Аналитические клеточные системы для изучения взаимодействия калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1 и Kv1.3 с пептидными блокаторами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Орлов Никита Александрович

• Орлов Никита Александрович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Орлов Никита Александрович

Список использованных сокращений

Введение

Цель и задачи работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Структура и функции каналов Ку1

1.1.1 Классификация и общая характеристика калиевых каналов Ку

1.1.2 Структура каналов Ку1 и механизм проведения К+

1.1.3 Физиологические функции каналов Ку1

1.2 Заболевания, связанные с нарушениями работы Ку, и перспективы лекарств на основе блокаторов Ку

1.2.1 Онкологические заболевания

1.2.2 Вирусные инфекции

1.2.3 Аутоиммунные заболевания

1.2.4 Астма

1.2.5 Сердечная аритмия

1.2.6 ВИЧ/СПИД

1.2.7 Нарушения обмена веществ

1.2.8 Нейродегенеративные заболевания

1.3 Пептидные блокаторы

1.3.1 Классификация пептидов-блокаторов

1.3.2 Механизм связывания пептидных блокаторов с каналами Ку1

1.3.3 Пептидные блокаторы как инструменты изучения каналов Ку1

1.3.4 Поиск новых пептидных блокаторов

1.3.5 Направленный дизайн пептидных блокаторов

1.4 Методы изучения пептидных поровых блокаторов

1.4.1 Радиолигандный анализ

1.4.2 Электрофизиологические методы

1.4.3 Моделирование

1.4.4 Флуоресцентные методы

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Реагенты

2.2 Создание экспрессионных плазмид, кодирующих ^1.3, слитый с mKate2

2.3 Создание экспрессионных плазмид, кодирующих дикий тип ^1.1 и мутированный тип Ку1.1, слитые с mKate2 по К-концу

2.4 Получение рекомбинантных пептидов

2.5 Эксперименты со сферопластами E. coli

2.6 Эксперименты с эукариотическими клетками

2.7 Конфокальная микроскопия

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Разработка аналитической системы на основе клеток HEK293 с экспрессированными на мембране каналами mKate2-Kv1

3.1.1 Создание плазмид, кодирующих каналы Kv1.3 с флуоресцентной меткой mKate2

3.1.2 Взаимодействие A-HgTx с K-AKv1

3.1.3 Процедура количественного анализа связывания

3.1.4 Анализ связывания A-HgTx

3.1.5 Эксперименты по конкурентному связыванию

3.2 Разработка аналитической системы на основе клеток Neuro2a с экспрессированными на мембране каналами mKate2-Kv1

3.2.1 Особенности экспрессии K-Kv1.1wt в клетках

3.2.2 Экспрессия и свойства K-Kv1.1 в клетках

3.2.3 Локализация K-Kv1.1 в клетках

3.2.4 Взаимодействие пептидных поровых блокаторов с K-Kv1

3.3 Применение аналитических систем на основе клеток Neuro2a, с экспрессированными на мембране каналами К-АКЛ.3 или K-Kv1

3.3.1 Взаимодействие AgTx2-GFP с K-AKv1.3 и K-Kv1

3.3.2 Изучение аффинности пептидных блокаторов к каналам K-AKv1.3 и K-Kv1.1 в открытом и закрытом состоянии

3.3.3 Изучение свойств рекомбинантных Ce пептидов (Ce1, Ce4, Ce5) и их производных

Заключение

Благодарности

Литература

Публикации

Список использованных сокращений

А-Б^Тх -хонготоксин1, меченный флуорофором Atto488; AgTx2 - агитоксин2;

AgTx2-GFP - агитоксин2, меченный по С-концу через линкер L3 флуоресцентным белком GFP;

Се1, Се4, Се5 - пептиды группы Ce;

Се5-М1, Се5-М2 - мутанты пептида Ce5;

Се5-М2-С1, Се5-М2-С2, Се5-М2-С3 - мутанты пептида Ce5-M2; СИТх - харибдотоксин;

GFP - зелёный флуоресцентный белок eGFP;

HgTx1 - хонготоксин1;

Ку - потенциал-зависимый К+ канал;

К-Ку1.1 - мутированный (S369T) вариант канала Ку1.1 с флуоресцентной меткой mKate2 на К-конце;

K-Kу1.1wt - дикий тип канала Ку1.1 с флуоресцентной меткой mKate2 на К-конце;

К-АКу1.3 - канал Ку1.3, содержащий К-концевую делецию (М1-052), с флуоресцентной меткой mKate2 на К-конце;

К-Ку1.3, Ку1.3-К - дикий тип канала Ку1.3 с флуоресцентной меткой mKate2 на К-конце или С-конце, соответственно;

КТх-1 - калиотоксин;

MgTx - маргатоксин

ПЧД - потенциал-чувствительный домен

Введение

Структура и свойства потенциал-зависимых ионных каналов (Kv) и их пептидных блокаторов, а также механизмы образования их комплексов -актуальное и широкое направление исследований в современной биофизике.

Представители семейства потенциал-зависимых калиевых каналов Kv1 являются ключевыми участниками разнообразных физиологических процессов: проведения нервных импульсов, обеспечения мышечной сократимости, контроля пролиферации и миграции клеток, иммунного ответа, секреции гормонов и нейромедиаторов, регуляции клеточного цикла и апоптоза. Каналы Kv1 являются сложными трансмембранными белками, осуществляющими перенос ионов калия через мембрану в ответ на изменение клеточного мембранного потенциала. Действие этих каналов направлено на поддержание потенциала покоя в различных типах клеток, а также на регуляцию порога активации, частоты и длительности потенциала действия в электрически-возбудимых клетках. Каналы Kv1 с нарушенными экспрессией или функционированием играют важную роль в патогенезе большого числа заболеваний - неврологических, аутоиммунных, сердечно-сосудистых, онкологических, и являются, таким образом, перспективными терапевтическими мишенями.

В ходе эволюции представители разных групп живых организмов: морских анемон, улиток-конусов, змей и скорпионов - совершенствовали свойства своих ядов, основной компонент которых - пептидные токсины. Такие токсины способны с высокой аффинностью и специфичностью связываться с разными типами ионных каналов. Это позволяет животным иметь в арсенале инструмент, способный быстро и эффективно обездвижить или нанести летальный урон своей жертве. Сегодня этот инструмент превращается в руках биологов в эффективное средство изучения структуры, свойств и локализации каналов Kv1 и других ионных каналов. Пептидные

поровые блокаторы, действие которых направлено на ингибирование тока ионов калия через пору Kv1 канала, являются кандидатами на создание на их основе лекарственных средств, способных подавлять нежелательную активность таргетных Kv1 каналов. В связи с перспективами терапевтического использования пептидных блокаторов возникает необходимость в совершенствовании методов поиска новых пептидных токсинов и исследования их свойств.

К наиболее известным методам изучения функциональной активности каналов Kv1 и их блокаторов относятся методы электрофизиологии, в частности, метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp), используемый в различных конфигурациях.

Развитие альтернативных биофизических подходов и методов исследования расширяет возможности изучения взаимодействия Kv1 каналов с пептидными блокаторами. К перспективным методам можно отнести флуоресцентные методы анализа, зарекомендовавшие себя высокой чувствительностью и надежностью в различных областях экспериментальной биологии и медицины. Известные флуоресцентные методы изучения активности каналов Kv1 основаны на непрямых измерениях с использованием потенциал-чувствительных красителей или флуоресцентных индикаторов ионов таллия. Однако до настоящего момента ещё не было разработано прямых флуоресцентных методов, позволяющих изучать взаимодействие лигандов с полноразмерными каналами Kv1 на живых клетках млекопитающих, в том числе, проводить измерения аффинности лигандов к таргетным каналам.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аналитические клеточные системы для изучения взаимодействия калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1 и Kv1.3 с пептидными блокаторами»

Цель и задачи работы

Целью работы является разработка и применение аналитических систем для изучения взаимодействий пептидных поровых блокаторов с калиевыми

каналами Ку1.3 и Ку1.1 в клетках эукариот методом флуоресцентной микроскопии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Получить биоинженерные конструкции каналов Ку1.3 и Ку1.1, слитых с флуоресцентным белком mKate2, с высокой экспрессией на мембране клеток эукариот.

2) Изучить применимость хонготоксина 1, меченного флуорофором ААю488 (А-^Тх), в качестве флуоресцентного лиганда для разрабатываемых аналитических систем.

3) Разработать на основе конфокальной микроскопии методику флуоресцентного анализа взаимодействий каналов Ку1.3 и Ку1.1 с пептидными блокаторами и расчёта констант диссоциации образуемых комплексов.

4) Провести валидацию разработанных аналитических систем на примере известных пептидных блокаторов каналов Ку1.3 и Ку1.1.

5) Применить разработанные аналитические системы для:

* изучения свойств генетически кодируемой химеры на основе агитоксина 2, слитого с зеленым флуоресцирующим белком (AgTx2-GFP), в качестве флуоресцентного лиганда каналов Ку1.3 и Ку1.1,

* сравнительного исследования взаимодействий пептидных блокаторов с открытыми и закрытыми каналами Ку1.3 и Ку1.1,

* изучения свойств рекомбинантных пептидных блокаторов из яда скорпиона

Centruroides elegans,

* определения ключевых аминокислотных остатков, определяющих высокоаффинное взаимодействие хонготоксина 1 с каналами Ку1.3 и Ку1.1.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Структура и функции каналов Ку1

Потенциал-зависимые калиевые каналы Ку составляют разнообразное семейство мембранных белков, которые присутствуют как в электрически возбудимых, так и невозбудимых клетках. Они обеспечивают прохождение через мембрану клетки ионов калия и играют ключевую роль в ряде клеточных процессов, регулируя возбудимость нейронов, сокращение мышц, обеспечивая секрецию гормонов и высвобождение нейромедиаторов и принимая участие во многих других аспектах жизнедеятельности клеток, тканей и организма в целом [1].

1.1.1 Классификация и общая характеристика калиевых каналов Ку

Большинство ионных каналов, включая калиевые, имеют в строении три функциональные части: ворота канала, пора с селективным фильтром и сенсор. Каждая из этих частей образована белковыми субъединицами. Общая классификация калиевых каналов основана на первичной аминокислотной последовательности пора-образующих субъединиц.

Выделяют несколько семейств калиевых каналов: кальций-активируемые каналы, калиевые каналы внутреннего выпрямления, двухпоровые калиевые каналы и потенциал-зависимые калиевые каналы (Ку) (Рисунок 1). Каналы Ку составляют по классификации первое (I) семейство - это каналы, содержащие в составе шесть трансмембранных доменов ^1^6) с одной порой [2].

Семейство потенциал-зависимых калиевых каналов является наиболее богатым и разнообразным среди семейств калиевых каналов; в кодировании

Рис. 1. Слева: радиальное филогенетическое древо генов известных калиевых каналов. Справа: филогенетическое древо подсемейства Kv1, полученное путём попарного выравнивания кодирующих последовательностей изоформы 1 всех генов Kv крысы [3].

каналов Kv принимает участие более 40 генов. Семейство подразделяется на двенадцать подсемейств (Kv1-Kv12), которые в свою очередь, могут содержать по несколько видов каналов, различающихся по своим биофизическим свойствам, фармакологическим профилям и способности образовывать гомо-и гетеротетрамеры [4]. Положение семейства каналов Kv и его подсемейств в радиальном филогенетическом древе известных ионных каналов показано на Рисунке 1.

Некоторые из подсемейств имеют устоявшиеся названия: так, подсемейство Kv1 принято называть Шейкерами (Shaker), подсемейство Kv2 -Шэб (Shab), Kv3 - Шоу (Shaw), Kv4 - Шэл (Shal). Подсемейство Kv1 (Shaker) -крупнейшее подсемейство Kv1 , включающее восемь потенциал-зависимых калиевых каналов (Kv1.1-Kv1.8) [5]. Филогенетическое древо подсемейства Kv1 показано на Рисунке 1.

Каналы некоторых подсемейств обладают способностью к гетеромультимеризации, т.е. образованию функциональных каналов, состоящих из четырёх а-субъединиц из разных каналов внутри одного подсемейства [4]. Частый альтернативный сплайсинг и слияние с регуляторными ß-субъединицами дополнительно способствуют разнообразию Kv.

Рисунок 2. Структурное представление канала Ку1.3 по модели, основанной на гомологии [6]. Слева (А) дана схема одной из 4-х субъединиц канала Ку1.3 и ее 3D изображение. Указаны ^концевой цитоплазматический тетрамеризующий домен (Т1); трансмембранные а-спирали S1-S6; потенциал-чувствительный домен (VSD) - а-спирали линкер S4-S5, соединяющий VSD и поровый домен (а-спирали S5-S6); Р-петля, соединяющая S5 и S6 с внешней стороны поры; последовательность Р-петли, входящая в состав селективного фильтра (SF) в составе тетрамера; С-концевой цитоплазматический домен. Справа (Б) показана 3D модель тетрамерного канала Ку 1.3 (вид сверху на наружную поверхность поры). Каждая субъединица отмечена цветом. Видна центральная часть канала - пора (Р), и прилегающие к поре 4 потенциал-чувствительных домена (VSD).

1.1.2 Структура каналов Ку1 и механизм проведения К+

Первые структурные данные о К+-каналах были получены на бактериальном канале KcsA [7] [8], обладающим высокой степенью гомологии с поровым доменом эукариотических Ку1 каналов. Тогда же был впервые описан подробно механизм прохождения иона калия через канал. Все калиевые каналы имеют сигнатурную аминокислотную последовательность в составе поры; мутации аминокислот этой последовательности нарушают ионоспецифичность канала [9].

Внешний вестибюль калиевого канала имеет консервативную пространственную структуру, однако аминокислотный состав вариабелен. Путём сайт-направленного мутагенеза МакКиннону и его коллегам удалось воспроизвести сайт связывания токсинов и показать, что структура канала KcsA имеет много общего со структурой ^ каналов эукариот.

Рентгеновская кристаллография, сравнения по гомологии и молекулярное моделирование позволили получить данные о структуре ^ каналов и понять основы механизма их ионной проводимости. Была определена рентгеновская структура домена Т1 из человеческого КД.3 с разрешением 1,2 А после его кристаллизации в условиях, близких к физиологическим [10]. Методом кристаллографии была определена структура КД.2 из КаИт потечет и "лопастной" химеры КЛ.2-^2.1 [11]. На основе этих данных методом молекулярного моделирования были построены гомологичные модели канала ^1.3 (рис. 2). Методом криоэлектронной микроскопии была получена модель комплекса кку1.3 со вспомогательной субъединицей К^2 с разрешением 3,4

А [12].

Как правило, К+-канал состоит из четырёх идентичных субъединиц, каждая субъединица канала построена из шести трансмембранных а-спиралей ^1-S6), четыре из которых ^1^4) образуют потенциал-чувствительный домен (VSD) и две ^5 и S6) - собственно поровый домен, который формирует пору канала в составе тетрамера. Спирали S5 и S6 порового домена соединены с внешней стороны канала длинной Р-петлей (около 40 а.о.), содержащей в своем составе важные функциональные элементы: S5-P линкер -неструктурированную "башенку", выступающую над поверхностью канала; селективный фильтр (SF) - узкий канал для прохождения ионов калия; короткую Р-спираль, участвующую в поддержании структуры селективного фильтра; короткую петлевую часть Р^6 линкера. Участки S5-P, SF и Р^6 образуют сайт связывания с пептидными блокаторами канала, при этом аминокислотная последовательность SF является наиболее консервативной

для Ку1 каналов, а неструктурированный петлевой участок Б5-Р ликера отличается большой вариабельностью (рис. 2А).

Архитектура поры канала напоминает "конус в колбочке", широким концом обращённый во внеклеточное пространство. Трансмембранные а-спирали каждой субъединицы (Б5 и Бб) образуют внешнюю "колбочку", а короткие а-спирали (Р-спирали) составляют внутренний "конус", который окружает поровое пространство канала и служит опорой селективного фильтра. Каналы Ку1 отличаются чрезвычайно высокой селективностью в отношении перемещения ионов К+ по сравнению с ионами №+. Механизм селективности основан на соответствии размера негидратированного иона калия (с радиусом в 1,33 А) диаметру SF, что обеспечивает плотное взаимодействие К+ с карбонильными группами аминокислотных остатков, обращенными внутрь селективного фильтра. Такое строение SF позволяет ионам К+ проходить через канал в 104 раз быстрее, чем ионам №+ (с радиусом в 0,95 А), со скоростью порядка 106-108 ионов в секунду, что приближается к теоретическому пределу ничем не ограниченной диффузии [2].

Оба ключевых свойства канала: его специфичность и интенсивный поток ионов через пору, - становятся понятны из его структуры. На внутренней и внешней поверхности плазматической мембраны преддверья канала содержат несколько отрицательно заряженных аминокислотных остатков, которые предположительно способствуют увеличению локальной концентрации катионов. Начиная свой путь по каналу сквозь мембрану, ион сначала сохраняет свою гидратную оболочку. Те самые короткие а-спирали четырёх субъединиц канала, упомянутые ранее, стабилизируют гидратированный ион, направляя на него частичные отрицательные заряды своих электрических диполей.

Примерно через две трети пути сквозь мембрану канал сужается в области

селективного фильтра и заставляет ион сбросить гидратную оболочку. Атомы

кислорода карбонильных групп в основе селективного фильтра занимают

12

место молекул воды, составлявших гидратную оболочку, образуя ряд идеальных координационных сфер, через которые так легко будет пройти иону калия и почти что невозможно иону натрия, поскольку он окажется слишком мал, чтобы образовать связи со всеми координационными атомами кислорода [2].

Сегменты S1-S4 субъединицы канала окружают пору и составляют потенциал-чувствительный домен. S4 содержит в составе положительно заряженные аминокислоты. При деполяризации мембраны происходит смещение S4, что влечёт за собой другие конформационные изменения и активацию канала [13], то есть открытие поры и запуск тока ионов калия через канал. Если канал находится в активированном состоянии дольше определённого предела по времени, ток ионов ^ через канал прекращается с помощью механизма инактивации.

Для семейства каналов ^ известны два типа инактивации: по №типу и ^ типу [14]. При инактивации по ^типу вконец канала связывается с поровым доменом и перекрывает ток ионов. Инактивация по ^типу также называется медленной инактивацией и связана с перестроениями в области селективного фильтра канала, что также делает прохождение ионов через канал невозможным [15]. На структуре канала ^1.2, инактивированном по ^типу, удалось показать, что этот тип инактивации вызывает расширение селективного фильтра в двух сайтах связывания ионов и что эти изменения также приводят к перестроениям в области внешнего вестибюля канала и Шгге^области порового домена [16].

1.1.3 Физиологические функции каналов

Широкий набор сигнатурных последовательностей способствует точной регуляции трафика каналов в ходе их биогенеза и на пути к

плазматической мембране [17]. Созревающий канал содержит

13

последовательность, направляющую его в ЭПР. В случае канала ^1.3 это сигнальная последовательность TM2 [18]. Формирование комплекса с транслоконом позволяет каналу ^ попасть в ЭПР, одновременно с этим процессом происходит интеграция трансмембранных сегментов канала и олигомеризация субъединиц канала. В образовании тетрамеров участвуют сигнатурные участки на N или Оконце субъединиц, также в этом принимают участие трансмембранные домены. В ходе фолдинга формируются пора канала и сенсорные домены [19]. Далее собранный канал следует по везикулярному пути через аппарат Гольджи, прежде чем окажется на плазматической мембране.

Помимо сигнатурных мотивов судьбу а-субъединицы канала определяют вспомогательные субъединицы. Эти вспомогательные белки могут влиять как на таргетинг каналов, так и на их функционирование. Выделяет две группы подобных белков: цитозольные белки (^р, KChAP, KChIPs) и малые трансмембранные белки. Субъединицы ^р могут связываться с а-субъединицами в соотношении до 4:4 в составе одного канала. Связывание происходит через вконец канала. ^р могут принимать участие в инактивации каналов ^ по ^типу, влиять на плотность каналов в плазматической мембране, определять локализацию канала, опосредовать регуляцию канала внутриклеточными факторами [20, 21].

Перечисленные факторы в совокупности с посттрансляционными модификациями определяют физиологические функции конкретных видов каналов в различных типах клеток.

Чтобы понять особенности функционирования каналов КЛ и распределение функций между представителями подсемейства КЛ, необходимо ознакомиться с типами К+-токов. Калиевые токи можно разделить на "быстрые" токи типа А и "медленные" токи или токи замедленного выпрямления. Для токов типа А характерна быстрая инактивация, что может играть определенную роль в установлении интервала потенциала действия.

14

Фаза Ky-зависимой реполяризации сокращается, если ^-каналы переходят в неактивированное состояние и нейрон (или любая возбудимая клетка) готов запустить новый потенциал действия. Термин "классический ток замедленного выпрямления" был использован Хаксли и Ходжкином [22] для описания в основном направленного наружу К+-тока, который активируется позже, чем №+-токи в аксоне гигантского кальмара. Этот ток не проявляет инактивации в миллисекундном масштабе времени. Несколько представителей семейства Kv1 обеспечивают проведение "медленных" токов; среди них - Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3 и Kv1.5, в то время как для других характерны токи типа А.

Каналы Kv1.1 играют важную роль в контроле возбудимости нейронов. Ингибирование их инактивации, опосредованной Р-субъединицами, позволяет предотвратить появление судорог у грызунов и было предложено для лечения эпилепсии [23, 24]. Главным образом, канал Kv1.1 встречается в головном мозге (гиппокамп, мозжечок, неокортекс) и периферической нервной системе [25].

Node of Paranode Juxtaparanode Internode

Ranvier

sS-Г MOG

Connexins

Рис. 3. Распределение миелиновых белков ЦНС. Изображён нейрон с миелинизированным аксоном. Миелин обволакивает аксон, пропуская небольшие участки, называемые перехватами Ранвье. К перехватам Ранвье примыкают паранодальная и юкстапаранодальная области аксона. В юкстапаранодальной области аксонов кластеризованы К+-каналы [26].

Каналы Ку1.1, локализованные в начальных сегментах аксонов и в юкстапаранодальной области аксонов (рис. 3), стабилизируют аксональную проводимость [27], а также регулируют высвобождение нейромедиаторов в нервных окончаниях [28]. Недавние исследования выявили роль канала Ку1.1 в секреции инсулина клетками поджелудочной железы [29] и в контроле тонуса гладкой мускулатуры артерий [30]. Экспрессия канала Ку1.1 была обнаружена в нормальных Т-лимфоцитах-хелперах, где они участвуют в регуляции продукции и секреции цитокина Т№а [31].

Канал Ку1.2 экспрессируется в центральных нейронах и локализуются преимущественно в начальных сегментах аксонов, юкстапаранодах и предтерминалах аксонов [32]. Различные варианты мутированного Ку1.2 как с усиленной, так и ослабленной активностью вовлечены в патогенез эпилептической энцифалопатии и других нейродегенеративных заболеваний [33, 34]. Нарушения в работе Ку1.2 лежат в основе этиопатогенеза невропатической боли [35].

Юкстапаранодальные области аксонов, как правило, содержат гетеромерные каналы Ку1.1/Ку1.2 (Рисунок 4), связанные со вспомогательные субъединицами Кур2. Их физиологическая роль может иметь критическое значение в процессе развития организма, а также при патологических состояниях [36].

Kv1 channel Kv1.1 /Kv1.2 tetramer

Voltage pore к+

COOhCpDZ binding

Рисунок 4. Слева: трансмембранная топология а-субъединицы канала Kv1. Справа: гетеромерный канал Kv1.1/Kv1.2 [37].

^1.3 задействован во многих физиологических процессах как на плазматической мембране, так и на мембране митохондрий; главным образом его деятельность связана с работой нервной и иммунной системы. Канал ^1.3 встречается на плазматической мембране клетки, внутренней мембране митохондрии ^^^1.3), мембране ядра и мембране цис-Гольджи [38]. Канал плазматической мембраны участвует в регуляции потенциала покоя и потенциала действия в возбудимых клетках, а в невозбудимых работа канала оказывает влияние на клеточный объём и пролиферацию клеток. mitoKv1.3 координирует мембранный потенциал митохондрий, их объём, а также выработку активных форм кислорода (АФК) и механизмы апоптоза [39]. ^1.3 активно экспрессируется в микроглии, макрофагах и эффекторных Т-клетках памяти, а также в клетках опухолей [40]. Канал ^1.3 также экспрессируется в Т-лимфоцитах, включая те, которые избегают иммунной регуляции и играют роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний: рассеянного склероза, ревматоидного артрита и сахарного диабета I типа [41] [42].

Нейрональные и поведенческие эффекты, ассоциированные с низкой мотивацией, связаны с аномально быстрой инактивацией ^1.4, что делает его потенциальной мишенью при работе с психическими состояниями, вызванными мотивационной дисфункцией [43]. ^1.4 играет критическую роль в пролиферации олигодендроцитов и влияет на процессы ремиелинизации [44].

В то время как экспрессия ^1.3 при онкологических патологиях не описывается чёткими закономерностями, в случае с ^1.5 можно выделить определённые паттерны. Так, было показано, что экспрессия ^1.5 демонстрирует обратную корреляцию со злокачественностью в глиомах и неходжкинских лимфомах. При этом совместная экспрессия ^1.3 и ^1.5 коррелирует с онкогенностью в мышечных саркомах. Кроме того, экспрессия ^1.5 демонстрирует значительную корреляцию со степенью злокачественности рабдомиосаркомы, опухолей почек и лимфом. Всё это

позволяет рассматривать потенциал-зависимые калиевые каналы не только в роли онкомаркёров, но также и в качестве прогностических и диагностических показателей [45].

Ку1.6 является вторым по распространённости калиевым каналом в ноцицепторах [46]. Экспрессия Ку1.6 усиливается в участках нейронов вблизи перехвата Ранвье после повреждения, в то время как экспрессия Ку1.1 и Ку1.2 снижается [47]. Предполагается, что субъединицы Ку1.6 участвуют в компенсаторной реакции на повреждение периферических нервов [48].

Таким образом, представители семейства потенциал-зависимых калиевых каналов Ку1 широко распространены в различных системах организма и осуществляют огромное количество физиологически важных функций в клетках. Изучение этих белков, определение их структуры и уточнение их роли в ключевых физиологических процессах остаются актуальными темами современной биофизики. Одной из наиболее социально-значимых задач в этой области является изучение роли каналов Ку1 в механизмах возникновения и развития заболеваний-каналопатий, а также поиск способов воздействий на каналы в рамках терапии подобных заболеваний. Одним из перспективных инструментов воздействия на ионные каналы и, в частности, на каналы Ку и Ку1 являются пептидные блокаторы.

1.2 Заболевания, связанные с нарушениями работы КУ, и перспективы лекарств на основе блокаторов К

Решающая роль каналов Ку в физиологии клеток и органов ярко иллюстрирована огромным количеством патологий, связанных с их мутациями, как например несиндромалъная нейросенсорная тугоухость второго типа для Ку7.4 [49] или синдром удлинённого интервала QT для Ку7.1 и Ку 11.1 [50]. Каналы с нарушенной функцией являются причиной многих

заболеваний, известных как каналопатии. Конечно, неправильно работающие каналы являются не единственным аспектом таких заболеваний, но в случае многих каналопатий - одним из наиболее значимых.

Ионные каналы человека кодируются более чем 400 генами (из которых 40 ответственны за Kv) и составляют таким образом второй по величине класс (после семиспиральных рецепторов) перспективных терапевтических целей для лечения заболеваний из самых разных областей: сердечно-сосудистые, метаболические, иммунологические, нефрологические, лёгочные и респираторные заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта, а также нервные и психические расстройства и многие виды рака [51]. По мере получения новых знаний о структурах каналов и разработке новых систем для поиска их лигандов, расширяются возможности и перспективы терапии каналопатий.

В 2009 году было предсказано, что лекарственные средства, нацеленные на потенциал-зависимые калиевые каналы, в частности Kv1.3, начнут входить в фазу клинических испытаний через 10 лет [24]. Однако, на момент написания данной работы, через 15 лет с того прогноза, лишь один кандидат - препарат далазатид (он же ShK-186), созданный на основе пептида морской анемоны Stichodactyla helianthus ShK [52], успешно прошёл клинические испытания на людях. Он доказал свою безопасность в ходе первой стадии испытаний и облегчил симптомы у пациентов с бляшечным псориазом. Селективность далазатида (ShK-186) была достигнута при помощи химической модификации [53].

Помимо сконструированного аналога ShK (ShK-186), известны и другие пептидые высокоаффинные и селективные блокаторы канала Kv1.3, как природные - Vm24 [54] и OdK2 [55] так и модифицированные (например, HsTxl [R14A] [56]) токсины скорпионов, которые также могут быть использованы в разработке лекарств. Пептид sVmKTx схож с Vm24, но содержит Glu вместо Lys в положении 32. Как показали авторы работы, это

19

отличие привело к снижению аффинности пептида к Ку1.3, но при этом тысячекратному увеличению его специфичности, что является его несомненным преимуществом [57].

С развитием современных аналитических методов появляется все больше данных (http://kaliumdb.org), касающихся измерения величин Ка пептидных блокаторов в отношении различных каналов-мишеней. Эти данные расширяют возможности выбора и использования пептидных блокаторов в научных исследованиях и для фармакологических разработок. Для дизайна эффективных лекарственных средств на основе селективных пептидных блокаторов Ку предстоит найти ответы ещё на многие вопросы, в частности найти способ увеличения времени пребывания пептидов в кровотоке (путём пегилирования или превращения их в антитела) и прояснить нецелевые последствия ингибирования каналов Ку [58].

1.2.1 Онкологические заболевания

Потенциал-зависимые калиевые каналы вносят решающий вклад в регуляцию потенциала плазматической мембраны, регуляцию объёма клетки и внутриклеточной концентрации ионов калия. Эти факторы влияют на ход клеточного цикла, пролиферацию клеток и апоптоз. Таким образом, каналы Ку являются перспективными фармакологическими мишенями в контексте раковых заболеваний (Таблица 1) [59].

Каналы Ку влияют на развитие сразу нескольких типов рака человека: глиобластому, лейкемию, рак молочной железы и толстой кишки и многие другие [60], - и связаны с усилением различных онкогенных и метастатических свойств опухолевых клеток [61]. Была продемонстрирована способность химических блокаторов Ку ингибировать развитие раковых клеток, и соответственно, пептидные блокаторы - токсины также изучаются на предмет их противоопухолевого действия. Для КАаН1 и КАаН2, двух гомологичных

блокаторов Ку1 из яда скорпиона, была показана перспектива их использования в противораковой терапии. КАаН1, блокатор Ку1.1 и Ку1.3, ингибирует миграцию и адгезию клеток и87, тогда как КАаН2, для которого характерна слабая аффинность лишь к каналу Ку1.1, ингибирует пролиферацию клеток через сигнальный путь EGFR [62]. При разработке лекарственных средств важно учитывать другие эффекты пептидных блокаторов Ку помимо непосредственного связывания с таргетными каналами.

Таблица 1. Каналы семейства Ку1, ассоциированные с раком [60].

Канал Механизм ассоциации Тип рака Источники

Ку1.1 Клеточная пролиферация, апоптоз, миграция и инвазия Рак шейки матки, медуллобластома [63] [64]

Ку1.3 Клеточная пролиферация, апоптоз и миграция Рак молочной железы, лёгких, толстой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, гладких мышц, скелетных мышц и лимфатических узлов, глиобластома и меланома [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72]

Ку1.4 Клеточная пролиферация и клеточный цикл Клетки нейробластомы [73]

Ку1.5 Пролиферация клеток и апоптоз Глиома, астроцитомы, раковые клетки желудка, неходжкинская лимфома человека, опухоли гладкой мускулатуры [65] [74] [75] [76]

1.2.2 Вирусные инфекции

Было показано, что часть препаратов, блокирующих ионные каналы, обладает противовирусной активностью, что побудило учёных к изучению возможности их нацеленного применения в этом направлении. Дополнительный импульс разработки в этой сфере получили после разгоревшейся в 2020 году пандемии коронавируса СОУГО19.

Некоторые из калиевых каналов напрямую вовлечены в механизм проникновения вируса в клетку, что было продемонстрировано на модельных буньявирусах и модели вируса крымско-конголезской геморрагической лихорадки [77, 78].

Вирус Коксаки B3, ассоциированный с кардиомиопатиями и внезапной сердечной смертью, тесно связан с экспрессией канала Kv7.1 [79]. Транспорт и активность Kv7.1 регулируются серин/треонинкиназой SGK1, которая и активируется вирусом (унаследованные мутации в Kv7.1 также связаны с нарушениями сердченого ритма). В то же время экспрессия и активность Kv 11.1 и Cav1.2 снижается. То есть вирус Коксаки B3 перепрограммирует экспрессию ионных каналов в сердечной ткани, что приводит к повышенному риску аритмии. Это делает указанные каналы первостепенными целями в качестве терапевтических мишеней лекарств на основе пептидов-блокаторов для предотвращения внезапной сердечной смерти в результате инфицирования вирусом Коксаки B3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Орлов Никита Александрович, 2024 год

Литература

1. Shieh C.C. et al. Potassium channels: molecular defects, diseases, and therapeutic opportunities. // Pharmacol Rev. 2000. Vol. 52, № 4. P. 557-594.

2. L Nelson D., Michael M C., others. Lehninger Principles of Biochemistry 8th Edition. Macmillan Learning, 2021.

3. Ranjan R. et al. A Kinetic Map of the Homomeric Voltage-Gated Potassium Channel (Kv) Family // Front Cell Neurosci. Frontiers Media S.A., 2019. Vol. 13.

4. Alexander S.P. et al. The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2017/18: Voltage-gated ion channels // Br J Pharmacol. 2017. Vol. 174. P. 160-194.

5. Peigneur S., Tytgat J. Toxins in drug discovery and pharmacology // Toxins (Basel). 2018. Vol. 10, № 3. P. 10-13.

6. Gubic S. et al. Discovery of K v 1.3 ion channel inhibitors: Medicinal chemistry approaches and challenges // Med Res Rev. 2021. Vol. 41, № 4. P. 2423-2473.

7. MacKinnon R. et al. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels // Science (1979). 1998. Vol. 280, № 5360. P. 106-109.

8. Doyle D.A. et al. The Structure of the Potassium Channel: Molecular Basis of K Conduction and Selectivity.

9. Heginbotham L. et al. Mutations in the K+ channel signature sequence // Biophys J. 1994. Vol. 66, № 4. P. 1061-1067.

10. Kremer W. et al. 1.2 Â X-ray Structure of the Renal Potassium Channel Kv1.3 T1 Domain // Protein J. 2013. Vol. 32, № 7. P. 533-542.

11. Rashid M.H., Kuyucak S. Free Energy Simulations of Binding of HsTx1 Toxin to Kv1 Potassium Channels: the Basis of Kv1.3/Kv1.1 Selectivity // J Phys Chem B. 2014. Vol. 118, № 3. P. 707-716.

12. Ong S.T. et al. Structure of Lymphocyte Potassium Channel K v 1.3 and Modulation by Cell-Penetrating Immunomodulatory Plant Defensin. 2019.

13. Bezanilla F. Voltage Sensor Movements // J Gen Physiol. 2002. Vol. 120, № 4. P. 465-473.

14. Hoshi T., Zagotta W.N., Aldrich R.W. Biophysical and Molecular Mechanisms of Shaker Potassium Channel Inactivation // Science (1979). 1990. Vol. 250, № 4980. P. 533-538.

15. Kurata H.T., Fedida D. A structural interpretation of voltage-gated potassium channel inactivation // Prog Biophys Mol Biol. 2006. Vol. 92, № 2. P. 185-208.

16. Reddi R. et al. Structural basis for C-type inactivation in a Shaker family voltage-gated K + channel // Sci Adv. 2022. Vol. 8, № 16.

17. Capera J. et al. The Potassium Channel Odyssey: Mechanisms of Traffic and Membrane Arrangement // Int J Mol Sci. 2019. Vol. 20, № 3. P. 734.

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

Tu L. et al. Transmembrane Biogenesis of Kv1.3 // Biochemistry. 2000. Vol. 39, № 4. P. 824-836.

Deutsch C. Potassium Channel Ontogeny // Annu Rev Physiol. 2002. Vol. 64, № 1. P. 1946.

Martens J. Modulation of Kv Channel a/ß Subunit Interactions // Trends Cardiovasc Med. 1999. Vol. 9, № 8. P. 253-258.

Shi G. et al. ßSubunits Promote K+ Channel Surface Expression through Effects Early in Biosynthesis // Neuron. 1996. Vol. 16, № 4. P. 843-852.

Hodgkin A.L., Huxley A.F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve // J Physiol. 1952. Vol. 117, № 4. P. 500544.

Smart S.L. et al. Deletion of the K V 1.1 Potassium Channel Causes Epilepsy in Mice prolonged action potential duration (Tanouye et al., 1981), and absence of a transient K current in pupal flight muscles (Salkoff and Wyman, 1981) // Neuron. 1998. Vol. 20. 809819 p.

Wulff H., Castle N.A., Pardo L.A. Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets // Nat Rev Drug Discov. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 8, № 12. P. 982-1001.

D'Adamo M.C. et al. Kv1.1 Channelopathies: Pathophysiological Mechanisms and Therapeutic Approaches // Int J Mol Sci. 2020. Vol. 21, № 8. P. 2935.

Mayer M.C., Meinl E. Glycoproteins as targets of autoantibodies in CNS inflammation: MOG and more // Ther Adv Neurol Disord. 2012. Vol. 5, № 3. P. 147-159.

Wang H. et al. Heteromultimeric K+ channels in terminal and juxtaparanodal regions of neurons // Nature. 1993. Vol. 365, № 6441. P. 75-79.

Meneses D. et al. K v 1 and K v 3 Potassium Channels Identified at Presynaptic Terminals of the Corticostriatal Synapses in Rat // Neural Plast. 2016. Vol. 2016. P. 1-11.

Ma Z. et al. Evidence for Presence and Functional Effects of Kv1.1 Channels in ß-Cells: General Survey and Results from mceph/mceph Mice // PLoS One. 2011. Vol. 6, № 4. P. e18213.

Firth A.L. et al. Functional Ion Channels in Human Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells: Voltage-Dependent Cation Channels // Pulm Circ. 2011. Vol. 1, № 1. P. 48-71.

Fellerhoff-Losch B. et al. Normal human CD4+ helper T cells express Kv1.1 voltage-gated K+ channels, and selective Kv1.1 block in T cells induces by itself robust TNFa production and secretion and activation of the NFkB non-canonical pathway // J Neural Transm. 2016. Vol. 123, № 3. P. 137-157.

Trimmer J.S. Subcellular Localization of K+ Channels in Mammalian Brain Neurons: Remarkable Precision in the Midst of Extraordinary Complexity // Neuron. 2015. Vol. 85, № 2. P. 238-256.

Döring J.H. et al. Refining Genotypes and Phenotypes in KCNA2-Related Neurological Disorders // Int J Mol Sci. 2021. Vol. 22, № 6. P. 2824.

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

Nilsson M. et al. An epilepsy-associated K v 1.2 charge-transfer-center mutation impairs K V 1.2 and K V 1.4 trafficking // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022. Vol. 119, № 17.

Zhang J. et al. Epigenetic restoration of voltage-gated potassium channel Kv1.2 alleviates nerve injury-induced neuropathic pain // J Neurochem. 2021. Vol. 156, № 3. P. 367-378.

Hivert B. et al. Assembly of juxtaparanodes in myelinating <scp>DRG</scp> culture: Differential clustering of the <scp>K</scp> v1/ <scp>C</scp> aspr2 complex and scaffolding protein 4.1 <scp>B</scp> // Glia. 2016. Vol. 64, № 5. P. 840-852.

Pinatel D., Faivre-Sarrailh C. Assembly and Function of the Juxtaparanodal Kv1 Complex in Health and Disease // Life. 2020. Vol. 11, № 1. P. 8.

Pérez-García M.T., Cidad P., López-López J.R. The secret life of ion channels: Kv1.3 potassium channels and proliferation // Am J Physiol Cell Physiol. 2018. Vol. 314, № 1. P. C27-C40.

Checchetto V. et al. Mitochondrial potassium channels in cell death // Biochem Biophys Res Commun. Elsevier B.V., 2018. Vol. 500, № 1. P. 51-58.

Comes N. et al. The voltage-dependent K+ channels Kv1.3 and Kv1.5 in human cancer // Front Physiol. Frontiers Media SA, 2013. Vol. 4.

Chiang E.Y. et al. Potassium channels Kv1.3 and KCa3.1 cooperatively and compensatorily regulate antigen-specific memory T cell functions // Nat Commun. 2017. Vol. 8, № 1. P. 14644.

Chandy K.G., Norton R.S. Peptide blockers of K v 1.3 channels in T cells as therapeutics for autoimmune disease // Curr Opin Chem Biol. 2017. Vol. 38. P. 97-107.

O'Donovan B. et al. Altered gating of Kv1.4 in the nucleus accumbens suppresses motivation for reward // Elife. 2019. Vol. 8.

González-Alvarado M.N. et al. Functional role of endogenous Kv1.4 in experimental demyelination // J Neuroimmunol. 2020. Vol. 343. P. 577227.

Comes N. et al. The voltage-dependent K+ channels Kv1.3 and Kv1.5 in human cancer // Front Physiol. Frontiers Media SA, 2013. Vol. 4.

Zheng Y. et al. Deep Sequencing of Somatosensory Neurons Reveals Molecular Determinants of Intrinsic Physiological Properties // Neuron. 2019. Vol. 103, № 4. P. 598-616.e7.

Calvo M. et al. Altered potassium channel distribution and composition in myelinated axons suppresses hyperexcitability following injury // Elife. 2016. Vol. 5.

Peck L.J. et al. Studying Independent Kcna6 Knock-out Mice Reveals Toxicity of Exogenous LacZ to Central Nociceptor Terminals and Differential Effects of Kv1.6 on Acute and Neuropathic Pain Sensation // The Journal of Neuroscience. 2021. Vol. 41, № 44. P. 9141-9162.

Xia X. et al. Molecular basis and restoration of function deficiencies of Kv7.4 variants associated with inherited hearing loss // Hear Res. Elsevier B.V., 2020. Vol. 388.

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

Brewer K.R. et al. Structures Illuminate Cardiac Ion Channel Functions in Health and in Long QT Syndrome // Frontiers in Pharmacology. Frontiers Media S.A., 2020. Vol. 11.

Liu Y., Wang K.W. Exploiting the diversity of ion channels: Modulation of ion channels for therapeutic indications // Handbook of Experimental Pharmacology. Springer, 2019. Vol. 260. P. 187-205.

Tarcha E.J. et al. Safety and pharmacodynamics of dalazatide, a Kv1.3 channel inhibitor, in the treatment of plaque psoriasis: A randomized phase 1b trial // PLoS One. 2017. Vol. 12, № 7. P. 1-19.

Shen B. et al. Treating autoimmune disorders with venom-derived peptides // Expert Opinion on Biological Therapy. Taylor and Francis Ltd, 2017. Vol. 17, № 9. P. 1065-1075.

Gurrola G.B. et al. Structure, Function, and Chemical Synthesis of Vaejovis mexicanus Peptide 24: A Novel Potent Blocker of Kv1.3 Potassium Channels of Human T Lymphocytes // Biochemistry. 2012. Vol. 51, № 19. P. 4049-4061.

Abdel-Mottaleb Y. et al. OdK2, a Kv1.3 channel-selective toxin from the venom of the Iranian scorpion Odonthobuthus doriae // Toxicon. 2008. Vol. 51, № 8. P. 1424-1430.

Rashid M.H. et al. A potent and Kv1.3-selective analogue of the scorpion toxin HsTX1 as a potential therapeutic for autoimmune diseases // Sci Rep. 2014. Vol. 4, № 1. P. 4509.

Csoti A. et al. sVmKTx, a transcriptome analysis-based synthetic peptide analogue of Vm24, inhibits Kv1.3 channels of human T cells with improved selectivity // Biochem Pharmacol. 2022. Vol. 199. P. 115023.

Varga Z., Tajti G., Panyi G. The Kv1.3 K+ channel in the immune system and its "precision pharmacology" using peptide toxins // Biologia Futura. Akademiai Kiado ZRt., 2021. Vol. 72, № 1. P. 75-83.

Bachmann M. et al. Voltage-Gated Potassium Channels as Regulators of Cell Death // Frontiers in Cell and Developmental Biology. Frontiers Media S.A., 2020. Vol. 8.

Zuniga L. et al. Potassium Channels as a Target for Cancer Therapy: Current Perspectives // OncoTargets and Therapy. Dove Medical Press Ltd, 2022. Vol. 15. P. 783-797.

Zouari M. et al. Multipurpose E-bioplatform targeting Kv channels in whole cancer cells and evaluating of their potential therapeutics // Anal Chim Acta. 2022. Vol. 1231. P. 340397.

Aissaoui D. et al. Functional role of Kv1.1 and Kv1.3 channels in the neoplastic progression steps of three cancer cell lines, elucidated by scorpion peptides // Int J Biol Macromol. 2018. Vol. 111. P. 1146-1155.

Liu L. et al. Silencing of KCNA1 suppresses the cervical cancer development via mitochondria damage // Channels. 2019. Vol. 13, № 1. P. 321-330.

Taylor M.D. et al. Molecular subgroups of medulloblastoma: the current consensus // Acta Neuropathol. 2012. Vol. 123, № 4. P. 465-472.

Bielanska J. et al. Differential Expression of Kv1.3 and Kv1.5 Voltage-Dependent K + Channels in Human Skeletal Muscle Sarcomas // Cancer Invest. 2012. Vol. 30, № 3. P. 203208.

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

BIELANSKA J. et al. Increased voltage-dependent K+ channel Kv1.3 and Kv1.5 expression correlates with leiomyosarcoma aggressiveness // Oncol Lett. 2012. Vol. 4, № 2. P. 227-230.

Comes N. et al. The voltage-dependent K+ channels Kv1.3 and Kv1.5 in human cancer // Front Physiol. 2013. Vol. 4.

Teisseyre A., G^siorowska J., Michalak K. Voltage-Gated Ptassium Channels Kv1.3 -Potentially New Molecular Target in Cancer Diagnostics and Therapy // Advances in Clinical and Experimental Medicine. 2015. Vol. 24, № 3. P. 517-524.

Teisseyre A. et al. Voltage-Gated Potassium Channel Kv1.3 as a Target in Therapy of Cancer // Front Oncol. 2019. Vol. 9.

Leanza L. et al. Direct Pharmacological Targeting of a Mitochondrial Ion Channel Selectively Kills Tumor Cells In Vivo // Cancer Cell. 2017. Vol. 31, № 4. P. 516-531.e10.

Venturini E. et al. Targeting the Potassium Channel Kv1.3 Kills Glioblastoma Cells // Neurosignals. 2017. Vol. 25, № 1. P. 26-38.

Leanza V.C.E.P.L. Mitochondrial Kv1. 3: a new target in cancer biology? // Cell Physiol Biochem. 2019. Vol. 53, № S1. P. 52-62.

Park J.H. et al. High expression of large-conductance Ca2+-activated K+ channel in the CD133+ subpopulation of SH-SY5Y neuroblastoma cells // Biochem Biophys Res Commun. 2010. Vol. 396, № 3. P. 637-642.

PreuBat K. et al. Expression of voltage-gated potassium channels Kv1.3 and Kv1.5 in human gliomas // Neurosci Lett. 2003. Vol. 346, № 1-2. P. 33-36.

Lan M. et al. Expression of delayed rectifier potassium channels and their possible roles in proliferation of human gastric cancer cells // Cancer Biol Ther. 2005. Vol. 4, № 12. P. 13421347.

Vallejo-Gracia A. et al. Emerging role for the voltage-dependent K+ channel Kv1.5 in B-lymphocyte physiology: expression associated with human lymphoma malignancy // J Leukoc Biol. 2013. Vol. 94, № 4. P. 779-789.

Charlton F.W. et al. Ion Channels as therapeutic targets for viral infections: Further discoveries and future perspectives // Viruses. MDPI AG, 2020. Vol. 12, № 8.

Hover S. et al. Modulation of potassium channels inhibits bunyavirus infection // Journal of Biological Chemistry. American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2016. Vol. 291, № 7. P. 3411-3422.

Peischard S. et al. A kidnapping story: How coxsackievirus B3 and its host cell interact // Cellular Physiology and Biochemistry. Cell Physiol Biochem Press GmbH & Co KG, 2019. Vol. 53, № 1. P. 121-140.

Cañas C.A., Castaño-Valencia S., Castro-Herrera F. Pharmacological blockade of KV1.3 channel as a promising treatment in autoimmune diseases // Journal of Translational Autoimmunity. Elsevier B.V., 2022. Vol. 5.

Cheng S. et al. Voltage-gated potassium channel 1.3: A promising molecular target in multiple disease therapy // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2024. Vol. 175. P. 116651.

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

Chandy K.G., Norton R.S. Peptide blockers of Kv1.3 channels in T cells as therapeutics for autoimmune disease // Curr Opin Chem Biol. Elsevier Ltd, 2017. Vol. 38. P. 97-107.

Ortiz G.G. et al. Role of the Blood-Brain Barrier in Multiple Sclerosis // Arch Med Res. 2014. Vol. 45, № 8. P. 687-697.

Huang J. et al. Kv1.3 channel blocker (ImKTx88) maintains blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis // Cell Biosci. 2017. Vol. 7, № 1. P. 31.

Tanner M.R. et al. Prolonged immunomodulation in inflammatory arthritis using the selective Kv1.3 channel blocker HsTX1[R14A] and its PEGylated analog // Clinical Immunology. 2017. Vol. 180. P. 45-57.

Toldi G. et al. The effects of Kv1.3 and IKCa1 potassium channel inhibition on calcium influx of human peripheral T lymphocytes in rheumatoid arthritis // Immunobiology. 2013. Vol. 218, № 3. P. 311-316.

Bradding P., Wulff H. The K + channels KCa3.1 and Kv1.3 as novel targets for asthma therapy // Br J Pharmacol. 2009. Vol. 157, № 8. P. 1330-1339.

Koshy S. et al. Blocking Kv1.3 channels inhibits Th2 lymphocyte function and treats a rat model of asthma // Journal of Biological Chemistry. 2014. Vol. 289, № 18. P. 12623-12632.

Sanguinetti M.C., Tristani-Firouzi M. hERG potassium channels and cardiac arrhythmia // Nature. 2006. Vol. 440, № 7083. P. 463-469.

Furutani K. et al. Facilitation of hERG channels by blockers: a mechanism predicted to reduce lethal cardiac arrhythmias. 2018.

Dubey R.C., Mishra N., Gaur R. G protein-coupled and ATP-sensitive inwardly rectifying potassium ion channels are essential for HIV entry // Sci Rep. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 9, № 1.

Keblesh J., Hu D., Xiong H. Voltage-gated potassium channels in human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1)-associated neurocognitive disorders // Journal of Neuroimmune Pharmacology. 2009. Vol. 4, № 1. P. 60-70.

Li C. et al. Phage randomization in a charybdotoxin scaffold leads to CD4-mimetic recognition motifs that bind HIV-1 envelope through non-aromatic sequences // Journal of Peptide Research. 2001. Vol. 57, № 6. P. 507-518.

Zayas-Arrabal J. et al. Kv1.3 Channel Blockade Improves Inflammatory Profile, Reduces Cardiac Electrical Remodeling, and Prevents Arrhythmia in Type 2 Diabetic Rats // Cardiovasc Drugs Ther. 2023. Vol. 37, № 1. P. 63-73.

Arevalo-Martinez M. et al. miR-126 contributes to the epigenetic signature of diabetic vascular smooth muscle and enhances antirestenosis effects of Kv1.3 blockers // Mol Metab. 2021. Vol. 53. P. 101306.

Upadhyay S.K. et al. Selective Kv1.3 channel blocker as therapeutic for obesity and insulin resistance // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013. Vol. 110, № 24.

Fomina A.F., Nguyen H.M., Wulff H. Kv1.3 inhibition attenuates neuroinflammation through disruption of microglial calcium signaling // Channels. 2021. Vol. 15, № 1. P. 6778.

98.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

Kidd J.F., Sattelle D.B. The effects of amyloid peptides on A-type K+ currents of Drosophila larval cholinergic neurons: Modeled actions on firing properties // Invertebrate Neuroscience. 2006. Vol. 6, № 4. P. 207-213.

Gati C.D.C., Mortari M.R., Schwartz E.F. Towards Therapeutic Applications of Arthropod Venom K+ -Channel Blockers in CNS Neurologic Diseases Involving Memory Acquisition and Storage // J Toxicol. 2012. Vol. 2012. P. 1-21.

Khanna R. et al. K + channels and the microglial respiratory burst // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2017. Vol. 280, № 4. P. C796-C806.

Fordyce C.B. Microglia Kv1.3 Channels Contribute to Their Ability to Kill Neurons // Journal of Neuroscience. 2005. Vol. 25, № 31. P. 7139-7149.

Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger A.L. Lenninger Principles of Biochemistry // New York : W.H. Freeman. 2012. P. 1328.

Kalina R. et al. New APETx-like peptides from sea anemone Heteractis crispa modulate ASIC1a channels // Peptides (N.Y.). Elsevier Inc., 2018. Vol. 104. P. 41-49.

Pinheiro-Junior E.L. et al. A Tale of Toxin Promiscuity: The Versatile Pharmacological Effects of Hcr 1b-2 Sea Anemone Peptide on Voltage-Gated Ion Channels // Mar Drugs. MDPI, 2022. Vol. 20, № 2.

Miller C. The charybdotoxin family of K+ channel-blocking peptides // Neuron. 1995. Vol. 15, № 1. P. 5-10.

Csoti A. et al. sVmKTx, a transcriptome analysis-based synthetic peptide analogue of Vm24, inhibits Kv1.3 channels of human T cells with improved selectivity // Biochem Pharmacol. Elsevier Inc., 2022. Vol. 199.

Andreu D., Andreu D., Rivas L. Andreu , D . & Rivas , L . Animal antimicrobial Peptides : An Overview. 2017. Vol. 0282, № January 1998. P. 415-433.

Kuzmenkov A.I., Grishin E. V, Vassilevski A.A. Diversity of Potassium Channel Ligands : Focus on Scorpion Toxins. 2015. Vol. 80, № 13. P. 1764-1799.

Diego-García E., Caliskan F., Tytgat J. The Mediterranean scorpion Mesobuthus gibbosus (Scorpiones, Buthidae): transcriptome analysis and organization of the genome encoding chlorotoxin-like peptides // BMC Genomics. 2014. Vol. 15, № 1. P. 295.

Tytgat J. et al. A unified nomenclature for short-chain peptides isolated from scorpion venoms: a-KTx molecular subfamilies // Trends Pharmacol Sci. 1999. Vol. 20, № 11. P. 444-447.

Naseem M.U. et al. A novel peptide from the venom of Centruroides margaritatus has unique primary structure and inhibits Kv1. 2 and Kv1. 3 with high affinity // Biophys J. Elsevier, 2022. Vol. 121, № 3. P. 389a.

Ezekowitz RA, Williams DJ, Koziel H, Armstrong MY, Warner A, Richards FF R.R. © 19 9 1 Nature Publishing Group // Nature. 1991. P. file:///D:/Thesis

Project/Project/literature/most.

Ahrens V.M., Bellmann-Sickert K., Beck-Sickinger A.G. Peptides and peptide conjugates: Therapeutics on the upward path // Future Med Chem. 2012. Vol. 4, № 12. P. 1567-1586.

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

Banerjee A. et al. Structure of a pore-blocking toxin in complex with a eukaryotic voltage-dependent K+ channel // Elife. 2013. Vol. 2013, № 2.

Dauplais M. et al. On the Convergent Evolution of Animal Toxins // Journal of Biological Chemistry. 1997. Vol. 272, № 7. P. 4302-4309.

Lange A. et al. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR // Nature. 2006. Vol. 440, № 7086. P. 959-962.

Rashid M.H. et al. A potent and selective peptide blocker of the Kv1.3 channel: Prediction from free-energy simulations and experimental confirmation // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 11.

Lenaeus M.J. et al. Structural basis of TEA blockade in a model potassium channel // Nat Struct Mol Biol. 2005. Vol. 12, № 5. P. 454-459.

Goldstein S.A., Miller C. Mechanism of charybdotoxin block of a voltage-gated K+ channel // Biophys J. Elsevier, 1993. Vol. 65, № 4. P. 1613-1619.

Ranganathan R., Lewis J.H., MacKinnon R. Spatial localization of the K+ channel selectivity filter by mutant cycle-based structure analysis // Neuron. Elsevier, 1996. Vol. 16, № 1. P. 131-139.

Koschak A. et al. Subunit composition of brain voltage-gated potassium channels determined by hongotoxin-1, a novel peptide derived from Centruroides limbatus venom // Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273, № 5. P. 2639-2644.

Matsumura K., Yokogawa M., Osawa M. Peptide Toxins Targeting KV Channels. 2021. P. 481-505.

Norton R.S., Chandy K.G. Venom-derived peptide inhibitors of voltage-gated potassium channels // Neuropharmacology. 2017. Vol. 127. P. 124-138.

Tajti G. et al. The voltage-gated potassium channel KV1.3 as a therapeutic target for venom-derived peptides // Biochem Pharmacol. 2020. Vol. 181. P. 114146.

Chen R., Chung S.H. Binding modes of two scorpion toxins to the voltage-gated potassium channel kv1.3 revealed from molecular dynamics // Toxins (Basel). 2014. Vol. 6, № 7. P. 2149-2161.

Chen P.-C., Kuyucak S. Developing a Comparative Docking Protocol for the Prediction of Peptide Selectivity Profiles: Investigation of Potassium Channel Toxins // Toxins (Basel). 2012. Vol. 4, № 2. P. 110-138.

Chen P.C., Kuyucak S. Developing a comparative docking protocol for the prediction of peptide selectivity profiles: Investigation of potassium channel toxins // Toxins (Basel). 2012. Vol. 4, № 2. P. 110-138.

Pragl B. et al. Synthesis, characterization, and application of Cy-dye- and Alexa-dye-labeled hongotoxin1 analogues. The first high affinity fluorescence probes for voltage-gated K+ channels // Bioconjug Chem. 2002. Vol. 13, № 3. P. 416-425.

Robitaille R. et al. Functional colocalization of calcium and calcium-gated potassium channels in control of transmitter release // Neuron. 1993. Vol. 11, № 4. P. 645-655.

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

Denisova K.R. et al. GFP-Margatoxin, a Genetically Encoded Fluorescent Ligand to Probe Affinity of Kv1.3 Channel Blockers // Int J Mol Sci. 2022. Vol. 23, № 3. P. 1724.

Garcia-Calvo M. et al. Purification and reconstitution of the high-conductance, calcium-activated potassium channel from tracheal smooth muscle. // Journal of Biological Chemistry. 1994. Vol. 269, № 1. P. 676-682.

Kourrich S., Mourre C., Soumireu-Mourat B. Kaliotoxin, a Kv1.1 and Kv1.3 channel blocker, improves associative learning in rats // Behavioural Brain Research. 2001. Vol. 120, № 1. P. 35-46.

Montnach J. et al. In vivo spatiotemporal control of voltage-gated ion channels by using photoactivatable peptidic toxins // Nat Commun. 2022. Vol. 13, № 1. P. 417.

Alvarenga E.R. et al. Transcriptome analysis of the &lt;i&gt;Tityus serrulatus&lt;/i&gt; scorpion venom gland // Open J Genet. Scientific Research Publishing, Inc, 2012. Vol. 02, № 04. P. 210-220.

Kuzmenkov A.I. et al. Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1 // Journal of Biological Chemistry. 2015. Vol. 290, № 19. P.12195-12209.

King G. Venoms to drugs: venom as a source for the development of human therapeutics. Royal Society of Chemistry, 2015.

Cid-Uribe J.I. et al. Scorpion venomics: a 2019 overview // Expert Rev Proteomics. 2020. Vol. 17, № 1. P. 67-83.

Gundry R.L. et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow // Curr Protoc Mol Biol. Wiley Online Library, 2010. Vol. 90, № 1. P. 10-25.

Song J. et al. An improvement of shotgun proteomics analysis by adding next-generation sequencing transcriptome data in orange // PLoS One. Public Library of Science San Francisco, USA, 2012. Vol. 7, № 6. P. e39494.

Batista C.V.F. et al. Venom characterization of the Amazonian scorpion Tityus metuendus // Toxicon. Elsevier, 2018. Vol. 143. P. 51-58.

Mak K.-K., Pichika M.R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects // Drug Discov Today. 2019. Vol. 24, № 3. P. 773-780.

Takacs Z. et al. A designer ligand specific for Kv1.3 channels from a scorpion neurotoxin-based library // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. Vol. 106, № 52. P.22211-22216.

Zhao R. et al. Designer and natural peptide toxin blockers of the KcsA potassium channel identified by phage display // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2015. Vol. 112, № 50.

Rauer H. et al. Structural Conservation of the Pores of Calcium-activated and Voltage-gated Potassium Channels Determined by a Sea Anemone Toxin // Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274, № 31. P. 21885-21892.

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

Beeton C. et al. Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases // Mol Pharmacol. 2005. Vol. 67, № 4. P. 1369-1381.

Pennington M.W. et al. Engineering a Stable and Selective Peptide Blocker of the Kv1.3 Channel in T Lymphocytes // Mol Pharmacol. 2009. Vol. 75, № 4. P. 762-773.

Cahalan M.D., Chandy K.G. The functional network of ion channels in T lymphocytes // Immunol Rev. Wiley Online Library, 2009. Vol. 231, № 1. P. 59-87.

Berkut A.A. et al. Structural Similarity between Defense Peptide from Wheat and Scorpion Neurotoxin Permits Rational Functional Design // Journal of Biological Chemistry. 2014. Vol. 289, № 20. P. 14331-14340.

Tabakmakher V.M. et al. Potassium channel blocker crafted by a-hairpinin scaffold engineering // Biophys J. 2021. Vol. 120, № 12. P. 2471-2481.

Gigolaev A.M. et al. Artificial pore blocker acts specifically on voltage-gated potassium channel isoform KV1.6 // Journal of Biological Chemistry. 2022. Vol. 298, № 11. P. 102467.

Ong S.T. et al. Modulation of Lymphocyte Potassium Channel K v 1.3 by MembranePenetrating, Joint-Targeting Immunomodulatory Plant Defensin // ACS Pharmacol Transl Sci. 2020. Vol. 3, № 4. P. 720-736.

Vázquez J. et al. Characterization of High Affinity Binding Sites for Charybdotoxin in Sarcolemmal Membranes from Bovine Aortic Smooth Muscle // Journal of Biological Chemistry. 1989. Vol. 264, № 35. P. 20902-20909.

Koch R.O. et al. Complex Subunit Assembly of Neuronal Voltage-gated K + Channels // Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 272, № 44. P. 27577-27581.

Schwartz E.F. et al. OcyKTx2, a new K+-channel toxin characterized from the venom of the scorpion Opisthacanthus cayaporum // Peptides (N.Y.). Elsevier Inc., 2013. Vol. 46. P. 40-46.

Hamill O.P. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch. 1981. Vol. 391, № 2. P. 85100.

Noguchi A., Ikegaya Y., Matsumoto N. In Vivo Whole-Cell Patch-Clamp Methods: Recent Technical Progress and Future Perspectives // Sensors. 2021. Vol. 21, № 4. P. 1448.

Comley J. Automated patch clamping finally achieves high throughout // Drug discovery world. 2014. Vol. 4. P. 45-56.

Li T. et al. High-throughput electrophysiological assays for voltage gated ion channels using SyncroPatch 768PE // PLoS One. 2017. Vol. 12, № 7. P. e0180154.

Gordon D., Chen R., Chung S.-H. Computational Methods of Studying the Binding of Toxins From Venomous Animals to Biological Ion Channels: Theory and Applications // Physiol Rev. 2013. Vol. 93, № 2. P. 767-802.

Giorgetti A., Carloni P. Molecular modeling of ion channels: structural predictions // Curr Opin Chem Biol. 2003. Vol. 7, № 1. P. 150-156.

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

Novoseletsky V.N. et al. Modeling of the Binding of Peptide Blockers to Voltage-Gated Potassium Channels: Approaches and Evidence // REVIEWS. 2016. Vol. 8.

Gordon D., Chen R., Chung S.-H. Computational Methods of Studying the Binding of Toxins From Venomous Animals to Biological Ion Channels: Theory and Applications // Physiol Rev. 2013. Vol. 93, № 2. P. 767-802.

Best R.B. et al. Optimization of the Additive CHARMM All-Atom Protein Force Field Targeting Improved Sampling of the Backbone y and Side-Chain x 1 and x 2 Dihedral Angles // J Chem Theory Comput. 2012. Vol. 8, № 9. P. 3257-3273.

Terstappen G.C. et al. Screening Technologies for Ion Channel Drug Discovery // Future Med Chem. 2010. Vol. 2, № 5. P. 715-730.

Freudenthaler G. et al. Ultrasensitive pharmacological characterisation of the voltage-gated potassium channel KV1.3 studied by single-molecule fluorescence microscopy // Histochem Cell Biol. 2002. Vol. 117, № 3. P. 197-202.

Beeton C. et al. A Novel Fluorescent Toxin to Detect and Investigate Kv1.3 Channel Up-regulation in Chronically Activated T Lymphocytes // Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278, № 11. P. 9928-9937.

Kuzmenkov A.I., Vassilevski A.A. Labelled animal toxins as selective molecular markers of ion channels: Applications in neurobiology and beyond // Neurosci Lett. 2018. Vol. 679. P. 15-23.

Nekrasova O. V. et al. N-Terminal Tagging with GFP Enhances Selectivity of Agitoxin 2 to Kv1.3-Channel Binding Site // Toxins (Basel). 2020. Vol. 12, № 12. P. 802.

Nekrasova O. V. et al. N-Terminal Tagging with GFP Enhances Selectivity of Agitoxin 2 to Kv1.3-Channel Binding Site // Toxins (Basel). 2020. Vol. 12, № 12. P. 802.

Kudryashova K.S. et al. Fluorescent system based on bacterial expression of hybrid KcsA channels designed for Kv1.3 ligand screening and study // Anal Bioanal Chem. 2013. Vol. 405, № 7. P. 2379-2389.

Tropea J.E., Cherry S., Waugh D.S. Expression and Purification of Soluble His6-Tagged TEV Protease. 2009. P. 297-307.

Kubota T., Correa A.M., Bezanilla F. Mechanism of functional interaction between potassium channel Kv1.3 and sodium channel NavBeta1 subunit // Sci Rep. 2017. Vol. 7, № 1. P. 45310.

Nekrasova O. et al. Straightforward approach to produce recombinant scorpion toxins— Pore blockers of potassium channels // J Biotechnol. Elsevier B.V., 2017. Vol. 241. P. 127135.

Novagen. TB055 10th Edition pET System Manual // pET Manual. 2003. P. 1-68.

LAEMMLI U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

Kuipers B.J.H., Gruppen H. Prediction of molar extinction coefficients of proteins and peptides using UV absorption of the constituent amino acids at 214 nm to enable

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

quantitative reverse phase high-performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis // J Agric Food Chem. 2007. Vol. 55, № 14. P. 5445-5451.

Nekrasova O. V. et al. Recombinant Kv channels at the membrane of escherichia coli bind specifically agitoxin2 // Journal of Neuroimmune Pharmacology. 2009. Vol. 4, № 1. P. 8391.

Orlov N.A. et al. Combining mKate2-Kv1.3 Channel and Atto488-Hongotoxin for the Studies of Peptide Pore Blockers on Living Eukaryotic Cells // Toxins (Basel). MDPI, 2022. Vol. 14, № 12.

Sands S.B., Lewis R.S., Cahalan M.D. Charybdotoxin Blocks Voltage-gated K + Channels in Human and Murine T Lymphocytes.

Attali B. et al. Cloning, functional expression, and regulation of two K+ channels in human T lymphocytes. // Journal of Biological Chemistry. Elsevier, 1992. Vol. 267, № 12. P. 86508657.

Kubota T., Correa A.M., Bezanilla F. Mechanism of functional interaction between potassium channel Kv1.3 and sodium channel NavBeta1 subunit // Sci Rep. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 7.

Voros O. et al. The C-terminal HRET sequence of Kv1.3 regulates gating rather than targeting of Kv1.3 to the plasma membrane // Sci Rep. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 8, № 1.

Legros C. et al. Engineering-Specific Pharmacological Binding Sites for Peptidyl Inhibitors of Potassium Channels into KcsA // Biochemistry. American Chemical Society, 2002. Vol. 41, № 51. P. 15369-15375.

Kuzmenkov A.I. et al. Fluorescent protein-scorpion toxin chimera is a convenient molecular tool for studies of potassium channels // Sci Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, № September. P. 1-10.

Kudryashova K.S. et al. Chimeras of KcsA and Kv1 as a bioengineering tool to study voltage-gated potassium channels and their ligands // Biochem Pharmacol. Elsevier Inc., 2021. Vol. 190, № May. P. 114646.

Andalib P. et al. The External TEA Binding Site and C-Type Inactivation in Voltage-Gated Potassium Channels // Biophys J. 2004. Vol. 87, № 5. P. 3148-3161.

Shieh C.C., Kirsch G.E. Mutational analysis of ion conduction and drug binding sites in the inner mouth of voltage-gated K+ channels // Biophys J. 1994. Vol. 67, № 6. P. 2316-2325.

Kirsch G.E. et al. Segmental exchanges define 4-aminopyridine binding and the inner mouth of K+ pores // Neuron. 1993. Vol. 11, № 3. P. 503-512.

Yung-Chi C., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction // Biochem Pharmacol. Elsevier, 1973. Vol. 22, № 23. P. 3099-3108.

Anangi R. et al. Recombinant Expression of Margatoxin and Agitoxin-2 in Pichia pastoris: An Efficient Method for Production of KV1.3 Channel Blockers // PLoS One. Public Library of Science, 2012. Vol. 7, № 12. P. e52965-.

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

Mourre C. et al. Distribution in rat brain of binding sites of kaliotoxin, a blocker of Kv1.1 and Kv1.3 alpha-subunits. // J Pharmacol Exp Ther. 1999. Vol. 291, № 3. P. 943-952.

Takacs Z. et al. A designer ligand specific for Kv1.3 channels from a scorpion neurotoxin-based library // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. Vol. 106, № 52. P.22211-22216.

Garcia M.L. et al. Purification and Characterization of Three Inhibitors of Voltage-Dependent K+ Channels from Leiurus Quinquestriatus var. Hebraeus Venom // Biochemistry. 1994. Vol. 33, № 22. P. 6834-6839.

Nekrasova O. V. et al. Complexes of Peptide Blockers with Kv1.6 Pore Domain: Molecular Modeling and Studies with KcsA-Kv1.6 Channel // Journal of Neuroimmune Pharmacology. Journal of Neuroimmune Pharmacology, 2017. Vol. 12, № 2. P. 260-276.

Volyntseva A.D. et al. Molecular modeling of interactions of agitoxin 2 with Kv1.3 voltage-gated potassium channel // Moscow Univ Biol Sci Bull. 2017. Vol. 72, № 1. P. 25-29.

Manganas L.N. et al. Identification of a trafficking determinant localized to the Kv1 potassium channel pore // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. Vol. 98, № 24. P.14055-14059.

Zhu J. et al. Determinants Involved in Kv1 Potassium Channel Folding in the Endoplasmic Reticulum, Glycosylation in the Golgi, and Cell Surface Expression // Journal of Biological Chemistry. 2001. Vol. 276, № 42. P. 39419-39427.

ZHU J. et al. Amino acids in the pore region of Kv1 potassium channels dictate cell-surface protein levels: a possible trafficking code in the Kv1 subfamily // Biochemical Journal. 2005. Vol. 388, № 1. P. 355-362.

Orlov N.A. et al. Interactions of the Kv1.1 Channel with Peptide Pore Blockers: A Fluorescent Analysis on Mammalian Cells // Membranes (Basel). 2023. Vol. 13, № 7. P. 645.

Zhao Y. et al. Diverse Structural Features of Potassium Channels Characterized by Scorpion Toxins as Molecular Probes // Molecules. 2019. Vol. 24, № 11. P. 2045.

Wang X. et al. Mesomartoxin, a new Kv1.2-selective scorpion toxin interacting with the channel selectivity filter // Biochem Pharmacol. 2015. Vol. 93, № 2. P. 232-239.

Kuzmenkov A.I., Vassilevski A.A. Labelled animal toxins as selective molecular markers of ion channels: Applications in neurobiology and beyond // Neurosci Lett. Elsevier, 2018. Vol. 679, № August. P. 15-23.

Bartok A. et al. Margatoxin is a non-selective inhibitor of human Kv1.3 K+ channels // Toxicon. 2014. Vol. 87. P. 6-16.

Primak A.L. et al. AgTx2-GFP, Fluorescent Blocker Targeting Pharmacologically Important Kv1.x (x = 1, 3, 6) Channels // Toxins (Basel). 2023. Vol. 15, № 3. P. 229.

Rienecker K.D.A., Poston R.G., Saha R.N. Merits and Limitations of Studying Neuronal Depolarization-Dependent Processes Using Elevated External Potassium // ASN Neuro. 2020. Vol. 12. P. 175909142097480.

206. Katzman R., Electrolytes B. Pappius HM // Brain electrolytes and fluid metabolism. Williams and Wilkins Baltimore, 1973. P. 14-32.

207. Blunck R., Batulan Z. Mechanism of Electromechanical Coupling in Voltage-Gated Potassium Channels // Front Pharmacol. 2012. Vol. 3.

208. Bhuyan R., Seal A. Conformational Dynamics of Shaker-Type Kv1.1 Ion Channel in Open, Closed, and Two Mutated States // J Membr Biol. 2015. Vol. 248, № 2. P. 241-255.