Исследование механизма транс-сплайсинга у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Уткина Марина Валерьевна

• Уткина Марина Валерьевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Уткина Марина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Тезисы конференций

Личное участие автора в проведении исследований

Структура и объем работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие представления о транскрипции

1.2 Сплайсинг

1.3 Последовательность событий при сплайсинге

1.4 РНК-РНК взаимодействия внутри сплайсосомы

1.5 Альтернативный сплайсинг

1.6 БЬ транс-сплайсинг

1.6.1 8Ь транс-сплайсинг у трипаносом

1.6.2 8Ь транс-сплайсинг у нематод

1.6.3 8Ь транс-сплайсинг у динофлагеллят и оболочников

1.7 Межгенный транс-сплайсинг

1.7.1 Транс-сплайсинг в локусе

1.7.2 Транс-сплайсинг в локусе mod(mdg4)

1.7.3 Модели транс-сплайсинга

1.8 Процессинг 3'-конца РНК

1.9 Процессинг 3'-конца мРНК белок-кодирующих генов у дрожжей

1.10 Процессинг 3'-конца некодирующих РНК (нкРНК) у дрожжей

1.10.1 Rnt1- и Reb1-комплекс

1.10.2 Нонсенс-зависимая деградация (ЫЫВ) нкРНК

1.11 Процессинг З'-конца мРНК белок-кодирующих генов у многоклеточных животных

1.12 Процессинг З'-конца гистоновой мРНК у многоклеточных животных

1.13 Процессинг З'-конца мяРНК у многоклеточных животных

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты

2.2 Методы работы с E.coli

2.2.1 Получение компетентных клеток

2.2.2 Трансформация компетентных клеток

2.3 Методы работы с ДНК

2.3.1 Выделение плазмидной ДНК из большого объема среды (Maxiprep)

2.3.2 Выделение плазмидной ДНК из маленького объема среды (Miniprep)

2.3.3 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

2.3.4 Лигирование ДНК

2.3.5 Тупление липких концов плазмидной ДНК

2.3.6 Дефосфорилирование 5'-концов ДНК

2.3.7 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3.8 Выделение ДНК из агарозного геля

2.3.9 Переосаждение ДНК

2.3.10 Скринирование бактериальных колоний с помощью ПЦР

2.3.11 Выделение геномной ДНК из D.melanogaster

2.4 Создание генно-инженерной конструкции

2.4.1 Плазмиды, содержащие донорные конструкции

2.4.2 Плазмиды, содержащие акцепторные конструкции

2.4.3 Плазмиды с бицистронной модельной системой

2.4.4 Плазмиды для редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9

2.4.5 Плазмиды, содержащие различные инсуляторы

2.5 Методы работы с РНК

2.5.1 Выделение тотальной РНК из D.melanogaster

2.5.2 Обработка препарата РНК ДНКазой I

2.5.3 Выделение тотальной РНК из S2 клеток

2.5.4 Разделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК

2.6 Количественная ПЦР (кПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени

2.6.1 Обратная транскрипция

2.6.2 ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени с использованием интеркалирующих флуоресцентных красителей

2.6.3 ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени с использованием Tagman-проб

2.7 Методы работы с культурой Б2-клеток D.melanogaster

2.7.1 Культура S2-клеток

2.7.2 Трансфекция S2-клеток

2.8 Измерение активности люцифераз

2.9 Методы работы с линиями мух

2.9.1 Получение трансгенных линий дрозофил

2.9.2 Редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9

2.9.3 Генетические скрещивания

2.10 3'Каее c последующим секвенированием

2.11 Анализ полногеномных данных

2.12 Компьютерные методы

2.12.1 Определение консервативности интрона

2.13 Иммунопреципитация хроматина

2.13.1 Фиксация и выделение хроматина из имаго

2.13.2 Иммунопреципитация хроматина (CHIP - chromatin immunoprecipitation)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Модель транс-сплайсинга в локусе mod(mdg4) у Drosophila melanogaster

3.2 В интроне 4 локуса mod(mdg4) происходит терминация транскрипции

3.3 В интроне 4 находятся участки, в которых происходит остановка РНКП II

3.4 В дистальной части интрона 4 находится промотор, который нужен для транскрипции альтернативного экзона

3.5 Идентификация консервативных участков в интроне 4 локуса mod (mdg4)

3.6 Картирование участков в интроне 4, которые необходимы для осуществления транс-сплайсинга

3.6.1 Создание модельной системы для идентификации транс-сплайсинга в трансгенных линиях дрозофил

3.6.2 Картирование районов в интроне 4, которые влияют на эффективность транссплайсинга

3.7 Делеция c73 снижает эффективность транс-сплайсинга в нативном локусе mod(mdg4) in vivo

3.8 Исследование терминации транскрипции в модельной системе, содержащей

scs - инсулятор

3.9 Консервативные последовательности участков efg индуцируют терминацию транскрипции

3.10 Выявление значимого для терминации транскрипции участка в области efg

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

Act5C - актиновый промотор CBC - кэп-связывающий комплекс

CID - консервативный домен, взаимодействующий c CTD РНКП II CPF - CF-комплекс расщепления (CF) и полиаденилирования (CPF)

CRE-рекомбиназа - модифицированный фермент из бактериофага P1, осуществляющий обмен

участками ДНК по специфическим последовательностям, которые называются loxP сайтами

CTD - C-концевой домен большой субъединицы РНКП II

CUTs - латентные нестабильные транскрипты

DSE - дистальный элемент промотора

DSIF - DRB-чувствительный фактор

DUTs - Dicer-чувствительные нестабильные транскрипты

fluc - ген люциферазы североамериканского светлячка Photinuspyralis

GAL4 - дрожжевой транскрипционный активатор

IgG - преиммунная сыворотка

input - образец до иммунопреципитации

INT - интегратор

IRES - сайта внутренней инициации трансляции из гена reaper

NMD - нонсенс-зависимая деградация

PABPN1 - поли(А)-связывающий белок

PAP - поли(А)-полимераза

PSE - проксимальный элемент промотора

rluc - ген люциферазы коралла Renilla reniformis

RUTs - Reb1-зависимые нестабильные транскрипты

SL-РНК - сплайсирующаяся лидерная РНК (Splice Leader RNA)

SS - сплайс-сайт

SUTs - стабильные неохарактеризованные транскрипты

UAS - промотор, который активируется фактором GAL4

XUTs - Xm1-зависимые нестабильные транскрипты

У(п)/ППП - полипиримидиновая последовательность

ИСС - интронный супрессор сплайсинга

ИЭС - интронный энхансер сплайсинга

кПЦР - количественная полимеразно-цепная реакция

КРГ - комплекс расщепления гистонов

Кэп - 7-метилгуанозин

мякРНК - малая ядрышковая РНК

мяРНК - малая ядерная РНК

мяРНП - малые ядерные рибонуклеопротеины

нкРНК - некодирующая РНК

НТО - нетранслируемая область

РНКП II - РНК-полимераза II

рРНК - рибосомная РНК

ТАТА-последовательность - консервативный мотив ДНК, с которым связываются

транскрипционные факторы, привлекающие РНК-полимеразу к старту транскрипции

ТВ - точка ветвления

ЭСС - экзонный супрессор сплайсинга

ЭЭС - экзонный энхансер сплайсинга

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма транс-сплайсинга у Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Сплайсинг - это котранскрипционный процесс, необходимый для образования зрелой мРНК, впервые был обнаружен в конце 1970-х годов. Существуют два варианта сплайсинга: цис-сплайсинг и транс-сплайсинг. Цис-сплайсинг - это процесс, при котором происходит вырезание интронов из пре-мРНК и сшивание экзонов между собой. Одним из вариантов цис-сплайсинга является альтернативный сплайсинг. Альтернативный сплайсинг представляет собой процесс, в котором экзоны могут быть включены или исключены в различных комбинациях, что значительно увеличивает разнообразие транскриптов мРНК и, следовательно, белков, кодируемых одним геном (Maarten M. G. et al., 2016).

У некоторых эукариот, включая нематод, трипаносом и коловраток, был обнаружен еще один вариант сплайсинга - транс-сплайсинг (SL-транс-сплайсинг), при котором происходит присоединение сплайсирующейся лидерной РНК (SL-РНК) к 5'-концу белок-кодирующих РНК (Lasda and Blumenthal, 2011). SL-РНК - это короткая молекула (45-140 н.о.), содержащая донорный сайт сплайсинга (5'SS/tss). Все SL-РНК на 5'-конце содержат одинаковую последовательность, называемую «лидером сплайсинга» (Splice Leader или SL-последовательность). Механизм SL транс-сплайсинга похож на обычный механизм сплайсинга пре-мРНК, за исключением того, что SL-РНК выступает одновременно в качестве донора экзона и вместо U1 мяРНК (Yang et al., 2017).

Существует и другой тип транс-сплайсинга, при котором происходит объединение экзонов, находящихся на разных пре-мРНК. В настоящее время единственные достоверные примеры такого варианта транс-сплайсинга были описаны в локусах mod(mdg4) и lola Drosophila melanogaster. Оба локуса кодируют 20-30 изоформ белков, которые отличаются по С-концевому домену. В локусе mod(mdg4) вариабельные домены кодируются 31 экзонами, находящимися на независимо транскрибируемых транскриптах. При образовании зрелых мРНК происходит объединение экзонов пре-мРНК, кодирующих общую часть белков и молекул пре-мРНК, которые кодируют один из вариантов С-концевого домена белка. Аналогичным образом происходит объединение экзонов, кодирующих общую часть белка lola, и одного из 22 экзонов, кодирующих вариабельную часть белка (Lei et al., 2016). Примеры локусов mod(mdg4) и lola демонстрируют, что транс-сплайсинг является эффективным способом создания одновременно большого количества изоформ белка. С другой стороны, транс-сплайсинг обычно полностью супрессируется при транскрипции генов, так как он приводил бы к формированию случайных химерных мРНК, кодирующих неправильные белки. Супрессия транс-сплайсинга

обеспечивается сопряжением транскрипции и сплайсинга интронов, в результате которого после окончания синтеза РНК почти все интроны уже удалены. Обычно транс-сплайсинг между случайными пре-мРНК наблюдается в клетках, имеющих значительные нарушения в регуляции транскрипции, возникшие в результате стрессов или малигнизации. Таким образом, локусы mod(mdg4) и lola представляют собой уникальную модель для исследования механизмов, которые приводят к транс-сплайсингу у высших эукариот. Предварительные данные демонстрируют, что все многочисленные альтернативные мРНК, синтезируемые в этих локусах, являются следствием транс-сплайсинга, что предполагает существование стабильных и эффективных механизмов этого процесса (Lasda and Blumenthal, 2011). Следовательно, выяснение механизма транс-сплайсинга в гене mod(mdg4) может значительно расширить общее понимание процессов сплайсинга и его регуляции. Однако до последнего времени не предпринималось попыток выяснения механизмов транс-сплайсинга. Это можно объяснить отсутствием адекватных модельных систем для исследования этого процесса. Вследствие этого целью настоящей работы стало создание удобных и адекватных модельных систем для исследования транс-сплайсинга на примере локуса mod(mdg4) у Drosophila melanogaster. При этом основной стратегией для разработки модельных систем было использование недавно появившихся новых методов редактирования геномов. Удобные модельные системы позволяют не только картировать регуляторные элементы, определяющие транс-сплайсинг в локусе mod(mdg4) , но и понять механизмы этого процесса.

В ходе выполнения проекта были созданы модельные системы и проведены биохимические, генетические и биоинформатические исследования, с помощью которых были получены первые результаты, позволяющие понять природу процессов, с помощью которых происходит транс-сплайсинг.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является идентификация регуляторных последовательностей в интроне 4, необходимых для осуществления транс-сплайсинга в локусе mod(mdg4) Drosophila melanogaster. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать с помощью различных методов профиль транскрипции и распределение РНК-полимеразы II внутри интрона 4, расположенного после последнего конститутивного экзона в локусе mod(mdg4).

2. Создать модельную систему, позволяющую картировать участки ДНК в интроне 4, которые необходимы для транс-сплайсинга.

3. С помощью разработанной модельной системы картировать последовательности ДНК в интроне 4, которые значимы для транс-сплайсинга.

4. Подтвердить in vivo необходимость найденных элементов для транс-сплайсинга в локусе mod(mdg4) с помощью направленного редактирования генома.

5. Картировать последовательности ДНК, которые участвуют в терминации транскрипции, используя различные модельные системы. Выявить особенности терминации транскрипции внутри интрона 4.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В данной научной работе показано, что для осуществления транс-сплайсинга в локусе mod(mdg4) у Drosophila melanogaster необходим интрон, распложенный после последнего конститутивного экзона (интрон 4). Для поиска регуляторных последовательностей в интроне 4 была создана модельная система. Данная модельная система позволяла картировать участки ДНК, необходимые для осуществления транс-сплайсинга. Был найден 73-нуклеотидный участок из интрона 4, необходимый для осуществления транс-сплайсинга. Показана необходимость данного участка для транс-сплайсинга в эндогенном локусе mod(mdg4). В данной работе был проведен анализ консервативности участков интрона 4 среди семейства Drosophilidae и в подроде Sophophora. Найденный 73-нуклетидный участок является одним из наиболее консервативных фрагментов.

Показано, что в интроне 4 происходит терминация транскрипции. Также обнаружен участок, необходимый для осуществления терминации транскрипции в интроне 4. В работе приведены данные, подтверждающие, что участок, необходимый для осуществления терминации транскрипции, работает не только в интроне 4, но и в гетерологичных интронах. Также в работе показано, что данный участок осуществляет терминацию транскрипции с помощь поли(А)-независимого механизма.

Наша работа вносит существенный вклад в развитие представлений о механизме транссплайсинга. Полученные данные помогут разобраться в механизме транс-сплайсинга и расширяют представление о механизмах транскрипции.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики (выделение ДНК и РНК, молекулярное клонирование, кПЦР в реальном времени, получение трансгенных линий D.melanogaster, иммунопреципитация хроматина,

3'Race с последующим секвенированием), а также биоинформатики (анализ полногеномных данных, определение консервативности последовательности).

Положения, выносимые на защиту

1. В интроне 4 локуса mod(mdg4) осуществляется поли(А)-независимая терминация транскрипции, что приводит к появлению транскриптов, не имеющих поли(А)-хвостов на З'-конце.

2. Высококонсервативная последовательность, найденная у всех видов семейства Drosophilidae, индуцирует терминацию транскрипции. Идентифицированная последовательность выступает в качестве терминатора транскрипции вне зависимости от окружающих его ДНК-элементов. Данная последовательность обладает выраженной вторичной структурой, представленной шпилькой с двумя внутренними петлями. РНК, образующаяся за счет терминации на найденной последовательности, задерживается в ядре и не экспортируется в цитоплазму.

3. Создана модельная система в трансгенных линиях дрозофил, которая позволяет идентифицировать эффективность транс-сплайсинга и картировать участки ДНК, которые имеют функциональное значение в транс-сплайсинге.

4. Делеция 73-нуклеотидного участка из интрона 4 локуса mod(mdg4) приводит к значимому снижению эффективности транс-сплайсинга.

5. С помощью направленного редактирования генома было показано, что делеция 73 п. н. участка значительно снижает эффективность транс-сплайсинга в эндогенном локусе mod(mdg4).

Степень достоверности и апробация результатов

Все результаты работы, представленные к защите, являются составными частями статей, опубликованных в двух рецензируемых научных журналах, и представлены на двух научных конференциях. Цель, поставленная в работе, достигнута.

Публикации

1. Tikhonov, M., Utkina, M., Maksimenko, O., and Georgiev, P. Conserved sequences in the Drosophila mod(mdg4) intron promote poly(A)-independent transcription termination and trans-splicing // Nucleic Acids Res. 2018 Aug 9. Vol. 46, № 20. P. 10608-10618.

2. О. В. Кырчанова, Д. В. Леман, С. В. Тощаков, М. В. Уткина, М. В. Тихонов, А. Ф. Паршиков, О. Г. Максименко, П. Г. Георгиев. Индукция транскрипции через scs-инсулятор

приводит к аномалиям развития Бго8орЫ1а ше1апо§аБ1ег // Генетика. - 2016. - Том 52. - № 10 -С. 1117-1125.

Тезисы конференций

1. М. В. Уткина, О. Г. Максименко, П. Г. Георгиев, М. В. Тихонов. Исследование механизма транс-сплайсинга у Drosophila melanogaster. // XXIX Зимняя молодежная научная школа «ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ», Москва, 7-10 февраля 2017 г. - С. 34.

2. М. В. Уткина, М. В. Тихонов, О. Г. Максименко, П. Г. Георгиев. Поиск регуляторных элементов, необходимых для транс-сплайсинга у Drosophila melanogaster. // 21-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Россия 17-21 апреля 2017 г. - С. 121.

Личное участие автора в проведении исследований

Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований. Все ключевые эксперименты (выделение тотальной РНК, количественная ПЦР (кПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени, постановка различных экспериментов на культуре Б2-клеток, генетические скрещивания и т. д.) были выполнены автором. Также автор внес вклад в подготовку и редактирование научных публикаций по теме диссертации. Некоторые эксперименты были осуществлены совместно с коллегами. Создание генно-инженерных конструкций было выполнено совместно с руководителем проекта М. В. Тихоновым. Иммунопреципитация хроматина была проведена О. Г. Максименко. З^асе был выполнен М. В. Тихоновым. Подготовку библиотек ДНК для секвенирования сделала О. Г. Максименко. Секвенирование библиотек ДНК было выполнено в МГУ им. Ломоносова.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»), заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 132 страницах, содержит 54 рисунка и 8 таблиц. Список литературы включает 134 источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общие представления о транскрипции

Транскрипция - это один из этапов экспрессии генов и реализации генетической информации, включающий три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию (Рисунок 1).

Сама по себе транскрипция не является обособленным процессом, а функционально связана со всеми стадиями созревания мРНК, к которым относятся 5'-кэпирование, сплайсинг, расщепление и полиаденилирование З'-конца РНК. Транскрипция и процессы созревания РНК происходят одновременно и осуществляются с помощью макромолекулярного комплекса. Эукариот РНК-полимераза II (РНКП II) отвечает за синтез всех белок-кодирующих РНК и большинства некодирующих РНК. РНКП II представляет собой белковый комплекс массой 550 кДа, состоящий из 12 коровых субъединиц (Rpb1-12). Самая большая субъединица РНКП II, Rpb1, содержит C-концевой домен (CTD), который необходим для осуществления всех основных этапов транскрипции, а также для привлечения факторов сплайсинга и факторов расщепления/полиаденилирования (Shukla and Oberdoerffer, 2012). CTD состоит из тандемных повторов семи аминокислотных остатков Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7 (26 повторов у дрожжей и 52 повтора у людей). CTD претерпевает несколько посттрансляционных модификаций, в частности фосфорилирование остатков Tyr1, Ser2, Ser5, Ser7 и Thr4. Фосфорилирование остатков Ser5 имеет важное значение для присоединения 7-метилгуанозина (кэп) на 5'-конец транскрипта, а фосфорилирование остатков Ser2 необходимо для привлечения факторов расщепления/полиаденилирования на З'-конец пре-мРНК (Licatalosi et al., 2002), а также для осуществления сплайсинга (Kuehner, Pearson, and Moore 2011).

Во время транскрипции на РНКП II влияют различные факторы, которые определяют скорость движения РНКП II вдоль гена. Замедление РНКП II часто коррелирует с началом сплайсинга (Alexander et al., 2010). РНКП II, замедляясь или останавливаясь на экзонах, обеспечивает сборку сплайсосомного комплекса на пре-мРНК. В ранних моделях предполагалось, что сплайсинг пространственно разделен с другими этапами транскрипции. Однако было обнаружено, что сплайсинг происходит непосредственно в процессе синтеза РНК, то есть котранскрипционно (Chan et al., 2011).

О >—► Ф

~1-4кб в минуту

Рисунок 1 - Схема транскрипции гена и котранскрипционных процессов созревания мРНК. Старт начала транскрипции обозначен зеленым флажком. Синтезирующийся транскрипт обозначен красным цветом. Рисунок взят и адаптирован из работы Bentley, 2014.

1.2 Сплайсинг

В 1977 г. было сделано открытие, которое показало прерывистость эукариотических генов, которые состоят из белок-кодирующих участков, экзонов и некодирующих участков, интронов (Berget et al., 1977). Это открытие стимулировало исследования, посвященные изучению роли интронов в геноме. Исходно считали, что интрон - это «мусорная ДНК», однако затем эти представления изменились, и в настоящее время показано, что интроны обладают важными функциями в экспрессии генов, создании разнообразия белковых изоформ и в эволюции генов эукариот.

Вырезание интронов из пре-мРНК осуществляется с помощью сплайсинга (Shukla and Oberdoerffer, 2012). Сплайсинг является важным этапом в регуляции экспрессии генов, за счет которого значительно расширяется функциональный протеом эукариотических организмов с использованием сравнительно небольшого количества генов. (Lee and Rio, 2015). У человека сплайсингу подвергается ~ 95-100% генов, у мыши ~ 63%, а у Drosophila ~ 45% (Merkin et al., 2012). Сплайсинг представляет собой котранскрипционный процесс, при котором происходит вырезание из пре-мРНК интронов и сшивание экзонов, находящихся в одной молекуле (Рисунок 2 А). Существует два варианта сплайсинга: цис-сплайсинг и транс-сплайсинг. При цис-сплайсинге происходит формирование зрелой мРНК за счет вырезания интронов и сшивание экзонов, находящихся на одном предшественнике мРНК. Отличие транс-сплайсинга

от цис-сплаисинга заключается в том, что при транс-сплаисинге происходит сшивание экзонов, расположенных на разных молекулах пре-мРНК (Gabler et al., 2005).

(А) Цис-сплайсинг (Б SL транс-сплайсинг

5' 3'

SS . SS

5' 3'

SS . SS

(В Межгенный транс-сплайсинг

I-г

Рисунок 2 - Типы сплайсинга. А) Цис-сплайсинг, Б) SL транс-сплайсинг, В) Межгенный транссплайсинг. Синими и розовыми прямоугольниками обозначены экзоны. Черной полосой обозначены интроны. Сайты сплайсинга обозначены 5'SS, 3'SS, 5'tss, 3'tss. Рисунок взят и адаптирован из работы Lasda and Blumenthal, 2011.

Как правило, сплайсинг интронов осуществляется последовательно. А диссоциация созревшей мРНК из транскрипционного комплекса происходит только после сплайсинга всех интронов в транскрипте. Таким образом, блокируется возможность объединения экзонов, принадлежащих двум разным генам (транс-сплайсинг), которая могла бы приводить к синтезу случайных химерных белков. Поэтому транс-сплайсинг является редким событием. Однако примеры транс-сплайсинга известны. Наиболее распространенным в природе вариантом транссплайсинга является присоединение лидерной SL РНК к большому количеству различных пре-мРНК (Рисунок 2 Б). Впервые такой тип сплайсинга был обнаружен у семейства Трипаносоматиды. Позднее было показано, что с помощью такого же механизма формируется большая часть мРНК у нематод, эвгленовых, трематод, оболочников и динофлагеллят (Lasda and Blumenthal, 2011).

Второй вариант транс-сплайсинга заключается в объединении в одну молекулу мРНК экзонов из разных транскриптов (Рисунок 2 В). У млекопитающих этот вариант транссплайсинга наблюдается только при нарушениях в нормальном функционировании клеток, часто при их превращении в раковые клетки. Однако у дрозофилы был описан аналогичный вариант транс-сплайсинга для двух локусов mod(mdg4) и lola.

1.3 Последовательность событий при сплайсинге

Сплайсинг осуществляется за счет сборки большого и высокодинамичного комплекса рибонуклеопротеинов, называемого сплайсосомой. В клетках эукариот работают две уникальные сплайсосомы: и2-зависимая сплайсосома, которая катализирует вырезание интронов типа U2 и менее распространённая Ш2-зависимая сплайсосома, которая присутствует только у некоторых групп эукариот и сплайсирует редкий класс интронов типа U12 (Patel and Steitz, 2003). Далее будет рассматриваться структура U2-зависимой сплайсосомы, так как она наиболее изучена и осуществляет вырезание наиболее распространенной группы интронов генов.

Интроны, вырезаемые U2-зависимой сплайсосомой, имеют схожую структуру. Большинство интронов содержат консервативные последовательности на 5'- и на 3'-концах и точку ветвления (ТВ). Консервативные последовательности на 5'- и на З'-концах интрона называются сайтами сплайсинга (SS) и представляют собой последовательности GU/GC и AG соответственно. Точка ветвления располагается на расстоянии 18-40 нуклеотидов от 3'SS. У высших эукариот после ТВ следует полипиримидиновая последовательность (Y(n)/111111) (Рисунок 3) (Abebrese et al., 2017). Также имеются дополнительные элементы: интронные энхансеры сплайсинга (ИЭС) и интронные супрессоры сплайсинга (ИСС). Они, как правило, представляют короткие последовательности, которые за счет связывания с регуляторными белками стимулируют или подавляют сборку сплайсосомного комплекса (Wang and Burge, 2008).

5'SS Т0ЧКа ППП 3'SS

ветвления

экзон GURAGU- - YNCURAC Y(n) YAG экзон 1,

экзон GUAUGU- - UACUAAC YAG экзон [

многоклеточные эукариоты

дрожжи

Рисунок 3 - Схема строения интрона у многоклеточных эукариот и дрожжей. ППП -полипиримидиновая последовательность. Рисунок взят и адаптирован из работы Will and Luhrmann, 2011.

Сплайсосома состоит из рибонуклеопротеинов U1, U2, U5 и U4:U6 (мяРНП) и около 70 белков. мяРНП состоят из мяРНК, семи Sm-белков (B/B', D3, D2, D1, E, F и G). Каждая мяРНК формирует вторичную структуру. Сплайсосома поочередно собирается на каждом интроне пре-мРНК и претерпевает обширные конформационные и композиционные изменения (Рисунок 4 Б) (Wahl et al., 2009).

5'SS

3'SS

P TBi

он

*qw\i ¿v

5'SS

V Ветвление

--[zzi3'i

3'SS

Атака 3'SS

— LZ=D3

Ол

мРНК

ТВ

1GU-A-AG« пре-MPHK

интрон

г

КомплексЕ

Ргр5 UAP56/ Sub2

Комплекс А

пре-В комплекс

U4/U6-U5 мяРНП

Комплекс В

Лигирование экзонов

мРНК

Ргр22

Комплекс Р

Лигирование экзонов

Комплексе

РФ16

Комплексе

Комплекс В

Комплекс В

Рисунок 4 - А) Два основных этапа сплайсинга пре-мРНК. Б) Каталитический цикл сплайсосомы. Рисунок взят и адаптирован из работы Fica and Nagai, 2017.

Интроны из пре-мРНК вырезаются с помощью двух последовательных реакций: ветвления и лигирования экзонов (Рисунок 4 А). На первом этапе 2'-OH консервативного аденозина из точки ветвления выполняет нуклеофильную атаку 5'SS, чтобы образовать свободный З'-конец экзона и циклическое промежуточное соединение. При лигировании экзонов гидроксильная группа З'-конца экзона атакует фосфат на 3'SS для соединения экзонов и вырезания интронов (Will and Luhrmann, 2011).

Формирование сплайсосомы начинается на экзоне - этот процесс называется определением экзона. Во время определения экзона U1 мяРНП связывается с 5'SS, а белок U2AF взаимодействует с полипиримидиновой последовательностью. Это, в свою очередь, приводит к рекрутированию U2 мяРНП на ТВ. Далее последовательность, усиливающая сплайсинг (ЭЭС-экзонный энхансер сплайсинга), привлекает белки из SR-семейства, которые необходимы для стабилизации сплайсосомы (Will and Lührmann, 2011). В результате происходит формирование комплекса А. Комплекс А взаимодействует с U4/U5/U6, и в результате образуется пре-В комплекс (Рисунок 4 Б).

Для формирования комплекса В из пре-В комплекса необходимо высвобождение U1 и перемещение U6 на 5'SS. Перемещение U6 на 5'SS в стабильном комплексе В осуществляет АТФ-азы, Ppr28 (Рисунок 4 Б). В стабильном комплексе В за счет комплементарных взаимодействий формируется спираль между U2 и U6 РНК, которая удерживает U2 и U4/U5/U6 комплекс вместе. Далее осуществляется выход U4 из сплайсосомного комплекса за счет РНК хеликазы Brr2. Активный сайт на N-конце РНК хеликазы Brr2 связывается с одноцепочечным участком U4 и начинает перемещаться вдоль него, расплетая дуплекс U4/U6. Это приводит к удалению U4 из комплекса В и к образованию B активированного (Bact) комплекса, в котором начинает формироваться активный сайт сплайсосомы (Рисунок 4 Б) (Plaschka et al., 2017).

Bact комплекс связывается с фактором Prp19 из комплекса NTC. Prp19 необходим для стабилизации структур РНК внутри сплайсосомы (Chan and Cheng, 2005). Некоторые факторы комплекса NTC, такие как Cwc24, могут заменять белки комплекса B и осуществлять распознавание 5'SS, а также осуществлять переходы между В и Bact комплексами (Wu et al., 2017).

Далее Bact комплекс связывается с РНК -хеликазой Prp2, что приводит к формированию комплекса B*. Комплекс B* осуществляет первую из двух реакций сплайсинга - ветвление: соединение ТВ с 5'SS (Рисунок 4 Б) (Semlow et al., 2016). После первой каталитической реакции сплайсинга происходит образование комплекса C. Затем АТФ-аза Prp16 осуществляет диссоциацию белковых факторов, необходимых для предыдущей стадии ветвления и размещает 3'SS в активном сайте с помощью факторов лигирования экзонов Slu7 и Prp18 (James et al., 2002). 5' - и 3'-концы экзонов сближаются с помощью U5 мяРНК. Это приводит к формированию комплекса C*, который выполняет вторую каталитическую реакцию - лигирование экзонов (Рисунок 4 Б). Затем АТФаза Prp22 высвобождает мРНК из каталитического центра сплайсосомы (Schwer, 2008), а

АТФазы Prp43 и Brr2 осуществляют диссоциацию компонентов сплайсосомы (Tsai et al.

2005).

1.4 РНК-РНК взаимодействия внутри сплайсосомы

Во время работы сплайсосомы каталитический центр формируется за счет РНК-РНК-взаимодействий. Каталитический центр сплайсосомы формируется при переходе из пре-В комплекса в Bact комплекс: U1 и U4 высвобождаются из сплайсосомы, а U6 и U2 формируют новые взаимодействия (Рисунок 4 Б). Считается, что важную функцию в сплайсинге играют именно взаимодействия между U2 и U6. Существует несколько моделей взаимодействий U2 и U6. В первой модели в активном центре формируется шпилька (ISL) и межмолекулярные спирали Ia, Ib и II между U2 и U6 (Рисунок 5 А, Б). Консервативный триплет U6 (A59, G60, C61) комплементарно взаимодействует с последовательностью нуклеотидов U2, при этом происходит формирование спирали Ib и образование сайтов связывания для двух ионов Mg2+ (Yean et al., 2000). В альтернативной модели AGC не взаимодействует с U2, а связывается с нуклеотидами U6 (Sashital et al., 2004).

А Б

А - U

U5 мяРНК{]

. с и и

G

с А^ ACAGAGA спирал tCjjj

СА | > |

AUACAGAn

I•I II I I \

aaUCUGUAUGvG интро^^ис

и А Iм1^11I д и UUACUACA^CUAG UCG-

Я II I I I II I \д Д1 I . ^

и cUAUGA4'GMGp la lb

V Спираль U ' G VAG

t g

с

"C-o

U6 mPHK -u ISL

U-A G-C А С

gjulua СпиральИ

CAAAGAGAUUU 11 i i 1111 11 i GUUUCUCUAAG

JUUC(

С Ч1 G- U U С A U

З'экзон

U2 мяРНК

Рисунок 5 - А) Динамика РНК-РНК взаимодействий в сплайсосоме. Рисунок взят и адаптирован из работы Will and Luhrmann, 2011. Б) Схема РНК-РНК взаимодействий в сплайсосоме при формировании активного центра в Bact комплексе. Рисунок взят и адаптирован из работы Fica and Nagai, 2017.

Были изучены и другие взаимодействия в активном центре сплайсосомы (Рисунок 5). Было показано, что первые шесть нуклеотидов интрона GUAUGU спариваются с нуклеотидами ACAGAGA U6, благодаря чему происходит размещение 5'SS в активном центре сплайсосомы (Galej et al., 2016). Точка ветвления представляет собой консервативную последовательность UACUAAC. Эта консервативная последовательность связывается с U2, что приводит к формированию спирали с выступающим аденозином. Данная спираль удерживается в активном сайте с помощью специфичных белков Cwc25, Yju2 и Isy 1, которые обеспечивают правильное расположение гидроксильной группы аденозина в активном центре. Гидроксильная группа аденозина функционирует как нуклеофил, который атакует 5'SS (Fica and Nagai, 2017).

Также было показано, что в комплексе С 5'- и З'-концы экзона связываются с U5, это необходимо для того, чтобы З'-OH группа 5'-экзона атаковала 3'SS и произошел второй этап -лигирование экзонов (Turner et al., 2004).

Есть данные о том, что U1 может играть роль в процессинге З'-конца мРНК. Более половины генов млекопитающих содержат несколько поли(А)-сигналов. Большинство поли(А)-сигналов располагаются в З'-нетранслируемая область (З'-НТО) мРНК и в интронах. Недавние исследования показали, что при блокировании функций U1 мяРНП происходит терминация транскрипции в интронах генов на нефункциональных в обычных условиях сигналах полиаденилирования. Действие U1 мяРНП на поли(А) сайты возможно обеспечивается за счет того, что в его состав входит белок U1-70K, который взаимодействует с поли(А)-полимеразой (PAP) и ингибирует ее на 5'SS (Berg et al., 2012). А если все-таки по каким-либо причинам произошло расщепление и полиаденилирование транскрипта, то транскрипты, меченные U1 мяРНП, разрушаются экзосомой (Chiu et al., 2018).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Уткина Марина Валерьевна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abebrese, E. L., Ali, S. H., Arnold, Z. R., Andrews, V. M., Armstrong, K., Burns, L., Crowder, H. R., Day, R. T., Hsu, D. G., Jarrell, K., et al. (2017). Identification of human short introns. PloS One 12, e0175393.

2. Aibara, S., Gordon, J. M. B., Riesterer, A. S., McLaughlin, S. H., Stewart, M. (2017). Structural basis for the dimerization of Nab2 generated by RNA binding provides insight into its contribution to both poly(A) tail length determination and transcript compaction in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 45, 1529-1538.

3. Alexander, R. D., Innocente, S. A., Barrass, J. D., and Beggs, J. D. (2010). Splicing-dependent RNA polymerase pausing in yeast. Mol. Cell 40, 582-593.

4. Almada, A. E., Wu, X., Kriz, A. J., Burge, C. B., and Sharp, P. A. (2013). Promoter directionality is controlled by U1 snRNP and polyadenylation signals. Nature 499, 360-363.

5. Andersen, P. R., Domanski, M., Kristiansen, M. S., Storvall, H., Ntini, E., Verheggen, C., Schein, A., Bunkenborg, J., Poser, I., Hallais, M., et al. (2013). The human cap-binding complex is functionally connected to the nuclear RNA exosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1367-1376.

6. Atkinson, S. R., Marguerat, S., Bitton, D. A., Rodríguez-López, M., Rallis, C., Lemay, J.-F., Cotobal, C., Malecki, M., Smialowski, P., Mata, J., Korber, P., Bachand, F., Bähler, J. (2018). Long noncoding RNA repertoire and targeting by nuclear exosome, cytoplasmic exonuclease, and RNAi in fission yeast. RNA 24, 1195-1213.

7. Arndt, K. M., and Reines, D. (2015). Termination of Transcription of Short Noncoding RNAs by RNA Polymerase II. Annu. Rev. Biochem. 84, 381-404.

8. Aznarez, I., Nomakuchi, T. T., Tetenbaum-Novatt, J., Rahman, M. A., Fregoso, O., Rees, H., and Krainer, A. R. (2018). Mechanism of Nonsense-Mediated mRNA Decay Stimulation by Splicing Factor SRSF1. Cell Rep. 23, 2186-2198.

9. Bachvaroff, T. R., and Place, A. R. (2008). From stop to start: tandem gene arrangement, copy number and trans-splicing sites in the dinoflagellate Amphidinium carterae. PloS One 3, e2929.

10. Baillat, D., and Wagner, E. J. (2015). Integrator: surprisingly diverse functions in gene expression. Trends Biochem. Sci. 40, 257-264.

11. Bentley, D. L. (2014). Coupling mRNA processing with transcription in time and space. Nat. Rev. Genet. 15, 163-175.

12. Berg, M. G., Singh, L. N., Younis, I., Liu, Q., Pinto, A. M., Kaida, D., Zhang, Z., Cho, S., Sherrill-Mix, S., Wan, L., et al. (2012). U1 snRNP Determines mRNA Length and Regulates Isoform Expression. Cell 150, 53-64.

13. Berget, S. M., Moore, C., and Sharp, P. A. (1977). Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 3171-3175.

14. Blasius, M., Wagner, S. A., Choudhary, C., Bartek, J., and Jackson, S. P. (2014). A quantitative 14-3-3 interaction screen connects the nuclear exosome targeting complex to the DNA damage response. Genes Dev. 28, 1977-1982.

15. Blumenthal, T. (2012). Trans-splicing and operons in C. elegans. WormBook 1-11.

16. Bruzik, J. P., Doren, K. V., Hirsh, D., and Steitz, J. A. (1988). Trans splicing involves a novel form of small nuclear ribonucleoprotein particles. Nature 335, 559-562.

17. Cartegni, L., Chew, S. L., and Krainer, A. R. (2002). Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat. Rev. Genet. 3, 285-298.

18. Casanal, A., Kumar, A., Hill, C. H., Easter, A. D., Emsley, P., Degliesposti, G., Gordiyenko, Y., Santhanam, B., Wolf, J., Wiederhold, K., Dornan, G. L., Skehel, M., Robinson, C. V., Passmore, L. A. (2017). Architecture of eukaryotic mRNA 3'-end processing machinery. Science 358, 1056-1059.

19. Chan, S.-P., and Cheng, S.-C. (2005). The Prp19-associated complex is required for specifying interactions of U5 and U6 with pre-mRNA during spliceosome activation. J. Biol. Chem. 280, 31190-31199.

20. Chan, S., Choi, E.-A., and Shi, Y. (2011). Pre-mRNA 3'-end processing complex assembly and function. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 2, 321-335.

21. Chamieh, H., Ballut, L., Bonneau, F., Le Hir, H. (2008). NMD factors UPF2 and UPF3 bridge UPF1 to the exon junction complex and stimulate its RNA helicase activity. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 85-93.

22. Chen, J., and Wagner, E. J. (2010). snRNA 3' end formation: the dawn of the Integrator complex. Biochem. Soc. Trans. 38, 1082-1087.

23. Chiu, A. C., Suzuki, H. I., Wu, X., Mahat, D. B., Kriz, A. J., and Sharp, P. A. (2018). Transcriptional Pause Sites Delineate Stable Nucleosome-Associated Premature Polyadenylation Suppressed by U1 snRNP. Mol. Cell 69, 648-663. e7.

24. Colin, J., Candelli, T., Porrua, O., Boulay, J., Zhu, C., Lacroute, F., Steinmetz, L. M., and Libri, D. (2014). Roadblock termination by reb1p restricts cryptic and readthrough transcription. Mol. Cell 56, 667-680.

25. Crowner, D., Madden, K., Goeke, S., and Giniger, E. (2002). Lola regulates midline crossing of CNS axons in Drosophila. Development 129, 1317-1325.

26. Dengl, S., and Cramer, P. (2009). Torpedo Nuclease Rati Is Insufficient to Terminate RNA Polymerase II in Vitro. J. Biol. Chem. 284, 21270-21279.

27. Dhir, A., Dhir, S., Proudfoot, N. J., and Jopling, C. L. (2015). Microprocessor mediates transcriptional termination of long noncoding RNA transcripts hosting microRNAs. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 319-327.

28. Dorn, R., Reuter, G., and Loewendorf, A. (2001). Transgene analysis proves mRNA trans-splicing at the complex mod(mdg4) locus in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 97249729.

29. Dunn, E. F., Hammell, C. M., Hodge, C. A., and Cole, C. N. (2005). Yeast poly(A)-binding protein, Pab1, and PAN, a poly(A) nuclease complex recruited by Pab1, connect mRNA biogenesis to export. Genes Dev. 79, 90-103.

30. Fatscher, T., Boehm, V., and Gehring, N. H. (2015). Mechanism, factors, and physiological role of nonsense-mediated mRNA decay. Cell. Mol. Life Sci. CMLS 72, 4523-4544.

31. Fica, S. M., and Nagai, K. (2017). Cryo-electron microscopy snapshots of the spliceosome: structural insights into a dynamic ribonucleoprotein machine. Nat. Struct. Mol. Biol. 24, 791-799.

32. Finkel, J. S., Chinchilla, K., Ursic, D., and Culbertson, M. R. (2010). Sen1p Performs Two Genetically Separable Functions in Transcription and Processing of U5 Small Nuclear RNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 784, 107-118.

33. Fischer, S. E.J., Butler, M. D., Pan, Q., and Ruvkun, G. (2008). Trans-splicing in C. elegans generates the negative RNAi regulator ERI-6/7. Nature 455, 491-496.

34. Gabler, M., Volkmar, M., Weinlich, S., Herbst, A., Dobberthien, P., Sklarss, S., Fanti, L., Pimpinelli, S., Kress, H., Reuter, G., et al. (2005). Trans-splicing of the mod(mdg4) Complex Locus Is Conserved Between the Distantly Related Species Drosophila melanogaster and D. virilis. Genetics 769, 723-736.

35. Galej, W. P., Wilkinson, M. E., Fica, S. M., Oubridge, C., Newman, A. J., and Nagai, K. (2016). Cryo-EM structure of the spliceosome immediately after branching. Nature 537, 197-201.

36. Gao, J.-L., Fan, Y.-J., Wang, X.-Y., Zhang, Y., Pu, J., Li, L., Shao, W., Zhan, S., Hao, J., and Xu, Y.-Z. (2015). A conserved intronic U1 snRNP-binding sequence promotes trans-splicing in Drosophila. Genes Dev. 29, 760-771.

37. Graber, J. H., Salisbury, J., Hutchins, L. N., and Blumenthal, T. (2007). C. elegans sequences that control trans-splicing and operon pre-mRNA processing. RNA 73, 1409-1426.

38. Grzechnik, P., Szczepaniak, S. A., Dhir, S., Pastucha, A., Parslow, H., Matuszek, Z., Mischo, H. E., Kufel, J., Proudfoot, N. J., 2018. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nat. Commun 9.

39. Gudipati, R. K., Neil, H., Feuerbach, F., Malabat, C., and Jacquier, A. (2012a). The yeast RPL9B gene is regulated by modulation between two modes of transcription termination. EMBO J. 31, 2427-2437.

40. Gudipati, R. K., Xu, Z., Lebreton, A., Séraphin, B., Steinmetz, L. M., Jacquier, A., and Libri, D. (2012b). Extensive degradation of RNA precursors by the exosome in wild-type cells. Mol. Cell 48, 409-421.

41. Günzl, A. (2010). The Pre-mRNA Splicing Machinery of Trypanosomes: Complex or Simplified? Eukaryot. Cell 9, 1159-1170.

42. Hastings, K. E. M. (2005). SL trans-splicing: easy come or easy go? Trends Genet. TIG 21, 240-247.

43. Hearne, J. L., Pitula, J. S. (2011). Identification of two spliced leader RNA transcripts from Perkinsus marinus. J. Eukaryot. Microbiol. 58, 266-268.

44. Henriques, T., Gilchrist, D. A., Nechaev, S., Bern, M., Muse, G.W., Burkholder, A., Fargo, D. C., Adelman, K. (2013). Stable pausing by RNA polymerase II provides an opportunity to target and integrate regulatory signals. Mol. Cell 52, 517-528.

45. Hong, D., Park, T., Jeong, S. (2019). Nuclear UPF1 Is Associated with Chromatin for Transcription-Coupled RNA Surveillance. Mol. Cells 42, 523-529.

46. Horiuchi, T., and Aigaki, T. (2006). Alternative trans-splicing: a novel mode of pre-mRNA processing. Biol. Cell 98, 135-140.

47. Horiuchi, T., Giniger, E., and Aigaki, T. (2003). Alternative trans-splicing of constant and variable exons of a Drosophila axon guidance gene, lola. Genes Dev. 17, 2496-2501.

48. James, S.-A., Turner, W., and Schwer, B. (2002). How Slu7 and Prp18 cooperate in the second step of yeast pre-mRNA splicing. RNA N. Y. N 8, 1068-1077.

49. Jackson, C. J., Gornik, S. G., Waller, R. F. (2012). The Mitochondrial Genome and Transcriptome of the Basal Dinoflagellate Hematodinium sp.: Character Evolution within the Highly Derived Mitochondrial Genomes of Dinoflagellates. Genome Biol. Evol. 4, 59-7.

50. Jurado, A. R., Tan, D., Jiao, X., Kiledjian, M., and Tong, L. (2014). Structure and Function of Pre-mRNA 5'-End Capping Quality Control and 3'-End Processing. Biochemistry 53, 1882-1898.

51. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. (2016). Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdiscip Rev RNA 7, 661-682.

52. Khodor, Y. L., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Tang, C.-H. A., Marr, M. T., Rosbash, M. (2011). Nascent-seq indicates widespread cotranscriptional pre-mRNA splicing in Drosophila. Genes Dev. 25, 2502-2512.

53. Kong, Y., Zhou, H., Yu, Y., Chen, L., Hao, P., and Li, X. (2015). The evolutionary landscape of intergenic trans-splicing events in insects. Nat. Commun. 6.

54. Krebs, J. E., Lewin, B., Goldstein, E. S., and Kilpatrick, S. T. (2014). Lewin's GENES XI (Jones & Bartlett Publishers).

55. Krauss, V., Dorn, R. (2004). Evolution of the trans-splicing Drosophila locus mod(mdg4) in several species of Diptera and Lepidoptera. Gene 331, 165-176.

56. Kuehner, J. N., Pearson, E. L., and Moore, C. (2011). Unravelling the means to an end: rna polymerase ii transcription termination. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 72, 283-294.

57. Kuhn, E. J., Hart, C. M., Geyer, P. K. (2004). Studies of the Role of the Drosophila scs and scs' Insulators in Defining Boundaries of a Chromosome Puff. Mol. Cell Biol. 24, 1470-1480.

58. Kühn, U., Buschmann, J., Wahle, E. (2017). The nuclear poly(A) binding protein of mammals, but not of fission yeast, participates in mRNA polyadenylation. RNA 23, 473.

59. Kyrchanova, O., Leman, D., Parshikov, A., Fedotova, A., Studitsky, V., Maksimenko, O., Georgiev, P. (2013). New Properties of Drosophila scs and scs' Insulators. PLoS One 8.

60. Labrador, M., Mongelard, F., Plata-Rengifo, P., Baxter, E. M., Corces, V. G., and Gerasimova, T. I. (2001). Protein encoding by both DNA strands. Nature 409, 1000.

61. Lasda, E. L., and Blumenthal, T. (2011). Trans-splicing. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 2, 417-434.

62. Laishram, R. S. (2014). Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Lett 588, 2185-2197.

63. Lee, Y., and Rio, D. C. (2015). Mechanisms and Regulation of Alternative Pre-mRNA Splicing. Annu. Rev. Biochem. 84, 291-323.

64. Lei, Q., Li, C., Zuo, Z., Huang, C., Cheng, H., Zhou, R. (2016). Evolutionary Insights into RNA trans-Splicing in Vertebrates. Genome Biol Evol 8, 562-577.

65. Li, H., Wang, J., Ma, X., and Sklar, J. (2009). Gene fusions and RNA trans-splicing in normal and neoplastic human cells. Cell Cycle 8, 218-222.

66. Li, W., You, B., Hoque, M., Zheng, D., Luo, W., Ji, Z., Park, J. Y., Gunderson, S. I., Kalsotra, A., Manley, J. L., Tian, B. (2015). Systematic profiling of poly(A)+ transcripts modulated by core 3' end processing and splicing factors reveals regulatory rules of alternative cleavage and polyadenylation. PLoS Genet. 77, e1005166.

67. Liang, X., Haritan, A., Uliel, S., and Michaeli, S. (2003). Trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryot. Cell 2, 830-840.

68. Licatalosi, D. D., Geiger, G., Minet, M., Schroeder, S., Cilli, K., McNeil, J. B., and Bentley, D. L. (2002). Functional interaction of yeast pre-mRNA 3' end processing factors with RNA polymerase II. Mol. Cell 9, 1101-1111.

69. Lin, J., Xu, R., Wu, X., Shen, Y., and Li, Q. Q. (2017). Role of cleavage and polyadenylation specificity factor 100: anchoring poly(A) sites and modulating transcription termination. Plant J. Cell Mol. Biol. 91, 829-839.

70. MacMorris, M., Kumar, M., Lasda, E., Larsen, A., Kraemer, B., and Blumenthal. (2007). A novel family of C. elegans snRNPs contains proteins associated with trans-splicing. RNA 13, 511-520.

71. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L., 2008. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell. Mol. Life Sci. 65, 1099-1122.

72. Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., and Zavolan, M. (2012). Genome-wide analysis of pre-mRNA 3' end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length. Cell Rep. 1, 753-763.

73. Marzluff, W. F., and Koreski, K. P. (2017). Birth and Death of Histone mRNAs. Trends Genet. TIG 33, 745-759.

74. Marzluff, W. F., Wagner, E. J., and Duronio, R. J. (2008). Metabolism and regulation of canonical histone mRNAs: life without a poly(A) tail. Nat. Rev. Genet. 9, 843-854.

75. Matlin, A. J., Clark, F., and Smith, C. W. J. (2005). Understanding alternative splicing: towards a cellular code. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 386-398.

76. McManus, C. J., Duff, M. O., Eipper-Mains, J., Graveley, B. R., 2010. Global analysis of trans-splicing in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 12975-12979.

77. Megy, K., Emrich, S. J., Lawson, D., Campbell, D., Dialynas, E., Hughes, D. S. T., Koscielny, G., Louis, C., Maccallum, R. M., Redmond, S. N., Sheehan, A., Topalis, P., Wilson, D., VectorBase Consortium, 2012. VectorBase: improvements to a bioinformatics resource for invertebrate vector genomics. Nucleic Acids Res. 40, D729-734.

78. Merkin, J., Russell, C., Chen, P., and Burge, C. B. (2012). Evolutionary dynamics of gene and isoform regulation in Mammalian tissues. Science 338, 1593-1599.

79. Merran, J., and Corden, J. L. (2017). Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Mol. Cell. Biol. 37.

80. Melero, R., Uchiyama, A., Castaño, R., Kataoka, N., Kurosawa, H., Ohno, S., Yamashita, A., Llorca, O. (2014). Structures of SMG1-UPFs complexes: SMG1 contributes to regulate UPF2-dependent activation of UPF1 in NMD. Structure 22, 1105-1119.

81. Miki, T. S., Carl, S. H., and GroBhans, H. (2017). Two distinct transcription termination modes dictated by promoters. Genes Dev. 31, 1870-1879.

82. Mischo, H. E., and Proudfoot, N. J. (2013). Disengaging polymerase: Terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim. Biophys. Acta 1829, 174-185.

83. Miura, S. K., Martins, A., Zhang, K. X., Graveley, B. R., and Zipursky, S. L. (2013). Probabilistic splicing of Dscam1 establishes identity at the level of single neurons. Cell 155, 11661177.

84. Narita, T., Yung, T. M. C., Yamamoto, J., Tsuboi, Y., Tanabe, H., Tanaka, K., Yamaguchi, Y., Handa, H. (2007). NELF interacts with CBC and participates in 3' end processing of replication-dependent histone mRNAs. Mol. Cell 26, 349-365.

85. Ntini, E., Jarvelin, A. I., Bornholdt, J., Chen, Y., Boyd, M., J0rgensen, M., Andersson, R., Hoof, I., Schein, A., Andersen, P. R., et al. (2013). Polyadenylation site-induced decay of upstream transcripts enforces promoter directionality. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 923-928.

86. Ohsako, T., Horiuchi, T., Matsuo, T., Komaya, S., and Aigaki, T. (2003). Drosophila lola encodes a family of BTB-transcription regulators with highly variable C-terminal domains containing zinc finger motifs. Gene 311, 59-69.

87. Parker, S., Fraczek, M. G., Wu, J., Shamsah, S., Manousaki, A., Dungrattanalert, K., de Almeida, R. A., Estrada-Rivadeneyra, D., Omara, W., Delneri, D., et al. (2017). A resource for functional profiling of noncoding RNA in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA 23, 1166-1171.

88. Patel, A. A., and Steitz, J. A. (2003). Splicing double: insights from the second spliceosome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 960-970.

89. Peck, S. A., Hughes, K. D., Victorino, J. F., Mosley, A. L. (2019). Writing a wrong: Coupled RNA polymerase II transcription and RNA quality control. Wiley Interdiscip Rev RNA 10.

90. Petitclerc, D., Attal, J., Théron, M. C., Bearzotti, M., Bolifraud, P., Kann, G., Stinnakre, M. G., Pointu, H., Puissant, C., Houdebine, L. M. (1995). The effect of various introns and transcription terminators on the efficiency of expression vectors in various cultured cell lines and in the mammary gland of transgenic mice. J. Biotechnol. 40, 169-178.

91. Pettinati, I., Grzechnik, P., Ribeiro de Almeida, C., Brem, J., McDonough, M. A., Dhir, S., Proudfoot, N. J., Schofield, C. J., n. d. Biosynthesis of histone messenger RNA employs a specific 3' end endonuclease. eLife 7.

92. Pearson, E., and Moore, C. (2014). The evolutionarily conserved Pol II flap loop contributes to proper transcription termination on short yeast genes. Cell Rep. 9, 821-828.

93. Plaschka, C., Lin, P.-C., and Nagai, K. (2017). Structure of a pre-catalytic spliceosome. Nature 546, 617-621.

94. Porrua, O., and Libri, D. (2015). Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, 190-202.

95. Quinn, J. J., and Chang, H. Y. (2016). Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function. Nat. Rev. Genet. 17, 47-62.

96. Rienzo, M., and Casamassimi, A. (2016). Integrator complex and transcription regulation: Recent findings and pathophysiology. Biochim. Biophys. Acta 1859, 1269-1280.

97. Robertson, H. M., Navik, J. A., Walden, K. K. O., and Honegger, H.-W. (2007). The Bursicon Gene in Mosquitoes: An Unusual Example of mRNA Trans-splicing. Genetics 176, 1351-1353.

98. Rondón, A. G., Mischo, H. E., Kawauchi, J., and Proudfoot, N. J. (2009). Fail-Safe Transcriptional Termination for Protein-Coding Genes in S. cerevisiae. Mol. Cell 36, 88-98.

99. Sashital, D. G., Cornilescu, G., McManus, C. J., Brow, D. A., and Butcher, S. E. (2004). U2-U6 RNA folding reveals a group II intron-like domain and a four-helix junction. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 1237-1242.

100. Schmucker, D., Clemens, J. C., Shu, H., Worby, C. A., Xiao, J., Muda, M., Dixon, J. E., and Zipursky, S. L. (2000). Drosophila Dscam is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity. Cell 101, 671-684.

101. Schwer, B. (2008). A conformational rearrangement in the spliceosome sets the stage for Prp22-dependent mRNA release. Mol. Cell 30, 743-754.

102. Semlow, D. R., Blanco, M. R., Walter, N. G., and Staley, J. P. (2016). Spliceosomal DEAH-Box ATPases Remodel Pre-mRNA to Activate Alternative Splice Sites. Cell 164, 985-998.

103. Shao, W., Zhao, Q.-Y., Wang, X.-Y., Xu, X.-Y., Tang, Q., Li, M., Li, X., and Xu, Y.-Z. (2012). Alternative splicing and trans-splicing events revealed by analysis of the Bombyx mori transcriptome. RNA N. Y. N 18, 1395-1407.

104. Shukla, S., and Oberdoerffer, S. (2012). Co-transcriptional regulation of alternative pre-mRNA splicing. Biochim. Biophys. Acta 1819, 673-683.

105. Southall, T. D., Davidson, C. M., Miller, C., Carr, A., and Brand, A. H. (2014). Dedifferentiation of Neurons Precedes Tumor Formation in lola Mutants. Dev. Cell 28, 685-696.

106. St-Sauveur, V. G., Soucek, S., Corbett, A. H., and Bachand, F. (2013). Poly(A) Tail-Mediated Gene Regulation by Opposing Roles of Nab2 and Pab2 Nuclear Poly(A)-Binding Proteins in Pre-mRNA Decay. Mol. Cell. Biol. 33, 4718-4731.

107. Schmidt, M.-J., Norbury, C. J., 2010. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley Interdiscip Rev RNA 1, 142-151.

108. Schreieck, A., Easter, A. D., Etzold, S., Wiederhold, K., Lidschreiber, M., Cramer, P., Passmore, L. A. (2014). RNA polymerase II termination involves CTD tyrosine dephosphorylation by CPF subunit Glc7. Nat Struct Mol. Biol. 21, 175-179.

109. Sullivan, K. D., Steiniger, M., and Marzluff, W. F. (2009). A core complex of CPSF73, CPSF100, and Symplekin may form two different cleavage factors for processing of poly(A) and histone mRNAs. Mol. Cell 34, 322-332.

110. MacMorris M., Kumar M., Lasda E., Larsen A., Kraemer B., Blumenthal T. (2007). A novel family of C. elegans snRNPs contains proteins associated with trans-splicing. RNA 13, 511-520.

111. Tang, W., Yu, L., He, W., Yang, G., Ke, F., Baxter, S. W., You, S., Douglas, C. J., You, M. (2014). DBM-DB: the diamondback moth genome database. Database (Oxford) 2014, bat087.

112. Thore, S., Fribourg, S., 2019. Structural insights into the 3'-end mRNA maturation machinery: Snapshot on polyadenylation signal recognition. Biochimie 164, 105-110.

113. Tessier, L. H., Keller, M., Chan, R. L., Fournier, R., Weil, J. H., and Imbault, P. (1991). Short leader sequences may be transferred from small RNAs to pre-mature mRNAs by trans-splicing in Euglena. EMBO J. 10, 2621-2625.

114. Tsai, R.-T., Fu, R.-H., Yeh, F.-L., Tseng, C.-K., Lin, Y.-C., Huang, Y.-H., and Cheng, S.-C. (2005). Spliceosome disassembly catalyzed by Prp43 and its associated components Ntr1 and Ntr2. Genes Dev. 19, 2991-3003.

115. Turner, I. A., Norman, C. M., Churcher, M. J., and Newman, A. J. (2004). Roles of the U5 snRNP in spliceosome dynamics and catalysis. Biochem. Soc. Trans. 32, 928-931.

116. Vandenberghe, A. E., Meedel, T. H., and Hastings, K. E. M. (2001). mRNA 5'-leader trans-splicing in the chordates. Genes Dev. 15, 294-303.

117. Velandia-Huerto, C. A., Brown, F. D., Gittenberger, A., Stadler, P. F., Bermudez-Santana, C. I. (2018). Nonprotein-Coding RNAs as Regulators of Development in Tunicates. Results Probl. Cell Differ. 65, 197-225.

118. Wahl, M. C., Will, C. L., and Lührmann, R. (2009a). The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell 136, 701-718.

119. Waller, R. F., Jackson, C. J. (2009). Dinoflagellate mitochondrial genomes: stretching the rules of molecular biology. Bioessays 31, 237-245.

120. Wahl, M. C., Will, C. L., and Lührmann, R. (2009b). The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell 136, 701-718.

121. Wang, Z., and Burge, C. B. (2008). Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA N. Y. No. 14, 802-813.

122. Wang, Z., Rolish, M. E., Yeo, G., Tung, V., Mawson, M., and Burge, C. B. (2004). Systematic identification and analysis of exonic splicing silencers. Cell 779, 831-845.

123. Will, C. L., and Lührmann, R. (2011). Spliceosome structure and function. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3.

124. Wu, N.-Y., Chung, C.-S., and Cheng, S.-C. (2017). Role of Cwc24 in the First Catalytic Step of Splicing and Fidelity of 5' Splice Site Selection. Mol. Cell. Biol. 37.

125. Xiang, K., Tong, L., and Manley, J. L. (2014). Delineating the Structural Blueprint of the Pre-mRNA 3'-End Processing Machinery. Mol. Cell. Biol. 34, 1894-1910.

126. Xie, M., Zhang, W., Shu, M.-D., Xu, A., Lenis, D. A., DiMaio, D., and Steitz, J. A. (2015). The host Integrator complex acts in transcription-independent maturation of herpesvirus microRNA 3' ends. Genes Dev. 29, 1552-1564.

127. Yang, Q., Coseno, M., Gilmartin, G. M., and Doublie, S. (2011). Crystal structure of a human cleavage factor CFIm25/CFIm68/RNA complex provides an insight into poly(A) site recognition and RNA looping. Struct. Lond. Engl. 1993 79, 368-377.

128. Yang, Q., Gilmartin, G. M., and Doublie, S. (2010). Structural basis of UGUA recognition by the Nudix protein CFIm25 and implications for a regulatory role in mRNA 3' processing. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 707, 10062-10067.

129. Yang, W., Hsu, P. L., Yang, F., Song, J.-E., and Varani, G. (2018). Reconstitution of the CstF complex unveils a regulatory role for CstF-50 in recognition of 3'-end processing signals. Nucleic Acids Res. 46, 493-503.

130. Yean, S. L., Wuenschell, G., Termini, J., and Lin, R. J. (2000). Metal-ion coordination by U6 small nuclear RNA contributes to catalysis in the spliceosome. Nature 408, 881-884.

131. Yang, Y.-F., Zhang, X., Ma, X., Zhao, T., Sun, Q., Huan, Q., Wu, S., Du, Z., Qian, W. (2017). Trans-splicing enhances translational efficiency in C. elegans. Genome Res 27, 1525-1535.

132. Yu, S., Waldholm, J., Böhm, S., and Visa, N. (2014). Brahma regulates a specific trans-splicing event at the mod(mdg4) locus of Drosophila melanogaster. RNA Biol. 77, 134-145.

133. Zhang, H., Hou, Y., Miranda, L., Campbell, D. A., Sturm, N. R., Gaasterland, T., and Lin, S. (2007). Spliced leader RNA trans-splicing in dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 704, 4618-4623.

134. Zhu, Y., Wang, X., Forouzmand, E., Jeong, J., Qiao, F., Sowd, G.A., Engelman, A. N., Xie, X., Hertel, K. J., and Shi, Y. (2018). Molecular Mechanisms for CFIm-Mediated Regulation of mRNA Alternative Polyadenylation. Mol. Cell 69, 62-74. e4.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

region r

980

Dmel Dsim Dsec Dyak Dere Dana Dwil Dmc; Dvir Dgri

ttcattccaafettttttgtatdgaacattttgl---

tttgtttcgafettgttcttttdagccacatttc---

tttgttetgafettgtc cttttgagccacatttc---

-ttacatttcaagaagtaa.ctijaaatcataa.tc---

-tcatacaacjttaatcctacjtcacaaaaagctg-

1000

—gtgttttttttala^g —atttgatattctttca —atttgatttactttta —gttcatatttcatttg -gtctcatttttaatttc

region f 1020

tc-----------cgaatta

Sgtaatacatataataaattt gtaathcatataataaattt

Sggaaaaa.-------------

Jggaagat-------------

-------------------gtcaattcacaagtaggac---gattcaatggagttctagEaacgcacattctgaaaa-

ttcaatacgcfetttatcgtttjgagttgccacja--------------------------------------------

ttccgcgcgcaagcagatgtttgcgttgccactagtctttaatttcaaacgtgaattgffltttgtagtggtc------

---------------------------------------------cgaaagttacqcgg^agtgcatgtcta------

gt

region r

* 1040 * 1060

Dmel : aagggtgt---ctgaagaatttcacgatatttacggatgtcgcggBaa-cc

Dsim : aggaatacgcgttgaatgttatttgatattttacggatgtcgcggfcaa-cc -■sec : aggaatacgcattgaacacatccatgatatttacggatgtcgcggtaa-cc

Dyak : ----------------------------tgtattggactgcctgcl:at-tt

Dere : ------------------------------ttttaaactatcttatacatt

Dana : -------------------------------------------------tt

Dwil : -------------------------------------------gg^ttata

Dmc; : -------------------------------------------------tg

Dvir : -------------------------------------------------tg

Dgri : ------------------------------------------------

region f 1080 * acaaaaa 3a|ca~aa(atact-aqa accccaalalalalaaaaaaa-tgc accaaaalaaaaaaaaaaaaatttc tgttttgttg gatttctgtatact-aga tgHcttaatg Stattctgtgtact-aga

tagttgattg Sgtgaaatttgtgt----

taffltctagaggaacgcaatgagga----

ccgtttattgtcaaaacg-gctga----

jtagtgcaacgHggaaatgtgctta----

tgacagttggctggttatgaatacttg----

t. a a

Dmel Dsim Dsec Dyak Dere Dana Dwil Dmoj Dvir Dgri

region r

1_00 * _120 *

cctcttacctaattggtaagagataaacata-----------aaccgttttaa—

acatttggttagtgtatttaaggaaatttcgagattttagattaccgttttaat-tcatttgtttagtgtatttaaggaaatttcgagattttagattac|gttttaat-

ta-----------------------------------------------------

ga-----------------------------------------------------

region i 1140

--------ttcatata

-cgtgcgttttttgta -cgtgcg-tttttgta --------~ tt:: tat :r

----------------------------------tt-tg

------------------------aatgt.g---------

------tcgtaaatgaaattgacagaagcg-" ttllaaja

-tagca------------------tgtatg-ctttttcc

-tgtcg------------------aaagtg-cct^g|c

-ggacg------------------a a tgt.g---------

Dmel Dsim Dsec Dyak Dere Dana Dwil Dmc; Dvir Dgri

region r

* 1160

ggcgatagtttat-atacc-----ttgga

attcatattttgt-gtgcctagtctggtt attcatattttgt-gtgcctagtctagat aac.aaaaataagtaatgccaagttcccat. agcaaatgt-----ttacgaatttttgatg

1130

f>l <g 1200

region g

caaaaggt— ttaataca— tttataca—

-tggaccgccttgaagcat -tcgatcatatttatggat -tccatcatatttatgaat

-------atcgtctggcga

----actgatctcaaagga

age a ga a t cc gt|t attjttga t t|gta a

tggaactaj------------cgccgatg

cgcaptttc.aat§at§tgggctgtcgaat. ------------------------§tgct.

Stccg arc::: atcc ttca [gtca -ctgcg

ttggtttBaatttattcgacHagcattatuacga

ttatggca--------cgactattagaaagtgag

atgcgtta--------t.gajgcgtgtaggtgta

ggcttcta--------t.aaaacgaactag0tgta

cagaat-cagaat-

tgctggcaggtttc-

atcattttaga----

agctattcagttttc accaactaaaagaaa ttgtagcaaattatg

region g

Dmel Dsim Dsec Dyak Dere Dana Dwil Dmoj Dvir Dgri

----ttata

-acg-tttt -acgatata

-------------tgtaaat

---------------c.aaaa

tatgtggaattattgaagtt tacgtatatcgcaatagaaa ; ---------------ctaaa t

region g

* 12 40

aattttcgtttttttattg---------------------

ttaatttaattgactagcgt----actagtacccttctta

tgaatttaattgactagcgt----actattacc---ctta

t.atatta---------------------------------

gattttc---------------------------------

aacgca----------------------------------

atactaaaBaat|t|agacatctgtaaatttaacatctgcaataaacgta atactgtt«atatcgg-ca------------------------------

1220

Bcctttajttgtagtag Sttt g t aHta a a::: g aa a Bttttta jtaaaccaaa Sttttgggagatcggaa

Stttt--------aggt

3gatgtcc|actt.taaa Statta Htggca

iagccacHaagttagcaggatgtgagta-jcaccgcgacgcacatgcaatgcg-----

a T

Dmel Dsim jsec Dyak Dere Dana Dwil Dmc; Dvir Dgri

region g region g

1 12 60 * _280

----agegta ttgagaaaatttitattJacgtttg-------------------------aatcgt

----atctaa «cggtatcaaattaaacgaaac.ataataactaagtaatttacaaagatcatattaaa

----atctaa cggtatqaacttBaacgattcttaa-------------------------attaaa

----attaaa cgtgcatBagcgaaBaag---------------------------aacaagtogcg

—taattaa jcgtgctaaagtgaaaaaag-----------------------ctcgtttagttttg

--------------------------------------------------------tcctlagtaat

ccaga---atttga acgaataaaccagtggaaaac:tccaatttctggtat------tgagctaaatga—

jggcaaacggttaatgataacaactataacataaa---------------------------ataagagacc

-gf §gagggtgcgttgat ctac.gagaaa-----------------------------------gccaacaggtg

-t g-----tetgettaa gtcattacgaatacacagg-------------------------------------

la t.

------1

ggcaact gccaact

------c

------1

------1

-----tt

Выравнивание последовательности интрона 4 из локуса mod(mdg4) среди близкородственных представителей подрода 8оркоркога и более отдаленных видов семейства Drosopkilidae. Границы участков а, Ь, с, d, е, /, g, г обозначены вертикальными линиями сверху. Различные цвета указывают на консервативность встречаемости последовательности среди видов: черный 100%; темно-серый > 80%; светло-серый > 60%; белый < 60%.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Картирование участка, необходимого для терминации транскрипции в интроне 4.

А) Схема донорной конструкции. Донорная конструкция содержит промотор (стрелка), четыре конститутивных экзона (зеленые прямоугольники), IRES, интрон 4 (розовая горизонтальная полоса) или его различные делеционные производные и альтернативный экзон N (оранжевый прямоугольник) с вставленным геном rluc (синий прямоугольник). Пары

праймеров указаны номерами 2, 6, 10, 11, 13, 14. С помощью этого набора праймеров анализировался уровень транскрипции в определенных точках интрона 4.

Б) Уровень транскрипции в определенных точках интрона 4, нормированный на экз4-ГОЕБ. Праймеры экз4-ГЯЕ8 обозначены стрелками. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения (п = 3).

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Картирование участка, необходимого для терминации транскрипции в интроне 4.

А) Схема донорной конструкции. Донорная конструкция содержит промотор (стрелка), четыре конститутивных экзона (зеленые прямоугольники), 1RES, интрон 4 (розовая горизонтальная полоса) или его различные делеционные производные и альтернативный экзон N (оранжевый прямоугольник) с вставленным геном rluc (синий прямоугольник). Пары праймеров указаны номерами 2, 7, 11, 13, 14, 15. С помощью этого набора праймеров анализировался уровень транскрипции в определенных точках интрона 4. Обратная транскрипция осуществлялась с помощью специфичного праймера из кодирующей области гена rluc.

Б) Уровень транскрипции в определенных точках интрона 4, нормированный на экз4-IRES. Праймеры экз4-ЖЕ8 обозначены стрелками. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения (n = 3).

Приложение 4

Картирование региона, участвующего в терминации транскрипции в интроне 4.

А) Схема конструкции, в которой анализировали профиль транскрипции в интроне 4. Донорная конструкция содержит промотор Act5C (стрелка), кодирующую область гена rluc, (синий прямоугольник), область abcdefg (розовая горизонтальная полоса) и кодирующую область гена fluc (желтый прямоугольник). На рисунке указаны номера пар праймеров 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, с помощью которых анализировали уровень транскрипции в определенной точки области abcdefg.

Б) Уровень транскрипции в определенных точках интрона 4, нормированный на уровень транскрипции у-тубулина - y37C (tub). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения (n = 3).

Приложение 5

Картирование региона, участвующего в терминации транскрипции в интроне 4.

А) Схема конструкции, в которой анализировали профиль транскрипции в интроне 4. Донорная конструкция содержит промотор Act5C (стрелка), кодирующую область гена rluc, (синий прямоугольник), область abcdefg (розовая горизонтальная полоса) и кодирующую область гена fluc (желтый прямоугольник). На рисунке указаны номера пар праймеров 7, 8, 10, 11, 13, с помощью которых анализировали уровень транскрипции в определенной точки области abcdefg. Обратная транскрипция осуществлялась с помощью специфичного праймера из кодирующей области гена rluc.

Б) Уровень транскрипции в определенных точках интрона 4, нормированный на уровень транскрипции у-тубулина - y37C (tub). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения (n = 3).