Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар: на примере белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.21, кандидат физико-математических наук Банишев, Александр Александрович

• Банишев, Александр Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Банишев, Александр Александрович

Принятые сокращения.

Введение.

Глава I. Объекты с локализованными донорно-акцепторными (ЛДА) парами и их флуоресцентные свойства (обзор литературы).

Введение.

1.1 Некоторые объекты с ЛДА парой.

1.1.1 Основные типы объектов с ЛДА парой.

1.1.2 Применение искусственно созданных объектов с ЛДА парой.

1.1.3 Перспективы использования белков как объектов с ЛДА парой.

1.2 Собственная флуоресценция белковых молекул.

1.2.1 Общие сведения о собственной флуоресценции белков.

1.2.2 Структура и спектральные свойства сывороточного альбумина человека (однотриптофановый белок) и бычьего сывороточного альбумина (двухтриптофановый белок).

1.2.3 Фотохимические реакции триптофана и триптофан-содержащих белков.

1.3 Флуоресцентные белки.

1.3.1. Общие сведения о флуоресцентных белках (на примере зеленного - GFP и красного - DsRed флуоресцентного белка).

1.3.2 Посттрансляционные формы флуоресцентных белков.

1.3.3 Мономерный аналог белка DsRed - белок mRFPl. Получение новых мутантов mRFPl.

Глава II. Определение фотофизических параметров ЛДА пар сложных органических соединений (теория).

2.1 Модель фотофизических процессов в сложных органических соединениях.

2.2 Модель фотофизических процессов в ансамбле молекул с ЛДА парой.

2.3. Нелинейная и наносекундная кинетическая флуориметрия ЛДА пар.

Глава III. Определение фотофизических параметров флуорофоров/хромофоров в ЛДА парах (эксперимент).

3.1 Экспериментальная техника.

3.1.1 Наносекундный лазерный флуориметр/флорометр.

3.1.2 Классические спектральные измерения.

3.2 Определение фотофизических параметров триптофана в водном растворе.

3.2.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции.

3.2.2 Анализ кривых насыщения и кинетических кривых.

3.3 Определение фотофизических параметров триптофан-содержащих белков (на примере человеческого и бычьего сывороточного альбумина) в водном растворе

3.3.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции.

3.3.2 Анализ кинетических кривых и кривых насыщения.

3.4 Определение фотофизических параметров подансамблей ЛДА пар на примере белка mRFPl.

3.4.1 Анализ спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул белка mRFPl.

3.4.2 Анализ воздействия лазерного излучения на ансамбль молекул белка mRFPl.

3.4.3 Определение концентраций и индивидуальных фотофизических параметров хромофора белка mRFPl.

3.4.4 Определение концентраций и фотофизических параметров флуоресцирующего хромофора белков mRFPl/066S и mRFPl/ОббС (мутанты белка mRFPl).

3.4.5 Перенос энергии в ЛДА парах подансамблей белка mRFPl.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар: на примере белков»

Флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется в исследованиях сложных органических соединений (красителей, белков, фото синтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.). Однако традиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе флуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные [1]), поэтому данных, получаемых этими методами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации и диагностики сложного органического соединения (СОС). Задача диагностики СОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одного флуорофора.

Интересным и важным для практического применения подклассом многофлуорофорных систем являются молекулярные объекты с локализованной донорно-акцепторной (ЛДА) парой - макромолекулы, содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможен перенос энергии возбуждения. Объекты подобного рода играют большую роль в получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: их пространственной организации, размерах [2], состоянии микроокружения [1] и т.д., а также изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях [3]. В частности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей (меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основе так называемой «спектроскопической линейки» [4], используемой для измерения расстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения изменения конформаций, например, в белках [5], ДНК [6], полимерах [7]. К объектам с ЛДА парой можно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорные красители [8].

Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДА парами являются их собственные флуорофоры. В этом случае не возникает проблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА) парам: неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток, стабильность комплекса молекула-метка и т.д. К числу таких объектов относятся многие типы белков. Их удобно использовать в качестве модельных объектов, содержащих локализованную пару флуорофоров. Но белки представляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компоненты живых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, что открывает возможность использования белков в качестве индикаторов процессов в живых системах.

При анализе белковой флуоресценции ограничения традиционной флуориметрии становятся особенно ощутимыми, т.к. флуоресценция белков может зависеть сразу от несколько факторов. Более того, белковая молекула часто изначально содержит несколько флуоресцирующих (и/или поглощающих, но не флуоресцирующих) центров, а препарат белка (ансамбль молекул) представляет собой смесь нескольких, спектрально неидентичных, подансамблей молекул белка [10,11]. Это приводит к тому, что получаемые традиционными флуоресцентными методами данные сложны для однозначной интерпретации и позволяют сделать, в основном, лишь качественные выводы о внутреннем состоянии объекта. Поэтому задача получения количественной информации in vivo, без каких-либо препаративных воздействий на объект, в ряде случаев не может быть решена методами классической флуориметрии.

Возможности флуоресцентного анализа СОС значительно расширяются с применением лазерных методов, которые в дополнение к традиционным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять молекулярные фотофизические параметры флуорофоров (время жизни, сечение поглощения, скорость межмолекулярного переноса энергии и др.) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах [12,13]. Эти параметры могут быть использованы в качестве диагностических признаков.

Разработка новых эффективных подходов к исследованию свойств многофлуорофорных объектов и методов их диагностики в условиях окружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладной задачей. Разрабатываемые применительно к белкам инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях и в перспективе, по-видимому, могут найти свои применения в практической медицине.

Целью работы является развитие новых подходов, которые открываются с применением к природным ансамблям с ЛДА парами лазерной флуориметрии — нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) и кинетической флуориметрии в нано- и субнаносекундном диапазонах.

В качестве объектов исследования были выбраны: белок бычий сывороточный альбумин (БСА), в каждой из молекул которого содержится пара природных флуорофоров - триптофановых остатков, и флуоресцентный белок mRFP 1 (monomeric Red Fluorescent Protein), в ансамбле молекул которого присутствуют три подансамбля ЛДА пар. Предварительно методами лазерной флуориметрии были исследованы однофлуорофорные природные объекты: триптофан в воде и белок сывороточный альбумин человека ((САЧ) каждая молекула которого содержит один триптофановый остаток).

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Построить модель, описывающую флуоресцентный отклик ансамблей ЛДА пар при их импульсном лазерном возбуждении.

2. Разработать основанный на совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии метод определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА парах.

3. Апробировать методы лазерной флуориметрии на однофлуорофорных объектах и получить фотофизические параметры их флуорофоров.

4. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного моноансамбля с ЛДА парой (двухтриптофановом белке — БСА): получить кривые насыщения и кинетики флуоресценции, определить из них индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии между ними (с возбужденной молекулы донора как па невозбужденную, так и на возбужденную молекулу акцептора).

5. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода па примере природного объекта (флуоресцентного белка), ансамбль молекул которого является совокупностью нескольких (трех) подансамблей с ЛДА парой: получить кривые насыщения флуоресценции, определить долю каждого подансамбля в общем ансамбле, определить индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии в локализованной паре для каждого подансамбля.

Содержание диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы.

Заключение диссертации по теме «Лазерная физика», Банишев, Александр Александрович

Заключение

В работе получены следующие основные результаты:

1. Методом лазерной флуориметрии, использующим согласованно наносекундную кинетическую и нелинейную флуориметрию, одновременно определены значения фотофизических параметров молекул триптофана в воде: сечений поглощения в основном и возбужденном синглетном состояниях, времени жизни возбужденного-состояния, суммы скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния. Определены значения фотофизических параметров триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости интеркомбинационной конверсии.

2. На основе совместного применения абсорбционной спектроскопии, классической и нелинейной лазерной флуориметрии разработан метод определения индивидуальных фотофизических параметров (сечения поглощения, скорости интеркомбинационной конверсии, времени жизни возбужденного состояния) флуоресцирующего хромофора флуоресцентного белка mRFPl и родственных ему флуоресцентных белков. Метод позволяет также определять долю флуоресцирующего хромофора в смеси хромопротеинов.

3. Введено понятие коллективных состояний локализованных донорно-акцепторных пар (ЛДА пар). Предложена модель, описывающая кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющая рассчитывать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамблей ЛДА пар при лазерном возбуждении.

4. Предложена методика определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА паре, основанная на совместном применении нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии. Методика применена к растворам двухтриптофанового белка бычьего сывороточного альбумина и флуоресцентного белка mRFPl. Установлена схема фотофизических процессов в них как в представителях систем с локализованными- донорно-акцепторными парами. Определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров (хромофоров) указанных белков: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости внутримолекулярного переноса энергии.

В заключение автор считает своей приятной обязанностью выразить благодарность своему научному руководителю - профессору кафедры квантовой электроники физического факультета МГУ Виктору Владимировичу Фадееву за предоставление интересной темы исследований, постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов.

Автор выражает благодарность в.н.с. НИИ «Полюс» Ляшенко А.И. за помощь в наладке лазерной техники. v

Автор выражает признательность П.В. Вржещу и Е.П. Вржещу, представляющих Научный биотехнологический центр МГУ, за предоставление образцов белков и ценные советы.

Автор также признателен всем сотрудникам, аспирантам и студентам лаборатории лазерной спектроскопии водных сред кафедры квантовой электроники за создание творческой атмосферы и постоянную поддержку в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Банишев, Александр Александрович, 2008 год

1. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. /Kluwer Academic/Plenum, New York, 1999,710 р.

2. Stryer L. Proximity relationship in rhodopsin. //Proc. Natl. Acad. Sci., 1972, v. 69, p. 1104-42.

3. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. //Annu. Rev. Biochem, 1978, v. 47, p. 819-846.

4. Truong K., Ikura M. The use of FRET imaging microscopy to detect protein-protein interactions and protein conformational changes in vivo. //Review article, Curr. Opin. Sturct. Biol., 2001, v 11, p.573-8.

5. Reid B.G., Flynn G.C. Single-Pair FRET Characterization of DNA Tweezers. //Biochemistry, 1997, v. 36, p. 6786-6791.

6. Srinivas G., Yethiraj A., Bagchi B. FRET by FET and Dynamics of Polymer Folding. //J. Phys. Chem. B, 2001, v. 105, №13, p. 2475 -2478.

7. Siling S.A., Shamshin S.H., Ronova I.A., Kovalevskii A.Yu., Grachev A.V., Tsiganova O.Yu., Yuzhakov V.I. Synthesis and Photophysical Properties of Azomethines-Bifluorophores. //Intern. J. Polymeric. Mater, 2000, v.46, p.775-791.

8. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. /М. Наука, 1980, 320 с.

9. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. //PNAS, 2000, v. 97, p. 11984-89.

10. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common Pathway for the Red Chromophore Formation in Fluorescent Proteins and Chromoproteins. //Chemistry & Biology, 2004, v. 11, p. 845-854:

11. Dolenko T.A., Fadeev V.V., Gerdova I.V., Dolenko S.A., Reuter R. Fluorescence diagnostics of oil pollution in coastal marine waters using artificial neural networks. //Applied Optics, 2002, v.41, №24, p.5155-5166.

12. Fadeev V.V., Dolenko Т.A., Filippova Е.М., Chubarov V.V. Saturation spectroscopy as a method for determining the photophysical parameters of complicated organic compounds. //Optics Communications, 1999, v.166, p. 25-33.

13. Маслов Д.В., Остроумов E.E., Фадеев В.В. Флуориметрия насыщения сложных органических соединений с высокой локальной концентрацией флуорофоров (на примере фитопланктона), //Квантовая электроника, 2006, т. 36, №2, с. 163-168.

14. Volkov P. A., Drozdov A. Yu., and Fadeev V. V. Nanosecond Laser Fluorometry of Humic Substances. //Laser Physics, 2007, v.17, №10, p. 1-7.

15. Агранович В. M., Галанин М. Д. Перенос энергии электронного возбуждения в конденсированных средах. /М.: Наука, 1978, 383 с.

16. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. /М:2003, 195 с.

17. Wu P., Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. //Anal. Biochem., 1994, v. 218, №1, p. 13-23.

18. Selvin R. Fluorescence resonance energy transfer. //Meth. Enzymol., 1995, v. 246, p.300-34.

19. Cabor C. Radiationless energy transfer through a polypeptide chain. //Biopolymers, 1967, v. 60, №116, p. 809-830.

20. Haugland R. Conformational changes in human serum albumin studied by fluorescence and absorption spectroscopy Distance measurements as a function of pH and fatty acids. //Biochem. J, 1989, v. 258, p. 199-204.

21. Das P., Mallick A., Haldar В., Rabarty A. and Chattopadhyay N. Fluorescence resonance energy transfer from tryptophan in human serum albumin to a bioactive indoloquinolizine system. //J. Chem. Sci., 2007, v. 119, №. 2, p. 77-82.

22. Vanderkooi I.M., Nakamura H., Martinosi A. Fluorecscence energy transfer between Ca2+ transport ATPase molecules in artificial membranes. //Biochemistry, 1977, v. 16, p.1262-1280.

23. Shaklai N., Ranney I. Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore. //Biochemistry, 1977, v. 16, p. 5585-5601.

24. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M. and Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. //Nature, 1997, v. 388, p. 882-887.

25. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. //Annu. Rev. Biochem., 1998, v. 67, p. 509544.

26. Зубова H.H., Булавина А.Ю., Савицкий А. П. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. //Усп. Биол. Хим., 2003, т. 43, 163-224.

27. Undine Lauf, Patricia Lopez, Matthias M. Falk. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. //FEBS Letters, 2001, v. 498, p. 11-15.

28. Prendergast F. G. Biophysics of the green fluorescent protein. //Meth. in cell biol., 1999, v. 58, p.1-18.

29. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. /М., Мир, 1986, 486 с.

30. Филькинпггейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. /М., КДУ, 2005, 456 с.

31. Burstein E.A., Permyakov E.A., Yashin V.A. et al. The fine structure of luminescence spectra of azurin. //Biochim. et biophys. acta., 1977, v. 491, № 1, p. 155-159.

32. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. //Photochem. and Photobiol., 1973. v. 18, p. 263-279.

33. Eftnik M.R., Chiron C.A. Exposure of tryptophanyl residues and protein dynamics. //Biochemestry, 1977, v. 16, p. 5546-57.

34. Beechem J M, Brand L. Time resolved fluorescence decay in proteins. //Annu. Rev.Biochem, 1985, v. 54, p. 43-71.

35. Yves Engelborghs. Time Resolved Protein Fluorescence.Application to Multi-Tryptophan Proteins, Supramolecular Structure and Function. /Edited by Pifat-Mrzljak Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2004, 34 pp.

36. Weber G. and Teale F. W. J. Determination of the absolute quantum yield of fluorescent. //Trans. Faraday Soc., 1957, v. 53, p. 646-655.

37. Theodore Peters Jr. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. /San Diego, C.A., Academic Press, 1996,432 p.

38. Грызунова Ю.А. и Добрецова Г.Е. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. /М.:ГЭОТАР, 1998,440 с.

39. Vlasova I.M., Saletsky A.M. Raman spectroscopy in investigation of mechanism» of binding of human serum albumin to molecular .probe fluorescein. //Laser Physics Letters,2008, D0110.1002/lapl.200810004, p.1-6.

40. Spector A.A. Fatty acid binding to plasma albumin. //Journal of Lipid Research, 1975, v. 16, 165-179.

41. Hallivell B. Albumin an important extracellular antioxidant. //Biochem. Pharmacol. 1988, v. 37, p. 569-571.

42. Brown J. R. Structure of Bovine Serum Albumin. // Fed. Proc., 1975, v. 34, p. 591.

43. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin. //Adv. Prot. Chm., 1994, v. 45, p.153-203.

44. Мельников М.Я., Иванов B.JI. Экспериментальные методы химической кинетики. Фотохимия. /Издательство Московского университета, 2004, 125 с.

45. Владимиров Ю.А. Инактивация ферментов ультрафиолетовым облучением. //Соросовский образовательный журнал, Биология, 2001, т.7, №2, с. 20-27.

46. Finstrom В., Tfibel F. and Lindqvist L. One- and two-photon ionization of aqueous tryptophan by the harmonics of the Nd laser. //Chem.Phys. Letters, 1981, v.71, №2, p312-316.

47. Dudley Bryant, Santus R. and Grossweiner L.I. Laser flash photolysis of aqueous tryptophan. //J. of Phys. Chem., 1975, v.79, №25, p. 2711-2716.

48. Sherin P.S., Snytnikova O.A., Tsentalovich Y.P. Tryptophan photoionization from prefluorescent and fluorescent state. //Chem. Phys. Letters, 2004, v.391, p. 44-49.

49. Klein R., Tatischeffl., Bazin M., Santus R. Photophysics of Indole. Comparative study of quenching, solvent, and temperature effects by laser flash photolysis and fluorescence. //J. Phys.Chem., 1981, v. 85, p. 670-677.

50. Pigault C. and Gerard D. Influence of the location of tryptophanyl residues in proteins on their photosensitivity. //Photochem. and Photobiol., 1984, v.40, №3, p-291-296.

51. Zubova Nadezhda N., Korolenko Vadim A., Astafyev Artem A., Petrukhin Andrew N., Vinokurov Leonid M., Sarkisov Oleg M., and Savitsky Alexander P. Brightness of

52. Yellow Fluorescent Protein from Coral (zFP538) Depends on Aggregation. //Biochemistry, 2005, v.44, p.3982-93.

53. Шелаев И.В., Саркисов O.M., Гостев Ф.Е., Савицкий А.П. Фемтосекундная динамика первичных процессов в флуоресцентном белке KFP. // Труды 50-ой научной конференции МФТИ, 23-27 ноября, 2007.

54. Chalfle М., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. //Science, 1994, v.263, p. 802-805.

55. Зубова H.H., Савицкий А.П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. //Успехи биологической химии, 2005, т. 45, с.391-454.

56. Верхуша В.В., Аковбян Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Вржещ П.В. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. //Биохимия, 2001, т. 66, №12, с.1656-1667.

57. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). //Nat Biotechnol, 2002, v.20, p. 83-87.

58. Heim R., Cubitt A., Tsien R. Improved green fluorescence. //Nature, 1995, v.373, p.663-4.

59. Matz M.V, Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Antozoa species. //Nature Biotechnology, 1999, v. 17, p. 969-973.

60. Jens Wiehler, Julia von Hummel, Boris Steipe. Mutants of Discosoma red fuorescent protein with a GFP-like chromophore. //FEBS Letters, 2001, v. 487, p. 384-389.

61. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, v. 98, №2, p. 462-467.

62. Mizuno FI., Sawano A., Eli P., Hama H., and Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. //Biochemistry, 2001, v. 40, p. 2502-2510.

63. Nifosi Riccardo and Yi Luo. Origin of the Anomalous Two-Photon Absorption in Fluorescent Protein DsRed. //J. Phys. Chem. B, 2007, v. 111, № 3, p.505-507.

64. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., and Tsien R.Y. Improved monomelic red, orange, and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. //Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, №12, p. 1567-72.

65. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. Structure of the Chromophore within DsRed, a Red Fluorescent Protein from Coral. //PNAS, 2000, v. 97, №22, p. 11990-95.

66. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. Synthesis and Properties of the Chromophore of the asFP595 Chromoprotein from Anemonia sulcata. //Biochemistry, 2005, v. 44, p.5788-5793.

67. Kneen M., Farinas J., Li Y. and Verkman A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. //Biophysical J., 1998, v. 74, p. 1591-1599.

68. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 8362-8367.

69. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. //PNAS, 2002, v. 99, p. 7877-7882.

70. Harald Otto et al. Time-Resolved Single Tryptophan Fluorescence in Photoactive Yellow Protein Monitors Changes in the Chromophore Structure during the Photocycle via Energy Transfer. //Biochemistry, 2005, v. 44, p. 16804-16.

71. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., and Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. //BMC Biochem., 2001; v. 2, p 6-15.

72. Друца B.JI., Вржещ Е.П., Дмитриенко Д.В., Вржещ П. В. Новые мутантные белки на основе mRFPl: мутагенез по 66 позиции и его влияние на свойства. //Биохимия, 2007, том 72, № 5. с. 1258-1265.

73. A.V. Terskikh, A.F. Fradkov, A.G. Zaraisky, A.V. Kajava and Brigitte Angres. Analysis of DsRed Mutants. //The Journal of Biological Chemestry, 2002, v.277, №10, p. 76337636.

74. Банишев A.A., Маслов Д.В., Фадеев B.B. Наносекундный лазерный флуорометр. // ПТЭ, 2006, №3, с. 143-148.

75. Dolenko S.A., Dolenko T.A., Fadeev V.V., Gerdova I.V., Kompitsas M. Time-Resolved

76. Fluorimetry of Two-Fluorophore Organic Systems Using Artificial Neural Networks. //Optics Communications, 2002, v.213, №4, p.309-324. .

77. Fadeev V.V., Dolenko T.A., Banishev A.A., Litvinov P.N., Maslov D.V., Ostroumov E.E. Matrix method in laser fluorimetry of organic compounds. //Proceedings of SPIE, Conference on Spectroscopy, Dublin, Ireland, April, 2005, v.5826, pp.44-55.

78. Фадеев B.B. Лазерная спектроскопия водных сред. /Дисс. докт. физ.-мат. наук, М. МГУ, физ. фак., 1983, 510 с.

79. Паркер С. Фотолюминисценция растворов. /М.: Мир, 1972, 510 с.

80. Маслов Д.В. Определение фотофизических параметров фитопланктона методом нелинейной лазерной флуориметрии. / Дисс. канд. физ.-мат. наук. М. МГУ, физ. фак., 2003, 125 с.

81. Пащенко В.З. Пикосекундная спектроскопия первичных процессов фотосинтеза, /дисс. докт. физ.-мат. наук, М. МГУ, биологический ф-т, 1986, 362с.

82. Банишев А.А., Ширшин Е.А., Фадеев В.В. Определение фотофизических параметров молекул триптофана методами лазерной флуориметрии. // Квантоваяэлектроника, 2008, т. 38, №1, стр. 76-80.

83. Банишев А.А., Маслов Д.В., Фадеев В.В. Определение квантового выхода синглет-триплетной конверсии в молекулах сложных органических соединений методомнелинейной лазерной флуориметрии. // Вестник МГУ, №3, 2008, с.69-71.

84. Банишев А.А., Маслов Д.В., Мешканцов А.А., Остроумов Е.Е., Фадеев В.В. ( Кинетическая флуориметрия природных вод. // Сб. статей «Физические проблемыэкологии (экологическая физика)», М.: МАКСПресс, 2005, №12, с.138-147.

85. Бойчук И.В., Доленко Т.А., Сабиров А.Р., Фадеев В.В., Филиппова Е.М. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи флуориметрии насыщения. //Квантовая электроника, 2000, т.30, №7, с.611-616.

86. Grossweiner L.I., Brendzel A.M., Blum A. Multiple pathways of tryptophan photoionization. //Chem. Phys., 1981, v.57, p.147-155.

87. Szabo A. G. and Rayner D. M. Fluorescence decay of tryptophan conformers in aqueous solution. //J. Am. Chem. Soc., 1980, v. 102, p. 554-563.

88. Chen Y., and Barkley M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. //Biochemistry, v. 37, p.9976-9982.

89. Robbins R.J., Fleming G.R., Beddard G.S., Robinson G.W., Thistlethwaite P.J. and Woolfe G.J. The Photophysics of Aqueous Tryptophan: pH and Temperature Effects. //J. Amer. Chem. Soc., 1980, v. 102, p. 6271-77.

90. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка. Природа и применения. /М.: ВИНИТИ, 1977, Итоги науки и техники, Биофизика, т. 7.

91. Расе C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. //Protein Sci., 1995, v. 4, p. 2411-2423.

92. Gill S.C. and P.H. von Hippel. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. //Analytical Biochem. 1989, 182, p.319-326.

93. McCluskey K. The Fungal Genetics Stock Center: from molds to molecules. //Adv. Appl. Microbiol, 2003, v. 52, p.245-262.

94. Bradford M.M.' A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. //Anal- Biochem, 1976, v.72, p.248-54.

95. Chekalyuk A., Fadeev V., Georgiev G., Kalkanjiev Т., Nickolov Zh. Determination of fluorescence quantumyields using a spontaneous Raman scattering line ofsolvent as internal standard. //Spectr. Lett., 1982, v.15, №5, p.355-365.

96. Романов Н.П., Шуклин B.C. //Оптика и спектроскопия, 1975, т. 37, вып. 6, с. 11201124.

97. Banishev A. A., Shirshin Е. A., Fadeev V. V. Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proceedings of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies (LAT 2007), Minsk, May 28-June 1, 2007, v. 6733, 67331B.

98. Гердова (Бойчук) И.В. Лазерная флуориметрия смесей сложных органических соединений в водных средах. /Дисс. канд. физ-мат наук, 2002, М. МГУ, физ. фак., 115с.

99. Эльсгольц Л.Э., Дифференциальные уравнения и вариационное исчисление. /М:Наука, 1956, 456 с.

100. Banishev А.А., Shirshin Е.А., Fadeev V.V., Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proc. of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, V.6733, p.67331B.

101. Shaner Nathan C., Steinbach Paul A. & Tsien Roger Y. A guide to choosing fluorescent proteins. //Nature Methods, 2005, v. 26, №126, p.905-1006.

102. Дмитриенко Д.В., Вржещ Е.П., Друца В.Л., Вржещ П.В. Получение новых мутантов белка mRFPl с заменой 66 аминокислотно остатка. //Биохимия, 2007, в печати.

103. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., Matz M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. // PNAS, 2002, v. 99, p.4256-4261.

104. Fischer Markus, Haase Ilka, Simmeth Evelyn, Gerisch Gunther, Muller-Taubenberger Annette. A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. //FEBS Letters, 2004, v. 577, p. 227-232.

105. Банишев A.A., Загидуллин В.Э., Пащенко B.3., Ширшин Е.А., Фадеев В.В. Лазерная флуориметрия белков. // Сб. статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М.: МАКСПресс, 2007, №14, с.43-61.

106. Борисевич Н.А., Толкочев В.А. Генерация излучения сложными молекулами в газовой фазе. //УФН, 1982, т. 138, вып. 4, с.545-72.

107. Berland К. M. Quantifying molecular interactions with fluorescence correlation spectroscopy, //in Molecular Imaging: FRET Microscopy and Spectroscopy, Periasamy, A.and Day, R. N. (eds.), Oxford University Press, New York, 2005, p.272-283.

108. Berney C. and Danuser G. FRET or No FRET: A quantitative comparison. //Biophysical Journal, 2003, v.84, p.3992-4010.

109. Ulrich Zachariae, Till von Feilitzsch, Jens Wiehler, Julia von Hummel, Boris Steipe, Maria E. Michel-Beyerle. Picosecond Time-Resolved FRET in the Fluorescent Protein from Discosoma Red (wt-DsRed). //ChemPhysChem. 2001, v.2, №5, p.325-28.

110. Qiu-Ping Qin, Olli Pel tola and Kim Pettersson, Time-resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Point-of-Care Testing of Urinary Albumin. //Clinical Chemistry, 2003, v. 49, p. 1105-1113.

111. Valuer B. Molecular Fluorescence. Principles and Applications. /Wiley-VCH, Winheim, 2002, 254 p.590.