Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе: детектирование флуоресцентным методом с использованием наносекундной спектроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Смолина, Наталья Викторовна

• Смолина, Наталья Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смолина, Наталья Викторовна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Некоторые сведения о сывороточном альбумине человека. Строение, функции, связывающие центры.

1.1.1. Метаболизм и распределение альбумина.

1.1.2. Распределение и циркуляция.

1.1.3. Функции альбумина в организме.

1.1.3.1. Поддержание онкотического давления плазмы.

1.1.3.2. Связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов

1.1.3.3. Альбумин — участник окислительио-восстановитсльных реакций в организме

1.1.3.4. Пластическая функция альбумина.

1.1.3.5. Регуляция гемостаза.

1.1.3.6. Участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови.

1.1.3.7. Регуляция апоптоза.

1.1.4. Структура молекулы.

1.1.4.1. Первичная последовательность.

1.1.4.2. Вторичная структура. Домены.

1.1.4.3. Распределение аминокислотных остатков и зарядов.]

1.1.5. Связывающие центры альбумина.

1.1.5.1. Главные («лекарственные») центры.

1.1.5.2. Центр связывания двухвалентных катионов.

1.1.5.3. Тиоловая группа остатка Суз-34.

1.1.5.4. Центры связывания неэстерифицированных жирных кислот.

1.1.5.5. «Минорные» центры.

1.1.6. Влияние физико-химических факторов на свойства центров альбумина.

1.1.6.1. Влияние рН.

1.1.6.2. Повышение температуры.

1.1.6.3. Концентрация неорганических солей.

1.1.6.4. Связывание лигандов.

1.2. Флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях.

1.2.1. Изучение белков с помощью красителей (история вопроса). Флуоресцентный зонд К-35.

1.2.2. Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА).

1.2.3. Информативность альбуминового флуоресцентного теста. Клинические наблюдения.

1.3. Конформационные изменения связывающих центров альбумина как универсальная реакция на патологический процесс.

1.4. Исследование молекулярных механизмов чувствительности альбуминового флуоресцентного теста. Достижения и нерешенные проблемы.

1.4.1. Определение параметров связывания К-35 с препаратами альбумина.

1.4.2. Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Реактивы.

2.2. Спектрофотометрия, спектрофлуорометрия.

2.3. Измерение затухания флуоресценции, анализ амплитуд.

2.4. Метод изучения гетерогенного затухания флуоресценции в биологических образцах («метод амплитудного стандарта»).

2.4.1. Выбор специальной среды (амплитудного стандарта).

2.4.2. Расчет парциальных концентраций молекул зонда в альбумине.

2.5. Тушение флуоресценции.

2.6. Ультрафильтрация.

2.7. Электрофорез.

2.8. Выделение фракции альбумина из сыворотки.

2.9. Определение уровня НЭЖК.

2.10. ЭК А, ОКА, массовая концентрация альбумина.

2.11. Квантово-химические расчеты.

2.12. Определение уровня гормонов.

2.13. Характеристика обследованных больных.

2.14. Животные.

2.15. Тест открытого поля, и характеристики поведения, острый стресс.

2.16. Статистический анализ результатов.

3. Результаты.

3.1. Роль различных центров в связывании альбумином флуоресцентного зонда К

3.1.1. Центры связывания зонда К-3 5 в молекуле ЧСА.

3.1.2. Оценка соотношения величин К; п; для разных центров.

3.1.3. Модель связывания зонда К-3 5 с ЧС А.

3.1.4. Центры связывания молекул К-35, не флуоресцирующих в альбумине.

3.1.5. Квантовый выход флуоресценции К-35 в растворе ЧСА.

3.1.6. Влияние маркеров связывающих центров I и II. на флуоресценцию К-35 из альбумина.

3.1.7. Влияние вариации ионного состава среды на затухание флуоресценции К-35 в альбумине.

3.1.8. Обсуждение результатов раздела.

3.2. Изменение связывающих центров альбумина при параноидной шизофрении и тревожной депрессии.

3.2.1. Исследование сывороток больных шизофренией с хроническим течением.

3.2.2. Исследование больных первого эпизода шизофрении.

3.2.2.1. Данные стационарной флуорометрии: различий между больными и добровольцами не обнаружено.

3.2.2.2. Наносекундная флуоресцентная спектроскопия выявила различия между больными первого эпизода и здоровыми.

3.2.3. Свойства альбуминовых центров у больных тревожной депрессией.

3.2.3.1. Свойства альбумина у больных депрессией с хроническим течением.

3.2.3.2 . Стационарная флуорометрия: больные депрессией до лечения, во время лечения и доноры неразличимы по свойствам альбумина.

3.2.3.3 Ранний эффект терапии тревожной депрессии: детектирование с помощью ианосекундной флуоресцентной спектроскопии.

3.3. Свойства альбуминовых центров у крыс с различным поведением в тесте открытого поля.

3.3.1. Избирательность флуоресценции К-35 из альбумина крыс.

3.3.2. Тестирование конформациопных свойств альбумина крыс.

3.3.3. Поведенческая активность животных в гесте открытого поля и свойства альбумина.

3.3.4. Перенос альбумином жирных кислот у крыс с различным поведением.

3.3.5. Уровень коргизола у животных разных групп.

4. Обсуждение.

4.1. Предпосылки и задачи работы.

4.2. Формирование сигнала флуоресценции К-35 из альбумина.

4.3. О механизме уменьшения флуоресценции К-35 в присутствии нитрата.

4.4. Свойства альбумина и поведенческие особенности крыс.

Выводы.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе: детектирование флуоресцентным методом с использованием наносекундной спектроскопии»

Поиск новых, более информативных показателей для оценки состояния организма в норме и при заболеваниях является актуальной задачей медико-биологической пауки. Такой поиск ведется различными методами, включая биофизические. В частности, в последние годы внимание исследователей привлекают изменения конформации (например, у прионов) и других физико-химических свойств белков, связанные с развитием патологических процессов в организме.

Одним из белков, легко подвергающихся модификациям, является альбумин - белок (около 66 кДа), составляющий около половины массы белков плазмы крови и присутствующий во всех жидкостях организма. В составе межклеточной жидкости альбумин взаимодействует почти со всеми клетками и в процессе циркуляции изменяется в зависимости от состояния органов и тканей. Около 15 лег назад в НИИ ФХМ был создан флуоресцентный метод для обнаружения модификаций альбумина. Метод основан на нековалентном взаимодействии с альбумином оригинального специфического красителя, получившего название К-35. В сыворотке или плазме крови К-35 флуоресцирует практически только из альбумина, что позволяет изучать этот белок без его выделения из плазмы, то есть в нативном состоянии [1,2].

Этот новый тест позволил обнаружить изменения центров альбумина при ряде заболеваний. Причем изменения оказались зависимы от тяжести состояния больного и прогноза развития заболевания. Клинические исследования показали высокую информативность флуоресцентного теста при распространенном перитоните, острых отравлениях, острых сердечно-сосудистых состояниях, при хронических заболеваниях печени, при ряде офтальмологических заболеваний [3-8].

Биофизические основы изменений альбуминовых центров при заболеваниях и механизмы высокой чувствительности показателей флуоресцентного теста к состоянию организма оставались во многом неясными. Раскрытие этих основ имеет как фундаментальное, так и прикладное значение для медико-биологической науки и биофизики.

Ранее взаимодействие К-35 с альбумином характеризовали лишь двумя измеряемыми флуоресцентными параметрами. Имело смысл увеличить число измеряемых параметров за счет регистрации кинетики затухания флуоресценции зонда, чтобы иметь больше информации об изменениях в молекуле альбумина. Эти новые параметры нуждались в физической интерпретации. Особенно актуально стоял вопрос об интерпретации гетерогенности затухания флуоресценции К-35 в альбумине.

Усовершенствовав таким образом метод, можно было попытаться обнаружить и исследовать изменения молекулы альбумина при психических расстройствах, особенно при их первом эпизоде (когда обычные лабораторные показатели чаще всего остаются в пределах нормы).

Изменения альбуминовых центров были обнаружены при самых разных заболеваниях [1,2]. Такая универсальность реакции альбумина на патологический процесс может быть связана с тем, что стресс, который сопровождает каждое заболевание, приводит к изменению связывающих центров альбумина. Необходимо было проверить это предположение в прямых опытах.

Анализ состояния проблемы позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы — повышение информативности флуоресцентного альбуминового теста и раскрытие механизмов его чувствительности к изменениям связывающих центров альбумина при заболеваниях.

Задачи исследования:

1. Методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ю-10 сек исследовать молекулярные механизмы взаимодействия! флуоресцентного зонда К-35 с альбумином.

2. Расширить информативность флуоресцентного альбуминового теста пу1ем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции зонда К-35 с временным разрешением Ю-10 сек.

3. Используя новые параметры, исследовать связывающие центры альбумина у больных параноидной шизофренией и депрессией при первом эпизоде болезни до начала терапии и при хроническом течении заболевания.

4. В прямых опытах на животных выяснить, существует ли связь между особенностями их поведения, реакцией на стресс и свойствами связывающих центров альбумина.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Смолина, Наталья Викторовна

Выводы

С целью повышения информативности флуоресцентного теста и раскрытия основ его чувствительности к состоянию организма при заболеваниях были изучены молекулярные механизмы взаимодействия зонда К-35 с альбуминовыми центрами методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ю-10 сек. С использованием новых параметров были исследованы изменения связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе. Результаты сводятся к следующему.

1. Зонд К-35 (Ы-(к ар б о кс и) ф ени л им ид диметиламинонафталевой кислоты) связывается с четырьмя центрами в молекуле альбумина и при связывании флуоресцирует как сумма компонент с временами затухания около 9, 3 и 1 наносекунд. Часть молекул зонда, связавшихся с альбумином, не флуоресцирует.

2. Молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с различными центрами в альбуминовой глобуле. Эти центры имеют разное сродство к 3 3 молекулам зонда (константы связывания составляют от 6*10 до 50*10 л/моль), и их взаимодействие с К-35 по-разному зависит от ионного состава среды и от присутствия специфических маркеров альбуминовых центров. Наносскупдная спектроскопия позволяет наблюдать за каждым типом центров в отдельности.

3. Информативность альбуминового флуоресцентного теста была расширена путем комбинации наносекупдной спектроскопии и воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава. Этот подход позволил различить больных первого эпизода параноидной шнзофрении (до начала лечения) и здоровых лиц (р<0,001), а также выявить влияние терапии при тревожной депрессии на 3-4-й неделе лечения (р<0.05).

4. У больных параноидной шизофренией и тревожной депрессией с хроническим (14±6 лет) течением заболевания изменения альбуминовых центров можно выявить методом стационарной флуорометрии, используя методику замены ионов хлора на попы нитрата в среде. Константа тушения флуоресценции К-35 в присутствии нитрата и доля флуоресценции зонда, доступной для тушения, у больных шизофренией п депрессией были достоверно ниже, чем у здоровых (р<0,01).

5. В прямых опытах на животных получены доказательства связи между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбумина. Время, затрачиваемое крысами на активное поведение, коррелировало (г = -0,55, р<0,001) с отношением интенсивности флуоресценции К-35 из альбумина при рН 7,4 к интенсивности при рН 4,2. Острый стресс приводил к увеличению этого отношения у более активных крыс и к уменьшению - у менее активных.

6. Выявлены факторы, лежащие в основе высокой чувствительности флуоресценции зонда К-35 к состоянию больных:

• зондирование глобулы альбумина молекулами К-35 в четырех различных центрах, что определяет чувствительность флуоресценции зонда к событиям в разных участках глобулы;

• различие реакций этих центров на процессы в организме, что детектируется методом наносекундной спектроскопии;

• влияние стресса как неспецифической составляющей заболеваний на альбуминовые центры, связывающие зонд К-35.

Работы, опубликованные по теме диссертации Статьи

1. Смолина Н.В., Грызунов Ю.А., Дегтярев Д.Н., Иванова А.В. Изучение свойств альбумина новорожденных методом тушения флуоресценции. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Кн. 2. Под ред. Ю. А. Грызунова и Г. Е. Добрсцова. Москва: ГЭОТАР. 1998:333-336.

2. Коплик Е.В., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Кошева J1. Б., Добрецов Г.Е., Судаков К. В. Сывороточный альбумин у крыс с различной устойчивостью к эмоциональным стрессорным нагрузкам. Системный подход в физиологии. Труды Межведомственного Научного Совета по Экспериментальной и Прикладной Физиологии. 2004, (12):301-316.

3. Gryzunov Yu., Koplik Е., Smolina N., Kopaeva L., Dobretsov G., Sudakov K. Conformational properties of serum albumin binding sites in rats with different behaviour in the open field test. The International Journal on the Biology of Stress. 2006, 9(l):53-60.

4. Смолина H.B., Грызунов 10.А., Максимова H.M., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Вертоградова О.П. Свойства связывающих центров молекулы альбумина у больных тревожной депрессией: исследование методом тушения флюоресценции. Бюллетень экспериментальной биологи и медицины 2007; (11):514-516. (Smolina N.V., Gryzunov Y.A., Maximova N.M., Dobretsov G.E., Uzbekov M.G., Misionzhnik E.Y., Vertogradova O.P. Characteristics of albumin molecule binding centers in patients with anxious depression. Study by the fluorescence quenching method. Bull Exp Biol Med. 2007, 144(5):674-676.)

5. Узбеков М.Г. Смолина И.В., Мисионжник Э.Ю., Молодецких А.В., Добрецов Г. Е., Грызунов Ю.А. Нарушение конформации связывающих центров сывороточного альбумина при шизофрении. Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 2008, 5(108):67-70.

6. Сырейщикова Т.Н., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Комар А.А, Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецких А.В., Максимова Н.М. (2008) Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия белков как новый подход к оценке эффективности терапии психических заболеваний. Альманах клинической медицины. 2008; XVII(l):94-96.

7. Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Максимова Н.М., Курмышева Н.Я., Сырейщикова Т.И., Комар А.А. (2008) Конформационные изменения альбумина при психических расстройствах. Материалы II международной конференции "Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения". 2008:158-163.

Тезисы докладов

8. Грызунов Ю.А., Киселев М.А., Добрецов Г.Е., Комарова М.Н., Смолина Н.В. Проблема размера и формы молекулы сывороточного альбумина человека в растворе и ее исследование методом малоуглового рассеяния нейтронов. Материалы III Съезда биофизиков России. Воронеж: 2004; 1:50-51.

9. Smolina N., Sokolova Т., Gryzunov Yu., Kopaeva L., Misionzhnik E.,. Uzbekov M. Albumin conformation and thiol reactivity in mental diseases. The World Journal of Biological Psychiatry. 2005; 6(Suppl. 1):330.

10. Gryzunov Yu., Koplik E., Smolina N., Kopaeva L., Dobretsov G., Sudakov K. Albumin binding sites state and individual stress resistance. The World Journal of Biological Psychiatry. 2005; 6(Suppl. 1):333.

П.Соколова Т.Н., Смолина H.B., Мисионжник Э.Ю., Узбеков М.Г.,. Грызунов Ю.А, Копаева Л.Б. Реакционная способность тиола альбумина сыворотки крови как показатель изменения конформации альбуминовой глобулы. Клиническая Лабораторная Диагностика. 2005; (9):71.

12. Грызунов Ю.А., Е.В.Коплик, Н.В.Смолина, Л.Б.Копаева, Г.Е.Добрецов, К.В.Судаков Коиформационные свойства связывающих центров альбумина крыс с различным поведением в тесте открытого поля Научные труды 1-го съезда физиологов СНГ. Дагомыс, 19-23 сентября 2005; 1:37-38

13. Smolina N.V., Gryzunov Yu.A., Syrejshchikova T.I., Alekseev S.S. On the mechanism of quenching of human albumin bound' fluorescence probe — dimethylaminonaphthalimine derivate — with nitrate anion. Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference. Novosibirsk, July 10-14, 2006:70.

14. Syrejshchikova T.I., Gryzunov Yu.A., Smolina N.V., Alekseev S.S. Red edge excitation shift of fluorescence of human albumin bound probe. The study by the time-resolved fluorescent spectroscopy. Digest reports of the XVI international synchrotron radiation conference. Novosibirsk. July 10-14, 2006:71.

15. Комар A.A., Сырейщикова Т.И., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Мисионжник Э.Ю., Узбеков М.Г. Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. «Фундаментальные науки — медицине». Материалы конференции. Москва, 27-29 ноября 2006. Изд-во «Слово»::78

16. Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Комар А.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецкий А.В., Максимова Н.М., Соколова Т.Н. Разработка новых подходов для индивидуального прогноза эффективности терапии психических заболеваний на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. Материалы Третьего международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак ,12-20 июня 2007:90.

17. Грызунов Ю.А, Смолина Н.В., Коплик Е.В., Калинина В.В. Конформационное состояние альбумина крови у крыс с различным поведением в тесте открытого поля. Нейронаука для медицины и психологии. Материалы Третьего международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, 12-20 июня 2007:91.

18. Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Коплик Е.В., Калинина В.В. Конформационные свойства альбумина крови у крыс с различным поведением в тесте открытого поля. «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии». Материалы конференции. Москва, 9-11 октября 2007:327.

19. Комар A.A., Грызунов Ю.А., Сырейщикова Т.И., Добрецов Г.Е., Смолина Н.В., Узбеков М.Г., Мисионжник Э.Ю., Молодецкий A.B., Максимова Н.М., Соколова Т.Н. Индивидуальный прогноз эффективности терапии психических заболеваний: новые подходы на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии». Материалы конференции. Москва, 9-11 октября 2007:337.

20. Комар A.A., Сырейщикова Т.И., Грызунов Ю.А., Смолина Н.В., Добрецов Г.Е., Мисионжник Э.Ю., Максимова Н.М., Узбеков М.Г. Разработка новых подходов для оценки эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков. 2. Модельные эксперименты и начало клинических исследований. «Фундаментальные науки - медицине». Материалы конференции. Москва, 3-4 декабря 2007: 81-82.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смолина, Наталья Викторовна, 2008 год

1. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Грызунов ЮА, Добрецов ГЕ (eds) Москва, Ириус, 1994, р 226.

2. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2. Грызунов ЮА, Добрецов ГЕ (eds) .Москва, ГЭОТАР, 1998, р 440.

3. Luzhnikov ЕА. Gol'dfarb Iu S, Marupov AM: Features of diagnosis and treatment of endotoxicosis syndrome in acute chemical poisoning. Anesteziol Reanimatol 2002: 9-14.

4. Гринберг AA, Грызунов ЮА, Черныш ТИ, Добрецов ГЕ, Игнатова ТП: Новый подход к раннему прогнозу течения перитонита. Анналы хирургии 1999; ? 3: 21-25.

5. Курышева НИ, Деев АИ, Грызунов ЮА, Комарова МН: Связывающая способность альбумина водянистой влаги у больных первичной глаукомой: Глаукома. Москва, 1999, рр 308-312.

6. Курышева НИ, Деев АИ, Грызунов ЮА, Комарова МП: Способ оценки инволюционного офтальмоэндо токсикоза путем флуоресцентного исследования слезной жидкости. Вестник офтальмологии 2000; 3: 16-18.

7. Родоман ГВ, Шалаева ТИ, Добрецов ГЕ, Сумиди ИР: Новый подход к прогнозу течения и исхода острого панкреатита: Опыт лечения и диагностики. Труды научно-практической конференции клинической больницы МСЧ ? 1. Москва, АМО ЗИЛ, 2001, рр 170-175.

8. Титов ВН, Староверов ИИ, Амелюшкина В A et al\ Диагностическое значение альбуминовых транспортных характеристик и уровня тропонина Т в крови при инфаркте миокарда. Клиническая лаб. диагностика 2002; 1: 3-7.

9. Нейрат Г, Бейли К. Белки. Биохимия белковых веществ. Москва, Изд-во Иностранной Литературы, 1958, vol 3, р 844.

10. Encyclopaedia Britannica. 2003.

11. Альбумины: Химическая энциклопедия. Москва, Советская энциклопедия, 1988, vol 1, Р 191.

12. Peters TJ: Serum albumin. Adv Protein Chem 1985; 37: 161-245.

13. He XM, Carter DC: Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature 1992; 358:209-215.

14. Harper ME, Dugaiczyk A: Linkage of the evolutionarily-related serum albumin and alpha-fetoprotein genes within qll-22 of human chromosome 4. Am J Hum Genet 1983; 35: 565572.

15. Miller LL, Bale WF: Synthesis of all plasma protein fractions except gamma globulins by the liver. The use of zone electrophoresis and lysine-C14 to define teh plasma proteins synthesis by isolated perfused liver. JExper Med 1954; 99: 125-133.16