Исследование процесса и создание технологии биосинтеза L-триптофана штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Сенаторова, Валентина Николаевна

• Сенаторова, Валентина Николаевна
• кандидат технических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат технических наук Сенаторова, Валентина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Использование L-триптофана в кормовых целях 1.1.1. L-триптофан как кормовая добавка

1.2. Актуальность проблемы сбалансированного питания 1.2.1. Химическая характеристика и функции триптофана в организме человека. Применение его в медицине и фармакологии

1.3. Пути биосинтеза ароматических соединений у Bacillus subtilis

1.4. Цитоморфологические исследования Bacillus subtilis

1.5. Состояние исследований в области создания технологии производства триптофана

1.6. Цели и задачи исследования

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Краткая характеристика штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика

2.2. Оптимизация питательной среды

2.2.1. Источники углерода

2.2.2. Ростовые вещества и источники азота

2.3. Цитоморфологические исследования

2.4. Изучение динамики роста и биосинтеза

2.5. Опытно-промышленная проверка

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ЗЛ. Выбор источника углерода

3.2. Выбор источника азота

3.3. Изучение влияния различных ростовых факторов на рост продуцента и биосинтез триптофана

3.4. Влияние условий культивирования на морфологию клеток штамма-продуцента и связь ее с интенсивностью роста и продуктивностью

3.4.1. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в регламентных условиях культивирования

3.4.2. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в измененных условиях культивирования

4. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА И БИОСИНТЕЗА

4.1. Модель роста

4.2. Выбор адекватной модели биосинтеза

4.3. Выбор адекватной модели потребления источника углерода

4.4 Выбор адекватной модели потребления кислорода

5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОСИНТЕЗА

5.1. Определение требований к культуральной жидкости и формулирование критерия оптимальности

5.2. Определение параметров полупериодического процесса

5.3. Определение параметров отъемно-доливного процесса

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование процесса и создание технологии биосинтеза L-триптофана штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15»

Известно, что белки различных продуктов отличаются по составу, который определяет их питательную ценность. Растительные белки, в отличие от животных, дефицитны по одной или нескольким аминокислотам. Добавление недостающих компонентов позволяет повысить усвояемость пищи и, следовательно, приблизиться к решению проблемы нехватки продовольствия.

Необходимость получения аминокислот в промышленном масштабе определяется их потребностью. Она существует в основных отраслях народного хозяйства - медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Среди доступных способов получения аминокислот микробиологическое производство имеет множество преимуществ, и данная работа посвящена разработке технологии получения одной из незаменимых аминокислот - L-триптофана при культивировании штамма-продуцента Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 на простой минеральной среде.

На основании литературных данных по биосинтезу L-трипто-фана и способам получения определены стехиометрические коэффициенты, позволяющие оптимизировать состав питательных сред.

Бактерии рода Bacillus subtilis имеют сложные ультраструктурные перестройки при переходе от вегетативных форм к образованию эндоспор. Однако в результате генетико-селекционных трансформаций данный штамм утратил четко выраженные формы циклических изменений. С целью создания новых приемов контроля за развитием культуры Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 изучали цито-морфологические изменения в различных фазах роста и условиях культивирования, а также корреляционные связи полученных 5 параметров с физиологическими характеристиками бактерий в процессе роста.

В опытных условиях определяли режимы и способы ферментации. На основании полученных экспериментальных данных построены математические модели роста, биосинтеза и потребления субстрата.

Разработанные процессы опробованы в производственных условиях на нескольких заводах. Масштабирование параметров процесса с учетом конкретных условий производства показало технологичность и воспроизводимость лабораторных результатов. 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ь-триптофана в кормовых, пищевых и медицинских целях.

1.1.1. Ь -триптофан как кормовая добавка

Ь-триптофан является гетероциклической аминокислотой, входящей в состав многих белков, но обычно в небольшом количестве. По химической структуре это (3-индолил-а-пропионовая кислота. В кристаллическом виде Ь-триптофан является белым или слегка желтоватым порошком, растворимым в воде (1Д4 г на 100 мл воды при 25°С). Он разлагается при температуре 282°С. Молекулярный вес Ь-триптофана 204,22. Ь-триптофан оптически активен.

В белках млекопитающих обнаружен Ь-изомер триптофана. Водные растворы Ь-триптофана имеют слабокислую реакцию. Путем синтеза получены Б-изомер триптофана и БЬ-триптофан. Установлено, что Б-триптофан является очень сладким, Ь-триптофан -пресным [1, 2]. При кислотном гидролизе белков триптофан разрушается, поэтому для его определения и выделения из белков применяется щелочной гидролиз при температуре 100-110°С .

Для животных и человека Ь-триптофан является незаменимой аминокислотой, т.к. они не способны его синтезировать; в их организме Ь-триптофан появляется лишь в результате распада белков. Это означает, что животные и человек должен получать его только с пищей в составе белка. Следует отметить, что соотношения между незаменимыми аминокислотами в пище должны соответствовать составу белка данного животного и его физиологическому состоянию, которое определяется полом и возрастом. Не касаясь здесь пока проблем питания человека, остановимся на вопросах кормления сельскохозяйственных животных и птицы. Ученые уже давно определили их потребности во всех незаменимых аминокислотах, в том 7 числе и в Ь-триптофане. Учитывая, что существуют определенные нормы расхода корма, суточная потребность в аминокислотах задается в г/кг корма и в г/кг «сырого протеина» - содержание общего азота, умноженное на 6.25. В таблицах 1.1 -1.3 указана эта потребность для наиболее используемых в сельскохозяйственном производстве свиней, кур-несушек и бройлеров.

Таблица 1.1

Потребность в Ь-триптофане для свиней. (АДМ)[3]

Вес животных, кг 5-10 10-20 20-50 50-80 80-110

Затраты корма, 0,375 1,0 2,33 2,56 2,92 кг/сутки

Содержание в корме Ь-триптофана, г/кг 1,9 1,7 1,5 1,4 1,2

Доля триптофана в 0,90 0,94 0,94 0,93 0,86 сыром протеине, %

Таблица 1.2

Потребность в Ь-триптофане для кур-несушек. [4] (ВНИТИП).

Возраст птицы, недель 1-7 8 - 16 17-20 21 -45 > 46

Затраты корма, г/сутки (в среднем за период) 23 37 66 124 120

Содержание в корме Ь-триптофана, г/кг 2.0 1.5 1.6 1.7 1.6

Доля Ь-триптофана в сыром протеине,% 0.87 0.86 0.85 0.85 0.85 8

Таблица 1.3

Потребность в Ь-триптофане для бройлеров. (ВНИТИП)

Возраст птицы, недель 1 - 3 4 - 5 6 - 7

Затраты корма, г/сутки (в среднем за период) 35 86 135

Содержание в корме Ь-трипто-фана, г/кг 2.3 2.1 2.0

Доля Ь-триптофана в сыром протеине,% 0.86 0.86 0.86

Анализ аминокислотного состава различных компонентов кормов указывает на относительно низкое содержание Ь-триптофана в зерновых компонентах кормов. Соответствующие данные приводятся в таблице 1.4.

Таблица 1.4.

Аминокислотный состав некоторых компонентов кормов.

Наименование компонента Содержание Ь-триптофана, г/кг Доля L-триптофана в сыром протеине,%

1 2 3

Кукуруза 0.8 0.89

Пшеница 1.5 1.3

Ячмень 1.3 1.18

Овес 1.5 1.43

Рожь 1.1 0.96

Горох 1.6 0.78

Отруби пшеничные 2.0 1.33 9

1 2 3

Мука рыбная 6.5 1.03

Мука мясокостная 3.4 0.89

Дрожжи кормовые 6.4 1.31

Шрот подсолнечниковый 4.3 1.19

Шрот соевый 5.9 1.40

Барда послеспир-товая (сухая) 7.7 1.96

Основной компонент кормов - злаковые - содержат недостаточное количество сырого протеина и, следовательно, незаменимых аминокислот (кроме Ь-триптофана это - в первую очередь - Ь-лизин,' Ь-метионин и Ь-треонин). Поэтому в корма вносят т.н. «протеиновые добавки» - содержащие большое количество сырого протеина рыбную или мясокостную муку, кормовые дрожжи, соевый и подсолнечниковый шрот. При этом дефицит Ь-триптофана снимается. Однако в последнее время для устранения этого дефицита резко возросло применение более дешевых кормовых аминокислот: Ь-лизина и Ь-метионина. В этом случае необходимо применение добавок Ь-триптофана [4].

1.2. Актуальность проблемы сбалансированного питания.

Стремительный рост народонаселения земного шара породил одну из острейших проблем современности - дефицит животного белка в питании человека. В некоторых странах жители получают до 90% белков из растительной пищи, в основном хлебных злаков (пшеница, овес, кукуруза, рис и др.). Содержание белков в такой

10 пище низкое и они неполноценны [5]. Это объясняется тем, что одна или несколько незаменимых аминокислот присутствуют в них в слишком малом количестве. Если белок характеризуется низкой биологической ценностью, он должен присутствовать в пище в очень больших количествах, чтобы обеспечить потребность организма в дефицитной аминокислоте, прочие аминокислоты окажутся в избытке и не будут усваиваться организмом, что создаст повышенную нагрузку на почки и печень [6]. Для полного усвоения белок должен содержать незаменимые аминокислоты в определенных соотношениях, причем, эталоном служит белок куриного яйца.

В таблице 1.5. представлено содержание незаменимых аминокислот в различных белках [5].

Таблица 1.5.

Содержание аминокислот в различных природных белках, (%)

Аминокислота Кормовые дрожжи Ячмень Рыба Молоко Яичный белок

1 2 3 4 5 6

Ь-Лизин 2,9 2,4 9,5 9,0 6,3

Ь-Метионин 0,5 1,1 2,7 2,4 5,2

Ь-Триптофан 1,1 1,1 1,4 1,3 3,7

Ь-Гистидин 2,9 2,1 2,2 2,7 2,4

Ь-Аргинин 2,9 4,3 7,5 3,5 5,7

Ь-Валин 3,6 5,1 5,5 6,7 7Д

Ь-Лейцин 3,4 6,7 8,0 9,9 9,2

Ь-Изолейцин 1,3 4,5 5,8 6,5 7,0

Ь-Фенилаланин 2,6 5Д 4,4 5,1 7,7

Ь-Треонин 2,6 3,5 4,2 4,7 4,0

11

По питательной ценности в первом ряду стоят белки материнского молока (90-97%), яиц, коровьего молока, сыра, мяса, рыбы (80-90%) и дрожжей (77%). Далее зерновые, среди которых наименьшей питательной ценностью обладают белки пшеничной муки (54%) [6 ].

Таблица 1.6. иллюстрирует качество некоторых пищевых белков.

Таблица 1.6.

Качество белков некоторых пищевых продуктов [6]

Продукт Химическая Биологическая ценность*-1 ценность**^

Женское молоко 100 95

Говядина 98 93

Яйцо 100 87

Коровье молоко 95 81

Кукуруза 49 36

Очищенный рис 67 63

Белый хлеб 47 30

Химическая ценность - определяется аминокислотным составом по сравнению с белком яиц

Биологическая ценность - определяется наличием в белке всех незаменимых аминокислот в необходимых пропорциях и в доступной форме (принимается равной 100)

Ежедневно молодым мужчинам рекомендуется потреблять 54 г белков, однако при этом подразумевается, что в пищу входят самые разнообразные белки растительного и животного происхождения. Из приведенных в табл. 1.7.данных следует, что, по крайней мере, 12 из 54 г белка должны приходиться на долю незаменимых аминокислот.

12

Таблица 1.7.

Суточная потребность в незаменимых аминокислотах для молодых мужчин [6]

Аминокислота Граммы Аминокислота Граммы

Аргинин 0» Метионин 2,02

Гистидин 2) Фенилаланин 2,02

Изолейцин 1,30 Треонин 0,91

Лейцин 2,02 Триптофан 0,46

Лизин 1,50 Валин 1,50

1-) Необходим только новорожденным и растущим детям

2) Незаменим, но точная потребность пока не установлена

Белки значительно различаются по аминокислотному составу. Для ликвидации дисбаланса аминокислоты используют в чистом виде. Добавление всего нескольких десятых долей процента недостающей аминокислоты во многих случаях приводит к повышению ценности*-1 белка более, чем на 100% [5 ].

Главным потребителем аминокислот является пищевая промышленность. Вопросы обогащения пищевых продуктов незаменимыми аминокислотами, сбалансирования рационов, т.е. добавки к малоценным белкам недостающих аминокислот, широко освещены в отечественной [8, 9] и зарубежной литературе [10].

Проводятся интенсивные исследования по возможному использованию Ь-треонина и БЬ-триптофана для обогащения продуктов питания, особенно в Японии. Употреблению этих лимитирующих аминокислот в пищевой промышленности препятствует высокая цена на них. Среди возможных сфер применения этих и других аминокислот рассматривают питание детей, обогащение низкокалорийной пищи, диетическое питание и даже специальное питание для космонавтов.

Питательная ценность или качество белка зависят от его аминокислотного состава и усвояемости

13

Многие аминокислоты обладают своим уникальным вкусом и являются элементами вкуса пищевых продуктов. Характерный вкус индивидуальных аминокислот изучен многими исследователями. Б-изомеры горьких аминокислот обычно сладкие. Ь-триптофан в два раза менее горек, чем кофеин, а Б-триптофан в 35 раз слаще сахарозы.

Как синергист, интенсифицирующий сладость сахарина и устраняющий присущий сахарину неприятный привкус, могут применяться Б- и БЬ-триптофан [11].

Наиболее дефицитны в продуктах четыре незаменимые амино-кислоты:Ь-лизин,Ь-метионин, Ь-треонин и Ь-триптофан. Такими аминокислотными добавками можно повысить качество белков злаков, делая их эквивалентными казеину. Количество используемых аминокислот колеблется между 0,1-0,4% от полного веса рациона. Исключение составляет Ь-триптофан, который следует добавлять в количестве не более 0,07% [9].

При обогащении растительных рационов аминокислотными добавками необходим учет их сбалансированности по аминокислотному составу. Так, рис, пшеницу, сорго следует обогащать Ь-лизином и Ь-треонином, кукурузу - Ь-триптофаном, соевую и арахисовую муку - Ь-метионином.

Все сказанное выше обусловило необходимость получения аминокислот в промышленных масштабах. В настоящее время мировой уровень производства аминокислот превысил миллион тонн в год. Основными способами получения аминокислот являются:

- экстракция белковых гидролизатов растительного сырья - старый способ, нерациональное использование сырья исключает его использование;

- химический синтез - достаточно эффективен, позволяет получить соединения любой структуры и использовать не пищевое сырье, достигая высокой концентрации продук

14 та, но таким способом получают только рацемические формы;

- микробиологический метод - основан на способности многих микроорганизмов синтезировать аминокислоты.

В последние годы прочные позиции начинает занимать комбинированный химико-микробиологический метод синтеза, при котором исходное соединение получают в результате химических реакций, а конечная стадия осуществляется за счет активности ферментных систем соответствующих штаммов микроорганизмов [12].

Получение одной из незаменимых аминокислот -Ь-триптофана с целью использования его в качестве биологически активной пищевой добавки - важная народно-хозяйственная задача.

1.2.1 .Химическая характеристика и функции Ь-триптофана в организме человека. Применение его в медицине и фармакологии.

Установлено, что в сутки взрослому человеку необходимо принимать с пищей 7,2-7,3 мг Ь-триптофана на 1 кг веса тела, ребенку - 30 мг/кг, грудным детям - 13-16 мг/кг. В случаях, когда женское молоко не содержит достаточного количества Ь-триптофана, ребенок отстает в развитии.

Свободный Ь-триптофан, который образуется при расщеплении пищевых белков ферментами желудочно-кишечного тракта, либо всасывается через стенку кишечника и попадает в кровь, либо подвергается расщеплению бактериями кишечника. Резорбирован-ный Ь-триптофан используется для ресинтеза белков, часть его выделяется из организма и часть подвергается обмену (схема 1.1).

15

Триптофан

Ресинтез белков Выделение Обмен Расщепление бактериями ндол Скатол

Кинуренин Серотонин Триптамин

Схема 1.1. Использование принятого с пищей триптофана [13].

Исключение из пищи всех аминокислот приводит к обеднению организма белком, что сопровождается потерей веса, анемией, общей атрофией мышц. При этом организм становится более восприимчивым к инфекциям и хуже переносит травмы и заболевания. С появлением очищенных рационов из аминокислот стало возможным исследовать изменения, возникающие при исключении одной незаменимой аминокислоты из состава рациона, полноценного в других отношениях. В опытах на животных, лишенных какой-либо одной незаменимой аминокислоты, наиболее отчетливо проявляется потеря аппетита; потребление пищи резко снижается уже после первого дня, что сопровождается немедленным отрицательным балансом азота. (Считается, что субъект находится в азотистом равновесии, когда количество азота, принятого с пищей, равно количеству азота, выводящемуся из организма. Если количество принятого азота больше, то имеет место положительный азотистый баланс, в противном случае - отрицательный) [9].

Так, у животных недостаточность Ь-триптофана вызывает помутнение роговицы, катаракту, выпадение шерсти, анемию, поражение зубов. У цыплят при недостаточности Ь-триптофана возникает повышение потребности в никотиновой кислоте.

16

К числу процессов обмена Ь-триптофана в организме человека относятся превращения Ь-триптофана в никотиновую кислоту через кинуренин и окисление и декарбоксилирование Ь-триптофана с образованием 5-окситриптамина (серотонина). В нормальных условиях на долю каждого из этих процессов приходится лишь несколько процентов всего подвергающегося превращению в организме Ь-триптофана.

У больных с далеко зашедшим злокачественным карциноидом обмен Ь-триптофана протекает преимущественно по пути превращения его в серотонин, что приводит к снижению синтеза никотиновой кислоты и развитию белковой недостаточности.

Лимитирующей в синтезе серотонина является стадия, катализируемая триптофангидроксилазой. Блокирование синтеза его или разрушение этой области приводит к нарушению сна или непрерывному бодрствованию.

Подобно тому, как Ь-метионин тесно связан в обмене с витамином В12, Ь-триптофан связан с никотиновой кислотой. Установлено, что никотиновая кислота образуется в организме из Ь-триптофана, но с весьма неблагоприятным коэффициентом - на образование одной части никотиновой кислоты затрачивается 50-60 частей Ь-триптофана. Введение никотиновой кислоты прекращает расходование Ь-триптофана на ее образование [14].

Отсутствие Ь-триптофана в пище человека и животных ведет к тяжелым нарушениям типа авитаминоза (пеллагра, характерные симптомы которой - дерматиты на открытых участках кожи лица, шеи, нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта и нервной системы, дерматит, диарея, дименеция), что связано с пониженным обменом в направлении никотиновой кислоты[13].

Показано, что исключением Ь-триптофана из пищи можно вызвать пеллагру, а добавлением Ь-триптофана пеллагра излечивается.

17

Недостаток белка в пище создает условия для быстрого образования витаминной недостаточности (белки - это якорь, удерживающий витамины).

Витамин В6 - пиридоксальфосфат - как кофермент принимает участие в синтезе всех аминокислот и также в обмене Ь-триптофана. В результате окислительного распада Ь-триптофана образуются аминокислоты - кинуренин и 3-оксикинуренин. Под влиянием фермента кинуреазы кинуренин гидролизуется на аланин и антраниловую кислоту. Подобным же образом 3-оксикинуренин превращается в 3-оксиантраниловую кислоту - предшественник никотиновой кислоты. Незначительная часть Ь-триптофана путем окисления, а затем и декарбоксилирования превращается в серото-нин (5-окситриптамин), концентрирующийся в значительных количествах в нервной системе.

Витамин Вб у человека и млекопитающих вступает в действие в стадии образования кинуренина, осуществляет его расщепление.

Существует и другой путь обмена Ь-триптофана, состоящий в том, что при содействии аминоферазы из кинуренина образуется кинуреновая и ксантуреновая кислоты.

В случае недостатка витамина Вб наблюдается повышенное образование как кинуренина, так и ксантуреновой кислоты с их выделением из организма в большом количестве. При определении содержания пиридоксина в моче после приема 1 г витамина Вб и ксантуреновой кислоты после приема 10 г Ь-триптофана выяснилось, что приблизительно половина из 144 больных диабетом страдают недостатком витамина Вб в организме. Установлено, что витамин Вб усиливает эффект при лечении диабета инсулином. Под влиянием Вб удалось уменьшить дозу инсулина.

Производные Ь-триптофана, образующиеся в процессе его деградации в организме, занимают одно из центральных мест среди причин возникновения диабета. К ним относится хинальдиновая и

8-оксихинальдиновая кислоты. Их образование происходит нефер-ментативно из соответственно кинуреновой и ксантуреновой кислот. Предполагается, что механизм их диабетогенного действия двоякий: ингибирование синтеза проинсулина рибосомами эндо-плазматической сети |3-клеток и инактивация инсулина путем связывания и выведения цинка.

Полученные данные подтверждают значение витамина В6 для физиологического обмена Ь-триптофана как фактора, обеспечивающего завершение полного цикла превращений данной аминокислоты. Это, в свою очередь, обеспечивает образование никотиновой кислоты (витамин РР) и серотонина [15].

При исключении Ь-триптофана из пищи уменьшается его содержание в плазме крови и снижается накопление витамина А, интенсивность обмена Ь-триптофана. Наблюдается дегенерация гладких и поперечно-полосатых мышц и повреждения миокарда.

Регуляторные функции Ь-триптофана выявляются при изучении физиологических и фармакологических влияний на функциональное состояние организма. Так недостаточность Ь-триптофана или исключение его из пищи даже на непродолжительное время приводит к понижению содержания белков в сыворотке крови и органах [14].

Ряд исследователей изучал действие предшественника серотонина - 5-окситриптофана на мозг животного. Известно, что недостаток серотонина в мозгу вызывает шизофрению. Сам серотонин не обладает способностью проникать из крови в мозг, поэтому его введение неэффективно. Однако периодическое введение 5-окситриптофана в кровь животного заметно увеличивает содержание серотонина в мозгу. Появились патенты на использование 5-окси-Ь и 5-окси-БЬ-триптофана для лечения нарушений мозга, регулирования кровяного давления и в качестве антидепрессантов. Созданы также композиции, полезные для лечения депрессий, содержащие Ь-триптофан и 5-окситриптофан, триптофан лития или комбинацию Ь-триптофана, пиридоксина, аскорбиновой кислоты и Сахаров.

Соли ацетилтриптофана и Ь-орнитина, Ь-аргинина, Ь-гистидина снижают содержание холестерина и могут применяться для лечения циррозов. Ь-триптофан входит также в составы для лечения печени и ожирения [11].

Важными направлениями использования Ь-триптофана в медицине являются применение его в составе аминокислотных смесей для парентерального питания ослабленных больных в послеоперационный период для компенсации значительных потерь крови, а также в качестве вспомогательного средства при лечении умственно отсталых детей, в частности, больных болезнью Дауна[16].

1.3. Пути биосинтеза ароматических соединений у

Вас. ятлЬИПб.

Для правильного понимания процессов, происходящих при микробиологическом биосинтезе Ь-триптофана, необходимо знать биохимические реакции, ведущие к его образованию. Это поможет принимать правильные решения при создании питательных сред и находить верные объяснения возникающих затруднений при реализации технологического процесса.

Как правило, пути синтеза незаменимых аминокислот сложнее и длиннее путей синтеза заменимых: первые обычно включают от пяти до пятнадцати этапов, а вторые лишь в редких случаях насчитывают пять. Неспособность высших животных синтезировать незаменимые аминокислоты объясняется отсутствием у них одного или двух ферментов, необходимых для этого синтеза. Наибольшей сложностью отличаются пути, ведущие к синтезу таких незаменимых аминокислот как Ь-фенилаланин, Ь-триптофан и Ь-гистидин, молекулы которых содержат бензольные кольца или гетероциклы. Синтез таких колец, особенно двух конденсированных колец Ь

20 триптофана, - сложный процесс, включающий целый ряд ферментативных этапов[17].

Ведущую роль в расшифровке механизма биосинтеза ароматических соединений у микроорганизмов сыграло исследование серии биохимических мутантов, блокированных на различных этапах этого пути. В настоящее время определена последовательность биохимических реакций, ведущих к синтезу ароматических метаболитов, выявлены ферменты, осуществляющие эти реакции, и идентифицированы промежуточные продукты. Установлено, что большинство микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, имеют сходные пути биосинтеза ароматических соединений, хотя различные группы и виды могут отличаться механизмами регуляции этого синтеза[18].

Ароматические аминокислоты Ь-триптофан, Ь-фенилаланин и Ь-тирозин синтезируются в клетках растений и микроорганизмов, тогда как для человека и животных Ь-триптофан и Ь-фенилаланин являются незаменимыми аминокислотами, а Ь-тирозин в них образуется путем гидроксилирования Ь-фенилаланина[19].

Общий путь биосинтеза ароматических соединений (рис. 1) состоит из семи реакций, которые последовательно превращают эрит-розо-4-фосфат и фосфоенолпируват в хоризмовую кислоту, представляющую собой точку разветвления путей синтеза следующих конечных продуктов: аминобензойной кислоты, никотиновой, фо-лиевой кислот, витаминов группы К, убихинонов, а также аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана. Ароматические аминокислоты составляют 99% от веществ, образуемых из хоризмо-вой кислоты.

Первый фермент общего участка цепи - дезокси-арабино-гептулозонат-7-фосфат-синтетаза (ДАГФ-синтетаза) катализирует реакцию конденсации эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата с образованием 7-углеродного ациклического соединения у Вас.

21

БиЫШв, в отличие от эитеробактерий и грибов, не имеет множественных форм.

Следующая реакция - образование соединения с ароматическим кольцом - дегидрохинной кислоты. Пять последующих реакций, катализируемых ферментами дегидрокиназой, дегидрошики-матредуктазой и хоризматсинтетазой, превращают дегидрохинную кислоту в хоризмовую.

Путь биосинтеза Ь-триптофана (рис. 2) состоит из пяти этапов, последовательно катализируемых пятью ферментами. Антранилат-синтетаза (АС) - первый специфический фермент триптофановой ветви, участвует в реакции превращения хоризмовой кислоты в ан-траниловую.

Фосфорибозилтрансфераза (ФРТ) катализирует присоединение фосфорибозила к антраниловой кислоте. После перегруппировки атомов, производимой фосфорибозилантранилатизомеразой, следующий фермент - индолглицерофосфатсинтетаза присоединяет пиррольный цикл к бензольному кольцу. За последнюю реакцию синтеза ответственен фермент триптофансинтетаза (ТС), состоящий из двух идентичных полипептидов: А и В. Каждый белок в отдельности имеет низкую активность.

Рис. 1. Биосинтез ароматических соединений [ 20, 21, 22].

Рис. 2. Схема биосинтеза триптофана у Bacillus subtilis

Рис. 3. Схема биосинтеза фенилаланина и тирозина

25

Субъединица А катализирует реакцию: индолглицерофосфат индол + глицерофосфат; субъединица В реакцию: индол + серин Ь-триптофан. Реакция: индолглицерофосфат + серин Ь-триптофан + глицерофосфат осуществляется только комплексом.

Путь биосинтеза Ь-тирозина и Ь-фенилаланина (рис. 3) также начинается от хоризмовой кислоты, которая с помощью фермента хоризматмутазы превращается в префеновую кислоту. Далее префе-новая кислота под действием ферментов префенатдегидрогеназы и трансаминазы превращается в Ь-тирозин; префенатдегидратаза и соответствующая трансаминаза катализируют образование Ь-фенилаланина.

У большинства изученных микроорганизмов регуляторный контроль общего участка цепи ароматических соединений сосредоточен на первом аллостерическом ферменте - ДАГФ-синтетазе, представленном системой изоферментов, контролируемых соответствующими конечными продуктами: ДАГФфен-Ь-фенилаланином, ДАГФтир - Ь-тирозином, ДАГФтрп - Ь-триптофаном.

ДАГФ-синтетаза у Вас. БиЪиНз в отличие от всех изученных микроорганизмов представлена одним белком, поэтому регуляторный контроль этого фермента у Вас, зиЬиИй значительно отличается от контроля у микроорганизмов с множественными формами ДАГФ-синтетазы. Показано, что первый фермент общего участка пути у Вас. БиЬиив не ингибируется конечными продуктами. Однако, этот фермент заметно ингибируется промежуточными метаболитами ароматического пути: префеновой и хоризмовой кислотами. Префе-новая кислота является главным ингибитором ДАГФ-синтетазы.

Хоризмовая кислота в этом отношении менее эффективна. Количественные различия в ингибировании ДАГФ-синтетазы префеновой и хоризмовой кислотами, по-видимому, биологически оправданы: префеновая кислота является предшественником тирозина и фени-лаланина, которые составляют 80% от концентрации всех ароматических аминокислот и ингибирует ДАГФ-синтетазу в 8-10 раз сильнее, чем хоризмовая кислота.

Активность ДАГФ-синтетазы у дикого типа штаммов Вас. впЬИИз значительно выше, чем это необходимо для удовлетворения потребности клеток в трех ароматических аминокислотах. Так, например, некоторые регуляторные мутанты выделяли в среду избыток одной из трех ароматических аминокислот без дополнительного увеличения уровня синтеза ДАГФ-синтетазы.

Особенностью ДАГФ-синтетазы Вас. subtilis является то, что она образует ферментный комплекс с шикимакиназной и низкоактивной формой хоризматмутазы[23].

Показано, что активность шикиматкиназы находится не только под контролем префената и хоризмата, но также зависит от уровня АТФ в клетке. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что именно шикиматкиназа, как объект более сложного контроля, является ключевым ферментом пути ароматического биосин-теза[18].

Остальные ферменты общего участка ароматического синтеза не ингибируются конечными продуктами.

У всех исследованных микроорганизмов Ъ-триптофан ингибирует активность первого аллостерического фермента собственного пути биосинтеза - антранилатсинтетазы (АС), катализирующего превращение хоризмовой кислоты и аммония в антраниловую кислоту и пируват. В отличие от других микроорганизмов антрани-латсинтетаза у Вас. 8иЪ1Ш$ не образует белковых комплексов ни с фосфорибозилтрансферазой (ФРТ), ни с другими ферментами триптофановой ветви пути. Было установлено, что у Вас. БиЬиИй, также как и у других бактерий, этот фермент представлен двумя субъединицами: Е и X. Субъединица Е, обладающая антранилатсинтетазной активностью, в свободном виде очень лабильна и может существовать только в комплексе с субъединицей X, которая сохраняется и при 100-кратной очистке фермента.

Антранилатсинтетазная активность специфически ингибирует-ся только Ь-триптофаном. Установлено, что ингибирование конкурентно по отношению к хоризмату.

Последний фермент биосинтеза Ь-триптофана - триптофансин-тетаза у Вас. яи^Шя состоит из двух полипептидов, А и В, представляющих собой белковый комплекс, осуществляющий превращение индолглицерофосфата в Ь-триптофан. Ретроингибированию со стороны конечного продукта фермент не подвергается.

Относительно остальных ферментов пути биосинтеза Ь-триптофана известно, что они белковых агрегатов не образуют, ал-лостерическими свойствами не обладают и не ингибируются конечными продуктами.

Таким образом, регуляторный контроль Ь-триптофанового участка пути осуществляется посредством ретроингибирования АС и координированной репрессии синтеза АС и всех последующих ферментов конечным продуктом, у Вас. зиЬиНБ репрессия имеет не меньшее значение, т.к. максимальные уровни репрессии и ингиби-рования примерно одного и того же порядка.

У микроорганизмов существуют катаболические энзимы, которые разрушают некоторые аминокислоты и позволяют использовать их в качестве источника углерода. Высокая концентрация аминокислоты в клетке стимулирует синтез этих ферментов. Если организм лишить определенного катаболического фермента, можно получить мутанты с заблокированными реакциями деградации соответствующей аминокислоты.

28

Триптофаназа - индуцибельный катаболический фермент, катализирует превращение Ь-триптофана в индол, аммиак и пирови-ноградную кислоту. Действие триптофаназы - пример механизма, который контролирует уровень метаболического пула Ь-триптофана и является серьезной помехой для сверхпродукции аминокислоты.

Показано, что у Вас. subtilis индол может выделяться в результате двух механизмов:

1) путем деградации индолглицерофосфата при катализе трип-тофансинтетазой;

2) путем разложения Ь-триптофана триптофаназой. Однако, активной триптофаназы у Вас. виЫШз не обнаружено.

Хоризматмутаза - осуществляет свое действие в точке разветвления путей биосинтеза ароматических аминокислот, что определяет ее особое значение в регуляции синтеза этих соединений.

Хоризматмутаза Вас. зиЫШя не подвергается отрицательному аллостерическому контролю со стороны Ь-тирозина и Ь-фенилаланина или положительному контролю со стороны Ь-триптофана. Обнаружено, что хоризматмутаза ингибируется префе-новой кислотой. Ингибирование конкурентно по отношению к хо-ризмату. Поскольку префенат представляет собой простую перегруппировку молекулы хоризмата, префеновая кислота действует по способу классического субстратного аналога.

Итак, биосинтез ароматических аминокислот находится у микроорганизмов под строгим регуляторным контролем. В связи с этим избыточный синтез Ь-триптофана из простых источников углерода и азота, сопровождающийся его выделением в среду, возможен только в результате мутационного нарушения механизмов репрессии и ретроингибирования. Помимо этого у Вас. зиЬНИя эффективность проявления указанных мутаций зависит от определенного ге-нотипического фона: генетически обусловленного уровня активности фермента хоризматмутазы.

29

Помимо указанных путей, предполагающих наследственное изменение свойств микроорганизмов, при получении Ь-триптофана микробиологическим способом довольно часто используется способность многих из них трансформировать его предшественники^].

Эксперименты по изучению физиологии штамма Вас. ячЬиНз 3557 были начаты во ВНИИгенетика Л.Э. Семеновой под руководством Н.И. Ждановой и Л.А. Минеевой и затем продолжены Л.Э. Семеновой и Е.А. Максимовой под руководством Л.А.Музыченко.

Были проведены лабораторные исследования и опытно-промышленные испытания. Подучены данные по динамике потребления аминокислот и мочевины в течение процесса.

Показано, что в течение 6-12 час. полностью потребились Ь-лейцин, Ь-изолейцин, Ь-фенилаланин, Ь-аланин, Ь-валин, Ь-глутаминовая кислота.

На 25 час. появляется Ь- глутамин и затем Ь-глицин. К концу ферментации (на 48 час.) в среде обнаружены вновь Ь-глутаминовая кислота, Ь-валин, Ь-аланин и Ь-тирозин.

Мочевина расходуется к концу первых суток.

Кроме того, для выявления сравнительной значимости различных аминокислот был использован метод случайного баланса [24, 25].

Результаты этого эксперимента выявили положительное влияние Ь-гистидина и отрицательное влияние Ь-метионина, что прямо следует из схемы регуляции.

Отрицательное влияние треонина авторы объясняют тем, что он ингибирует гомосеринкиназу, что приводит к усилению расхода Ь-гомосерина на биосинтез Ь-метионина. Предполагается, что и Ь-лизин положительно влияет на биосинтез триптофана путем инги

30 бирования аспартилкиназы и блокирования образования Ь-метионина.

Однако с этой точки зрения, добавление Ь-аспарагиновой кислоты должно было бы ухудшить процесс, т.к. приводит к усилению биосинтеза аминокислот аспарагинового семейства, в том числе и Ь-метионина. По-видимому, здесь в результате накопления оксал-ацетата усиливается его декарбоксилирование с образованием ФЕП. Причиной отрицательного влияния Ь-изолейцина может быть накопление Ь-треонина и связанное с ним увеличение концентрации Ь-метионина.

Аналогично внесение валина может привести к возрастанию пула «активного ацетальдегида». Таким образом, биосинтез Ь-изолейцина должен ускориться с вытекающими отсюда последствиями.

Добавление Ь-аланина может увеличить концентрацию пиру-вата и интенсифицировать работу цикла трикарбоновых кислот, поставляющего в клетку Ь-глутаминовую кислоту, а, следовательно, и Ь-глутамин. Правда, известно, что в ряде случаев аланин может ин-гибировать образование глутамина [26], что, видимо, компенсирует его активизирующую роль

Поскольку Ь-серин является одним из субстратов триптофан-синтетазы, очевидно, положительное влияние избытка Ь-глицина, тормозящего сток Ь-серина на его образование, ясно.

В то же время, Ь-серин ингибирует биосинтез Ь-триптофана. Это становится понятным с учетом того, что он участвует в блоке равновесных реакций, который охватывает значительную часть реакций гликолиза, фосфоглюконатного пути и пути биосинтеза Ь-серина и Ь-глицина. Компонентами этого блока являются предшественники Ь-триптофана и ароматических аминокислот: эритрозо-4-фосфат, фосфоенолпируват, Ь-серин, рибозо-5-фосфат. Введение избытка Ь-серина нарушает равновесие, причем доля Ь-серина воз

3 1 растает, а доля остальных метаболитов уменьшается. При добавлении Ь-серина часть его обратимо превратится в оксипируват, что нарушит соотношение «глутамат/кетоглутарат» - изменение его в сторону увеличения уменьшает концентрацию в сторону всех компонентов, а концентрацию серина увеличивает.

Биосинтез Ь-триптофана стехиометрически сбалансированный процесс, поэтому вызванное снижением концентрации исходных веществ замедление процесса в целом не может быть скомпенсировано увеличением концентрации Ь-серина.

Ь-глицин в этом процессе играет сложную роль. С одной стороны, он, являясь компонентом гликолитического блока, играет роль аналогичную Ь-серину в качестве источника азота для Ь-глутаминовой кислоты. Более того, он является энергичным ингибитором превращения Ь-глутаминовой кислоты в Ь-глутамин. В то же время Ь-глицин, взаимодействуя с глиоксиловой кислотой «бай-пасирует» в цикле трикарбоновых кислот реакцию образования Ь-глутаминовой кислоты. Кроме этого, взаимодействуя с глутаминци-стеином, он стимулирует расход Ь-глутаминовой кислоты на образование глутатиона. По-видимому, два последних процесса играют большую роль. Взаимодействием с Ь-глутаминовой кислотой, видимо и объясняется положительная роль Ь-цистеина.

Так как мочевина при культивировании данного штамма является предпочтительным источником азота, логично предположить, что положительное влияние Ь-аргинина на процесс биосинтеза Ь-триптофана следует рассматривать совместно с влиянием мочевины. По-видимому, Ь-аргинин, разлагаясь до Ьгорнитина, является донором мочевины и, таким образом, ускоряет процесс биосинтеза Ь-триптофана.

Возможны две гипотезы вовлечения мочевины в метаболизм:

1. Мочевина принимает участие в реакции с Ь-глутаминовой кислотой, давая Ь-глутамин, который исполь

32 зуется далее в реакции образования антраниловой кислоты. Эта реакция энергетически более выгодна, чем реакция прямого аминирования Ь-глутаминовой кислоты аммиаком.

2. Мочевина, взаимодействуя с АТФ, образует карба-моилфосфат. Образовавшийся карбамоилфосфат непосредственно принимает участие в аминировании хоризмовой кислоты.

Второе предположение объясняет защелачивание, происходящее при биосинтезе, и интенсивное выделение СОг, сопряженное с биосинтезом триптофана.

Обе гипотезы требуют присутствия мочевины в среде в заметных количествах в течение всего биосинтеза, т.к. клетка не может запасти в себе значительные количества как карбамоилфосфата, так и Ь-глутамина.

Поэтому следует предположить, что мочевина «запускает» какой-то процесс, а далее необходимость в ней отпадает.

Таким образом, возможно непосредственное аминирование хоризмовой кислоты либо Ь-аргинином, либо Ь-аргининфосфатом, который может образовываться в условиях избытка АТФ. (Кстати, таким образом, понижая концентрацию АТФ, Ь-аргинин может активировать гликолиз на стадии фосфорилирования фруктозо-6-фосфата).

В результате этой реакции образуется Ь-цитруллин:

Ь-аргинин + хоризмовая кислота —> Ь-цитруллин + антранило-вая кислота + пируват

Далее Ь-цитруллин обычной реакцией с Ь-аспарагиновой кислотой превращается в Ь-аргинин. Фумаровая кислота, образующаяся на этой стадии, переходит в цикле трикарбоновых кислот в оксалацетат и далее, с участием Ь-глутаминовой кислоты, снова в Ь-аспартат.

33

Таким образом, роль мочевины, возможно, сводится к переводу некоторого количества Ь-орнитина дополнительно в Ь-аргинин.

Предложенная гипотеза объясняет также и положительное влияние Ь-аспарагиновой кислоты. Кроме того, данный механизм обеспечивает снижение концентрации Ь-глутаминовой кислоты и объясняет отсутствие отрицательной реакции полиферментной системы на ингибирующее влияние глицина и аланина при аминирова-нии Ь-глутамата в Ь-глутамин.

Естественно, предлагаемый механизм не исключает участия в аминировании хоризмата и Ь-глутамина.

Итак, в результате логического анализа автором цитируемой работы было объяснено отклонение от «литературной» модели биосинтеза введением гипотетической реакции аминирования хоризмо-вой кислоты Ь-аргинином. Показано также важное влияние на биосинтез Ь-триптофана процессов образования его предшественников, также предполагается наличие влияния на процесс концентрации растворенного СО2, т.к. при малых его количествах будет происходить интенсификация цикла трикарбоновых кислот, со сгоранием в нем метаболитов гликолиза и накоплением повышенных концентраций Ь-глутаминовой кислоты. При высоких же концентрациях интенсифицируется сток продуктов гликолиза на образование Ь-аспарагиновой кислоты, и, следовательно, ускорение процесса аминирования хоризмата.

В первом случае мы будем иметь избыток Ь-серина и недостаток эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата.

Во втором случае будет накапливаться антраниловая кислота при недостатке Ь-серина[27].

34