Исследование патогенности вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, влияющих на сплайсинг тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Спарбер Пётр Андреевич

• Спарбер Пётр Андреевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Спарбер Пётр Андреевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цель и задачи

Задачи, решаемые в ходе исследования:

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация результатов

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эпилепсия

1.1.1 Определение и эпидемиология эпилепсии

1.1.2 Современная классификация эпилепсии

1.1.3 Моногенные эпилепсии

1.2 Ген SCN1A

1.2.1 Структура, экспрессия и функция гена SCN1A

1.2.2 Регуляция экспрессии гена SCN1A

1.2.3 Менделирующие SCN1A-ассоциированные фенотипы

1.3 Сплайсинг и моногенные заболевания

1.3.1 Основные этапы прохождения сплайсинга

1.3.2 Распознавание экзонов и интронов и роль регуляторных элементов

1.3.3 Нарушение сплайсинга как причина развития моногенных заболеваний

1.3.4 Экспериментальное подтверждение влияния вариантов нуклеотидной последовательности на прохождение сплайсинга

1.4 Псевдоэкзоны в норме и при патологии

1.4.1 Псевдоэкзоны в норме

1.4.2 Псевдоэкзоны при патологии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Пациенты

2.2 Номенклатура вариантов нуклеотидной последовательности и оценка патогенности

2.3 Материалы исследования

2.4 Методы исследования

2.4.1 Биоинформатические методы

2.4.2 Методы работы с прокариотическими клетками штамма Е.соН XL10-Gold

2.4.3 Методы работы с эукариотическими клетками линии НЕК293Т

2.4.4 Исследование влияния вариантов нуклеотидной последовательности на прохождение сплайсинга с использованием системы экспрессии минигенов

2.4.5 Создание плазмид с модифицированными антисмысловыми и7-мяРНК для подавления включения псевдоэкзонов гена 8СЫ1Л

2.4.6 Методы статистического анализа

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Оценка доли вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л потенциально влияющих на прохождение сплайсинга

3.1.1 Анализ мутационного спектра всех описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л

3.1.2 Биоинформатический анализ всех описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л на предмет нарушения прохождения сплайсинга

3.2 Разработка системы плазмидных векторов, экспрессирующих мини/миди/максигены 8СЫ1Л

3.2.1 Создание векторов для исследования сплайсинга

3.2.2 Дизайн и создание плазмидных векторов, экспрессирующих мини/мидигены 8СЫ1Л

3.2.3 Тестирование плазмидных векторов, экспрессирующие мини/мидигены 8СЫ1Л

3.2.4 Применение подходов по улучшению распознавания экзонов гена 8СЫ1Л в составе минигенов

3.2.5 Итоги разработки системы плазмидных векторов, экспрессирующих мини/миди/максигены 8СЫ1Л

3.3 Исследование влияния интронных вариантов нуклеотидной последовательности на прохождение сплайсинга в гене 8СЫ1Л

3.4 Исследование влияния экзонных вариантов нуклеотидной последовательности на прохождение сплайсинга в гене 8СЫ1Л

3.5 Функциональный анализ вариантов нуклеотидной последовательности, влияющих на прохождение сплайсинга в гене 8СЫ1Л, выявленных у российских пациентов

3.6 Исследование псевдоэкзонов гена 8СЫ1Л и их участия в патогенезе 8СЫ1Л-ассоциированной эпилепсии

3.6.1 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 4 гена SCN1A

3.6.2 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 23 гена SCN1A

3.6.3 Разработка и валидация системы по экспрессии минигена для псевдоэкзона 25 гена SCN1A

3.6.4 Подавление включения псевдоэкзонов гена SCN1A с помощью модифицированных антисмысловых и7-мяРНК

3.7 Гено-фенотипические корреляции в гене SCN1A с учетом данных функционального анализа

3.7.1 Анализ распределения миссенс вариантов, не предсказывающихся как влияющие на сплайсинг, и «миссенс» вариантов, потенциально влияющих на прохождение сплайсинга, относительно структуры белка Nav1

3.7.2 Сравнение тяжести SCN1A-ассоциированных фенотипов среди пациентов с различными типами вариантов нуклеотидной последовательности

3.8 Оценка чувствительности и специфичности различных биоинформатических алгоритмов предсказания влияния вариантов нуклеотидной последовательности на сплайсинг

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России

Список публикаций в других изданиях

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение А Список всех описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, предсказанных биоинформатическим алгоритмом SpliceAI как влияющие на сплайсинг

Приложение Б Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 68 интронных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A

Приложение В Результаты функционального анализа 68 интронных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A

Приложение Г Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 21 экзонного варианта нуклеотидной последовательности в гене SCN1A

Приложение Д Результаты функционального анализа 21 экзонного варианта нуклеотидной последовательности в гене SCN1A

Приложение E Биоинформатические предсказания и результаты функционального анализа 8 ранее неописанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, выявленные у российских пациентов

Приложение Ж Список всех выявленных в базе данных gnomAD вариантов нуклеотидной последовательности в окрестностях ПЭ гена SCN1A с результатами биоинформатического анализа

Приложение З Список всех экзонных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, предсказанных биоинформатическим алгоритмом SpliceAI как влияющие на сплайсинг по результатам in silico мутагенеза

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная РНК

ОТ-ПЦР - ПЦР, совмещённая с обратной транскрипцией ВНП - вариант нуклеотидной последовательности МПС - массовое параллельное секвенирование ПЭ - псевдоэкзон

ПСК - преждевременный стоп-кодон ППТ - полипиримидиновый тракт СД - синдром Драве ФС - фебрильные судороги ФС+ -фебрильные судороги плюс АСО - антисмысловые олигонуклеотиды ФКД - фокальная кортикальная дисплазия ЦНС - центральная нервная система мяРНК - малые ядерные РНК

GEFS+ - Genetic epilepsy with febrile seizures plus; генетическая эпилепсия с фебрильными судорогами плюс

ICE-GTC - intractable childhood epilepsy with generalized tonic-clonic seizures; некупируемая

эпилепсия детства с генерализованными тонико-клоническими судорогами

DPBS - Буфер фосфатный Дюльбекко

DMEM - модифицированная Дюльбекко среда Игла

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

п.н. - пара нуклеотидов

РАС - расстройство аутистического спектра

EDTA - Этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

STE - трис-буфер с добавлением NaCl

ТБЕ - трис-боратный буфер

TEMED - ^^^№тетраметилэтилендиамин

SCN1A - Sodium Voltage-Gated Channel Alpha Subunit 1; альфа-субъединица 1 потенциал-зависимого натриевого канала

ACMG - American College of Medical Genetics and Genomics, Американская коллегия медицинской генетики и геномики

VUS - variant of uncertain significance, вариант с неизвестным клиническим значением NMD - nonsense-mediated decay; нонсенс-опосредованная деградация мРНК NGS - next-generation sequencing; секвенирование следующего поколения HGVS - Human Genome Variation Society

HGMD - The Human Gene Mutation Database; база данных мутаций человека

LOVD - Leiden Open Variation Database; Лейденская открытая база данных вариаций

OMIM - online mendelian inheritance in man; онлайн-справочник менделирующих заболеваний

человека

HPO - Human phenotype ontology; онтологии фенотипа человека RefSeq - Reference Sequence

mTOR - mammalian target of rapamycin; мишень рапамицина у млекопитающих

DEE - Developmental and epileptic encephalopathy; энцефалопатия развития и эпилептическая

энцефалопатия

SUDEP - Sudden unexpected death in epilepsy; Синдром внезапной смерти при эпилепсии SMEI - Severe myoclonic epilepsy of infancy; тяжелая миоклоническая эпилепсия младенческого возраста

UTR - untranslated region, нетранслируемая область

RACE - Rapid amplification of cDNA ends; Быстрая амплификация концевых фрагментов кДНК GTEx - The Genotype-Tissue Expression,

gnomAD - The Genome Aggregation Database, База данных по агрегации геномов CMV - cytomegalovirus, цитомегаловирус

HSV TK - Herpes simplex virus hymidine kinase, Тимидинкиназа вируса простого герпеса

RBP - RNA-binding protein, РНК связывающий белок

ESS - exonic splicing silencer, экзонный сайленсер сплайсинга

ESE - exonic splicing enhancer, экзонный энхансер сплайсинга

ISS - intronic splicing silencer, интронный сайленсер сплайсинга

ISE - intronic splicing enhancer, интронный энхансер сплайсинга

SRSF1 - Serine/Arginine Rich Splicing Factor, серин/аргинин-богатый фактор сплайсинга 1 ROC - receiver operating characteristic; рабочая характеристика приёмника AUC - area under curve, площадь под кривой

PPV - positive predictive value; положительная прогностическая ценность NPV - negative predictive value; отрицательная прогностическая ценность WT - wild-type - образец дикого типа

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование патогенности вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A, влияющих на сплайсинг»

Актуальность темы исследования

Патогенные варианты нуклеотидной последовательности (ВНП) в гене SCN1A, кодирующем альфа-субъединицу потенциал-зависимого натриевого канала Navl.1, являются одной из самых частых генетически обусловленных причин развития эпилепсии и заболеваний развития нервной системы у детей [Beltran-Corbellini A. et al., 2022, Symonds J. D. et al., 2019]. На сегодняшний день в базах данных, содержащих информацию о патогенности вариантов нуклеотидной последовательности, таких как ClinVar, Human Gene Mutation Database (HGMD) и Leiden Open Variation Database (LOVD), для гена SCN1A суммарно описано более пяти тысяч ВНП, ассоциированных с различными по тяжести эпилептическими фенотипами - от доброкачественных фебрильных судорог (ФС) до крайне тяжелого фенотипа синдрома Драве

(СД).

Среди описанных ВНП в гене SCN1A около 50% являются миссенс вариантами, которые могут приводить к любому SCN1A-ассоциированному фенотипу. Далее по частоте следуют ВНП, нарушающие открытую рамку считывания, и нонсенс-варианты, на долю которых приходится до 40% всех вариантов. Несмотря на то, что ранее проведенные исследования продемонстрировали, что данные ВНП приводят к потере функции (loss-of-function; LoF) гена SCN1A и чаще ассоциированы с более тяжелым эпилептическим фенотипом [Chen C. et al., 2022, Ishii A. et al., 2017, Zuberi S. M. et al., 2011], во многих случаях данная закономерность не прослеживается [Takaori T. et al., 2017, Yu M. J. et al., 2010]. В связи с этим определение более точных корреляций между генотипом и фенотипом для гена SCN1A остается крайне актуальной задачей.

Наиболее малочисленной и малоизученной группой в мутационном спектре гена SCN1A являются ВНП, аннотированные как влияющие на прохождение сплайсинга, хотя известно, что ВНП, нарушающие прохождение сплайсинга, вносят значительный вклад в развитие моногенных заболеваний у человека [Lord J. et al., 2021]. По различным оценкам на долю ВНП, нарушающих прохождение сплайсинга, приходится от 15-60% всех патогенных вариантов в структуре наследственной патологии [Krawczak M. et al., 1992, Lopez-Bigas N. et al., 2005]. Однако, в публичных базах данных лишь около 10% всех описанных ВНП в гене SCN1A аннотированы как варианты, влияющие на прохождение сплайсинга. Это свидетельствует о значительной недопредставленности данных вариантов, которая обусловлена сложностью в их выявлении и интерпретации. Современные биоинформатические алгоритмы позволяют предсказать возможное влияние ВНП на прохождение сплайсинга, однако для подтверждения данного

влияния и установления патогенности варианта и его точного молекулярного механизма необходимо проведение дополнительных подтверждающих функциональных исследований. Более того, на сегодняшний день с помощью данных алгоритмов невозможно предсказать точный молекулярный механизм нарушения сплайсинга, что имеет принципиальное значение как для установления гено-фенотипических корреляций, так и для разработки этиотропных методов лечения.

Среди экспериментальных подходов по анализу влияния ВНП на прохождение сплайсинга «золотым стандартом» является исследование структуры мРНК с помощью полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), где в качестве матрицы используется мРНК, выделенная из нативного материала пациента [Harvey S. E. et al., 2016]. Однако, в связи с тканеспецифичным паттерном экспрессии гена SCN1A в головном мозге исследование патогенетической значимости ВНП в нативных образцах невозможно. Альтернативным подходом в таких случаях является исследование сплайсинга с использованием плазмидных векторов, экспрессирующих минигены. В этом подходе исследуемые на сплайсинг экзоны клонируются в плазмидные вектора, после чего проводится трансфекция в модельные эукариотические клеточные линии и анализ сплайсинга минигенных транскриптов с помощью ОТ-ПЦР [Gaildrat P. et al., 2010].

Несмотря на то, что ген SCN1A является одним из наиболее изученных генов в области медицинской генетики и эпилептологии, функциональный анализ ВНП на предмет нарушения сплайсинга проводился лишь в единичных случаях и не системно. Более того, наши исследования и работы других коллективов ранее продемонстрировали, что ВНП, локализованные к экзонах генов, также могут приводить к нарушению сплайсинга за счёт возникновения новых криптических сайтов сплайсинга в экзонах или нарушения важных экзонных ^ис-регуляторных элементов сплайсинга [Dionnet E. et al., 2020, Soemedi R. et al., 2017, Sparber P. et al., 2021]. Однако на сегодняшний день роль и вклад экзонных вариантов в контексте нарушения сплайсинга для гена SCN1A не изучены.

Плазмидные вектора, экспрессирующие минигены, уже несколько десятков лет применяются при изучении молекулярных основ сплайсинга наряду с функциональными исследованиями влияния ВНП на прохождение сплайсинга в медицинской генетике. Существенной проблемой, затрудняющей рутинное применение данного подхода, является некорректное распознавание клонированного экзона, когда при тестировании плазмидного вектора с последовательностью дикого типа наблюдается частичный или полный пропуск экзона в составе мРНК. Несмотря на длительное применение данной методики, в профессиональной литературе практически отсутствуют данные о подходах, позволяющих решить проблему

некорректного распознавания экзонов в составе плазмиды, что затрудняет широкое применение этой методики в клинической практике.

Псевдоэкзоны (poison exons, ПЭ) представляют собой альтернативно сплайсирующиеся экзоны, включение которых в состав пре-мРНК приводит к сдвигу рамки считывания или формированию преждевременного стоп-кодона (ПСК) c последующей активацией механизма нонсенс-опосредованной деградации мРНК (NMD) [Carvill G. L. et al., 2020, Ni J. Z. et al., 2007]. Данные альтернативные экзоны являются высоко консервативными элементами генома, принимающими важное участие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов в различных организмах, на разных этапах онтогенеза и в крайне тканеспецифичной манере [Titus M. B. et al., 2021]. Однако, их роль и участие в развитии моногенных заболеваний в целом и SCN1A-ассоциированной эпилепсии в частности остается малоизученной.

Степень разработанности темы

До проведения данной работы исследование патогенности ВНП в гене SCN1A, влияющих на прохождение сплайсинга, проводились лишь в единичных случаях [Ben Mahmoud A. et al., 2015, Hata Y. et al., 2020, Zhou X. et al., 2021], и их вклад в мутационный спектр SCN1A-ассоциированной эпилепсии остается неизученным. Более того, оценка доли ВНП, потенциально влияющих на прохождение сплайсинга, среди всех описанных интронных и экзонных ВНП не проводились для гена SCN1A. Среди описанных в литературе интронных ВНП в гене SCN1A существенная доля расположена вне каноничных динуклеотидов сайтов сплайсинга, и их патогенетическая значимость остается под вопросом. Кроме того, многие из описанных экзонных ВНП в действительности могут влиять на прохождение сплайсинга, как показано на примере других генов [Ahlborn L. B. et al., 2015, Dionnet E. et al., 2020, Soemedi R. et al., 2017], однако такого рода работы для гена SCN1A не проводились. Таким образом, существует значительный пробел в системном анализе сплайсинга гена SCN1A в норме и при патологии.

В гене SCN1A один ПЭ, локализированный в интроне 23, функционально охарактеризован [Carvill G. L. et al., 2018], и еще два ПЭ в интронах 4 и 25 биоинформатически предсказаны [Steward C. A. et al., 2019]. Тем не менее, до проведения данного исследования не существовало систем, позволяющих рутинно анализировать влияние глубоко-интронных вариантов на включение ПЭ в мРНК гена SCN1A.

Некорректное распознавание экзонов в составе плазмид, экспрессирующих минигены, является актуальной и нерешенной научной проблемой. Имеются данные о том, что увеличение геномного окружения вставки в составе плазмиды в ряде случаев приводит к лучшему распознаванию клонированного экзона [Baralle M. et al., 2006, Sangermano R. et al., 2018],

вероятно, за счет включения интронных энхансеров сплайсинга (IESs). Несмотря на это, значительный пропуск экзона может наблюдаться и при включении фланкирующих интронов целиком, что свидетельствует о необходимости разработки дополнительных методов по коррекции распознавания экзонов в составе минигенов.

Работы по исследованию сплайсинга всего гена с последующим анализом большого количества ВНП проведены в единичных случаях [Sangermano R. et а1., 2018], и для гена 8СЫ1Л такого рода исследования не проводились ранее в России и в мире.

Цель и задачи

Целью исследования является анализ влияния на сплайсинг описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л, а также вариантов, выявленных у российских пациентов с эпилепсией, и установление механизмов их молекулярного патогенеза.

Задачи, решаемые в ходе исследования:

1. Оценить долю описанных в литературе вариантов нуклеотидной последовательности на предмет потенциального влияния на сплайсинг пре-мРНК гена 8СЫ1Л.

2. Разработать систему на основе плазмид, экспрессирующих минигены, содержащую все белок-кодирующие экзоны гена 8СЫ1Л, для анализа влияния вариантов нуклеотидной последовательности на сплайсинг.

3. Провести анализ влияния на сплайсинг интронных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л.

4. Провести анализ влияния на сплайсинг экзонных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л.

5. Провести функциональный анализ вариантов нуклеотидной последовательности, влияющих на сплайсинг пре-мРНК гена 8СЫ1Л, выявленных у российских пациентов.

6. Охарактеризовать псевдоэкзоны гена 8СЫ1Л и оценить их участие в патогенезе 8СЫ1Л-ассоциированной эпилепсии.

7. Провести анализ гено-фенотипических корреляций в гене 8СЫ1Л с учетом установленных механизмов влияния вариантов нуклеотидной последовательности на сплайсинг.

8. Оценить чувствительность и специфичность различных биоинформатических алгоритмов предсказания влияния вариантов нуклеотидной последовательности на сплайсинг, используя результаты функционального анализа.

Научная новизна

В работе представлены результаты масштабного исследования влияния ВНП на прохождение сплайсинга в гене SCN1A. Системное исследование подобного рода для гена SCN1A ранее не проводилось. В рамках выполнения работы использованы несколько подходов по улучшению распознавания экзонов в составе мини/мидигенов дикого типа, многие из которых (модификация плазмидного интрона для U12 интронов, модификация цис-регуляторных элементов в экзонах, снижение силы промотора плазмиды) разработаны и применены впервые. Впервые в ходе выполнения работы проведена характеризация псевдоэкзонов 4, 23 и 25 гена SCN1A и создана система, позволяющая исследовать сплайсинг данных псевдоэкзонов. Псевдоэкзоны 4 и 25 гена SCN1A охарактеризованы и функционально аннотированы впервые.

Впервые проведен функциональный анализ всех описанных интронных вариантов, расположенных вне канонических динуклеотидов сайтов сплайсинга в гене SCN1A (68 вариантов нуклеотидной последовательности) и установлен их молекулярный механизм патогенеза. Исследование всех описанных интронных вариантов, расположенных вне канонических динуклеотидов сайтов сплайсинга в гене SCN1A, выявило, что 12 из исследуемых вариантов не влияют на сплайсинг. Таким образом, данные варианты переквалифицированы в вероятно доброкачественные, что имеет принципиальное значение для корректного медико-генетического консультирования пациентов, у которых данные варианты могут быть выявлены при ДНК-диагностике. Проведен функциональный анализ 21 ранее описанных экзонных ВНП (16 миссенс вариантов, 3 синонимичных варианта, один нонсенс вариант и одна делеция без сдвига рамки считывания), предсказанных как влияющих на прохождение сплайсинга с помощью биоинформатического алгоритма SpliceAI. Установлено влияние на прохождение сплайсинга для 15 из 21 ВНП (11 миссенс вариантов, 3 синонимичных варианта и 1 нонсенс вариант) и таким образом установлен их молекулярный механизм патогенеза. Проведен функциональный анализ 8 ранее неописанных ВНП в гене SCN1A, выявленных у российских пациентов (1 нонсенс вариант, 2 миссенс вариант, 2 синонимичных варианта, 2 интронных варианта и один глубоко-интронный вариант). Установлено влияние на прохождение сплайсинга для 7 из 8 (87,5%) ранее неописанных ВНП, выявленных у российских пациентов.

Впервые проведен in silico мутагенез всей последовательности гена SCN1A и анализ потенциального влияния на прохождение сплайсинга всех возможных ВНП. Показано, что распределение миссенс вариантов, предсказанных как потенциально влияющих на прохождение сплайсинга, существенно отличается от распределения ранее описанных в литературе миссенс вариантов, которые не предсказываются как влияющие на сплайсинг, что дополнительно свидетельствует о различных биологических свойствах данных двух групп. Впервые для гена

8СЫ1Л проведен анализ гено-фенотипических корреляций для ВНП, влияющих на прохождение сплайсинга. Показано, что ВНП, влияющие на прохождение сплайсинга, чаще по сравнению с миссенс вариантами ассоциированы с более тяжелым эпилептическим фенотипом, тогда как при сравнении с нонсенс вариантами различий выявлено не было. С использованием результатов функционального анализа впервые проведен анализ сравнения тяжести клинической картины среди пациентов, у которых выявлены ВНП, влияющие на прохождение сплайсинга и приводящие к сдвигу рамки считывания, и пациентов, у которых выявлены ВНП, которые, согласно функциональному анализу, не приводят к сдвигу рамки считывания.

Суммарно в рамках исследования проведен функциональный анализ 114 ВНП и одного комплексного аллеля на предмет влияния на сплайсинг в гене 8СЫ1Л, что представляет одну из крупнейших в мире выборок исследованных вариантов для отдельно взятого гена.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанная в ходе данной работы система по анализу сплайсинга, покрывающая все 26 белок-кодирующих экзонов гена 8СЫ1Л, применима для исследования влияния на прохождение сплайсинга практически любых ВНП в гене 8СЫ1Л, как описанных в литературе, так и вновь выявленных у пациентов. Применение разработанной системы позволило установить молекулярный механизм нарушения сплайсинга для ранее описанных вариантов, а также переквалифицировать ранее описанные варианты в доброкачественные и вероятно доброкачественные. Полученные результаты имеют важнейшие значение как для корректного медико-генетического консультирования пациентов, у которых могут быть выявлены исследованные ВНП, так и для разработки персонализированных методов лечения с помощью подходов по коррекции сплайсинга.

Разработанные и использованные в работе подходы по улучшению распознавания клонированных экзонов в составе мини/миди/максигенов дикого типа позволили впервые выявить важные цис-регуляторные элементы, необходимые для корректного прохождения сплайсинга мРНК 8СЫ1Л, углубляя понимание молекулярных механизмов сплайсинга в норме и при патологии. Более того, многие из описанных подходов (модификация плазмидного интрона для Ш2 интронов, модификация цис-регуляторных элементов в экзонах, снижение силы промотора плазмиды) описаны впервые и могут быть применимы в отдельности или в сочетании для улучшения распознавания экзонов в составе любых мини/мидигенов.

Разработанная в ходе исследования система по исследованию влияния ВНП на прохождение сплайсинга в гене 8СЫ1Л внедрена в практику ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова».

Методология и методы исследования

Методологической и теоретической основой диссертационной работы являлись отечественные и зарубежные исследования в области эпилептологии и функциональные исследования, направленные на оценку патогенности ВНП. В диссертационной работе использованы следующие молекулярно-генетические методы: клонирование локусов гена 8СЫ1Л для получения плазмидных конструкций (мини/миди и максигены), содержащих один или несколько экзонов гена 8СЫ1Л; внесение в полученные конструкции исследуемых ВНП с помощью сайт-направленного мутагенеза; ведение и пересев клеточной культуры HEK293T; трансфекция клеточных линий полученными мини/миди и максигенами; выделение тотальной РНК; постановка реакции обратной транскрипции; полимеразная цепная реакция с детекцией по конечной точке; фрагментный анализ; методы статистической обработки полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту

1. Проведенный биоинформатический анализ установил, что 40% всех вариантов нуклеотидной последовательности, которые согласно алгоритму Sp1iceAI потенциально влияют на сплайсинг, локализуются в экзонах гена 8СЫ1Л, что указывает на их неверную аннотацию. Среди описанных интронных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л 39% не предсказываются как влияющие на сплайсинг и, следовательно, могут являться доброкачественными.

2. Показано, что для успешной разработки системы на основе плазмид, экспрессирующих минигены, корректно воспроизводящих сплайсинг референсного транскрипта 8СЫ1Л, необходимо применять различные подходы по улучшению распознавания клонированных экзонов.

3. Проведенный функциональный анализ показал, что 17,6% всех описанных интронных вариантов нуклеотидной последовательности, расположенных вне каноничных сайтов сплайсинга в гене 8СЫ1Л, не влияют на прохождение сплайсинга несмотря на то, что описаны как патогенные/вероятно-патогенные в литературе.

4. Функциональный анализ подтвердил, что большинство предсказанных экзонных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СЫ1Л (71,4%, 15 вариантов из 21) действительно приводят к нарушению прохождения сплайсинга, и, таким образом, установлен их молекулярный механизм патогенеза.

5. Показано, что использование биоинформатического алгоритма SpliceAI в сочетании с проведением функционального анализа может быть успешно использовано для подтверждения патогенности ранее неописанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене SCN1A.

6. Разработана и валидирована система на основе плазмид, экспрессирующих минигены, для псевдоэкзонов гена SCN1A. Показана патогенетическая значимость псевдоэкзонов в развитии SCN1A-ассоциированной эпилепсии.

7. Показано, что использование модифицированных антисмысловых и7-мяРНК успешно приводит к подавлению включения псевдоэкзонов гена SCN1A, что может быть использовано как перспективный терапевтический подход у пациентов с глубоко-интронными вариантами, усиливающими включение исследуемых псевдоэкзонов.

8. Показано, что миссенс варианты нуклеотидной последовательности, предсказанные как влияющие на прохождение сплайсинга, обладают отличным распределением относительно структуры белка Nav1.1 по сравнению с описанными патогенными миссенс вариантами, которые не предсказываются как влияющие на прохождение сплайсинга. Установлено, что варианты нуклеотидной последовательности, влияющие на прохождение сплайсинга в гене SCN1A, в среднем ассоциированы с более тяжелым фенотипом, чем миссенс варианты. Показано, что тяжесть фенотипа не связана с влиянием аномального транскрипта на открытую рамку считывания.

9. На примере гена SCN1A показано, что биоинформатические алгоритмы предсказывают влияние варианта нуклеотидной последовательности на прохождение сплайсинга с высокой чувствительностью, однако обладают низкой специфичностью, что подтверждает необходимость экспериментальной валидации для исключения ложноположительных результатов.

Степень достоверности результатов

Результаты работы получены на большом экспериментальном материале. Для достижения высокого уровня достоверности эксперименты проводились в нескольких (не менее трех) биологических повторностях с последующим анализом полученных результатов при использовании современных методов статистической оценки. Цели и задачи работы основываются на данных современных исследований в области молекулярной биологии, биотехнологии и генетики. В работе использовались современные молекулярно-биологические и генетические методы исследования. Поставленные в работе цель и задачи полностью выполнены, и их результаты полностью отражены в выводах.

Апробация результатов

Материалы диссертационной работы доложены на 9 международных и всероссийских конференциях среди которых European Human Genetics Conference 2018, June 16-19, 2018, Milan, Italy; European Human Genetics Conference 2021, August 28-31, 2021, virtual conference; European Human Genetics Conference 2022, June 11-14, 2022, Vienna, Austria; 8th Congress of the European Academy of Neurology - Europe 2022, June 25-28, Vienna, Austria; 14th European Epilepsy Congress, July 9-13, Geneva, Switzerland; X Съезд Российского общества медицинских генетиков, 16 августа 2021, Москва, Россия; I Ежегодная конференция Московского общества медицинских генетиков с международным участием, 19-20 мая 2022, Москва, Россия; Конференция «Эпилепсия - от гена до скальпеля: перезагрузка» 21 января 2023, Москва, Россия; Научно-практическая конференция «Новые технологии в диагностике и лечении наследственных болезней», 6 апреля 2023.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» (ФГБНУ «МГНЦ»).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует формуле специальности 1.5.7. - Генетика (Фундаментальная медицина) - «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни», «Молекулярные и цитологические основы наследственности», «Мутационная изменчивость», «Генетический код. Структурно-функциональная организация геномов. Структурная и функциональная геномика» - работа включает в себя обсуждение генетики человека, медицинской генетики, наследственных заболеваний. Включает в себя изучение проблем реализации генетической информации (транскрипция), процессинга мРНК (сплайсинг) на молекулярном и клеточном уровне.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор исследовательской работы принимал участие на всех этапах её проведения: анализ литературы, формулирование цели и задач, проведение экспериментальной работы, обработка и интерпретация полученных результатов, формулирование выводов. Автором проанализирована и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, обработаны

полученные результаты, сформулированы выводы и написана рукопись. Материалы исследования подготовлены автором к публикации в рецензируемых зарубежных журналах. Результаты исследовательской работы представлены лично автором на 5 международных и 4 всероссийских конференциях.

Публикации

Материалы диссертационной работы представлены в 7 печатных работах, в том числе в 3 статьях (все в Web of Science и Scopus), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. В опубликованных научных работах и автореферате полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 272 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 43 рисунка и 8 приложений. Работа имеет следующую структуру: список сокращений и условных обозначений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список научных трудов по теме диссертации, список цитируемой литературы, приложения. Библиографический указатель включает 250 наименований, из них 3 отечественных и 247 зарубежных источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Эпилепсия 1.1.1 Определение и эпидемиология эпилепсии

Согласно определению Международной лиги по борьбе с эпилепсией (ILAE), эпилепсия представляет собой хроническое расстройство головного мозга, характеризующееся стойкой предрасположенностью к развитию эпилептических приступов [Fisher R. S. et al., 2005]. В свою очередь эпилептический приступ является временным, клиническим проявлением избыточной, патологической, синхронной активности нейронов головного мозга. С практической точки зрения эпилепсия является заболеванием головного мозга, для которого выполняется одно из двух следующий условий: (1) наличие двух и более неспровоцированных (или рефлекторных) эпилептических приступов с интервалом более 24 часов между ними или (2) наличие одного неспровоцированного (или рефлекторного) эпилептического приступа с вероятностью повторных приступов, сопоставимой с общим рисков рецидива (не менее 60%) после двух неспровоцированных приступов в следующие 10 лет [Fisher R. S. et al., 2014].

Эпилепсия является одним из наиболее распространённых неврологических заболеваний, которым болеют люди всех возрастных групп, рас и социальных классов. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) эпилепсией болеют около 50 миллионов человек во всем мире. Проведенный мета-анализ, включающий 222 эпидемиологических исследования установил, что распространённость активной формы эпилепсии в мире составляет 6,38 случаев на 1000 (95% доверительный интервал (95% CI) 5,57-7,30), тогда как распространённость в течение жизни составляет 7,6 случаев на 1000 (95% CI 6,17-9,38) [Fiest K. M. et al., 2017]. Общемировая заболеваемость эпилепсией составляет 61,4 случая на 100000 в год и сильно зависит от среднего уровня дохода населения. В странах с низким и средним уровнем дохода ежегодная заболеваемость эпилепсией почти в 3 раза превышает заболеваемость в странах с высоким уровнем дохода (139 случаев против 48,9 соответственно) [Beghi E., 2020]. Эти различия объясняются разницей в структуре групп риска и более высокой подверженности населения в менее развитых странах перинатальным факторам риска и более высокой частотой черепно-мозговых травм и инфекций центральной нервной системы (ЦНС) [Beghi E. et al., 2014].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Спарбер Пётр Андреевич, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авакян Г. Н., Блинов Д. В., Лебедева А. В. et al. Классификация эпилепсии Международной Противоэпилептической Лиги: пересмотр и обновление 2017 года // Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2017. V. 9. № 1. P. 6-25.

2. Гуляев С., Архипенко И. Современные аспекты эпидемиологии эпилепсии // Русский журнал детской неврологии. 2011. № 1. P. 11-18.

3. Рыжкова О., Кардымон О., Прохорчук Е. et al. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (МРБ)(редакция 2018, версия 2) // Медицинская генетика. 2019. V. 18. № 2. Р. 3-23.

4. Agirre E., Oldfield A., Bellora N. et al. Splicing-associated chromatin signatures: a combinatorial and position-dependent role for histone marks in splicing definition // Nature communications. 2021. V. 12. № 1. P. 682.

5. Ahlborn L. B., Dandanell M., Steffensen A. Y. et al. Splicing analysis of 14 BRCA1 missense variants classifies nine variants as pathogenic // Breast Cancer Res Treat. 2015. V. 150. № 2. P. 289-98. doi: 10.1007/s10549-015-3313-7

6. Andersson R., Enroth S., Rada-Iglesias A. et al. Nucleosomes are well positioned in exons and carry characteristic histone modifications // Genome research. 2009. V. 19. № 10. P. 1732-1741.

7. Anna A., Monika G. Splicing mutations in human genetic disorders: examples, detection, and confirmation // Journal of applied genetics. 2018. V. 59. P. 253-268.

8. Annesi G., Gambardella A., Carrideo S. et al. Two novel SCN1A missense mutations in generalized epilepsy with febrile seizures plus // Epilepsia. 2003. V. 44. № 9. P. 1257-1258.

9. Arzimanoglou A., Guerrini R., Aicardi J. Aicardi's epilepsy in children // (No Title). 2004.

10. Auffenberg E., Hedrich U. B., Barbieri R. et al. Hyperexcitable interneurons trigger cortical spreading depression in an Scn1a migraine model // The Journal of clinical investigation. 2021. V. 131. № 21

11. Baralle M., Skoko N., Knezevich A. et al. NF1 mRNA biogenesis: effect of the genomic milieu in splicing regulation of the NF1 exon 37 region // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 18. P. 4449-56. doi: 10.1016/j.febslet.2006.07.018

12. Bartoletti-Stella A., Gasparini L., Giacomini C. et al. Messenger RNA processing is altered in autosomal dominant leukodystrophy // Human Molecular Genetics. 2015. V. 24. № 10. P. 27462756.

13. Beck V. C., Hull J. M., Isom L. L. Beyond Dravet syndrome: characterization of a novel, more severe SCN1A-linked epileptic encephalopathy // Epilepsy Currents. 2019. V. 19. № 4. P. 266268.

14. Beghi E. The Epidemiology of Epilepsy // Neuroepidemiology. 2020. V. 54. № 2. P. 185-191. doi: 10.1159/000503831

15. Beghi E., Hesdorffer D. Prevalence of epilepsy--an unknown quantity // Epilepsia. 2014. V. 55. № 7. P. 963-7. doi: 10.1111/epi.12579

16. Beltran-Corbellini A., Aledo-Serrano A., Moller R. S. et al. Epilepsy Genetics and Precision Medicine in Adults: A New Landscape for Developmental and Epileptic Encephalopathies // Front Neurol. 2022. V. 13. P. 777115. doi: 10.3389/fneur.2022.777115

17. Ben Mahmoud A., Ben Mansour R., Driss F. et al. Evaluation of the effect of c.2946+1G>T mutation on splicing in the SCN1A gene // Comput Biol Chem. 2015. V. 54. P. 44-8. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2015.01.003

18. Berget S. M. Exon recognition in vertebrate splicing // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 6. P. 24114. doi: 10.1074/jbc.270.6.2411

19. Berget S. M. Exon Recognition in Vertebrate Splicing (*) // Journal of biological Chemistry. 1995. V. 270. № 6. P. 2411-2414.

20. Black D. L. Does steric interference between splice sites block the splicing of a short c-src neuron-specific exon in non-neuronal cells? // Genes & development. 1991. V. 5. № 3. P. 389402.

21. Bonanni P., Malcarne M., Moro F. et al. Generalized epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+): clinical spectrum in seven Italian families unrelated to SCN1A, SCN1B, and GABRG2 gene mutations // Epilepsia. 2004. V. 45. № 2. P. 149-158.

22. Bournazos A. M., Riley L. G., Bommireddipalli S. et al. Standardized practices for RNA diagnostics using clinically accessible specimens reclassifies 75% of putative splicing variants // Genetics in medicine. 2022. V. 24. № 1. P. 130-145.

23. Bowler E., Porazinski S., Uzor S. et al. Hypoxia leads to significant changes in alternative splicing and elevated expression of CLK splice factor kinases in PC3 prostate cancer cells // BMC cancer. 2018. V. 18. P. 1-11.

24. Brunklaus A., Brunger T., Feng T. et al. The gain of function SCN1A disorder spectrum: novel epilepsy phenotypes and therapeutic implications // Brain. 2022. V. 145. № 11. P. 3816-3831.

25. Carter M. S., Doskow J., Morris P. et al. A regulatory mechanism that detects premature nonsense codons in T-cell receptor transcripts in vivo is reversed by protein synthesis inhibitors in vitro // Journal of biological Chemistry. 1995. V. 270. № 48. P. 28995-29003.

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

Carvill G. L., Engel K. L., Ramamurthy A. et al. Aberrant Inclusion of a Poison Exon Causes Dravet Syndrome and Related SCNIA-Associated Genetic Epilepsies // Am J Hum Genet. 2018. V. 103. № 6. P. 1022-1029. doi: 10.1016/j.ajhg.2018.10.023

Carvill G. L., Mefford H. C. Poison exons in neurodevelopment and disease // Curr Opin Genet Dev. 2020. V. 65. P. 98-102. doi: 10.1016/j.gde.2020.05.030

Carvill G. L., Weckhuysen S., McMahon J. M. et al. GABRA1 and STXBP1: novel genetic causes of Dravet syndrome // Neurology. 2014. V. 82. № 14. P. 1245-1253. Catterall W. A. From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels // Neuron. 2000. V. 26. № 1. P. 13-25.

Chang X., Wang K. wANNOVAR: annotating genetic variants for personal genomes via the web // J Med Genet. 2012. V. 49. № 7. P. 433-6. doi: 10.1136/jmedgenet-2012-100918 Charles A. C., Baca S. M. Cortical spreading depression and migraine // Nature Reviews Neurology. 2013. V. 9. № 11. P. 637-644.

Chen C., Fang F., Wang X. et al. Phenotypic and Genotypic Characteristics of SCN1A Associated Seizure Diseases // Front Mol Neurosci. 2022. V. 15. P. 821012. doi: 10.3389/fnmol.2022.821012

Cheng J., Nguyen T. Y. D., Cygan K. J. et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing // Genome biology. 2019. V. 20. № 1. P. 1-15. Chong J. A., Tapia-Ramirez J., Kim S. et al. REST: a mammalian silencer protein that restricts sodium channel gene expression to neurons // Cell. 1995. V. 80. № 6. P. 949-957. Claes L., Del-Favero J., Ceulemans B. et al. De novo mutations in the sodium-channel gene SCN1A cause severe myoclonic epilepsy of infancy // The American Journal of Human Genetics. 2001. V. 68. № 6. P. 1327-1332.

Claes L. R., Deprez L., Suls A. et al. The SCN1A variant database: a novel research and diagnostic tool // Human mutation. 2009. V. 30. № 10. P. E904-E920.

Clerte C., Hall K. B. Characterization of multimeric complexes formed by the human PTB1 protein on RNA // Rna. 2006. V. 12. № 3. P. 457-475.

Cohen-Eliav M., Golan-Gerstl R., Siegfried Z. et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers // The Journal of Pathology. 2013. V. 229. № 4. P. 630-639.

Colosimo E., Gambardella A., Mantegazza M. et al. Electroclinical features of a family with simple febrile seizures and temporal lobe epilepsy associated with SCN1A loss-of-function mutation // Epilepsia. 2007. V. 48. № 9. P. 1691-1696.

Cooper T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements // Methods. 2005. V. 37. № 4. P. 331-340.

41. Corvelo A., Hallegger M., Smith C. W., Eyras E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing // PLoS computational biology. 2010. V. 6. № 11. P. e1001016.

42. D'Gama A. M., Geng Y., Couto J. A. et al. Mammalian target of rapamycin pathway mutations cause hemimegalencephaly and focal cortical dysplasia // Ann Neurol. 2015. V. 77. № 4. P. 7205. doi: 10.1002/ana.24357

43. Dalla Bernardina B., Capovilla G., Gattoni M. et al. Epilepsie myoclonique grave de la première année // Revue d'Electroencéphalographie et de Neurophysiologie Clinique. 1982. V. 12. № 1. P. 21-25.

44. Dawes R., Bournazos A. M., Bryen S. J. et al. SpliceVault predicts the precise nature of variant-associated mis-splicing // Nat Genet. 2023. V. 55. № 2. P. 324-332. doi: 10.1038/s41588-022-01293-8

45. De Conti L., Baralle M., Buratti E. Exon and intron definition in pre-mRNA splicing // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2013. V. 4. № 1. P. 49-60.

46. De Jonghe P. Molecular genetics of Dravet syndrome // Developmental Medicine & Child Neurology. 2011. V. 53. P. 7-10.

47. de la Mata M., Alonso C. R., Kadener S. et al. A slow RNA polymerase II affects alternative splicing in vivo // Molecular cell. 2003. V. 12. № 2. P. 525-532.

48. de Oliveira Freitas Machado C., Schafranek M., Brüggemann M. et al. Poison cassette exon splicing of SRSF6 regulates nuclear speckle dispersal and the response to hypoxia // Nucleic acids research. 2023. V. 51. № 2. P. 870-890.

49. De Vries B., Freilinger T., Vanmolkot K. et al. Systematic analysis of three FHM genes in 39 sporadic patients with hemiplegic migraine // Neurology. 2007. V. 69. № 23. P. 2170-2176.

50. den Dunnen J. T., Dalgleish R., Maglott D. R. et al. HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants: 2016 Update // Hum Mutat. 2016. V. 37. № 6. P. 564-9. doi: 10.1002/humu.22981

51. Depienne C., Bouteiller D., Keren B. et al. Sporadic infantile epileptic encephalopathy caused by mutations in PCDH19 resembles Dravet syndrome but mainly affects females // PLoS genetics. 2009. V. 5. № 2. P. e1000381.

52. Dichgans M., Freilinger T., Eckstein G. et al. Mutation in the neuronal voltage-gated sodium channel SCN1A in familial hemiplegic migraine // The Lancet. 2005. V. 366. № 9483. P. 371377.

53. Ding J., Li X., Tian H. et al. SCN1A mutation—beyond Dravet syndrome: a systematic review and narrative synthesis // Frontiers in Neurology. 2021. V. 12. P. 743726.

54. Dionnet E., Defour A., Da Silva N. et al. Splicing impact of deep exonic missense variants in CAPN3 explored systematically by minigene functional assay // Hum Mutat. 2020. V. 41. № 10. P. 1797-1810. doi: 10.1002/humu.24083

55. Dionnet E., Defour A., Da Silva N. et al. Splicing impact of deep exonic missense variants in CAPN3 explored systematically by minigene functional assay // Human mutation. 2020. V. 41. № 10. P. 1797-1810.

56. Dominski Z., Kole R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons // Molecular and cellular biology. 1991.

57. Dong Z.-F., Tang L.-J., Deng G.-F. et al. Transcription of the human sodium channel SCN1A gene is repressed by a scaffolding protein RACK1 // Molecular neurobiology. 2014. V. 50. P. 438-448.

58. Dong Z., Wang Y., Zhang J. et al. Analyzing the effects of BRCA1/2 variants on mRNA splicing by minigene assay // Journal of Human Genetics. 2023. V. 68. № 2. P. 65-71.

59. Dravet C. Les epilepsies graves de l'enfant // Vie méd. 1978. V. 8. P. 543-548.

60. Dravet C. The core Dravet syndrome phenotype // Epilepsia. 2011. V. 52. P. 3-9.

61. Dravet C. How Dravet syndrome became a model for studying childhood genetic epilepsies // Brain. 2012. V. 135. № 8. P. 2309-2311.

62. Dutton S. B., Makinson C. D., Papale L. A. et al. Preferential inactivation of Scn1a in parvalbumin interneurons increases seizure susceptibility // Neurobiology of disease. 2013. V. 49. P. 211-220.

63. Eberle A. B., Stalder L., Mathys H. et al. Posttranscriptional gene regulation by spatial rearrangement of the 3' untranslated region // PLoS biology. 2008. V. 6. № 4. P. e92.

64. Eksioglu Y., Scheffer I., Cardenas P. et al. Periventricular heterotopia: an X-linked dominant epilepsy locus causing aberrant cerebral cortical development // Neuron. 1996. V. 16. № 1. P. 77-87.

65. Eng L., Coutinho G., Nahas S. et al. Nonclassical splicing mutations in the coding and noncoding regions of the ATM Gene: maximum entropy estimates of splice junction strengths // Human mutation. 2004. V. 23. № 1. P. 67-76.

66. Erkelenz S., Mueller W. F., Evans M. S. et al. Position-dependent splicing activation and repression by SR and hnRNP proteins rely on common mechanisms // Rna. 2013. V. 19. № 1. P. 96-102.

67. Escayg A., Goldin A. L. Sodium channel SCN1A and epilepsy: mutations and mechanisms // Epilepsia. 2010. V. 51. № 9. P. 1650-1658.

68. Escayg A., MacDonald B. T., Meisler M. H. et al. Mutations of SCN1A, encoding a neuronal sodium channel, in two families with GEFS+ 2 // Nature genetics. 2000. V. 24. № 4. P. 343-345.

69. Fajardo M., Cirillo M. L. Understanding the Spectrum of SLC2A1-Associated Disorders // Pediatr Neurol Briefs. 2017. V. 31. № 2. P. 4. doi: 10.15844/pedneurbriefs-31-2-1

70. Felker S. A., Lawlor J. M., Hiatt S. M. et al. Poison exon annotations improve the yield of clinically relevant variants in genomic diagnostic testing // Genetics in medicine. 2023. V. 25. № 8. P. 100884.

71. Fica S. M., Tuttle N., Novak T. et al. RNA catalyses nuclear pre-mRNA splicing // Nature. 2013. V. 503. № 7475. P. 229-34. doi: 10.1038/nature12734

72. Fiest K. M., Sauro K. M., Wiebe S. et al. Prevalence and incidence of epilepsy: A systematic review and meta-analysis of international studies // Neurology. 2017. V. 88. № 3. P. 296-303. doi: 10.1212/WNL.0000000000003509

73. Filatova A. Y., Vasilyeva T. A., Marakhonov A. V. et al. Functional reassessment of PAX6 single nucleotide variants by in vitro splicing assay // Eur J Hum Genet. 2019. V. 27. № 3. P. 488-493. doi: 10.1038/s41431-018-0288-y

74. Fisher R. S., Acevedo C., Arzimanoglou A. et al. ILAE official report: a practical clinical definition of epilepsy // Epilepsia. 2014. V. 55. № 4. P. 475-82. doi: 10.1111/epi.12550

75. Fisher R. S., Cross J. H., French J. A. et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology // Epilepsia. 2017. V. 58. № 4. P. 522-530. doi: 10.1111/epi. 13670

76. Fisher R. S., van Emde Boas W., Blume W. et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE) // Epilepsia. 2005. V. 46. № 4. P. 470-2. doi: 10.1111/j.0013-9580.2005.66104.x

77. Fong N., Kim H., Zhou Y. et al. Pre-mRNA splicing is facilitated by an optimal RNA polymerase II elongation rate // Genes & development. 2014. V. 28. № 23. P. 2663-2676.

78. Fox-Walsh K. L., Dou Y., Lam B. J. et al. The architecture of pre-mRNAs affects mechanisms of splice-site pairing // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005. V. 102. № 45. P. 16176-16181.

79. Frasier C. R., Zhang H., Offord J. et al. Channelopathy as a SUDEP biomarker in Dravet syndrome patient-derived cardiac myocytes // Stem cell reports. 2018. V. 11. № 3. P. 626-634.

80. Fu X.-D., Ares Jr M. Context-dependent control of alternative splicing by RNA-binding proteins // Nature Reviews Genetics. 2014. V. 15. № 10. P. 689-701.

81. Gaildrat P., Killian A., Martins A. et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants // Methods Mol Biol. 2010. V. 653. P. 249-57. doi: 10.1007/978-1-60761-759-4 15

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

Gaildrat P., Killian A., Martins A. et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants // Cancer susceptibility: methods and protocols. 2010. P. 249-257.

Goyenvalle A., Babbs A., van Ommen G.-J. B. et al. Enhanced exon-skipping induced by U7 snRNA carrying a splicing silencer sequence: Promising tool for DMD therapy // Molecular Therapy. 2009. V. 17. № 7. P. 1234-1240.

Guo M. H., Bardakj ian T. M., Brzozowski M. R. et al. Temporal trends and yield of clinical diagnostic genetic testing in adult neurology // American Journal of Medical Genetics Part A. 2021. V. 185. № 10. P. 2922-2928.

Han J., Li J., Ho J. C. et al. Hypoxia is a key driver of alternative splicing in human breast cancer cells // Scientific reports. 2017. V. 7. № 1. P. 4108.

Harding P., Fall A., Honeyman K. et al. The influence of antisense oligonucleotide length on

dystrophin exon skipping // Molecular Therapy. 2007. V. 15. № 1. P. 157-166.

Harvey S. E., Cheng C. Methods for Characterization of Alternative RNA Splicing // Methods

Mol Biol. 2016. V. 1402. P. 229-241. doi: 10.1007/978-1-4939-3378-5_18

Harvey S. E., Xu Y., Lin X. et al. Coregulation of alternative splicing by hnRNPM and ESRP1

during EMT // Rna. 2018. V. 24. № 10. P. 1326-1338.

Hata Y., Oku Y., Taneichi H. et al. Two autopsy cases of sudden unexpected death from Dravet syndrome with novel de novo SCN1A variants // Brain Dev. 2020. V. 42. № 2. P. 171-178. doi: 10.1016/j.braindev.2019.10.005

Hata Y., Oku Y., Taneichi H. et al. Two autopsy cases of sudden unexpected death from Dravet syndrome with novel de novo SCN1A variants // Brain and Development. 2020. V. 42. № 2. P. 171-178.

Hauser W. A., Kurland L. T. The epidemiology of epilepsy in Rochester, Minnesota, 1935 through 1967 // Epilepsia. 1975. V. 16. № 1. P. 1-66. doi: 10.1111/j.1528-1157.1975.tb04721.x Heger K., Lund C., Larsen Burns M. et al. A retrospective review of changes and challenges in the use of antiseizure medicines in Dravet syndrome in Norway // Epilepsia Open. 2020. V. 5. № 3. P. 432-441.

Heinemann S. H., Terlau H., Stuhmer W. et al. Calcium channel characteristics conferred on the sodium channel by single mutations // Nature. 1992. V. 356. № 6368. P. 441-443. Hildebrand M. S., Myers C. T., Carvill G. L. et al. A targeted resequencing gene panel for focal epilepsy // Neurology. 2016. V. 86. № 17. P. 1605-12. doi: 10.1212/WNL.0000000000002608 Hong X., Scofield D. G., Lynch M. Intron size, abundance, and distribution within untranslated regions of genes // Mol Biol Evol. 2006. V. 23. № 12. P. 2392-404. doi: 10.1093/molbev/msl111

96. Huang Y., Zhang L. An In Vitro Single-Primer Site-Directed Mutagenesis Method for Use in Biotechnology // Methods Mol Biol. 2017. V. 1498. P. 375-383. doi: 10.1007/978-1-4939-6472-7_26

97. Ishii A., Watkins J. C., Chen D. et al. Clinical implications of SCN1A missense and truncation variants in a large Japanese cohort with Dravet syndrome // Epilepsia. 2017. V. 58. № 2. P. 282290. doi: 10.1111/epi.13639

98. Isom L. L., Knupp K. G. Dravet Syndrome: Novel Approaches for the Most Common Genetic Epilepsy // Neurotherapeutics. 2021. V. 18. № 3. P. 1524-1534. doi: 10.1007/s13311-021-01095-6

99. Jaganathan K., Kyriazopoulou Panagiotopoulou S., McRae J. F. et al. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning // Cell. 2019. V. 176. № 3. P. 535-548 e24. doi: 10.1016/j.cell.2018.12.015

100. Jansson J. S., Hallböök T., Reilly C. Intellectual functioning and behavior in Dravet syndrome: A systematic review // Epilepsy & Behavior. 2020. V. 108. P. 107079.

101. Jen J. C. Familial hemiplegic migraine //. 2021.

102. Johannesen K., Marini C., Pfeffer S. et al. Phenotypic spectrum of GABRA1: From generalized epilepsies to severe epileptic encephalopathies // Neurology. 2016. V. 87. № 11. P. 1140-51. doi: 10.1212/WNL.0000000000003087

103. Johnston A. J., Kang J. Q., Shen W. et al. A novel GABRG2 mutation, p.R136*, in a family with GEFS+ and extended phenotypes // Neurobiol Dis. 2014. V. 64. P. 131-141. doi: 10.1016/j.nbd.2013.12.013

104. Jouali F., MarchoudI N., Rouissi A., Fekkak J. Identification of a Novel Nonsense Variant in the SCN1A Gene that Causes Febrile Seizure Disorder // Journal of Pediatric Neurology. 2018. V. 16. № 04. P. 236-238.

105. Jourdy Y., Fretigny M., Nougier C. et al. Splicing analysis of 26 F8 nucleotide variations using a minigene assay // Haemophilia. 2019. V. 25. № 2. P. 306-315.

106. Kalume F., Frank H. Y., Westenbroek R. E. et al. Reduced sodium current in Purkinje neurons from Nav1. 1 mutant mice: implications for ataxia in severe myoclonic epilepsy in infancy // Journal of Neuroscience. 2007. V. 27. № 41. P. 11065-11074.

107. Ke S., Shang S., Kalachikov S. M. et al. Quantitative evaluation of all hexamers as exonic splicing elements // Genome Res. 2011. V. 21. № 8. P. 1360-74. doi: 10.1101/gr.119628.110

108. Keezer M. R., Sisodiya S. M., Sander J. W. Comorbidities of epilepsy: current concepts and future perspectives // Lancet Neurol. 2016. V. 15. № 1. P. 106-15. doi: 10.1016/S1474-4422(15)00225-2

109. Koenig J., Werdehausen R., Linley J. E. et al. Regulation of Navl. 7: a conserved SCN9A natural antisense transcript expressed in dorsal root ganglia // PLoS One. 2015. V. 10. № 6. P. e0128830.

110. Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A. et al. Health characteristics of patients with cystic fibrosis whose genotype includes a variant of the nucleotide sequence c. 3140-16T> A and functional analysis of this variant // Genes. 2021. V. 12. № 6. P. 837.

111. Krawczak M., Reiss J., Cooper D. N. The mutational spectrum of single base-pair substitutions in mRNA splice junctions of human genes: causes and consequences // Hum Genet. 1992. V. 90. № 1-2. P. 41-54. doi: 10.1007/BF00210743

112. Krenn M., Wagner M., Hotzy C. et al. Diagnostic exome sequencing in non-acquired focal epilepsies highlights a major role of GATOR1 complex genes // J Med Genet. 2020. V. 57. № 9. P. 624-633. doi: 10.1136/jmedgenet-2019-106658

113. Lareau L. F., Inada M., Green R. E. et al. Unproductive splicing of SR genes associated with highly conserved and ultraconserved DNA elements // Nature. 2007. V. 446. № 7138. P. 926929.

114. Le Caignec C., Kwiatkowski D. J., Kury S. et al. Three independent mutations in the TSC2 gene in a family with tuberous sclerosis // Eur J Hum Genet. 2009. V. 17. № 9. P. 1165-70. doi: 10.1038/ejhg.2009.28

115. Le Hir H., Gatfield D., Izaurralde E., Moore M. J. The exon-exon junction complex provides a binding platform for factors involved in mRNA export and nonsense-mediated mRNA decay // The EMBO journal. 2001. V. 20. № 17. P. 4987-4997.

116. Le Hir H., Izaurralde E., Maquat L. E., Moore M. J. The spliceosome deposits multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions // The EMBO journal. 2000. V. 19. № 24. P. 6860-6869.

117. Leclair N. K., Brugiolo M., Urbanski L. et al. Poison exon splicing regulates a coordinated network of SR protein expression during differentiation and tumorigenesis // Molecular cell. 2020. V. 80. № 4. P. 648-665. e9.

118. Leman R., Parfait B., Vidaud D. et al. SPiP: Splicing Prediction Pipeline, a machine learning tool for massive detection of exonic and intronic variant effects on mRNA splicing // Human mutation. 2022. V. 43. № 12. P. 2308-2323.

119. Lemke J. R., Lal D., Reinthaler E. M. et al. Mutations in GRIN2A cause idiopathic focal epilepsy with rolandic spikes // Nat Genet. 2013. V. 45. № 9. P. 1067-72. doi: 10.1038/ng.2728

120. Lewis B. P., Green R. E., Brenner S. E. Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003. V. 100. № 1. P. 189-192.

121. Li Q., Wang Y., Pan Y. et al. Unraveling synonymous and deep intronic variants causing aberrant splicing in two genetically undiagnosed epilepsy families // BMC Medical Genomics. 2021. V.

14. № 1. P. 1-9.

122. Liao Y., Deprez L., Maljevic S. et al. Molecular correlates of age-dependent seizures in an inherited neonatal-infantile epilepsy // Brain. 2010. V. 133. № 5. P. 1403-1414.

123. Lim J. S., Kim W. I., Kang H. C. et al. Brain somatic mutations in MTOR cause focal cortical dysplasia type II leading to intractable epilepsy // Nat Med. 2015. V. 21. № 4. P. 395-400. doi: 10.1038/nm.3824

124. Lin J.-H., Wu H., Zou W.-B. et al. Splicing outcomes of 5' splice site GT> GC variants that generate wild-type transcripts differ significantly between full-length and minigene splicing assays // Frontiers in Genetics. 2021. V. 12. P. 701652.

125. Lin J. h., Tang X. y., Boulling A. et al. First estimate of the scale of canonical 5' splice site GT> GC variants capable of generating wild-type transcripts // Human mutation. 2019. V. 40. № 10. P. 1856-1873.

126. Lin Lin Lee V., Kar Meng Choo B., Chung Y. S. et al. Treatment, Therapy and Management of Metabolic Epilepsy: A Systematic Review // Int J Mol Sci. 2018. V. 19. № 3 doi: 10.3390/ijms19030871

127. Lin W.-D., Chou I.-C., Tsai F.-J. Novel human pathological mutations. Gene symbol: SCN1A. Disease: generalized epilepsy with febrile seizures plus // Human genetics. 2010. V. 127. № 4. P. 478.

128. Lindy A. S., Stosser M. B., Butler E. et al. Diagnostic outcomes for genetic testing of 70 genes in 8565 patients with epilepsy and neurodevelopmental disorders // Epilepsia. 2018. V. 59. № 5. P. 1062-1071. doi: 10.1111/epi.14074

129. Long Y. S., Zhao Q. H., Su T. et al. Identification of the promoter region and the 5'-untranslated exons of the human voltage-gated sodium channel Nav1. 1 gene (SCN1A) and enhancement of gene expression by the 5'-untranslated exons // Journal of neuroscience research. 2008. V. 86. №

15. P. 3375-3381.

130. Lopez-Bigas N., Audit B., Ouzounis C. et al. Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? // FEBS Lett. 2005. V. 579. № 9. P. 1900-3. doi: 10.1016/j.febslet.2005.02.047

131. Lord J., Baralle D. Splicing in the Diagnosis of Rare Disease: Advances and Challenges // Front Genet. 2021. V. 12. P. 689892. doi: 10.3389/fgene.2021.689892

132. Lossin C., Rhodes T. H., Desai R. R. et al. Epilepsy-associated dysfunction in the voltage-gated neuronal sodium channel SCN1A // Journal of Neuroscience. 2003. V. 23. № 36. P. 1128911295.

133. Lossin C., Wang D. W., Rhodes T. H. et al. Molecular basis of an inherited epilepsy // Neuron. 2002. V. 34. № 6. P. 877-884.

134. Lykke-Andersen S., Jensen T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes // Nat Rev Mol Cell Biol. 2015. V. 16. № 11. P. 665-77. doi: 10.1038/nrm4063

135. Lykke-Andersen S., Jensen T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes // Nature reviews Molecular cell biology. 2015. V. 16. № 11. P. 665-677.

136. Lynch D., Revil T., Schwartzentruber J. et al. Disrupted auto-regulation of the spliceosomal gene SNRPB causes cerebro-costo-mandibular syndrome. Nat. Commun. 5, 4483 // Book Disrupted auto-regulation of the spliceosomal gene SNRPB causes cerebro-costo-mandibular syndrome. Nat. Commun. 5, 4483 / Editor, 2014.

137. Malo M., Blanchard B., Andresen J. et al. Localization of a putative human brain sodium channel gene (SCN1A) to chromosome band 2q24 // Cytogenetic and Genome Research. 1994. V. 67. № 3. P. 178-186.

138. Mantegazza M., Gambardella A., Rusconi R. et al. Identification of an Nav1. 1 sodium channel (SCN1A) loss-of-function mutation associated with familial simple febrile seizures // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005. V. 102. № 50. P. 18177-18182.

139. Martin M. S., Tang B., Ta N., Escayg A. Characterization of 5' untranslated regions of the voltage-gated sodium channels SCN1A, SCN2A, and SCN3A and identification of cis-conserved noncoding sequences // Genomics. 2007. V. 90. № 2. P. 225-235.

140. Maruthi G., Dhayalan P., Kumaran P. et al. SCN1A Gene Mutations in Indian Children With Epilepsy: Single Center Experience // Indian Pediatr. 2023. V. 60. № 8. P. 648-650.

141. Mayr C. Evolution and biological roles of alternative 3' UTRs // Trends in cell biology. 2016. V. 26. № 3. P. 227-237.

142. Meng H., Xu H. Q., Yu L. et al. The SCN1A mutation database: updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype // Human mutation. 2015. V. 36. № 6. P. 573-580.

143. Mercer T. R., Clark M. B., Andersen S. B. et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints // Genome Res. 2015. V. 25. № 2. P. 290-303. doi: 10.1101/gr.182899.114

144. Miller I. O., Sotero de Menezes M. A. SCN1A seizure disorders //. 2022.

145. Mishra S., Reznikov V., Maltsev V. A. et al. Contribution of sodium channel neuronal isoform Nav1. 1 to late sodium current in ventricular myocytes from failing hearts // The Journal of physiology. 2015. V. 593. № 6. P. 1409-1427.

146. M0ller R. S., Dahl H. A., Helbig I. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics // Expert review of molecular diagnostics. 2015. V. 15. № 12. P. 1531-1538.

147. Myers C. T., Hollingsworth G., Muir A. M. et al. Parental mosaicism in "de novo" epileptic encephalopathies // The New England journal of medicine. 2018. V. 378. № 17. P. 1646.

148. Neugebauer K. M. Nascent RNA and the coordination of splicing with transcription // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2019. V. 11. № 8. P. a032227.

149. Ni J. Z., Grate L., Donohue J. P. et al. Ultraconserved elements are associated with homeostatic control of splicing regulators by alternative splicing and nonsense-mediated decay // Genes Dev. 2007. V. 21. № 6. P. 708-18. doi: 10.1101/gad. 1525507

150. Nicita F., Spalice A., Papetti L. et al. Genotype-phenotype correlations in a group of 15 SCN1A-mutated Italian patients with GEFS+ spectrum (seizures plus, classical and borderline severe myoclonic epilepsy of infancy) // Journal of child neurology. 2010. V. 25. № 11. P. 1369-1376.

151. Nickless A., Bailis J. M., You Z. Control of gene expression through the nonsense-mediated RNA decay pathway // Cell & bioscience. 2017. V. 7. № 1. P. 1-12.

152. Ogino T. Severe myoclonic epilepsy in infancy: clinico-electroencephalographic and long-term follow up studies // Brain Dev. 1986. V. 8. P. 162.

153. Ohashi T., Akasaka N., Kobayashi Y. et al. Infantile epileptic encephalopathy with a hyperkinetic movement disorder and hand stereotypies associated with a novel SCN1A mutation // Epileptic Disorders. 2014. V. 16. № 2. P. 208-212.

154. Orrico A., Galli L., Grosso S. et al. Mutational analysis of the SCN1A, SCN1B and GABRG2 genes in 150 Italian patients with idiopathic childhood epilepsies // Clinical genetics. 2009. V. 75. № 6. P. 579-581.

155. Ottman R., Winawer M. R., Kalachikov S. et al. LGI1 mutations in autosomal dominant partial epilepsy with auditory features // Neurology. 2004. V. 62. № 7. P. 1120-6. doi: 10.1212/01.wnl.0000120098.39231.6e

156. Pagni S., Custodio H. M., Frankish A. et al. SCN1A: bioinformatically informed revised boundaries for promoter and enhancer regions // Human Molecular Genetics. 2023. V. 32. № 10. P. 1753-1763.

157. Palombo R., Verdile V., Paronetto M. P. Poison-exon inclusion in DHX9 reduces its expression and sensitizes ewing sarcoma cells to chemotherapeutic treatment // Cells. 2020. V. 9. № 2. P. 328.

158. Pan Q., Shai O., Lee L. J. et al. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing // Nat Genet. 2008. V. 40. № 12. P. 1413-5. doi: 10.1038/ng.259

159. Pan Q., Shai O., Lee L. J. et al. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing // Nature genetics. 2008. V. 40. № 12. P. 14131415.

160. Patel N., Ram D., Swiderska N. et al. Febrile seizures // Bmj. 2015. V. 351.

161. Pelorosso C., Watrin F., Conti V. et al. Somatic double-hit in MTOR and RPS6 in hemimegalencephaly with intractable epilepsy // Hum Mol Genet. 2019. V. 28. № 22. P. 37553765. doi: 10.1093/hmg/ddz194

162. Perucca E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives // Acta Epileptologica. 2021. V. 3. № 1. P. 22.

163. Plummer N. W., Meisler M. H. Evolution and diversity of mammalian sodium channel genes // Genomics. 1999. V. 57. № 2. P. 323-331.

164. Popplewell L., Trollet C., Dickson G., Graham I. Design of phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMOs) for the induction of exon skipping of the human DMD gene // Human Gene Therapy. - T. 19 -MARY ANN LIEBERT INC 140 HUGUENOT STREET, 3RD FL, NEW ROCHELLE, NY 10801 USA, 2008. - C. 1174-1174.

165. Qian X., Wang J., Wang M. et al. Identification of deep-intronic splice mutations in a large cohort of patients with inherited retinal diseases // Frontiers in Genetics. 2021. V. 12. P. 647400.

166. Qin N., D'Andrea M. R., Lubin M. L. et al. Molecular cloning and functional expression of the human sodium channel ß1B subunit, a novel splicing variant of the ß 1 subunit // European journal of biochemistry. 2003. V. 270. № 23. P. 4762-4770.

167. Raga S., Specchio N., Rheims S., Wilmshurst J. M. Developmental and epileptic encephalopathies: recognition and approaches to care // Epileptic Disord. 2021. V. 23. № 1. P. 40-52. doi: 10.1684/epd.2021.1244

168. Ragsdale D. S. How do mutant Nav1. 1 sodium channels cause epilepsy? // Brain research reviews. 2008. V. 58. № 1. P. 149-159.

169. Ribeiro M., Furtado M., Martins S. et al. RNA splicing defects in hypertrophic cardiomyopathy: implications for diagnosis and therapy // International Journal of Molecular Sciences. 2020. V. 21. № 4. P. 1329.

170. Ribierre T., Deleuze C., Bacq A. et al. Second-hit mosaic mutation in mTORC1 repressor DEPDC5 causes focal cortical dysplasia-associated epilepsy // J Clin Invest. 2018. V. 128. № 6. P. 2452-2458. doi: 10.1172/JCI99384

171. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in medicine. 2015. V. 17. № 5. P. 405-423.

172. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and

Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet Med. 2015. V. 17. № 5. P. 40524. doi: 10.1038/gim.2015.30

173. Riepe T. V., Khan M., Roosing S. et al. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays // Human mutation. 2021. V. 42. № 7. P. 799-810.

174. Rigo F., Hua Y., Krainer A. R., Bennett C. F. Antisense-based therapy for the treatment of spinal muscular atrophy // Book Antisense-based therapy for the treatment of spinal muscular atrophy / EditorThe Rockefeller University Press, 2012.

175. Rinaldi C., Wood M. J. Antisense oligonucleotides: the next frontier for treatment of neurological disorders // Nature Reviews Neurology. 2018. V. 14. № 1. P. 9-21.

176. Rivas M. A., Pirinen M., Conrad D. F. et al. Effect of predicted protein-truncating genetic variants on the human transcriptome // Science. 2015. V. 348. № 6235. P. 666-669.

177. Robberson B. L., Cote G. J., Berget S. M. Exon definition may facilitate splice site selection in RNAs with multiple exons // Mol Cell Biol. 1990. V. 10. № 1. P. 84-94. doi: 10.1128/mcb.10.1.84-94.1990

178. Robberson B. L., Cote G. J., Berget S. M. Exon definition may facilitate splice site selection in RNAs with multiple exons // Molecular and cellular biology. 1990.

179. Rosenberg A. B., Patwardhan R. P., Shendure J., Seelig G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 698-711.

180. Ruby S. W., Abelson J. Pre-mRNA splicing in yeast // Trends in Genetics. 1991. V. 7. № 3. P. 79-85.

181. Sadleir L. G., Mountier E. I., Gill D. et al. Not all SCN1A epileptic encephalopathies are Dravet syndrome: early profound Thr226Met phenotype // Neurology. 2017. V. 89. № 10. P. 1035-1042.

182. Sakharkar M. K., Chow V. T., Kangueane P. Distributions of exons and introns in the human genome // In Silico Biol. 2004. V. 4. № 4. P. 387-93.

183. Saltzman A. L., Kim Y. K., Pan Q. et al. Regulation of multiple core spliceosomal proteins by alternative splicing-coupled nonsense-mediated mRNA decay // Molecular and cellular biology. 2008. V. 28. № 13. P. 4320-4330.

184. Sangermano R., Khan M., Cornelis S. S. et al. ABCA4 midigenes reveal the full splice spectrum of all reported noncanonical splice site variants in Stargardt disease // Genome Res. 2018. V. 28. № 1. P. 100-110. doi: 10.1101/gr.226621.117

185. Scheffer I. E., Bennett C. A., Gill D. et al. Exome sequencing for patients with developmental and epileptic encephalopathies in clinical practice // Dev Med Child Neurol. 2023. V. 65. № 1. P. 50-57. doi: 10.1111/dmcn.15308

186. Scheffer I. E., Berkovic S., Capovilla G. et al. ILAE classification of the epilepsies: Position paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology // Epilepsia. 2017. V. 58. № 4. P. 512-521. doi: 10.1111/epi.13709

187. Scheffer I. E., Berkovic S. F. Generalized epilepsy with febrile seizures plus. A genetic disorder with heterogeneous clinical phenotypes // Brain: a journal of neurology. 1997. V. 120. № 3. P. 479-490.

188. Scotti M. M., Swanson M. S. RNA mis-splicing in disease // Nature Reviews Genetics. 2016. V. 17. № 1. P. 19-32.

189. Selmer K., Eriksson A. S., Brandal K. et al. Parental SCN1A mutation mosaicism in familial Dravet syndrome // Clinical genetics. 2009. V. 76. № 4. P. 398-403.

190. Shenasa H., Hertel K. J. Combinatorial regulation of alternative splicing // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 2019. V. 1862. № 11-12. P. 194392.

191. Shirai C. L., Ley J. N., White B. S. et al. Mutant U2AF1 expression alters hematopoiesis and pre-mRNA splicing in vivo // Cancer cell. 2015. V. 27. № 5. P. 631-643.

192. Sickmier E. A., Frato K. E., Shen H. et al. Structural basis for polypyrimidine tract recognition by the essential pre-mRNA splicing factor U2AF65 // Molecular cell. 2006. V. 23. № 1. P. 4959.

193. Silva A. L., Ribeiro P., Inâcio Â. et al. Proximity of the poly (A)-binding protein to a premature termination codon inhibits mammalian nonsense-mediated mRNA decay // Rna. 2008. V. 14. № 3. P. 563-576.

194. Soemedi R., Cygan K. J., Rhine C. L. et al. Pathogenic variants that alter protein code often disrupt splicing // Nat Genet. 2017. V. 49. № 6. P. 848-855. doi: 10.1038/ng.3837

195. Soemedi R., Cygan K. J., Rhine C. L. et al. Pathogenic variants that alter protein code often disrupt splicing // Nature genetics. 2017. V. 49. № 6. P. 848-855.

196. Sparber P., Bychkov I., Pyankov D., Skoblov M. Functional investigation of SCN1A deep-intronic variants activating poison exons inclusion // Human genetics. 2023. P. 1-11.

197. Sparber P., Filatova A., Anisimova I. et al. Various haploinsufficiency mechanisms in PittHopkins syndrome // European Journal of Medical Genetics. 2020. V. 63. № 12. P. 104088.

198. Sparber P., Filatova A., Khantemirova M., Skoblov M. The role of long non-coding RNAs in the pathogenesis of hereditary diseases // BMC Medical Genomics. 2019. V. 12. № 2. P. 63-78.

199. Sparber P., Mikhaylova S., Galkina V. et al. Case Report: Functional Investigation of an Undescribed Missense Variant Affecting Splicing in a Patient With Dravet Syndrome // Front Neurol. 2021. V. 12. P. 761892. doi: 10.3389/fneur.2021.761892

200. Sparber P., Mikhaylova S., Galkina V. et al. Case Report: Functional Investigation of an Undescribed Missense Variant Affecting Splicing in a Patient With Dravet Syndrome // Frontiers in Neurology. 2021. V. 12. P. 761892.

201. Spellman R., Smith C. W. Novel modes of splicing repression by PTB // Trends in biochemical sciences. 2006. V. 31. № 2. P. 73-76.

202. Spycher C., Streit A., Stefanovic B. et al. 3' end processing of mouse histone pre-mRNA: evidence for additional base-pairing between U7 snRNA and pre-mRNA // Nucleic acids research. 1994. V. 22. № 20. P. 4023-4030.

203. Steel D., Symonds J. D., Zuberi S. M., Brunklaus A. Dravet syndrome and its mimics: Beyond SCN 1A // Epilepsia. 2017. V. 58. № 11. P. 1807-1816.

204. Stefanski A., Calle-Lopez Y., Leu C. et al. Clinical sequencing yield in epilepsy, autism spectrum disorder, and intellectual disability: A systematic review and meta-analysis // Epilepsia. 2021. V. 62. № 1. P. 143-151.

205. Steward C. A., Roovers J., Suner M. M. et al. Re-annotation of 191 developmental and epileptic encephalopathy-associated genes unmasks de novo variants in SCN1A // NPJ Genom Med. 2019. V. 4. P. 31. doi: 10.1038/s41525-019-0106-7

206. Stoss O., Stoilov P., Hartmann A. M. et al. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing // Brain Res Brain Res Protoc. 1999. V. 4. № 3. P. 383-94. doi: 10.1016/s1385-299x(99)00043-4

207. Sugawara T., Mazaki-Miyazaki E., Ito M. et al. Nav1. 1 mutations cause febrile seizures associated with afebrile partial seizures // Neurology. 2001. V. 57. № 4. P. 703-705.

208. Sultan M., Schulz M. H., Richard H. et al. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome // Science. 2008. V. 321. № 5891. P. 956-60. doi: 10.1126/science. 1160342

209. Symonds J. D., Zuberi S. M., Stewart K. et al. Incidence and phenotypes of childhood-onset genetic epilepsies: a prospective population-based national cohort // Brain. 2019. V. 142. № 8. P. 2303-2318. doi: 10.1093/brain/awz195

210. Symonds J. D., Zuberi S. M., Stewart K. et al. Incidence and phenotypes of childhood-onset genetic epilepsies: a prospective population-based national cohort // Brain. 2019. V. 142. № 8. P. 2303-2318.

211. Takaori T., Kumakura A., Ishii A. et al. Two mild cases of Dravet syndrome with truncating mutation of SCN1A // Brain Dev. 2017. V. 39. № 1. P. 72-74. doi: 10.1016/j.braindev.2016.07.006

212. Talerico M., Berget S. M. Intron definition in splicing of small Drosophila introns // Molecular and cellular biology. 1994. V. 14. № 5. P. 3434-3445.

213. Tammaro P., Conti F., Moran O. Modulation of sodium current in mammalian cells by an epilepsy-correlated ß1-subunit mutation // Biochemical and biophysical research communications. 2002. V. 291. № 4. P. 1095-1101.

214. Tan E. H., Yusoff A. A. M., Abdullah J. M., Razak S. A. Generalized epilepsy with febrile seizure plus (GEFS+) spectrum: novel de novo mutation of SCN1A detected in a Malaysian patient // Journal of pediatric neurosciences. 2012. V. 7. № 2. P. 123.

215. Tapia-Ramírez J., Eggen B. J., Peral-Rubio M. J. et al. A single zinc finger motif in the silencing factor REST represses the neural-specific type II sodium channel promoter // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997. V. 94. № 4. P. 1177-1182.

216. Thomas J. D., Polaski J. T., Feng Q. et al. RNA isoform screens uncover the essentiality and tumor-suppressor activity of ultraconserved poison exons // Nature genetics. 2020. V. 52. № 1. P. 84-94.

217. Titus M. B., Chang A. W., Olesnicky E. C. Exploring the Diverse Functional and Regulatory Consequences of Alternative Splicing in Development and Disease // Front Genet. 2021. V. 12. P. 775395. doi: 10.3389/fgene.2021.775395

218. Tubeuf H., Charbonnier C., Soukarieh O. et al. Large-scale comparative evaluation of user-friendly tools for predicting variant-induced alterations of splicing regulatory elements // Hum Mutat. 2020. V. 41. № 10. P. 1811-1829. doi: 10.1002/humu.24091

219. Turunen J. J., Niemela E. H., Verma B., Frilander M. J. The significant other: splicing by the minor spliceosome // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2013. V. 4. № 1. P. 61-76. doi: 10.1002/wrna.1141

220. Ule J., Blencowe B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution // Mol Cell. 2019. V. 76. № 2. P. 329-345. doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.017

221. Valenzuela-Palomo A., Sanoguera-Miralles L., Bueno-Martínez E. et al. Splicing Analysis of 16 PALB2 ClinVar Variants by Minigene Assays: Identification of Six Likely Pathogenic Variants // Cancers. 2022. V. 14. № 18. P. 4541.

222. van der Klift H. M., Jansen A. M., van der Steenstraten N. et al. Splicing analysis for exonic and intronic mismatch repair gene variants associated with Lynch syndrome confirms high concordance between minigene assays and patient RNA analyses // Mol Genet Genomic Med. 2015. V. 3. № 4. P. 327-45. doi: 10.1002/mgg3.145

223. Van Trigt W. K., Kelly K. M., Hughes C. C. W. GNAQ mutations drive port wine birthmark-associated Sturge-Weber syndrome: A review of pathobiology, therapies, and current models // Front Hum Neurosci. 2022. V. 16. P. 1006027. doi: 10.3389/fnhum.2022.1006027

224

225

226

227

228

229

230

231

232

233

234

235

236

237

Vanmolkot K. R., Babini E., de Vries B. et al. The novel p. L1649Q mutation in the SCN1A epilepsy gene is associated with familial hemiplegic migraine: genetic and functional studies // Human mutation. 2007. V. 28. № 5. P. 522-522.

Vaz-Drago R., Custodio N., Carmo-Fonseca M. Deep intronic mutations and human disease // Human genetics. 2017. V. 136. P. 1093-1111.

Vezyroglou A., Varadkar S., Bast T. et al. Focal epilepsy in SCN1A-mutation carrying patients: is there a role for epilepsy surgery? // Dev Med Child Neurol. 2020. V. 62. № 11. P. 1331-1335. doi: 10.1111/dmcn. 14588

Vieira N. M., Naslavsky M. S., Licinio L. et al. A defect in the RNA-processing protein HNRPDL causes limb-girdle muscular dystrophy 1G (LGMD1G) // Human Molecular Genetics. 2014. V. 23. № 15. P. 4103-4110.

Voskobiynyk Y., Battu G., Felker S. A. et al. Aberrant regulation of a poison exon caused by a non-coding variant in a mouse model of Scn1a-associated epileptic encephalopathy // PLoS genetics. 2021. V. 17. № 1. P. e1009195.

Wan L., Yu W., Shen E. et al. SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer // Gut. 2019. V. 68. № 1. P. 118-129. Wang J. Y., Tang B., Sheng W. X. et al. Clinical and Functional Features of Epilepsy-Associated In-Frame Deletion Variants in SCN1A // Front Mol Neurosci. 2022. V. 15. P. 828846. doi: 10.3389/fnmol.2022.828846

Wang X., Zhong J., Gao Y. et al. A SNP in intron 8 of CD46 causes a novel transcript associated with mastitis in Holsteins // BMC Genomics. 2014. V. 15. № 1. P. 630. doi: 10.1186/1471-216415-630

Wang Z., Burge C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code // Rna. 2008. V. 14. № 5. P. 802-813.

Wang Z., Rolish M. E., Yeo G. et al. Systematic identification and analysis of exonic splicing silencers // Cell. 2004. V. 119. № 6. P. 831-45. doi: 10.1016/j.cell.2004.11.010 Wilkinson M. E., Charenton C., Nagai K. RNA splicing by the spliceosome // Annual review of biochemistry. 2020. V. 89. P. 359-388.

Wilton S. D., Fall A. M., Harding P. L. et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript // Molecular Therapy. 2007. V. 15. № 7. P. 12881296.

Wood J. N., Iseppon F. Sodium channels // Brain and Neuroscience Advances. 2018. V. 2. P. 2398212818810684.

Wu J. Y., Maniatis T. Specific interactions between proteins implicated in splice site selection and regulated alternative splicing // Cell. 1993. V. 75. № 6. P. 1061-1070.

238. Wu Q., Krainer A. R. AT-AC pre-mRNA splicing mechanisms and conservation of minor introns in voltage-gated ion channel genes // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. № 5. P. 3225-36. doi: 10.1128/MCB.19.5.3225

239. Wu Y. W., Sullivan J., McDaniel S. S. et al. Incidence of Dravet Syndrome in a US Population // Pediatrics. 2015. V. 136. № 5. P. e1310-5. doi: 10.1542/peds.2015-1807

240. Wu Y. W., Sullivan J., McDaniel S. S. et al. Incidence of Dravet syndrome in a US population // Pediatrics. 2015. V. 136. № 5. P. e1310-e1315.

241. Wyers L., Van de Walle P., Hoornweg A. et al. Gait deviations in patients with dravet syndrome: A systematic review // European Journal of Paediatric Neurology. 2019. V. 23. № 3. P. 357-367.

242. Yeo G., Burge C. B. Maximum entropy modeling of short sequence motifs with applications to RNA splicing signals // Proceedings of the seventh annual international conference on Research in computational molecular biology -, 2003. - C. 322-331.

243. Yu F. H., Catterall W. A. Overview of the voltage-gated sodium channel family // Genome biology. 2003. V. 4. № 3. P. 1-7.

244. Yu M. J., Shi Y. W., Gao M. M. et al. Milder phenotype with SCN1A truncation mutation other than SMEI // Seizure. 2010. V. 19. № 7. P. 443-5. doi: 10.1016/j.seizure.2010.06.010

245. Zhang J., Maquat L. E. Evidence that translation reinitiation abrogates nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells // The EMBO journal. 1997. V. 16. № 4. P. 826-833.

246. Zhang R., Chen Z., Song Q. et al. Identification of seven exonic variants in the SLC4A1, ATP6V1B1, and ATP6V0A4 genes that alter RNA splicing by minigene assay // Human mutation. 2021. V. 42. № 9. P. 1153-1164.

247. Zhang X., Chen M. H., Wu X. et al. Cell-type-specific alternative splicing governs cell fate in the developing cerebral cortex // Cell. 2016. V. 166. № 5. P. 1147-1162. e15.

248. Zhou X., Xu H., Cai X. et al. Differences in SCN1A intronic variants result in diverse aberrant splicing patterns and are related to the phenotypes of epilepsy with febrile seizures // Epilepsy Res. 2021. V. 176. P. 106711. doi: 10.1016/j.eplepsyres.2021.106711

249. Zhou X., Xu H., Cai X. et al. Differences in SCN1A intronic variants result in diverse aberrant splicing patterns and are related to the phenotypes of epilepsy with febrile seizures // Epilepsy Research. 2021. V. 176. P. 106711.

250. Zuberi S. M., Brunklaus A., Birch R. et al. Genotype-phenotype associations in SCN1A-related epilepsies // Neurology. 2011. V. 76. № 7. P. 594-600. doi: 10.1212/WNL.0b013e31820c309b

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение А Список всех описанных вариантов нуклеотидной последовательности в гене 8СМ1А, предсказанных биоинформатическим алгоритмом 8рНееЛ1 как влияющие на сплайсинг

Хромосомн ая позиция ЯеГ ЛИ Тип кДНК Белок Частота 8рНееЛ1 ЛО 8рНееЛ1 ЛЬ 8рНееЛ1 БО 8рИееЛ1 БЬ

166848486 С - Делеция с.5299ёе1 р.(Уа117678егГБ тег12) 0.37 0.00 0.00 0.00

166848878 С о Миссенс с.4907о>С р.(Аг§1636Рго) 0.41 0.00 0.00 0.00

166848933 С о Интронный с.4853-1о>С р.? 0.61 0.92 0.00 0.00

166848933 С т Интронный с.4853-1о>А р.? 0.44 1.00 0.00 0.00

166848934 т - Интронный с.4853-2ёе1 р? 0.66 0.99 0.00 0.00

166848934 т о Интронный с.4853-2А>С р? 0.54 0.99 0.00 -0.00

166848934 т А Интронный с.4853-2А>т р? 0.63 0.99 0.00 0.00

166848946 А С Интронный с.4853-14т>о р? 0.86 0.08 0.00 0.00

166850651 С о Интронный с.4852+5о>С р? 0.01 0.00 0.50 0.20

166850653 т А Интронный с.4852+3А>т р? 0.01 0.00 0.02 0.52

166850654 А о Интронный с.4852+2т>С р? 0.01 0.00 0.00 0.91

166850654 А т Интронный с.4852+2т>А р? 0.01 0.00 0.00 0.99

166850655 С т Интронный с.4852+1о>А р? 0.00 0.00 0.00 0.99

166850655 С А Интронный с.4852+1о>т р? 0.00 0.00 0.06 1.00

166850656 С т Миссенс с.4852о>А р.(о1у1618Бег) 0.00 0.00 0.83 0.53

166850744 А т Нонсенс с.4764т>А р.(СуБ1588тег) 0.00 0.00 0.98 0.00

166850745 С т Миссенс с.4763о>А р.(СуБ1588туг) 0.00 0.00 0.39 0.00

166850807 т С Синонимичный с.4701А>о р.(о1и1567=) 0.00 0.01 0.98 0.00

166850844 А С Миссенс с.4664т>о р.(МеП555А^) 0.98 0.01 0.00 0.00

166850875 т С Миссенс с.4633А>о р.(11е1545Уа1) 0.00 0.00 0.62 0.00

166850924 о С Миссенс с.4584С>о р.(А8й1528Ьув) 0.89 0.00 0.00 0.00

166850927 С о Интронный с.4582-1о>С р? 0.65 0.99 0.00 0.00

166850927 С А Интронный е.4582-Ю>т р.? 0.70 0.99 0.00 0.00

166850928 т А Интронный с.4582-2А>т р.? 0.47 0.99 0.00 0.00

166850928 т С Интронный с.4582-2А>о р? 0.23 0.99 0.00 0.00

166850929 о т Интронный с.4582-3С>А р? 0.03 0.28 0.00 0.00

166850929 о С Интронный с.4582-3С>о р? 0.96 0.87 0.00 0.00

166850937 А С Интронный с.4582-11т>о р? 0.28 0.75 0.00 0.00

166852452 т А Интронный с.4581+71А>т р? 0.00 0.02 0.99 0.00

166852505 т С Интронный с.4581+18А>о р? 0.00 0.00 0.93 0.12

166852518 С т Интронный с.4581+5о>А р? 0.00 0.00 0.00 0.82

166852518 С о Интронный с.4581+5о>С р? 0.00 0.00 0.03 0.81

166852519 т С Интронный с.4581+4А>о р? 0.00 0.00 0.00 0.77

166852520 т А Интронный с.4581+3А>т р? 0.00 0.00 0.00 0.83

166852520 - А Интронный с.4581+2ёир р? 0.00 0.00 0.00 0.79

166852521 А - Интронный с.4581+2ёе1 р? 0.00 0.00 0.04 0.83

166852521 А т Интронный с.4581+2т>А р? 0.00 0.00 0.01 0.83

166852521 А о Интронный с.4581+2т>С р? 0.00 0.00 0.00 0.83

166852521 А С Интронный с.4581+2т>о р? 0.00 0.00 0.00 0.83

166852522 С т Интронный с.4581+1о>А р? 0.00 0.00 0.07 0.83

166852522 С о Интронный с.4581+1о>С р? 0.00 0.00 0.06 0.83

166852522 С А Интронный с.4581+1о>т р? 0.00 0.00 0.05 0.83

166852531 о А Нонсенс с.4573С>т р.(А^1525тег) 0.00 0.00 0.00 0.37

166852555 т А Нонсенс с.4549А>т р.(ЬуБ1517тег) 0.00 0.00 0.00 0.31

166852557 о т Нонсенс с.4547С>А р.(Бег1516тег) 0.00 0.00 0.00 0.66

166852575 о А Миссенс с.4529С>т р.(А1а1510Уа1) 0.00 0.20 0.02 0.00

166852583 о С Нонсенс с.4521С>о р.(туг1507тег) 0.00 0.38 0.00 0.00

166852583 о т Нонсенс с.4521С>А р.(туг1507тег) 0.00 0.29 0.00 0.00

166852586 тттСт тст - Делеция с.4511_4518ёе1 р.(о1и1504ЬеиГ Бтег3) 0.00 0.36 0.00 0.00

166852588 тс - Делеция с.4515_4516ёе1 р.(Ьув150611еГ8 тег3) 0.00 0.46 0.00 0.00

166852591 т А Нонсенс с.4513А>т р.(ЬуБ1505тег) 0.00 0.51 0.00 0.00

166852592 С А Миссенс с.4512о>т р.(о1и1504И18) 0.00 0.29 0.00 0.00

166852595 TTC - Делеция c.4507 4509del p.(Glu1503del) 0.00 0.32 0.00 0.00

166852597 C T Миссенс c.4507G>A p.(Glu1503Lys) 0.00 0.31 0.00 0.00

166852600 C A Нонсенс c.4504G>T p.(Glu1502Ter) 0.00 0.41 0.00 0.00

166852610 G - Делеция c.4494del p.(Phe1499Leuf sTer2) 0.00 0.21 0.00 0.00

166852612 TGTCT - Делеция c.4488_4492del p.(Gln1496Hisfs Ter12) 0.01 0.21 0.00 0.00

166852616 T - Делеция c.4488del p.(Asp1497Thrf sTer4) 0.23 0.21 0.00 0.00

166852617 T G Делеция c.4486del p.(Gln1496Lysf sTer5) 0.00 0.33 0.13 0.00

166852618 G - Миссенс c.4487A>C p.(Gln1496Pro) 0.24 0.09 0.00 0.00

166852620 C - Делеция c.4484del p.(Gly1495Valfs Ter6) 0.38 0.68 0.00 0.00

166852623 C T Миссенс c.4481G>A p.(Gly1494Glu) 0.30 0.22 0.00 0.00

166852628 G A Интронный c.4477-1C>T p.? 0.15 0.29 0.00 0.00

166852629 T C Интронный c.4477-2A>G p.? 0.09 0.30 0.00 0.00

166852630 A T Интронный c.4477-3T>A p? 0.00 0.23 0.00 0.00

166852680 T C Интронный c.4477-53A>G p? 0.41 0.00 0.00 -0.00

166854542 A G Интронный c.4476+6T>C p? 0.00 0.04 0.00 0.24

166854542 A C Интронный c.4476+1 4476+5d el p? 0.00 0.05 0.00 0.43

166854543 CTTAT - Интронный c.4476+6T>G p? 0.00 0.05 0.00 0.36

166854543 C T Интронный c.4476+5G>A p? 0.00 0.05 0.00 0.43

166854543 C A Интронный c.4476+5G>T p? 0.00 0.05 0.00 0.43

166854546 ATC - Делеция c.4476 4476+2del p? 0.00 0.05 0.01 0.43

166854547 TCT - Делеция c.4475 4476+1del p.? 0.00 0.01 0.51 0.43

166854547 T C Интронный c.4476+1A>G p.? 0.07 0.00 0.57 0.05

166854547 T A Интронный c.4476+1A>T p.? 0.00 0.00 0.93 0.41

166854548 C A Миссенс c.4476G>T p.(Lys1492Asn) 0.00 0.05 0.01 0.37

166854548 C T Синонимичный c.4476G>A p.(Lys1492=) 0.00 0.04 0.05 0.40

166854551 - T Дупликация c.4472dup p.(Lys1492Gluf sTer18) 0.00 0.00 0.01 0.22

166854573 T C Миссенс c.4451A>G p.(Asp1484Gly) 0.04 0.00 0.20 0.19

166854617 A T Миссенс c.4407T>A p.(Phe1469Leu) 0.95 0.02 0.00 0.00

166854683 C T Синонимичный c.4341G>A p.(Val1447=) 0.43 0.01 0.00 0.00

166854686 C T Интронный c.4339-1G>A p.? 0.02 1.00 0.00 0.00

166854686 C A Интронный c.4339-1G>T p.? 0.24 1.00 0.00 0.00

166854690 C T Интронный c.4339-5G>A p? 0.97 0.05 0.00 0.00

166854699 A C Интронный c.4339-14T>G p? 0.55 0.24 0.00 0.00

166854701 A C Интронный c.4339-16T>G p? 0.61 0.03 0.00 0.00

166856228 C G Интронный c.4338+5G>C p? 0.00 0.00 0.01 0.77

166856228 C T Интронный c.4338+5G>A p? 0.00 0.00 0.01 0.56

166856232 C T Интронный c.4338+1G>A p? 0.00 0.00 0.09 0.97

166856232 C A Интронный c.4338+1G>T p? 0.00 0.00 0.06 0.99

166856232 C G Интронный c.4338+1G>C p? 0.00 0.00 0.15 0.99

GGCC

166856284 TATT AAGA A - Делеция c.4285-10_4287del p? 0.10 0.99 0.00 0.60

166856284 GGC - Делеция c.4285 4287del p.(Ala1429del) 0.94 0.99 0.00 0.04

166856286 C A Миссенс c.4285G>T p.(Ala1429Ser) 0.02 0.43 0.00 0.00

166856287 C T Интронный c.4285-1G>A p? 0.21 0.99 0.00 0.00

166856288 T C Интронный c.4285-2A>G p? 0.08 0.99 0.00 0.00

166856289 A C Интронный c.4285-3T>G p? 0.44 0.90 0.00 0.00

166856290 T C Интронный c.4285-4A>G p.? 0.79 0.30 0.00 0.00

166858977 C T Интронный c.4284+5G>A p.? 0.00 0.00 0.26 0.92

166858978 T A Интронный c.4284+4A>T p.? 0.00 0.00 0.21 0.77

166858978 T G Интронный c.4284+4A>C p? 0.00 0.00 0.11 0.56

166858980 A - Интронный c.4284+2del p? 0.00 0.00 0.16 0.93

166858980 A G Интронный c.4284+2T>C p? 0.00 0.00 0.20 0.93

166858981 C T Интронный c.4284+1G>A p? 0.00 0.00 0.23 0.93

166858981 C G Интронный c.4284+1G>C p? 0.00 0.00 0.24 0.93