторы транскрипции, включая РНК-полимеразу II и/или белки, участвующие в активации РНК полимеразы, находящейся в состоянии паузинга (Buecker and Wysocka, 2012; Bulger and Groudine, 2011; de Laat and Duboule, 2013). Одним из таких комплексов является комплекс Медиатор, состоящий из множества субъединиц (25 у дрожжей и 30 у млекопитающих). Медиатор рекрутируется на энхансеры взаимодействуя со связанными с ними ТФ. После образования петли между энхансером и промотором,

он взаимодействует с компонентами преинициаторного комплекса, способствуя рекрутированию и/или стабилизации его компонентов (8ои1оигта, 2018) (Рис. 1.2).

Рисунок 0.2 Активация транскрипции. а) ТФ связываются с энхансером, расположенном на некотором удалении от промотора. Сайт старта транскрипции (TSS) обозначен стрелкой. б) ТФ привлекают коактиваторные комплексы, которые модифицируют или ремоделируют хроматин, и делают его доступным для других факторов. Затем привлекаются другие коактиваторные комплексы, уже действующие непосредственно на сборку преинициаторного комплекса (PIC). Медиатор является одним из ключевых коактиваторных комплексов. в) Сборка PIC на промоторе. Медиатор способствует привлечению/стабильности различных компонентов PIC на разных этапах его сборки. г) Фосфорилирование С-концевого домена РНК полимеразы II, что приводит к высвобождению полимеразы с промотора и началу элонгации. Это фосфорилирование регулируется Медиатором. (Soutourina, 2018)

Экспрессия генов может контролироваться несколькими энхансерами. В работах по картированию энхансеров было показано, что количество энхансеров может в пять - десять раз превышать количество активных генов (Shen et al., 2012). Как правило, на энхансерах сайты связывания транскрипционных факторов кластеризуются. Транскрипционные факторы и кофакторы могут кооперативно связывать хроматин на энхансерах и образовывать энхансеосомы (Merika and Thanos, 2001). Гены могут регулироваться несколькими энхансерами, которые иногда располагаются близко друг к другу вдоль хромосомы. Исходя из их размеров, наличия модификаций гистонов и уровня загруженности факторами такие кластеры энхансеров называют областями контроля локуса (LCR) или суперэнхансерами

(Heinz et al., 2015; Pott and Lieb, 2015). Энхансерные элементы могут быть разбросаны по локусу и находится перед, внутри или после гена, который они регулируют и могут сближаться в пространстве, формируя экспрессионный центр (экспрессионный хаб) (Patrinos et al., 2004).

Генетические исследования показывают, что некоторые энхансеры могут взаимодействовать с любым промотором, находящимся поблизости (Symmons et al., 2014), в то время как другие имеют специфичность к промоторам определённого типа (Juven-Gershon et al., 2008). Один возможный механизм такой специфичности - это конкуренция промоторов, когда один общий энхансер с большей вероятностью связывается с ближайшим или более сильным промотором. Такая конкуренция была показана для многих процессов, как например, контроль экспрессии протоонкогена c-Myc (Cho et al., 2018). Его экспрессия ограничивается при помощи промотора гена PVT1, экспрессирующего длинную некопирующую РНК. Промотор PVT1 находится между промотором c-Myc и его энхансерами и снижает экспрессию c-Myc конкурентно связываясь с его энхансерами. Большинство энхансер-промоторных взаимодействий происходит в пределах так называемых топологически ассоциированных доменах (ТАД) (Dixon et al., 2012; Rao et al., 2014), что также может быть основой для обеспечения специфичности этих взаимодействий.

1.1.4 Инсуляторы

Исходно инсуляторы были открыты у дрозофилы и относятся к особому классу регуляторных элементов, которые, как предполагается, не влияют непосредственно на активность промотора, но регулируют взаимодействие промотора с окружающим хроматином, энхансерами и сайленсерами. В общем, инсуляторами называют цис-регуляторные элементы, которые обладает двумя свойствами: 1) предотвращают распространение репрессионного хроматина, то есть выполняют роль барьера между репрессированным и открытым хроматином; 2) могут блокировать взаимодействие между промотором и энхансером, когда располагаются между ними (Sun and Elgin, 1999). Первое свойство инсуляторов исходно было выявлено в функциональных тестах, в которых репортерный ген, окружённый инсуляторами, встраивался в различные области генома дрозофилы с

помощью Р-транспозона. В результате было показано, что транскрипция репортерного гена защищена инсуляторами от воздействия окружающих регуляторных элементов и хроматина (Kellum and Schedl, 1991). В некоторых случаях было показано, что сильные инсуляторы поддерживают экспрессию трансгена даже при интеграции в гетерохроматиновые области генома (Roseman et al., 1993). Второе свойство было продемонстрировано при тестировании инсуляторов в трансгенной системе, когда тестируемый фрагмент располагается между репортерным геном и энхансером (Kellum and Schedl, 1992).

Первыми последовательностями, которые показали наличие инсуляторной активности в функциональных тестах, были элементы scs и scs' (specialized chromatin structures). Эти элементы ограничивают домен, состоящий из двух генов hsp70. На политенных хромосомах дрозофилы при индукции теплового шока формируется пуф деконденсированного хроматина, связанного с активной транскрипцией, который ограничен последовательностями инсуляторов (Kuhn et al., 2004; Udvardy et al., 1985). Были обнаружены два белка Zw5 и BEAF32, которые имеют сайты связывания соответственно в инсуляторах scs и scs', и от которых зависит инсуляторная активность последних (Gaszner et al., 1999; Zhao et al., 1995).

Одним из наиболее хорошо изученных инсуляторов является фрагмент, состоящий из 12 повторяющихся сайтов связывания белка Su(Hw), найденный в ретротранспозоне МДГ4 (gypsy) (Georgiev and Corces, 1995). Изначально, был обнаружен ряд мутаций в геноме Drosophila melanogaster вызванные встройками gypsy в bithorax-комплекс (BX-C), общим свойством которых было то, что их фенотип ослаблялся при мутации гена suppressor of Hairy wing (Su(Hw)) (Modolell et al., 1983). Мутации, вызванные встройкой gypsy в основном обнаруживаются в генах с обширными регуляторными областями (таких как гены cut и yellow и комплексы bithorax и achaete-scute), где энхансеры могут находится на большом расстоянии от регулируемых генов. Позднее было показано, что повторяющиеся сайты связывания белка Su(Hw) обладают инсуляторной активностью (Geyer and Corces, 1992). Были идентифицированы другие белки, необходимые для работы повторяющихся сайтов Su(Hw) в качестве инсулятора: Mod(mdg4) (Gerasimova et al., 1995), CP190 (Pai et al., 2004) и dTopors (Capelson and Corces, 2005).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Постика Николай Евгеньевич, 2021 год

Список литературы

Akalin, A., Fredman, D., Arner, E., Dong, X., Bryne, J.C., Suzuki, H., Daub, C.O., Hayashizaki, Y., Lenhard, B., 2009. Transcriptional features of genomic regulatory blocks. Genome Biol. 10, R38. https://doi.org/10.1186/gb-2009-10-4-r38 Akbari, O.S., Bae, E., Johnsen, H., Villaluz, A., Wong, D., Drewell, R.A., 2008. A novel promoter-tethering element regulates enhancer-driven gene expression at the bithorax complex in the Drosophila embryo. Development 135, 123-131. https://doi.org/10.1242/dev.010744 Aoki, T., Sarkeshik, A., Yates, J., Schedl, P., 2012. Elba, a novel developmentally regulated chromatin boundary factor is a hetero-tripartite DNA binding complex. Elife 1, e00171. https://doi.org/10.7554/eLife.00171 Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W., 1981. Expression of a beta-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27, 299-308. https://doi.org/10.1016/0092-8674(81)90413-x

Bantignies, F., Grimaud, C., Lavrov, S., Gabut, M., Cavalli, G., 2003. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 17, 2406-2420. https://doi.org/10.1101/gad.269503 Bantignies, F., Roure, V., Comet, I., Leblanc, B., Schuettengruber, B., Bonnet, J., Tixier, V., Mas, A., Cavalli, G., 2011. Polycomb-dependent regulatory contacts between distant Hox loci in Drosophila. Cell 144, 214-226. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.12.026 Barges, S., Mihaly, J., Galloni, M., Hagstrom, K., Müller, M., Shanower, G., Schedl, P., Gyurkovics, H., Karch, F., 2000. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain. Development 127, 779-790. Bartkuhn, M., Straub, T., Herold, M., Herrmann, M., Rathke, C., Saumweber, H., Gilfillan, G.D., Becker, P.B., Renkawitz, R., 2009. Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190. EMBO J. 28, 877-888. https://doi.org/10.1038/emboj.2009.34 Bateman, J.R., Lee, A.M., Wu, C. -ting, 2006. Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics 173, 769-777. https://doi.org/10.1534/genetics.106.056945 Beagrie, R.A., Scialdone, A., Schueler, M., Kraemer, D.C.A., Chotalia, M., Xie, S.Q., Barbieri, M., de Santiago, I., Lavitas, L.-M., Branco, M.R., Fraser, J., Dostie, J., Game, L., Dillon, N., Edwards, P.A.W., Nicodemi, M., Pombo, A., 2017. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature 543, 519-524. https://doi.org/10.1038/nature21411 Bell, A.C., West, A.G., Felsenfeld, G., 1999. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98, 387-396. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81967-4 Belton, J.-M., McCord, R.P., Gibcus, J.H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J., 2012. HiC: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods 58, 268-276. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.05.001 Bender, W., Akam, M., Karch, F., Beachy, P.A., Peifer, M., Spierer, P., Lewis, E.B., Hogness, D.S., 1983. Molecular Genetics of the Bithorax Complex in Drosophila melanogaster. Science 221, 23-29. https://doi.org/10.1126/science.221.4605.23

Bender, W., Lucas, M., 2013. The border between the ultrabithorax and abdominal-A regulatory domains in the Drosophila bithorax complex. Genetics 193, 1135-1147. https://doi.org/10.1534/genetics.112.146340 Bernstein, B.E., Mikkelsen, T.S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D.J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., Jaenisch, R., Wagschal, A., Feil, R., Schreiber, S.L., Lander, E.S., 2006. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125, 315-326. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.02.041 Bintu, B., Mateo, L.J., Su, J.-H., Sinnott-Armstrong, N.A., Parker, M., Kinrot, S., Yamaya, K., Boettiger, A.N., Zhuang, X., 2018. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science 362. https://doi.org/10.1126/science.aau1783 Bischof, J., Maeda, R.K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K., 2007. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317. https://doi.org/10.1073/pnas.0611511104 Bonchuk, A., Maksimenko, O., Kyrchanova, O., Ivlieva, T., Mogila, V., Deshpande, G., Wolle, D., Schedl, P., Georgiev, P., 2015. Functional role of dimerization and CP190 interacting domains of CTCF protein in Drosophila melanogaster. BMC Biol. 13, 63. https://doi.org/10.1186/s12915-015-0168-7 Bonev, B., Mendelson Cohen, N., Szabo, Q., Fritsch, L., Papadopoulos, G.L., Lubling, Y., Xu, X., Lv, X., Hugnot, J.-P., Tanay, A., Cavalli, G., 2017. Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171, 557-572.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.043 Brant, L., Georgomanolis, T., Nikolic, M., Brackley, C.A., Kolovos, P., van Ijcken, W., Grosveld, F.G., Marenduzzo, D., Papantonis, A., 2016. Exploiting native forces to capture chromosome conformation in mammalian cell nuclei. Mol. Syst. Biol. 12, 891. https://doi.org/10.15252/msb.20167311 Buecker, C., Wysocka, J., 2012. Enhancers as information integration hubs in development: lessons from genomics. Trends Genet 28, 276-284. https://doi.org/10.1016/j.tig.2012.02.008 Bulger, M., Groudine, M., 2011. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell 144, 327-339.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.01.024 Bushey, A.M., Ramos, E., Corces, V.G., 2009. Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions. Genes Dev. 23, 13381350. https://doi.org/10.1101/gad. 1798209 Busslinger, G.A., Stocsits, R.R., van der Lelij, P., Axelsson, E., Tedeschi, A., Galjart, N., Peters, J.-M., 2017. Cohesin is positioned in mammalian genomes by transcription, CTCF and Wapl. Nature 544, 503-507. https://doi.org/10.1038/nature22063 Busturia, A., Lloyd, A., Bejarano, F., Zavortink, M., Xin, H., Sakonju, S., 2001. The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development 128, 2163-2173. Cai, H.N., Shen, P., 2001. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291, 493-495.

https://doi.org/10.1126/science.291.5503.493 Camino, E.M., Butts, J.C., Ordway, A., Vellky, J.E., Rebeiz, M., Williams, T.M., 2015. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory

network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11, e1005136. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005136 Cao, Y., Yao, Z., Sarkar, D., Lawrence, M., Sanchez, G.J., Parker, M.H., MacQuarrie, K.L., Davison, J., Morgan, M.T., Ruzzo, W.L., Gentleman, R.C., Tapscott, S.J., 2010. Genome-wide MyoD binding in skeletal muscle cells: a potential for broad cellular reprogramming. Dev. Cell 18, 662-674.

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2010.02.014 Capelson, M., Corces, V.G., 2005. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol. Cell 20, 105-116. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.08.031 Carninci, P., Sandelin, A., Lenhard, B., Katayama, S., Shimokawa, K., Ponjavic, J., Semple, C.A.M., Taylor, M.S., Engström, P.G., Frith, M.C., Forrest, A.R.R., Alkema, W.B., Tan, S.L., Plessy, C., Kodzius, R., Ravasi, T., Kasukawa, T., Fukuda, S., Kanamori-Katayama, M., Kitazume, Y., Kawaji, H., Kai, C., Nakamura, M., Konno, H., Nakano, K., Mottagui-Tabar, S., Arner, P., Chesi, A., Gustincich, S., Persichetti, F., Suzuki, H., Grimmond, S.M., Wells, C.A., Orlando, V., Wahlestedt, C., Liu, E.T., Harbers, M., Kawai, J., Bajic, V.B., Hume, D.A., Hayashizaki, Y., 2006. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat. Genet. 38, 626-635. https://doi.org/10.1038/ng1789 Casares, F., Sánchez-Herrero, E., 1995. Regulation of the infraabdominal regions of the

bithorax complex of Drosophila by gap genes. Development 121, 1855-1866. Chen, Q., Lin, L., Smith, S., Lin, Q., Zhou, J., 2005. Multiple Promoter Targeting Sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation. Dev. Biol. 286, 629-636. https://doi.org/10.1016yj.ydbio.2005.08.025 Chetverina, D., Fujioka, M., Erokhin, M., Georgiev, P., Jaynes, J.B., Schedl, P., 2017. Boundaries of loop domains (insulators): Determinants of chromosome form and function in multicellular eukaryotes. Bioessays 39. https://doi.org/10.1002/bies.201600233 Cho, S.W., Xu, J., Sun, R., Mumbach, M.R., Carter, A.C., Chen, Y.G., Yost, K.E., Kim, J., He, J., Nevins, S.A., Chin, S.-F., Caldas, C., Liu, S.J., Horlbeck, M.A., Lim, D.A., Weissman, J.S., Curtis, C., Chang, H.Y., 2018. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell 173, 1398-1412.e22. https://doi.org/10.1016Zj.cell.2018.03.068 Cléard, F., Moshkin, Y., Karch, F., Maeda, R.K., 2006. Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. Nat. Genet. 38, 931-935. https://doi.org/10.1038/ng1833 Comet, I., Schuettengruber, B., Sexton, T., Cavalli, G., 2011. A chromatin insulator driving three-dimensional Polycomb response element (PRE) contacts and Polycomb association with the chromatin fiber. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 2294-2299. https://doi.org/10.1073/pnas.1002059108 Cubeñas-Potts, C., Corces, V.G., 2015. Architectural proteins, transcription, and the three-dimensional organization of the genome. FEBS Lett. 589, 2923-2930. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.05.025 Cubeñas-Potts, C., Rowley, M.J., Lyu, X., Li, G., Lei, E.P., Corces, V.G., 2017. Different enhancer classes in Drosophila bind distinct architectural proteins and mediate unique chromatin interactions and 3D architecture. Nucleic Acids Res. 45, 1714-1730. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1114

de Laat, W., Duboule, D., 2013. Topology of mammalian developmental enhancers and their regulatory landscapes. Nature 502, 499-506. https://doi.org/10.1038/nature12753 de Wit, E., Vos, E.S.M., Holwerda, S.J.B., Valdes-Quezada, C., Verstegen, M.J.A.M., Teunissen, H., Splinter, E., Wijchers, P.J., Krijger, P.H.L., de Laat, W., 2015. CTCF Binding Polarity Determines Chromatin Looping. Mol. Cell 60, 676-684. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.09.023 Dekker, J., Mirny, L., 2016. The 3D Genome as Moderator of Chromosomal

Communication. Cell 164, 1110-1121. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.007 Deng, W., Lee, J., Wang, H., Miller, J., Reik, A., Gregory, P.D., Dean, A., Blobel, G.A., 2012. Controlling long-range genomic interactions at a native locus by targeted tethering of a looping factor. Cell 149, 1233-1244. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.03.051 Dixon, J.R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., Hu, M., Liu, J.S., Ren, B., 2012. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376-380. https://doi.org/10.1038/nature11082 Duboule, D., 2007. The rise and fall of Hox gene clusters. Development 134, 2549-2560.

https://doi.org/10.1242/dev.001065 Duboule, D., Dolle, P., 1989. The structural and functional organization of the murine HOX gene family resembles that of Drosophila homeotic genes. EMBO J. 8, 14971505.

Eagen, K.P., Aiden, E.L., Kornberg, R.D., 2017. Polycomb-mediated chromatin loops revealed by a subkilobase-resolution chromatin interaction map. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 8764-8769. https://doi.org/10.1073/pnas.1701291114 Eltsov, M., Maclellan, K.M., Maeshima, K., Frangakis, A.S., Dubochet, J., 2008. Analysis of cryo-electron microscopy images does not support the existence of 30-nm chromatin fibers in mitotic chromosomes in situ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19732-19737. https://doi.org/10.1073/pnas.0810057105 Engström, P.G., Ho Sui, S.J., Drivenes, O., Becker, T.S., Lenhard, B., 2007. Genomic regulatory blocks underlie extensive microsynteny conservation in insects. Genome Res. 17, 1898-1908. https://doi.org/10.1101/gr.6669607 Erokhin, M., Davydova, A., Kyrchanova, O., Parshikov, A., Georgiev, P., Chetverina, D., 2011. Insulators form gene loops by interacting with promoters in Drosophila. Development 138, 4097-4106. https://doi.org/10.1242/dev.062836 Forcato, M., Nicoletti, C., Pal, K., Livi, C.M., Ferrari, F., Bicciato, S., 2017. Comparison of computational methods for Hi-C data analysis. Nat. Methods 14, 679-685. https://doi.org/10.1038/nmeth.4325 Frankel, N., Davis, G.K., Vargas, D., Wang, S., Payre, F., Stern, D.L., 2010. Phenotypic robustness conferred by apparently redundant transcriptional enhancers. Nature 466, 490-493. https://doi.org/10.1038/nature09158 Fudenberg, G., Imakaev, M., Lu, C., Goloborodko, A., Abdennur, N., Mirny, L.A., 2016. Formation of Chromosomal Domains by Loop Extrusion. Cell Rep 15, 2038-2049. https://doi.org/10.1016/jxelrep.2016.04.085 Fujioka, M., Mistry, H., Schedl, P., Jaynes, J.B., 2016. Determinants of Chromosome Architecture: Insulator Pairing in cis and in trans. PLoS Genet. 12, e1005889. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005889 Fussner, E., Strauss, M., Djuric, U., Li, R., Ahmed, K., Hart, M., Ellis, J., Bazett-Jones, D.P., 2012. Open and closed domains in the mouse genome are configured as 10-

nm chromatin fibres. EMBO Rep. 13, 992-996. https://doi.org/10.1038/embor.2012.139 Gambetta, M.C., Furlong, E.E.M., 2018. The Insulator Protein CTCF Is Required for Correct Hox Gene Expression, but Not for Embryonic Development in Drosophila. Genetics 210, 129-136. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301350 Gan, L., Ladinsky, M.S., Jensen, G.J., 2013. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma 122, 377-386. https://doi.org/10.1007/s00412-013 -0423 -z Gaszner, M., Vazquez, J., Schedl, P., 1999. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev. 13, 2098-2107. https://doi.org/10.1101/gad.13.16.2098 Gaunt, S.J., Sharpe, P.T., Duboule, D., 1988. Spatially restricted domains of homeo-gene transcripts in mouse embryos: relation to a segmented body plan. Development 104, 169-179.

Georgiev, P.G., Corces, V.G., 1995. The su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 5184-5188. https://doi.org/10.1073/pnas.92.11.5184 Gerasimova, T.I., Gdula, D.A., Gerasimov, D.V., Simonova, O., Corces, V.G., 1995. A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82, 587-597. https://doi.org/10.1016/0092-8674(95)90031-4 Getzenberg, R.H., Pienta, K.J., Ward, W.S., Coffey, D.S., 1991. Nuclear structure and the three-dimensional organization of DNA. J. Cell. Biochem. 47, 289-299. https://doi.org/10.1002/jcb.240470402 Geyer, P.K., Corces, V.G., 1992. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6, 1865-1873. https://doi.org/10.1101/gad.6.10.1865 Gibert, J.-M., Peronnet, F., Schlötterer, C., 2007. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network. PLoS Genet. 3, e30. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0030030 Graham, A., Papalopulu, N., Krumlauf, R., 1989. The murine and Drosophila homeobox gene complexes have common features of organization and expression. Cell 57, 367-378. https://doi.org/10.1016/0092-8674(89)90912-4 Green, M.M., 1984. Genetic instability in Drosophila melanogaster: Transpositions of the white gene and their role in the phenotypic expression of the zeste gene. Molec. Gen. Genet. 194, 275-278. https://doi.org/10.1007/BF00383527 Gruzdeva, N., Kyrchanova, O., Parshikov, A., Kullyev, A., Georgiev, P., 2005. The Mcp element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication. Mol. Cell. Biol. 25, 3682-3689. https://doi.org/10.1128/MCB.25.9.3682-3689.2005 Guo, Y., Xu, Q., Canzio, D., Shou, J., Li, J., Gorkin, D.U., Jung, I., Wu, H., Zhai, Y., Tang, Y., Lu, Y., Wu, Y., Jia, Z., Li, W., Zhang, M.Q., Ren, B., Krainer, A.R., Maniatis, T., Wu, Q., 2015. CRISPR Inversion of CTCF Sites Alters Genome Topology and Enhancer/Promoter Function. Cell 162, 900-910.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.07.038

Gyurkovics, H., Gausz, J., Kummer, J., Karch, F., 1990. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 9, 2579-2585. Haarhuis, J.H.I., van der Weide, R.H., Blomen, V.A., Yáñez-Cuna, J.O., Amendola, M., van Ruiten, M.S., Krijger, P.H.L., Teunissen, H., Medema, R.H., van Steensel, B., Brummelkamp, T.R., de Wit, E., Rowland, B.D., 2017. The Cohesin Release Factor WAPL Restricts Chromatin Loop Extension. Cell 169, 693-707.e14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.013 Hampsey, M., 1998. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional

machinery. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 465-503. Hansen, A.S., Cattoglio, C., Darzacq, X., Tjian, R., 2017a. Recent evidence that TADs and chromatin loops are dynamic structures. Nucleus 9, 20-32. https://doi.org/10.1080/19491034.2017.1389365 Hansen, A.S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X., 2017b. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife 6. https://doi.org/10.7554/eLife.25776 Heinz, S., Romanoski, C.E., Benner, C., Glass, C.K., 2015. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, 144-154. https://doi.org/10.1038/nrm3949 Hogga, I., Mihaly, J., Barges, S., Karch, F., 2001. Replacement of Fab-7 by the gypsy or scs insulator disrupts long-distance regulatory interactions in the Abd-B gene of the bithorax complex. Mol. Cell 8, 1145-1151. https://doi.org/10.1016/s1097-2765(01)00377-x

Holohan, E.E., Kwong, C., Adryan, B., Bartkuhn, M., Herold, M., Renkawitz, R., Russell, S., White, R., 2007. CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex. PLoS Genet. 3, e112. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0030112 Horn, C., Jaunich, B., Wimmer, E.A., 2000. Highly sensitive, fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis. Dev. Genes Evol. 210, 623-629. https://doi.org/10.1007/s004270000111 Hoskins, R.A., Landolin, J.M., Brown, J.B., Sandler, J.E., Takahashi, H., Lassmann, T., Yu, C., Booth, B.W., Zhang, D., Wan, K.H., Yang, L., Boley, N., Andrews, J., Kaufman, T.C., Graveley, B.R., Bickel, P.J., Carninci, P., Carlson, J.W., Celniker, S.E., 2011. Genome-wide analysis of promoter architecture in Drosophila melanogaster. Genome Res. 21, 182-192. https://doi.org/10.1101/gr.112466.110 Hou, C., Li, L., Qin, Z.S., Corces, V.G., 2012. Gene density, transcription, and insulators contribute to the partition of the Drosophila genome into physical domains. Mol. Cell 48, 471-484. https://doi.org/10.1016Zj.molcel.2012.08.031 Hug, C.B., Grimaldi, A.G., Kruse, K., Vaquerizas, J.M., 2017. Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription. Cell 169, 216-228.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.03.024 Iampietro, C., Gummalla, M., Mutero, A., Karch, F., Maeda, R.K., 2010. Initiator elements function to determine the activity state of BX-C enhancers. PLoS Genet. 6, e1001260. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1001260 Irish, V.F., Martinez-Arias, A., Akam, M., 1989. Spatial regulation of the Antennapedia and Ultrabithorax homeotic genes during Drosophila early development. EMBO J. 8, 1527-1537.

Ivanov, D., Nasmyth, K., 2005. A topological interaction between cohesin rings and a circular minichromosome. Cell 122, 849-860.

https://doi.org/10.1016Zj.cell.2005.07.018 Izpisua-Belmonte, J.C., Falkenstein, H., Dolle, P., Renucci, A., Duboule, D., 1991. Murine genes related to the Drosophila AbdB homeotic genes are sequentially expressed during development of the posterior part of the body. EMBO J. 10, 2279-2289. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S.B., 2006. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell 125, 1387-1399. https://doi.org/10.1016yj.cell.2006.04.043 Jolma, A., Yan, J., Whitington, T., Toivonen, J., Nitta, K.R., Rastas, P., Morgunova, E., Enge, M., Taipale, M., Wei, G., Palin, K., Vaquerizas, J.M., Vincentelli, R., Luscombe, N.M., Hughes, T.R., Lemaire, P., Ukkonen, E., Kivioja, T., Taipale, J., 2013. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell 152, 327-339. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.12.009 Jolma, A., Yin, Y., Nitta, K.R., Dave, K., Popov, A., Taipale, M., Enge, M., Kivioja, T., Morgunova, E., Taipale, J., 2015. DNA-dependent formation of transcription factor pairs alters their binding specificity. Nature 527, 384-388. https://doi.org/10.1038/nature15518 Joti, Y., Hikima, T., Nishino, Y., Kamada, F., Hihara, S., Takata, H., Ishikawa, T., Maeshima, K., 2012. Chromosomes without a 30-nm chromatin fiber. Nucleus 3, 404-410. https://doi.org/10.4161/nucl.21222 Jung, Y.H., Sauria, M.E.G., Lyu, X., Cheema, M.S., Ausio, J., Taylor, J., Corces, V.G., 2017. Chromatin States in Mouse Sperm Correlate with Embryonic and Adult Regulatory Landscapes. Cell Rep 18, 1366-1382.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.01.034 Juven-Gershon, T., Hsu, J.-Y., Kadonaga, J.T., 2008. Caudal, a key developmental regulator, is a DPE-specific transcriptional factor. Genes Dev. 22, 2823-2830. https://doi.org/10.1101/gad.1698108 Juven-Gershon, T., Kadonaga, J.T., 2010. Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery. Dev. Biol. 339, 225-229. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2009.08.009 Kaaij, L.J.T., van der Weide, R.H., Ketting, R.F., de Wit, E., 2018. Systemic Loss and Gain of Chromatin Architecture throughout Zebrafish Development. Cell Rep 24, 1-10.e4. https://doi.org/10.1016/jxelrep.2018.06.003 Kadonaga, J.T., 2012. Perspectives on the RNA polymerase II core promoter. Wiley

Interdiscip Rev Dev Biol 1, 40-51. https://doi.org/10.1002/wdev.21 Karch, F., Galloni, M., Sipos, L., Gausz, J., Gyurkovics, H., Schedl, P., 1994. Mcp and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 22, 3138-3146. https://doi.org/10.1093/nar/22.15.3138 Karch, F., Weiffenbach, B., Peifer, M., Bender, W., Duncan, I., Celniker, S., Crosby, M., Lewis, E.B., 1985. The abdominal region of the bithorax complex. Cell 43, 81-96. https://doi.org/10.1016/0092-8674(85)90014-5 Karess, R.E., Rubin, G.M., 1984. Analysis of P transposable element functions in

Drosophila. Cell 38, 135-146. https://doi.org/10.1016/0092-8674(84)90534-8 Kellum, R., Schedl, P., 1992. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell. Biol. 12, 2424-2431. https://doi.org/10.1128/mcb.12.5.2424

Kellum, R., Schedl, P., 1991. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64, 941-950. https://doi.org/10.1016/0092-8674(91)90318-s

Kennison, J.A., 1993. Transcriptional activation of Drosophila homeotic genes from distant regulatory elements. Trends Genet. 9, 75-79. https://doi.org/10.1016/0168-9525(93)90227-9

Kim, T.-K., Hemberg, M., Gray, J.M., Costa, A.M., Bear, D.M., Wu, J., Harmin, D.A., Laptewicz, M., Barbara-Haley, K., Kuersten, S., Markenscoff-Papadimitriou, E., Kuhl, D., Bito, H., Worley, P.F., Kreiman, G., Greenberg, M.E., 2010. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature 465, 182-187. https://doi.org/10.1038/nature09033 Kostyuchenko, M., Savitskaya, E., Koryagina, E., Melnikova, L., Karakozova, M., Georgiev, P., 2009. Zeste can facilitate long-range enhancer-promoter communication and insulator bypass in Drosophila melanogaster. Chromosoma 118, 665-674. https://doi.org/10.1007/s00412-009-0226-4 Kuhn, E.J., Hart, C.M., Geyer, P.K., 2004. Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol. Cell. Biol. 24, 1470-1480. https://doi.org/10.1128/mcb.24A 1470-1480.2004 Kyrchanova, O., Chetverina, D., Maksimenko, O., Kullyev, A., Georgiev, P., 2008a. Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements. Nucleic Acids Res. 36, 7019-7028. https://doi.org/10.1093/nar/gkn781 Kyrchanova, O., Georgiev, P., 2014. Chromatin insulators and long-distance interactions in Drosophila. FEBS Lett. 588, 8-14. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2013.10.039 Kyrchanova, O., Ivlieva, T., Toshchakov, S., Parshikov, A., Maksimenko, O., Georgiev, P., 2011. Selective interactions of boundaries with upstream region of Abd-B promoter in Drosophila bithorax complex and role of dCTCF in this process. Nucleic Acids Res. 39, 3042-3052. https://doi.org/10.1093/nar/gkq1248 Kyrchanova, O., Maksimenko, O., Stakhov, V., Ivlieva, T., Parshikov, A., Studitsky, V.M., Georgiev, P., 2013. Effective blocking of the white enhancer requires cooperation between two main mechanisms suggested for the insulator function. PLoS Genet. 9, e1003606. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003606 Kyrchanova, O., Mogila, V., Wolle, D., Deshpande, G., Parshikov, A., Cléard, F., Karch, F., Schedl, P., Georgiev, P., 2016. Functional Dissection of the Blocking and Bypass Activities of the Fab-8 Boundary in the Drosophila Bithorax Complex. PLoS Genet. 12, e1006188. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006188 Kyrchanova, O., Mogila, V., Wolle, D., Magbanua, J.P., White, R., Georgiev, P., Schedl, P., 2015. The boundary paradox in the Bithorax complex. Mech. Dev. 138 Pt 2, 122-132. https://doi.org/10.1016/j.mod.2015.07.002 Kyrchanova, O., Toshchakov, S., Podstreshnaya, Y., Parshikov, A., Georgiev, P., 2008b. Functional interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in the Drosophila Abd-B gene. Mol. Cell. Biol. 28, 4188-4195. https://doi.org/10.1128/MCB.00229-08 Kyrchanova, O., Zolotarev, N., Mogila, V., Maksimenko, O., Schedl, P., Georgiev, P., 2017. Architectural protein Pita cooperates with dCTCF in organization of functional boundaries in Bithorax complex. Development 144, 2663-2672. https://doi.org/10.1242/dev.149815

Kyrchanova, O.V., Georgiev, P.G., 2015. The bithorax complex of Drosophila melanogaster as a model for studying specific long-distance interactions between enhancers and promoters. Russ J Genet 51, 440-448. https://doi.org/10.1134/S1022795415050038 Kyrchanova, O.V., Ivleva, T.A., Georgiev, P.G., 2011. [Interacting insulators from the Drosophila melanogaster bithorax complex can form independent expression domains]. Genetika 47, 1586-1595. Lengronne, A., Katou, Y., Mori, S., Yokobayashi, S., Kelly, G.P., Itoh, T., Watanabe, Y., Shirahige, K., Uhlmann, F., 2004. Cohesin relocation from sites of chromosomal loading to places of convergent transcription. Nature 430, 573-578. https://doi.org/10.1038/nature02742 Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P., 2012. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nat. Rev. Genet. 13, 233-245. https://doi.org/10.1038/nrg3163 Lettice, L.A., Williamson, I., Devenney, P.S., Kilanowski, F., Dorin, J., Hill, R.E., 2014. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development 141, 1715-1725. https://doi.org/10.1242/dev.095430 Lewis, E.B., 1978. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276,

565-570. https://doi.org/10.1038/276565a0 Li, H.-B., Müller, M., Bahechar, I.A., Kyrchanova, O., Ohno, K., Georgiev, P., Pirrotta, V., 2011. Insulators, not Polycomb response elements, are required for long-range interactions between Polycomb targets in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 31, 616-625. https://doi.org/10.1128/MCB.00849-10 Li, X., MacArthur, S., Bourgon, R., Nix, D., Pollard, D.A., Iyer, V.N., Hechmer, A., Simirenko, L., Stapleton, M., Luengo Hendriks, C.L., Chu, H.C., Ogawa, N., Inwood, W., Sementchenko, V., Beaton, A., Weiszmann, R., Celniker, S.E., Knowles, D.W., Gingeras, T., Speed, T.P., Eisen, M.B., Biggin, M.D., 2008. Transcription factors bind thousands of active and inactive regions in the Drosophila blastoderm. PLoS Biol. 6, e27. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060027 Lieberman-Aiden, E., van Berkum, N.L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling,

A., Amit, I., Lajoie, B.R., Sabo, P.J., Dorschner, M.O., Sandstrom, R., Bernstein,

B., Bender, M.A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L.A., Lander, E.S., Dekker, J., 2009. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science 326, 289-293. https://doi.org/10.1126/science.1181369

Lin, Q., Wu, D., Zhou, J., 2003. The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development 130, 519-526. https://doi.org/10.1242/dev.00227 Lupianez, D.G., Kraft, K., Heinrich, V., Krawitz, P., Brancati, F., Klopocki, E., Horn, D., Kayserili, H., Opitz, J.M., Laxova, R., Santos-Simarro, F., Gilbert-Dussardier, B., Wittler, L., Borschiwer, M., Haas, S.A., Osterwalder, M., Franke, M., Timmermann, B., Hecht, J., Spielmann, M., Visel, A., Mundlos, S., 2015. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell 161, 1012-1025.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.004 Maeda, R.K., Karch, F., 2015. The open for business model of the bithorax complex in Drosophila. Chromosoma 124, 293-307. https://doi.org/10.1007/s00412-015-0522-0

Maeda, R.K., Karch, F., 2006. The ABC of the BX-C: the bithorax complex explained.

Development 133, 1413-1422. https://doi.org/10.1242/dev.02323 Maeshima, K., Hihara, S., Takata, H., 2010. New insight into the mitotic chromosome structure: irregular folding of nucleosome fibers without 30-nm chromatin structure. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 75, 439-444. https://doi.org/10.1101/sqb.2010.75.034 Maksimenko, O., Bartkuhn, M., Stakhov, V., Herold, M., Zolotarev, N., Jox, T., Buxa, M.K., Kirsch, R., Bonchuk, A., Fedotova, A., Kyrchanova, O., Renkawitz, R., Georgiev, P., 2015. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99. https://doi.org/10.1101/gr.174169.114 Maksimenko, O., Kyrchanova, O., Bonchuk, A., Stakhov, V., Parshikov, A., Georgiev, P., 2014. Highly conserved ENY2/Sus1 protein binds to Drosophila CTCF and is required for barrier activity. Epigenetics 9, 1261-1270. https://doi.org/10.4161/epi.32086 Mallo, M., Wellik, D.M., Deschamps, J., 2010. Hox genes and regional patterning of the vertebrate body plan. Dev. Biol. 344, 7-15. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2010.04.024 Martin, C.H., Mayeda, C.A., Davis, C.A., Ericsson, C.L., Knafels, J.D., Mathog, D.R., Celniker, S.E., Lewis, E.B., Palazzolo, M.J., 1995. Complete sequence of the bithorax complex of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8398-8402. https://doi.org/10.1073/pnas.92.18.8398 Martinez, S.R., Miranda, J.L., 2010. CTCF terminal segments are unstructured. Protein

Sci. 19, 1110-1116. https://doi.org/10.1002/pro.367 Mateo, L.J., Murphy, S.E., Hafner, A., Cinquini, I.S., Walker, C.A., Boettiger, A.N., 2019. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature 568, 49-54. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1035-4 Merika, M., Thanos, D., 2001. Enhanceosomes. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 205-208.

https://doi.org/10.1016/s0959-437x(00)00180-5 Mifsud, B., Tavares-Cadete, F., Young, A.N., Sugar, R., Schoenfelder, S., Ferreira, L., Wingett, S.W., Andrews, S., Grey, W., Ewels, P.A., Herman, B., Happe, S., Higgs, A., LeProust, E., Follows, G.A., Fraser, P., Luscombe, N.M., Osborne, C.S., 2015. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nat. Genet. 47, 598-606. https://doi.org/10.1038/ng.3286 Mihaly, J., Barges, S., Sipos, L., Maeda, R., Cleard, F., Hogga, I., Bender, W., Gyurkovics, H., Karch, F., 2006. Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex. Development 133, 2983-2993.

https://doi.org/10.1242/dev.02451 Mihaly, J., Hogga, I., Barges, S., Galloni, M., Mishra, R.K., Hagstrom, K., Müller, M., Schedl, P., Sipos, L., Gausz, J., Gyurkovics, H., Karch, F., 1998. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell. Mol. Life Sci. 54, 60-70. https://doi.org/10.1007/s000180050125 Misulovin, Z., Schwartz, Y.B., Li, X.-Y., Kahn, T.G., Gause, M., MacArthur, S., Fay, J.C., Eisen, M.B., Pirrotta, V., Biggin, M.D., Dorsett, D., 2008. Association of cohesin and Nipped-B with transcriptionally active regions of the Drosophila melanogaster genome. Chromosoma 117, 89-102. https://doi.org/10.1007/s00412-007-0129-1 Modolell, J., Bender, W., Meselson, M., 1983. Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile

element. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1678-1682. https://doi.org/10.1073/pnas.80.6.1678 Moon, H., Filippova, G., Loukinov, D., Pugacheva, E., Chen, Q., Smith, S.T., Munhall, A., Grewe, B., Bartkuhn, M., Arnold, R., Burke, L.J., Renkawitz-Pohl, R., Ohlsson, R., Zhou, J., Renkawitz, R., Lobanenkov, V., 2005. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer blocking of the Fab-8 insulator. EMBO Rep. 6, 165-170. https://doi.org/10.1038/sj.embor.7400334 Muller, M., Hagstrom, K., Gyurkovics, H., Pirrotta, V., Schedl, P., 1999. The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics 153, 1333-1356. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, A., Belenkaya, T., Pirrotta, V., Georgiev, P., 2001. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291, 495-498. https://doi.org/10.1126/science.291.5503.495 Narendra, V., Rocha, P.P., An, D., Raviram, R., Skok, J.A., Mazzoni, E.O., Reinberg, D., 2015. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science 347, 1017-1021.

https://doi.org/10.1126/science.1262088 Nègre, N., Brown, C.D., Shah, P.K., Kheradpour, P., Morrison, C.A., Henikoff, J.G., Feng, X., Ahmad, K., Russell, S., White, R.A.H., Stein, L., Henikoff, S., Kellis, M., White, K.P., 2010. A comprehensive map of insulator elements for the Drosophila genome. PLoS Genet. 6, e1000814. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000814 Ni, T., Corcoran, D.L., Rach, E.A., Song, S., Spana, E.P., Gao, Y., Ohler, U., Zhu, J., 2010. A paired-end sequencing strategy to map the complex landscape of transcription initiation. Nat. Methods 7, 521-527. https://doi.org/10.1038/nmeth.1464 Nora, E.P., Goloborodko, A., Valton, A.-L., Gibcus, J.H., Uebersohn, A., Abdennur, N., Dekker, J., Mirny, L.A., Bruneau, B.G., 2017. Targeted Degradation of CTCF Decouples Local Insulation of Chromosome Domains from Genomic Compartmentalization. Cell 169, 930-944.e22.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.004 Nora, E.P., Lajoie, B.R., Schulz, E.G., Giorgetti, L., Okamoto, I., Servant, N., Piolot, T., van Berkum, N.L., Meisig, J., Sedat, J., Gribnau, J., Barillot, E., Blüthgen, N., Dekker, J., Heard, E., 2012. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature 485, 381-385. https://doi.org/10.1038/nature11049 Pai, C.-Y., Lei, E.P., Ghosh, D., Corces, V.G., 2004. The centrosomal protein CP190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell 16, 737-748. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.11.004 Paro, R., 1990. Imprinting a determined state into the chromatin of Drosophila. Trends

Genet. 6, 416-421. https://doi.org/10.1016/0168-9525(90)90303-n Patrinos, G.P., de Krom, M., de Boer, E., Langeveld, A., Imam, A.M.A., Strouboulis, J., de Laat, W., Grosveld, F.G., 2004. Multiple interactions between regulatory regions are required to stabilize an active chromatin hub. Genes Dev. 18, 1495-1509. https://doi.org/10.1101/gad.289704 Pérez-Lluch, S., Cuartero, S., Azorin, F., Espinàs, M.L., 2008. Characterization of new regulatory elements within the Drosophila bithorax complex. Nucleic Acids Res. 36, 6926-6933. https://doi.org/10.1093/nar/gkn818 Pirrotta, V., 1997. Chromatin-silencing mechanisms in Drosophila maintain patterns of gene expression. Trends Genet. 13, 314-318. https://doi.org/10.1016/s0168-9525(97)01178-5

Pirrotta, V., 1988. Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology

10, 437-456. https://doi.org/10.1016/b978-0-409-90042-2.50028-3 Pott, S., Lieb, J.D., 2015. What are super-enhancers? Nat. Genet. 47, 8-12.

https://doi.org/10.1038/ng.3167 Rach, E.A., Winter, D.R., Benjamin, A.M., Corcoran, D.L., Ni, T., Zhu, J., Ohler, U., 2011. Transcription Initiation Patterns Indicate Divergent Strategies for Gene Regulation at the Chromatin Level. PLOS Genetics 7, e1001274. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1001274 Rach, E.A., Yuan, H.-Y., Majoros, W.H., Tomancak, P., Ohler, U., 2009. Motif composition, conservation and condition-specificity of single and alternative transcription start sites in the Drosophila genome. Genome Biol. 10, R73. https://doi.org/10.1186/gb-2009-10-7-r73 Ramirez, F., Bhardwaj, V., Arrigoni, L., Lam, K.C., Grüning, B.A., Villaveces, J., Habermann, B., Akhtar, A., Manke, T., 2018. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nat Commun 9, 189. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02525-w Rao, S.S.P., Huang, S.-C., Glenn St Hilaire, B., Engreitz, J.M., Perez, E.M., Kieffer-Kwon, K.-R., Sanborn, A.L., Johnstone, S.E., Bascom, G.D., Bochkov, I.D., Huang, X., Shamim, M.S., Shin, J., Turner, D., Ye, Z., Omer, A.D., Robinson, J.T., Schlick, T., Bernstein, B.E., Casellas, R., Lander, E.S., Aiden, E.L., 2017. Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell 171, 305-320.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.026 Rao, S.S.P., Huntley, M.H., Durand, N.C., Stamenova, E.K., Bochkov, I.D., Robinson, J.T., Sanborn, A.L., Machol, I., Omer, A.D., Lander, E.S., Aiden, E.L., 2014. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell 159, 1665-1680. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.021 Rebeiz, M., Williams, T.M., 2017. Using Drosophila pigmentation traits to study the mechanisms of cis-regulatory evolution. Curr Opin Insect Sci 19, 1-7. https://doi.org/10.1016yj.cois.2016.10.002 Roider, H.G., Lenhard, B., Kanhere, A., Haas, S.A., Vingron, M., 2009. CpG-depleted promoters harbor tissue-specific transcription factor binding signals--implications for motif overrepresentation analyses. Nucleic Acids Res. 37, 6305-6315. https://doi.org/10.1093/nar/gkp682 Roseman, R.R., Pirrotta, V., Geyer, P.K., 1993. The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12, 435-442. Rowley, M.J., Nichols, M.H., Lyu, X., Ando-Kuri, M., Rivera, I.S.M., Hermetz, K., Wang, P., Ruan, Y., Corces, V.G., 2017. Evolutionarily Conserved Principles Predict 3D Chromatin Organization. Mol. Cell 67, 837-852.e7. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.07.022 Sanborn, A.L., Rao, S.S.P., Huang, S.-C., Durand, N.C., Huntley, M.H., Jewett, A.I., Bochkov, I.D., Chinnappan, D., Cutkosky, A., Li, J., Geeting, K.P., Gnirke, A., Melnikov, A., McKenna, D., Stamenova, E.K., Lander, E.S., Aiden, E.L., 2015. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wildtype and engineered genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, E6456-6465. https://doi.org/10.1073/pnas.1518552112

Sánchez-Herrero, E., Vemós, I., Marco, R., Morata, G., 1985. Genetic organization of Drosophila bithorax complex. Nature 313, 108-113. https://doi.org/10.1038/313108a0 Savitsky, M., Kim, M., Kravchuk, O., Schwartz, Y.B., 2016. Distinct Roles of Chromatin Insulator Proteins in Control of the Drosophila Bithorax Complex. Genetics 202, 601-617. https://doi.org/10.1534/genetics.115.179309 Schaaf, C.A., Misulovin, Z., Gause, M., Koenig, A., Gohara, D.W., Watson, A., Dorsett, D., 2013. Cohesin and polycomb proteins functionally interact to control transcription at silenced and active genes. PLoS Genet. 9, e 1003560. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003560 Schoenfelder, S., Fraser, P., 2019. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nat. Rev. Genet. 20, 437-455. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0128-0

Schoenfelder, S., Furlan-Magaril, M., Mifsud, B., Tavares-Cadete, F., Sugar, R., Javierre, B.-M., Nagano, T., Katsman, Y., Sakthidevi, M., Wingett, S.W., Dimitrova, E., Dimond, A., Edelman, L.B., Elderkin, S., Tabbada, K., Darbo, E., Andrews, S., Herman, B., Higgs, A., LeProust, E., Osborne, C.S., Mitchell, J.A., Luscombe, N.M., Fraser, P., 2015. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Res. 25, 582-597. https://doi.org/10.1101/gr.185272.114 Schwarzer, W., Abdennur, N., Goloborodko, A., Pekowska, A., Fudenberg, G., Loe-Mie, Y., Fonseca, N.A., Huber, W., Haering, C.H., Mirny, L., Spitz, F., 2017. Two independent modes of chromatin organization revealed by cohesin removal. Nature 551, 51-56. https://doi.org/10.1038/nature24281 Scott, K.C., Taubman, A.D., Geyer, P.K., 1999. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153, 787-798.

Sexton, T., Yaffe, E., Kenigsberg, E., Bantignies, F., Leblanc, B., Hoichman, M., Parrinello, H., Tanay, A., Cavalli, G., 2012. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell 148, 458-472. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.01.010 Shen, Y., Yue, F., McCleary, D.F., Ye, Z., Edsall, L., Kuan, S., Wagner, U., Dixon, J., Lee, L., Lobanenkov, V.V., Ren, B., 2012. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature 488, 116-120. https://doi.org/10.1038/nature11243 Shimell, M.J., Simon, J., Bender, W., O'Connor, M.B., 1994. Enhancer point mutation results in a homeotic transformation in Drosophila. Science 264, 968-971. https://doi.org/10.1126/science.7909957 Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A., 2014. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat. Rev. Genet. 15, 272-286. https://doi.org/10.1038/nrg3682 Simon, J., 1995. Locking in stable states of gene expression: transcriptional control during Drosophila development. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 376-385. https://doi.org/10.1016/0955-0674(95)80093-x Skibbens, R.V., 2016. Of Rings and Rods: Regulating Cohesin Entrapment of DNA to Generate Intra- and Intermolecular Tethers. PLoS Genet. 12, e1006337. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006337 Smith, S.T., Wickramasinghe, P., Olson, A., Loukinov, D., Lin, L., Deng, J., Xiong, Y., Rux, J., Sachidanandam, R., Sun, H., Lobanenkov, V., Zhou, J., 2009. Genome wide

ChIP-chip analyses reveal important roles for CTCF in Drosophila genome organization. Dev. Biol. 328, 518-528. https://doi.org/10.1016Zj.ydbio.2008.12.039 Soutourina, J., 2018. Transcription regulation by the Mediator complex. Nat. Rev. Mol.

Cell Biol. 19, 262-274. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.115 Spitz, F., Furlong, E.E.M., 2012. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat. Rev. Genet. 13, 613-626. https://doi.org/10.1038/nrg3207 Starr, M.O., Ho, M.C.W., Gunther, E.J.M., Tu, Y.-K., Shur, A.S., Goetz, S.E., Borok, M.J., Kang, V., Drewell, R.A., 2011. Molecular dissection of cis-regulatory modules at the Drosophila bithorax complex reveals critical transcription factor signature motifs. Dev. Biol. 359, 290-302. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2011.07.028 Sun, F.L., Elgin, S.C., 1999. Putting boundaries on silence. Cell 99, 459-462.

https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81534-2 Symmons, O., Uslu, V.V., Tsujimura, T., Ruf, S., Nassari, S., Schwarzer, W., Ettwiller, L., Spitz, F., 2014. Functional and topological characteristics of mammalian regulatory domains. Genome Res. 24, 390-400. https://doi.org/10.1101/gr.163519.113 Thomas, M.C., Chiang, C.-M., 2006. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41, 105-178. https://doi.org/10.1080/10409230600648736 Tschopp, P., Christen, A.J., Duboule, D., 2012. Bimodal control of Hoxd gene transcription in the spinal cord defines two regulatory subclusters. Development 139, 929-939. https://doi.org/10.1242/dev.076794 Udvardy, A., Maine, E., Schedl, P., 1985. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J. Mol. Biol. 185, 341-358. https://doi.org/10.1016/0022-2836(85)90408-5

Ulianov, S.V., Khrameeva, E.E., Gavrilov, A.A., Flyamer, I.M., Kos, P., Mikhaleva, E.A., Penin, A.A., Logacheva, M.D., Imakaev, M.V., Chertovich, A., Gelfand, M.S., Shevelyov, Y.Y., Razin, S.V., 2016. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Res. 26, 70-84. https://doi.org/10.1101/gr.196006.115 Van Bortle, K., Nichols, M.H., Li, L., Ong, C.-T., Takenaka, N., Qin, Z.S., Corces, V.G., 2014. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biol. 15, R82. https://doi.org/10.1186/gb-2014-15-5-r82

Vazquez, J., Müller, M., Pirrotta, V., Sedat, J.W., 2006. The Mcp Element Mediates Stable Long-Range Chromosome-Chromosome Interactions in Drosophila. Mol Biol Cell 17, 2158-2165. https://doi.org/10.1091/mbc.E06-01-0049 Vietri Rudan, M., Barrington, C., Henderson, S., Ernst, C., Odom, D.T., Tanay, A., Hadjur, S., 2015. Comparative Hi-C reveals that CTCF underlies evolution of chromosomal domain architecture. Cell Rep 10, 1297-1309.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.02.004 Visel, A., Blow, M.J., Li, Z., Zhang, T., Akiyama, J.A., Holt, A., Plajzer-Frick, I., Shoukry, M., Wright, C., Chen, F., Afzal, V., Ren, B., Rubin, E.M., Pennacchio, L.A., 2009. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature 457, 854858. https://doi.org/10.1038/nature07730

Vokes, S.A., Ji, H., Wong, W.H., McMahon, A.P., 2008. A genome-scale analysis of the cis-regulatory circuitry underlying sonic hedgehog-mediated patterning of the mammalian limb. Genes Dev. 22, 2651-2663. https://doi.org/10.1101/gad.1693008 Wang, D.C., Wang, W., Zhang, L., Wang, X., 2019. A tour of 3D genome with a focus on CTCF. Semin. Cell Dev. Biol. 90, 4-11.

https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.07.020 Wang, Q., Sun, Q., Czajkowsky, D.M., Shao, Z., 2018. Sub-kb Hi-C in D. melanogaster reveals conserved characteristics of TADs between insect and mammalian cells. Nat Commun 9, 188. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02526-9 Weintraub, A.S., Li, C.H., Zamudio, A.V., Sigova, A.A., Hannett, N.M., Day, D.S., Abraham, B.J., Cohen, M.A., Nabet, B., Buckley, D.L., Guo, Y.E., Hnisz, D., Jaenisch, R., Bradner, J.E., Gray, N.S., Young, R.A., 2017. YY1 Is a Structural Regulator of Enhancer-Promoter Loops. Cell 171, 1573-1588.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.008 Weirauch, M.T., Yang, A., Albu, M., Cote, A.G., Montenegro-Montero, A., Drewe, P., Najafabadi, H.S., Lambert, S.A., Mann, I., Cook, K., Zheng, H., Goity, A., van Bakel, H., Lozano, J.-C., Galli, M., Lewsey, M.G., Huang, E., Mukherjee, T., Chen, X., Reece-Hoyes, J.S., Govindarajan, S., Shaulsky, G., Walhout, A.J.M., Bouget, F.-Y., Ratsch, G., Larrondo, L.F., Ecker, J.R., Hughes, T.R., 2014. Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Cell 158, 1431-1443. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.009 White, R.A., Lehmann, R., 1986. A gap gene, hunchback, regulates the spatial expression of Ultrabithorax. Cell 47, 311-321. https://doi.org/10.1016/0092-8674(86)90453-8 Wolle, D., Cleard, F., Aoki, T., Deshpande, G., Schedl, P., Karch, F., 2015. Functional Requirements for Fab-7 Boundary Activity in the Bithorax Complex. Mol. Cell. Biol. 35, 3739-3752. https://doi.org/10.1128/MCB.00456-15 Wu, H., Nord, A.S., Akiyama, J.A., Shoukry, M., Afzal, V., Rubin, E.M., Pennacchio, L.A., Visel, A., 2014. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genet. 10, e1004610. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004610 Young, T., Rowland, J.E., van de Ven, C., Bialecka, M., Novoa, A., Carapuco, M., van Nes, J., de Graaff, W., Duluc, I., Freund, J.-N., Beck, F., Mallo, M., Deschamps, J., 2009. Cdx and Hox genes differentially regulate posterior axial growth in mammalian embryos. Dev. Cell 17, 516-526.

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2009.08.010 Yuen, K.C., Slaughter, B.D., Gerton, J.L., 2017. Condensin II is anchored by TFIIIC and H3K4me3 in the mammalian genome and supports the expression of active dense gene clusters. Sci Adv 3, e1700191. https://doi.org/10.1126/sciadv.1700191 Zhao, K., Hart, C.M., Laemmli, U.K., 1995. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. Cell 81, 879-889. https://doi.org/10.1016/0092-8674(95)90008-x Zhou, J., Barolo, S., Szymanski, P., Levine, M., 1996. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 10, 3195-3201. https://doi.org/10.1101/gad.10.24.3195 Zhou, J., Levine, M., 1999. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell 99, 567-575. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81546-9

Благодарности

Автор выражает благодарность Кырчановой Ольге Викторовне и Георгиеву Павлу Георгиевичу за участие в совместной работе, обсуждение результатов и подготовку публикаций.