Исследование энергетических процессов в митохондриях тканей крыс при гипотермии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Мирская, Руслана Олеговна

• Мирская, Руслана Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мирская, Руслана Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Температура, как экологический фактор.

1.2. Электрон-транспортная цепь митохондрий.

1.3. Термодинамика окислительного фосфорилирования митохондрий.

1.4. Синтез АТФ и его регуляция.

1.5. Роль митохондрий в регуляции кальциевого гомеостаза клетки.

1.6. Внешний путь окисления НАДН.

1.7. Митохондрии и окислительный стресс.

1.8. Температурная зависимость митохондриальных процессов.

1.9. Гипотермия и ее действие на организм.

1.10. Потребление кислорода тканями мозга и печени при гипотермии.

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Обоснование выбора объекта исследования.

2.2. Постановка эксперимента.

2.2.1. Способ многократного холодового воздействия.

2.2.2. Способ достижения умеренной и глубокой гипотермии.

2.3. Методика инъекции 2,4-динитрофенола животным.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Препаративные методы исследования.

2.4.2. Полярографическая регистрация дыхания.

2.4.3. Метод определения содержания малонового диальдегида в гомогенатах тканей.

2.5. Статистическая обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Влияние гипотермии 3 0°С и введения 2,4-динитрофенола на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс.

3.2. Влияние гипотермии 30°С на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени адаптированных к холоду крыс.

3.3. Влияние глубокой гипотермии 20°С на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс.

3.4. Влияние гипотермии и на потребление кислорода гомогенатами печени сусликов.

3.5. Температурные зависимости дыхания гомогенатов ткани мозга при гипотермии 20°С.

3.6. Перекисное окисление липидов мозга и печени крыс при введении 2,4-динитрофенола и гипотермии 30°С.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование энергетических процессов в митохондриях тканей крыс при гипотермии»

Актуальность проблемы. Температурные адаптации у позвоночных представлены несколькими основными стратегиями. Разнообразие температурных адаптаций обусловлено различием климатических условий в различных широтах, а также разнообразием других экологических факторов (среда обитания: водная, наземная, воздушная; продолжительность световой части суток; эволюционная история вида). Различают три главные стратегии температурных адаптаций: пойкилотермия, гомойотермия, гетеротермия [Проссер, 1988; Хочачка, Сомеро, 1988]. Пойкилотермия наиболее древняя стратегия адаптации, когда температура тела изменяется вслед за изменениями температуры окружающей среды. У пойкилотермов температура тела может в течение суток меняться на 10-15°С. При этом, однако, скорость физиологических процессов изменяется не существенно. Такая слабая зависимость физиологических процессов от температуры тела обеспечивается специальной адаптацией, которая называется температурной компенсацией. Суть температурной компенсации состоит в том, что физико-химические свойства структурных белков и системы обратных связей таковы, что они компенсируют изменения скорости, вызванные изменением температуры тела.

Гомойотермия - такая стратегия, при которой температура тела стабилизирована. Эволюционно это более молодая стратегия температурной адаптации, так как наблюдается только у млекопитающих и птиц. Температура тела у гомойотермов поддерживается в довольно узком интервале значений и требует довольно больших затрат энергии, как при низких температурах окружающей среды, так и при температурах выше установочной точки.

Однако, температурный режим у гомойотермов неоднороден: в теле гомойотермов можно выделить «ядро» и «оболочку». К ядру относятся мозг, сердце, печень, почки и другие внутренние органы, а к оболочке -кожные покровы и подлежащая под ними мышечная ткань.

Температура ядра более стабильна, температура оболочки может варьировать в пределах нескольких градусов. Оказалось, что температурная зависимость биохимических процессов в клетках тканей ядра и оболочки неодинакова: в тканях оболочки температурная зависимость слабее, чем в тканях ядра [Слоним, 1986].

Отсюда следует, что оболочка тела более «пойкилотермна», чем ядро. Поскольку генетический материал всех клеток организма идентичен, это говорит о том, что пойкилотермные механизмы закодированы на генетическом уровне и в клетках гомойотермов.

Следовательно, можно предположить, что при определенных условиях переход к пойкилотермической стратегии может быть индуцирован и в клетках тканей ядра.

Третья стратегия - гетеротермия, при которой животное способно существенно менять температурный режим в различные сезоны года. Примером этой стратегии является зимняя спячка мелких грызунов, таких как, суслики. В бодрствующем состоянии суслики поддерживают температуру тела около 38°С. В зимнее время в условиях бескормицы и низкой температуры окружающей среды температура тела суслика мало отличается от температуры среды и может достигать 0°С [Калабухов, 1985].

Гетеротермия направлена на сбережение энергетических ресурсов организма в условиях недостатка пищи. При гетеротермии происходит резкая смена температурного режима. Однако состояние зимней спячки отличается от состояния пойкилотермии тем, что у пойкилотермов снижение температуры тела не сопровождается значительным снижением физиологической активности, а, следовательно, не уменьшается расход энергии. При зимней же спячке снижение температуры тела необходимо для подавления, как физиологической активности, так и энергетического обмена. Общность же этих двух состояний заключается в том, что животные могут и в том, и в другом случае выживать при низких температурах тела.

Считается, что гетеротермия является надстройкой для гомойотер-мии, то есть эволюционно более поздней стратегией адаптации.

Из выше сказанного следует, что все три стратегии адаптации не являются тремя изолированными друг от друга механизмами. Эволюционно более молодые стратегии могут быть сведены при определенных условиях к более древним. Однако во всех этих стратегиях энергетические процессы играют важную, если не главную роль. Поэтому исследование особенностей энергетического обмена у животных, использующих различные стратегии температурных адаптации, является актуальной проблемой современной физиологической экологии.

Попытки индуцировать переход от гомойотермии к пойкилотермии экспериментальными путями представляют значительный теоретический и практический интерес.

Индуцировать такой переход можно было бы либо химическим, либо физическим путем. Например, можно предположить, что введение в клетку веществ, создающих дефицит энергии, может послужить толчком для перехода на энергосберегающую или иную стратегию. Дефицит энергии в клетке можно вызвать введением разобщителей окислительного фосфори-лирования таких, например, как 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ). Опыты с введением 2,4-ДНФ в организм используются в экспериментальной биологии для повышения устойчивости к гипоксическим состояниям [Пауков, Хитров, 1985]. С другой стороны, снижение температуры тела (гипотермия) также подавляет энергетический обмен и может приводить к энергетическому дефициту в клетке. Следовательно, при гипотермических состояниях также возможна смена стратегии.

Цели и задачи исследования. Целью работы была проверка предположения о возможности индуцировать смену стратегий температурной адаптации в организме гомойотермного животного. Для этого были исследованы:

1. Энергетические процессы в тканях мозга и печени крыс при введении разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола и гипотермии.

2. Энергетические процессы в тканях мозга и печени крыс при многократном холодовом воздействии.

3. Температурные зависимости энергетических процессов в тканях мозга и печени крыс при гипотермии.

Основные положения. выносимые на защиту.

1. Гипотермия гомойотермного животного (крыса) стимулирует адаптивные изменения энергетического обмена, направленные на поддержание физиологической активности при низких температурах тела.

2. Гипотермия вызывает такие изменения температурной зависимости потребления кислорода гомогенатами мозга, которые указывают на включение механизма температурной компенсации энергетического метаболизма.

Научная новизна. В настоящей работе впервые исследованы энергетические процессы в тканях мозга и печени крыс в различных метаболических состояниях, совместное действие гипотермии и разобщителя окислительного фосфорилирования на дыхание тканей мозга и печени крыс, определена температурная зависимость окислительных процессов в тканях мозга и печени при гипотермических состояниях.

Установлено, что:

1. влияние гипотермии и введения 2,4-динитрофенола на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени имеет органную специфику;

2. совместное действие гипотермии 30°С и введения 2,4-динитрофенола на энергетические процессы в тканях мозга и печени крыс не аддитивно;

3. температурная зависимость потребления кислорода в различных метаболических состояниях в Аррениусовских координатах имеет вид прямой. Гипотермия 20°С приводит к уменьшению эффективной энергии активации дыхания гомогенатов мозга на смеси глу-тамат+малат.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные указывают на то, что при гипотермических состояниях гомойотермного организма возможна индукция механизма температурной компенсации в некоторых структурах мозга.

Эти результаты имеют большое значение для построения теорий температурных адаптаций у гомойотермных животных.

Полученные результаты могут быть использованы при планировании экспериментов по изучению явления температурной компенсации у гомойотермных животных.

Материалы, полученные при выполнении данной работы, используются в учебном процессе на кафедре биохимии Даггосуниверситета при чтении курсов «Энзимология», «Биоэнергетика», при проведении лабораторных занятий для студентов, специализирующихся по кафедре биохимии.

Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ (1995-1999 г.), на конференции молодых ученых СевероКавказского региона (Ростов-на-Дону, 1995 г.), на совместном съезде Американского и Международного нейрохимических обществ (Бостон, США, 1997 г.), на 12 Европейской нейрохимической конференции (Санкт-Петербург, 1998 г.), на совместном съезде Европейского и Международно9 го нейрохимических обществ (Берлин, Германия, 1999 г.), на юбилейной конференции ДНЦ РАН (Махачкала, 1999 г.), на 1-ом Кавказском симпозиуме по медико-биологическим наукам (Тбилиси, 1999 г.), на совместном заседании кафедры биохимии и НИИ биологии ДГУ (Махачкала, 2000 г.)

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 13 работ, две статьи находятся в печати.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мирская, Руслана Олеговна

ВЫВОДЫ

1. Умеренная гипотермия 30°С вызывает стимуляцию окислительных процессов в гомогенатах тканей мозга и печени во всех метаболических состояниях. В мозге стимуляция сопровождается уменьшением степени сопряжения. Углубление гипотермии до 20°С приводит к дальнейшей стимуляции дыхания гомогенатов печени во всех состояниях, кроме фосфорилирующего. В гомогенатах мозга гипотермия 20°С не стимулирует дыхание.

2. Внутрибрюшинное введение 2,4-динитрофенола в дозе 20 мг/кг веса стимулирует дыхание гомогенатов мозга и печени.

Совместное действие умеренной гипотермии и введения 2,4-динитрофенола вызывает увеличение скорости потребления кислорода во всех метаболических состояниях гомогенатами исследуемых тканей. Это увеличение сопровождается некоторым ростом сопряжения окисления и фосфорилирования.

3. Многократное действие холодового стресса на крыс (-5°С 3 ч ежедневно в течение 25 дней) активирует окислительные процессы в гомогенатах тканей мозга и печени. В гомогенатах ткани мозга это сопровождается существенным разобщением окисления и фосфорилирования, что не наблюдается в гомогенатах ткани печени.

4. При кратковременной гипотермии 30°С у крыс предварительно адаптированных к многократному действию холода, наблюдается активация окислительных процессов в гомогенатах печени и мозга, причем в печени сильнее. При гипотермии 30°С у этих крыс, в отличие от неадаптированных к охлаждениям животных, существенно растет отношение Р/О для гомогенатов исследуемых тканей. При пролонгировании гипотермии в течение 3 ч у крыс, предварительно адаптированных к многократному действию холода, в мозге наблюдается

118 рост отношения Р/О и скорости фосфорилирования, а в печени падение этих показателей.

5. В гомогенатах печени сусликов как умеренная, так и глубокая гипотермии стимулируют дыхание. Однако в отличие от умеренной, глубокая гипотермия 20°С заметно снижает отношение Р/О.

6. Внутрибрюшинное введение 2,4-динитрофенола (10 и 20 мг/кг веса) вызывает дозозависимый рост исходного содержания и скорости образования малонового диальдегида. Гипотермия 30°С достоверно снизила исходное содержание малонового диальдегида и увеличила скорость их образования в мозге, не оказав влияния в ткани печени.

Совместное действие этих двух факторов по-разному оказало влияние на образование малонового диальдегида в печени и мозге. В печени при увеличении исходного уровня малонового диальдегида, скорость их образования несколько снижается. В мозге же растут оба показателя.

7. Гипотермия 20°С уменьшает эффективную энергию активации дыхания гомогенатов мозга крыс (смесь глутамат+малат) в состояниях без добавления АДФ и фосфорилирующем и не меняет в разобщенном состоянии. При использовании в качестве субстрата смеси сукцинат+глутамат подобного эффекта не наблюдается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гипотермия широко используется в клинической практике при операциях на сердце и мозге [Волколаков, Лацис, 1977]. Это связано с тем, что при гипотермии клетки тканей мозга и сердца могут более длительное время переживать периоды ишемии, которые возникают при хирургическом вмешательстве. Защитное действие гипотермии при ишемии показано на различных моделях, начиная с организменного уровня и кончая уровнем срезов тканей [Иванов, Кисляков, 1979; Семенова, Швец, 1980; Таш-пкйо, Окас1а, 1987].

Ясно, что защитное действие какого-либо фактора в условиях дефицита энергии может быть обусловлено, либо снижением потребности клеток в энергии, либо подавлением процессов, ведущих к разрушению клеточных структур в условиях дефицита энергии.

Уже умеренная гипотермия оказывает защитное действие при ише-мических состояниях [Сапеуап е1 а1., 1999].

Известно, что при снижении температуры тела происходит закономерное снижение уровня потребления кислорода организмом в целом и отдельными его тканями [Ygushi, 1986]. Это снижение может быть обусловлено двумя причинами.

Во-первых, снижение температуры замедляет скорость химических реакций, в том числе и скорость восстановления кислорода. Само по себе это не может служить защитой от дефицита энергии потому, что чем ниже скорость окисления, тем ниже скорость продукции макроэргических связей. Защитный эффект в этом случае возможен лишь тогда, когда температурная зависимость энергопотребляющих процессов будет сильнее, чем температурная зависимость энергопродуцирующих процессов.

Энергопотребляющие процессы можно разделить на две группы: процессы, требующие затрат энергии при физиологическом покое и процессы, связанные с физиологической активностью. Одним из основных процессов, относящихся к первому типу, является пассивное движение ионов по градиенту электрохимического потенциала.

В мозге значительное количество энергии расходуется на поддержание ионных градиентов. В отсутствие электрической активности нейронов, связанной со значительным рассеиванием энергии ионных градиентов, потребление энергии определяется пассивной проницаемостью плазматических мембран нейронов для Ыа+ и К+. Чем интенсивнее ионы движутся по градиенту концентраций, тем больше требуется энергии, чтобы восстановить необходимый градиент концентраций.

Известно, что практически весь активный транспорт ионов в нейронах осуществляется Ка+,К+-АТФазой, локализованной на плазматической мембране и использующей АТФ для транслокации ионов [Иванов, Кисля-ков, 1979; Котык, Янычек, 1980].

При нормотермических условиях потребление кислорода срезами ткани мозга уменьшается примерно на 40% в присутствии оуабаина, ингибитора №+,К+-АТФазы [ЭокоМ^ 1999]. Это говорит о том, что в состоянии покоя, по крайней мере 40%, вырабатываемой в клетке энергии, тратится на откачку пассивно двигающихся ионов.

Другой статьей энергетических расходов для клеток мозга является биосинтез белков, а также пассивная утечка протонов через внутреннюю мембрану митохондрий.

Гипотермия снижает физиологическую активность мозга, что выражается в уменьшении частоты и амплитуды колебаний на ЭЭГ [ТашшЫо, Окас1а, 1987]. Известно, что потребление кислорода и глюкозы срезами мозга пропорционально частоте электростимуляции срезов [8око1о£Г, 1999]. Поэтому вполне объяснимо параллельное снижение потребления кислорода мозга при снижении температуры тела.

В некоторых работах потребление кислорода организмом экспоненциально зависит от температуры тела [ГиЬгшап, 1956]. В других случаях отмечается линейная зависимость между этими величинами [Black et al., 1976]. Различия между данными разных авторов обусловлены, видимо, условиями эксперимента: скоростью охлаждения, уровнем наркоза. Однако во всех работах отмечается снижение потребления кислорода мозгом и организмом в целом. Таким образом, часть энергии сберегается при гипотермии за счет снижения электрической активности.

Поскольку при гипотермических состояниях общая физиологическая активность организма снижается, подавление электрической активности нейронов не является повреждающим фактором, так как часть функций, выполняемых при нормотермии, может быть на время отключена. Поэтому снижение электрической активности мозга при гипотермии можно рассматривать как часть энергосберегающего механизма.

Следует, однако, отметить, что электрическая активность мозга при гипотермии сохраняется вплоть до снижения температуры тела примерно до 20°С [Петров, Гублер, 1961]. Этот факт можно интерпретировать как проявление резистентной стратегии, попытки сохранить активность при снижающейся температуре тела.

С другой стороны его можно рассматривать как проявление последовательного отключения отдельных функций, по мере снижения температуры тела. В обоих случаях снижение электрической активности обусловлено, видимо, снижением возможности энергопродуцирующих процессов поставлять энергию в необходимых для работы формах.

При полном отключении физиологической активности потребление кислорода определяется только пассивной процессами. Поэтому дальнейшее снижение потребления кислорода по мере снижения температуры тела, зависит от температурной зависимости пассивной проницаемости мембраны.

Известно, что умеренная гипотермия существенно подавляет биосинтез белков и нуклеиновых кислот в тканях млекопитающих [Диускалиев, 1974]. При гипотермии 20°С синтез биополимеров также, как и их распад практически полностью подавлен, и, следовательно, эти процессы уже не требуют энергии [Конникова, 1979].

Несмотря на существенное снижение потребности в энергии при глубокой гипотермии, клетки все-таки нуждаются в энергии. Необходимая для откачки ионов энергия вырабатывается в митохондриях. Температурная зависимость изолированных митохондрий характеризуется эффективной энергией активации примерно 50 кДж/моль, что соответствует коэффициенту Вант-Гоффа (Qi0) равному примерно 2.0[Pechowich, Wang, 1981]. В то время как пассивная проницаемость мембран для ионов имеет Qio равный 1.1-1.3 [Лев, 1975]. Это означает, что температурная зависимость энергопродуцирующего процесса сильнее, чем температурная зависимость энергопотребляющего процесса. А, следовательно, при некоторой критической температуре скорости обоих процессов будут равны. Ниже этой температуры энергетические процессы уже не справляются с пассивными, и возникает риск гибели клеток. Выше этой температуры возможность выживания сохраняется.

Адаптивные изменения, позволяющие выживать при более низких температурах, должны, с одной стороны, активировать процессы синтеза макроэргов, а с другой стороны, снижать скорость пассивной утечки ионов через мембрану.

В наших исследованиях мы показали, что гипотермия 30°С стимулирует дыхание гомогенатов тканей мозга и печени. Эта стимуляция в различных метаболических состояниях колеблется от 30 до 50% (табл.2, 3). Особо важно, что гипотермия 30°С стимулирует фосфорилирующее дыхание, при котором образуется АТФ. Механизм этой стимуляции практически не изучен.

Мы предполагаем, что при гипотермии 30°С снижение температуры ткани запускает ряд процессов, которые направлены на повышение способности митохондрий генерировать АТФ. Можно предположить, что при гипотермии активируются десатуразы - ферменты, создающие двойные связи в жирнокислотных остатках фосфолипидов.

Это с одной стороны, уменьшает вязкость мембран, что может увеличить подвижность белковых комплексов, локализованных в мембране. В митохондриях млекопитающих участники электрон-транспортной цепи, видимо, подвижны и поэтому скорость диффузии белковых комплексов в мембране митохондрий может лимитировать отдельные стадии окислительного фосфорилирования.

В частности, стадии переноса электрона от убихинона на цитохром bcj зависит от коэффициента диффузии убихинона в липидной матрице мембраны.

Гипотермия стимулирует разобщенное дыхание как на сукцинате, так и на глутамате. Это означает, что при гипотермии, возможно, увеличивается подвижность как убихинона, так и цитохрома, поскольку для глута-мата лимитирующей стадией является перенос электрона с НАДИ на уби-хинон, а для сукцината - перенос между цитохромами.

Гипотермия стимулирует также дыхание в состоянии 3. Мы это объясняем повышением активности АТФ-синтетазы.

Согласно современным представлениям АТФ-синтетазы митохондрий - это молекулярная машина, в которой преобразование субстратов происходит вследствие вращения одной из субъединиц внутри полости, образованной другими субъеиницами [Hatefi, 1993]. Это означает, что работа АТФ-синтетазы требует существенной конформационной подвижности, зависящей от вязкости среды, в которую помещен фермент. Поэтому уменьшение вязкости липидов внутренней митохондриальной мембраны может служить причиной увеличения максимальной скорости синтеза АТФ.

В многочисленных исследованиях сотрудников нашей лаборатории и в нашей работе показано, что умеренная гипотермия существенно стимулирует процессы перекисного окисления в ткани мозга [Львова и др., 1993; Кличханов и др., 1997].

Анализ полученных нами данных и литературных источников позволяет предположить, что гипотермия активирует десатуразы, вследствие чего количество жирнокислотных остатков в липидах мембран возрастает [Хочачка, Сомеро, 1988]. Это приводит к двум эффектам. С одной стороны уменьшается вязкость липидов, а с другой стороны, увеличивается содержание субстратов перекисного окисления липидов.

Митохондрии являются основным источником свободных радикалов в клетке. Считается, что приблизительной 2-5% электронов, проходящих через электрон-транспортную цепь, участвует в одноэлектронном восстановлении кислорода до супероксида [1т1ау, Бпёо'шс]!, 1991].

Время жизни супероксидного радикала в водной среде составляет 10"6 сек. Полагая, что коэффициент диффузии для кислорода равен 10"5 см2/сек, получим среднее расстояние проходимое супероксидным анионом за время жизни - приблизительно 1 микрон. Это означает, что большинство радикалов, генерированных в митохондриях, будут окислять липиды мембран митохондрий. А поскольку при гипотермии мы наблюдаем усиление перекисного окисления липидов, то можно предположить, что именно в митохондриальных мембранах происходит увеличение ненасыщенных жирнокислотных остатков при гипотермических состояниях.

Следует отметить, что гипотермия 30°С существенно не повлияла, согласно нашим данным, на перекисное окисление в ткани печени. Это различие, возможно, обусловлено тем, что нейроны гораздо в большей степени зависят от продукции АТФ, чем гепатоциты.

С другой стороны увеличение степени ненасыщенности липидов мембран должно приводить к увеличению их неспецифической проницаемости, в том числе и для ионов. Согласно полученным нами данным гипотермия приводит к стимуляции дыхания в состоянии 2. В этом состоянии скорость дыхания определяется в основном величиной протонной утечки. Поэтому возрастание скорости в состоянии 2 при гипотермии в ткани мозга согласуется с предположением об увеличении степени ненасыщенности липидов внутренних мембран митохондрий.

Увеличение протонной утечки должно приводить к тому, что энергетические расходы клетки возрастают. Согласно данным Brand до 40% рассеиваемой энергии в организме может быть обусловлено утечкой протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану [Brand et al., 1994]. Поэтому с одной стороны активация окислительных процессов может привести к увеличению скорости фосфорилирования АДФ. Однако в состоянии физиологического покоя, когда АТФ не расходуется на совершение физиологической работы, энергопотери могут возрастать за счет увеличения протонной утечки. Таким образом, на стадии активации физиологических процессов изменение свойств внутренней митохондриальной мембраны имеет адаптивное значение. Однако, после фонового подавления физиологической активности, эти же изменения могут сыграть и отрицательную роль. Следует отметить, что при углублении гипотермии от 30° С до 20°С, содержание продуктов перекисного окисления липидов в ткани мозга нормализуется [Кличиханов и др., 1997]. Тем не менее, при гипотермии 20°С скорость потребления кислорода в состоянии 2 выше, чем в контроле. Это говорит о том, что, если обнаруженное нами изменение обусловлено увеличением числа ненасыщенных жирнокислотных остатков в липидах мембран митохондрий, то при углублении гипотермии их количество существенно не изменяется, а уровень перекисного окисления снижается за счет снижения температуры ткани.

Таким образом, увеличение протонной утечки при глубокой гипотермии может вести к увеличению энергетических затрат на поддержание необходимой для синтеза АТФ протондвижущей силы на внутренней мембране митохондрий.

При гипотермии 20°С электрическая активность в мозге практически отсутствует. Одной из причин этого может быть увеличенная протонная утечка. Суслики сохраняют электрическую активность мозга при температуре тела близкой к 0°С [Калабухов, 1985]. Возможно, это отчасти связано с меньшей протонной утечкой, так как известно, что проницаемость плазматической мембраны для ионов Na+ и К+ у гибернаторов меньше [Hall, Willis, 1986].

Введение 2,4-динитрофенола стимулирует дыхание в тканях мозга и печени крыс. Причем увеличение скорости окислительных процессов примерно такое же, как при гипотермии.

Совместное действие этих двух факторов не является аддитивным. Оба фактора вызывают максимально возможное в данных условиях увеличение скорости окислительных процессов.

Однако введение 2,4-динитрофенола, кроме того, снимает торможение оксалоацетатом, что мы связываем с активирующим действием его на изоцитратсинтетазу [Ещенко и др., 1976].

Адаптация к холоду приводит к стимуляции окислительных процессов в тканях печени и мозга уже при нормальной температуре. При этом стимуляция дыхания сопровождается торможением дыхания оксалоацетатом.

Кратковременная и пролонгированная гипотермии 30°С приводят к дальнейшей стимуляции скорости окислительных процессов в различных метаболических состояниях в ткани печени.

В мозге стимуляция дыхания при гипотермии 30°С адаптированных животных по сравнению с печенью значительно меньше. Эти изменения согласуются с данными других авторов об активации окислительных процессов в тканях при адаптации [Волжина, 1991].

Новым является то, что у адаптированных к холоду животных гипотермия вызывает дальнейшее стимулирование дыхания в гомогенатах печени.

Работа митохондриального аппарата несет на себе отпечаток функции, выполняемой клетками соответствующей ткани. С точки зрения неравновесной линейной термодинамики окислительное фосфорилирование может быть описано с помощью коэффициента сопряжения и коэффициента эффективности преобразования энергии, как уже отмечалось в обзоре литературы.

Поток потребления кислорода при окислительном фосфорилирова-нии называют входным потоком, а поток синтеза АТФ — выходным. Стационарное состояние, при котором выходной поток равен нулю, называется состоянием статического напора. В случае окислительного фосфорили-рования это состояние реализуется после исчерпания добавленного АДФ (состояние 4 по Чансу). В полностью разобщенном состоянии выходной поток также равен нулю, вследствие равенства нулю выходной силы. Учет этих обстоятельств приводит к следующему уравнению для коэффициента сопряжения в состоянии статического напора[Сапп8 е! а!., 1998]: q = ^Hh*)sЛh)mc (1).

Коэффициент сопряжения является независимой величиной, которая наряду с Р/О также характеризует сопряженность. Увеличение сопряжения окисления с фосфорилированием должно увеличивать как Р/О, так и ц.

Отношение Р/О находят из отношения количества добавленного АДФ к количеству потребленного для его фосфорилирования кислорода. А ц (коэффициент сопряженности) находят из соотношения У4/У5. Для оценки коэффициента сопряженности необходимо, чтобы величина У5 не искажалась ингибирующим действием оксалоацетата.

В наших экспериментах в ряде случаев, как уже отмечалось выше, У5 оказывалась меньше, чем Уз. И поэтому в этих случаях оценить величину q не возможно. Когда же V5 примерно равна V3 формула (1) может быть использована для оценки коэффициента сопряженности.

В наших экспериментах эта величина имела значения от 0.5 до 0.8. Это заметно меньше, чем значение, соответствующее оптимальному преобразованию энергии. Возможно, что в гомогенатах тканей митохондрии частично разобщаются за счет эндогенных разобщителей, например свободных жирных кислот, для связывания которых обычно используется обезжиренный альбумин.

Согласно данным Cairns et al. (1998) коэффициент сопряженности в митохондриях мозга составляет 0.955 при дыхании на НАД-зависимых субстратах и 0.922 на сукцинате. Для печени - 0.969 и 0.938, соответственно. Авторы делают вывод, что митохондрии мозга и сердца расходуют больше кислорода, но могут производить АТФ с большей скоростью, чем митохондрии печени. Однако митохондрии печени, по-видимому, имеют больший коэффициент эффективности. В тоже время предполагается, что в мозге максимизируется синтез АТФ за счет окисления субстратов цикла Кребса. Авторы считают, что митохондрии мозга и печени по разному настроены на производство АТФ из различных источников. Поэтому можно ожидать, что существенное изменение температуры ткани, влияя как на внутримитохондриальные процессы, так и на процессы в цитозоле, могут вызвать различные реакции митохондриальных систем печени и мозга, поскольку они по-разному ориентированы на внутри- и экстрамитохондри-альные субстраты.

Температурная зависимость дыхания гомогенатов мозга и печени, как уже отмечалось, согласно нашим данным характеризуется эффективной энергией активации порядка 50 кДж/моль. Эта величина описывает температурную зависимость окислительных процессов в митохондриях тканей. Следует отметить, что изменения скорости метаболических процессов в тканях при изменении температуры тела могут не соответствовать температурной зависимости окислительных процессов in vitro. Например, Wang et al. (1997) на изолированных сердцах крысы и суслика обнаружили уменьшение гликолитического потока. Это уменьшение в сердце крыс составило 8 раз при снижении температуры сердца от 37 до 15°С. В то время как скорость окисления глюкозы вообще никак не изменилась при существенном снижении температуры тела.

В целом оценивая полученные нами результаты исследования температурной зависимости окислительных процессов в тканях мозга и печени крыс следует подчеркнуть, что гипотермия 20°С не вызвала изменения температурной зависимости потребления кислорода гомогенатами ткани печени. Это, скорее всего, свидетельствует о том, что серьезных структурных перестроек в митохондриях печени гипотермия не вызывает. В тоже время активация окислительных процессов в гомогенатах печени говорит о том, что активность митохондриального аппарата приведена в соответствие с новыми условиями функционирования, и, следовательно, с новыми потребностями в энергии.

В мозге гипотермия 20°С привела к заметному уменьшению эффективной энергии активации дыхания гомогенатов. Надо полагать, что популяции митохондрий в мозге гораздо более гетерогенны, нежели в печени. Это связано с наличием множества различных медиаторных систем. Например, исследование метаболизма ГАМК-эргических нейронов из мозга мышей в культуре указывает на возможное существование двух типов митохондрий в этих клетках. Одни, из которых содержат цикл Кребса, продуцирующий аспартат, другие - ГАМК [Waagepetersen et al., 1998].Кроме того, в мозге митохондрии находятся в перикарионе (свободные) и в си-наптосомах.

Мы предполагаем, что поскольку именно в области синаптических контактов энергетический обмен особенно интенсивен по сравнению с пе-рикарионом, то влияние гипотермии на энергетику свободных и синаптических митохондрий может быть различным [Sokoloff, 1999]. А именно, для поддержания синаптических функций при снижении температуры тела, следовало бы компенсировать снижение температуры ткани. В то время как в свободных митохондриях гипотермия могла бы даже подавить энергетический метаболизм для сохранения энергии. Уменьшение эффективной энергии активации может быть следствием того, что энергетические процессы в синаптических митохондриях претерпевают температурную компенсацию. Особенностью энергетического метаболизма мозга является способность мозга интенсифицировать гликолиз в аэробных условиях (аэробный гликолиз) [Pellerin, Magistretti, 1996].

В работе [Schurr et al., 1997] показано, что при реоксигенации срезов гиппокампа после пролонгированной гипоксии, добавление лактата в су-перфузионную жидкость приводило к восстановлению синаптической функции. В то время как добавление глюкозы оказалось не эффективным. Эти данные указывают на то, что лактат является более эффективным источником энергии для нейронов, в частности для синаптических процессов.

При гипотермии уровень лактата в мозге повышается [Эмирбеков, Львова, 1985]. Раньше увеличение лактата в мозговой ткани рассматривалось как признак гипоксии. Однако математическое моделирование концентрации кислорода в мозге показало, что гипоксия не наступает ни при умеренной, ни при глубокой гипотермии [Иванов, Кисляков, 1979]. Следовательно, увеличение продукции лактата может быть специализированной адаптацией к снижению температуры тела, поскольку этот субстрат легче утилизируется нейронами. Повышение концентрации лактата в нейронах, должно вести к повышению уровня НАДН, который затем по челночному механизму поступает в митохондрии, где и окисляется дыхательной цепью.

116

Если этот процесс является существенным источником АТФ в нейронах, то следует ожидать температурной компенсации скорости утилизации НАДН и соответственно НАДН-зависимых субстратов. Согласно полученным нами данным уменьшение эффективной энергии активации (признак возможной температурной компенсации) наблюдается при использовании в качестве субстрата окисления смеси глутамат+малат. Этого эффекта не наблюдается при использовании в качестве субстрата сукцина-та. Таким образом, наши данные согласуются с предположением об особой роли гликолиза в ткани мозга.

Подводя итог проведенных нами исследований энергетических процессов в тканях мозга и печени крыс при гипотермических состояниях, можно заключить, что гипотермия активирует энергетический метаболизм в этих тканях. В тоже время реакции в этих тканях на снижение температуры тела отличаются друг от друга. Эти различия мы связываем с различием функций, которые выполняют эти два органа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мирская, Руслана Олеговна, 2000 год

1. Агуреев А.П., Алтухов Н.Д., Мохова E.H., Савельев И.А. Активация внешнего пути окисления НАДН в митохондриях при снижении pH // Биохимия,-1981.-Т.46, вып.11.- С.1945-1956

2. Алимова Е.К., Юфит П.М., Аствацатурьян А.Т., Тарасов E.JI. Влияние гипотермии и последующего самосогревания на состав липидов различных органов и биосинтез их в печени // Изв. Сев.-Кав. научного центра высш. школы. Естеств. науки. 1984. - №3. - С.86-88

3. Алюхин Ю.С. Действие тироксина и 2,4-динитрофенола на энергетику сердца // Физиол. журнал СССР им. И.М. Сеченова.-1976.-Т. LXII, №8.-С.1182-1189

4. Анисимов A.A. (общая редакция) Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1986.-551с.

5. Ахмеров Р. Изменение тканевого дыхания различных органов при воздействии на организм высоких температур среды // Бюлл. эксперим. биол. и мед.-1972.-Т.73, №2.-С.50-51

6. Барбараш H.A. Периодическое действие холода и устойчивость организма // Успехи физиол. наук. 1996. - Т.27, №4. - С. 116-132

7. Биофизика. Под ред. Б.Н. Тарусова, O.P. Колье. М.: Высшая школа, 1986. -467 с.

8. Брустовецкий H.H., Гогвадзе В.Г., Маевский Е.И. Биохимические основы торможения и активации дыхания митохондрий печени гибернирующих сусликов // Биол. науки. 1988. - №4. - С.8-12

9. Ю.Векслер Я.И., Арбуханова М.С. Митохондрии головного и спинного мозга при тяжелой физической работе // Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. Тезисы XI Всесоюзного симпозиума. Пущино.-1981.-С.18

10. Векслер Я.И., Атабегова Н.Г. О регуляции метаболизма митохондрий головного мозга в связи с адаптацией теплокровного организма к холоду // Митохондрии. Биохимические функции в системе клеточных органелл. Сб. ст. М.: Наука, 1969. - С. 15-19

11. Волжина Н.Г. Углеводный и энергетический обмен головного мозга при адаптации к переохлаждениям: Автореф. дисс. докт. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1991. - 45с.

12. Волколаков Я.В., Лацис А.Т. Глубокая гипотермия в кардиохирургии детского возраста. Л.: Медицина, 1977. - 151с.

13. Гасангаджиева А.Г. Антиоксидантная активность тканей адаптированных к холоду крыс при гипотермии и самосогравании: Автореф. дисс. канд. биол.наук. Махачкала, 1999. - 27с.

14. Гурин В.Н. Центральные механизмы терморегуляции. Минск: Беларусь- 1980.- 125с

15. Дедухова В.И., Мохова E.H. Скорости дыхания митохондрий печени в среде с pH 6,5 у адаптированных к гипоксии и контрольных крыс. В кн.: Биохимия митохондрий. Тез. докл.-М.:Наука, 1976.- С. 15-20

16. Демин О.В, Вестерхофф Х.В., Холоденко Б.Н. Математическое моделирование процессов генерации супероксида bei комплексом митохондрий // Биохимия. 1998. - Т.63, вып.6. - С.755-772

17. Диускалиев З.Д. Синтез белка в неопластической и нормальной ткани при гипотермии // Вопросы онкологии. 1974. - №20. - С.67-70

18. Ещенко Н.Д., Прохорова М.И. Механизм регуляции метаболизма лимонной кислоты в головном мозгу // Вопросы биохимии мозга. Ереван, 1976.- С. 79-88

19. Жигачева И.В., Цукерман А.И., Каплан Э.Я. Внешний путь окисления НАДН и вязкость митохондриальных мембран // Биохимия. 1983. - Т.48, вып.2. - С.254-258

20. Иванов К.П., Кисляков Ю.Я. Энергетические потребности и кислородное обеспечение головного мозга. JI.: Наука, 1979.- 215с.

21. Иванова О.И., Сеферова Р.И. Состояние некоторых функций печени при гипертермии // Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. Тезисы XI Всесоюзного симпозиума. Пущино. - 1981. - С.23

22. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М.: Наука. - 1985. - 259с.

23. Кеплен С.Р., ЭссигЭ. Биоэнергетика и линейная термодинамика необратимых процессов. М.: Мир, 1986. - 382с.

24. Кличханов Н.К., Гасангаджиева А.Г., Халдун Авадх Убад, Саидов М.Б. Влияние холодового закаливания и введения даларгина на интенсивность перекисного окисления липидов в тканях при гипотермии // Вестник ДГУ. Естест.науки. 1997. - Вып. 1. - С. 154-156

25. Козловский B.JI. Регуляция кальциевого гомеостаза в нервных клетках // Успехи физиол. наук. 1995. - Т.26, №3. - С. 14-24

26. Кондрашова М.Н., Ананенко A.A. Обследование состояния выделенных митохондрий // Рук-во по изучению биологического окисления полярографическим методом. Сб. статей. М.: Наука, 1973. - С. 106-129

27. Кондрашова М.Н., Озрина Р.Д., Николаева Л.В. Транспорт электронов и накопление энергии в дыхательной цепи как переменно-сопряженные процессы. I. Обзор экспериментальных данных // Митохондрии. Структура и функции. Сб. статей. М.: Наука, 1966. - С.28-39

28. Котык А., Янычек К. Мембранный транспорт. М.: Мир, 1980. - 343с.

29. Кудряшова И.А., Красинская И.П., Ягужинский JI.C. Проблема взаимодействия синтеза АТР и дыхания митохондрий, стимулированного ионами Са2+. Ингибирующее действие олигомицина // Биол. мембраны. 1990. -Т.7, №7. - С.711-717

30. Лакин В. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 300с.

31. Лев A.A. Ионная избирательность клеточных мембран. Л.: Наука, 1975. -323с.

32. Лемешко В.В., Анишкин А.Г. математическое моделирование энергетического сопряжения в митохондриях в рамках протонно-химической гипотезы // Биофизика. 1998. - Т.43, вып.2. - С.308-314

33. Ленинджер А. Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции. М.: Мир, 1966. - 316с.

34. Лукоянова H.A., Мейланов И.С. Влияние внутрибрющинного введения спермина на окислительные процессы в изолированных митохондриях печени крыс при гипотермии // Бюллетень эксперим. биологии и медицины.-1998. Т.125, №5. - С.526-528

35. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние гипотермии и далар-гина на ПОЛ в тканях крыс // Вопр.мед.химии. 1993. - Т.39, №3. - С.21 -24

36. Михайлова Р.И. Влияние гипотермии на окисление и фосфорилирование в мозге крыс // Материалы 3-й Поволжской конф. физиол., биохим. и фар-макол. Горький: ГГУ, 1963. - С.220-221

37. Николс Д.Дж. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. -М.: Мир, 1985.- 192с.

38. Пауков, Хитров Адаптация сердца к гипоксии. М.: Наука, 1985. - 300с

39. Петров С., Гублер Р. Искусственная гипотермия. Ленинград: Медгиз, 1961.-228 с.

40. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1977. - Т.2. - С.84-209

41. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. М.: Мир, 1979.-216с.

42. Семенова Т.С., Швец H.A. Окислительное ферменты и фосфорилирование в митохондриях мозга и сердца при тяжелой форме кислородной недостаточности в условиях гипотермии // Дегидрогеназы в норме и патологии. Под ред. Хватовой Е.М. Горький. - 1980. - С.75-81

43. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. -М.: Высшая школа, 1989. 271с.

44. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. Москва: Наука, 1989.- 404с.

45. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма // Биохимия. 1999. - Т.64, вып. 12. - С. 1679-1688

46. Слоним А.Д. Эволюция терморегуляции. Л.: Наука, 1986. - 76с.

47. Соболев В.И. О терморегуляторном значении гормонов щитовидной железы у крыс, аклимированных к холоду // Физиол.журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1976. - T.LXII, №5. - С.745-749

48. Тимофеев H.H. Искусственный гипобиоз. М.: Медицина, 1983. - 190с.

49. Федотчева Н.И., Проневич Л.А., Миронова Г.Д. Потенциальная активность внешнего пути окисления NADH в митохондриях // Укр. биохим. журн. 1985. - Т.57, №4. - С.38-43

50. Хаскин В.В. Энергетический обмен. В кн.: Экологическая физиология животных. Л.: Наука, 1981. 4.2. - С.379-406

51. Хватова Е.М. Роль субстратов окисления в процессе окислительноо фос-форилирования митохондрий мозга при охлаждении организма и в периодвосстановления температуры тела // Митохондрии. Биохимия и морфология. Сб. ст. М.: Наука, 1966. - С. 36-40

52. Хватова Е.М., Городисская Г.Я., Швец Н. Функциональная активность митохондрий мозга при охлаждении организма в период восстановления температуры тела // Труды 4 Всесоюзн. конф. по биохимии нерв. Системы. -Тарту: ТГУ, 1969. С. 667-676

53. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. -568с.

54. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977.-398с.

55. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы. М.: Мир. 1990. - 384с.

56. Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных. Приспособление и среда. -М.: Мир, 1982. Т. 1.- 414с.бО.Эмирбеков Э.З., Львова С.П. Механизмы биохимических изменений при низких температурах тела. Ростов-на-Дону: РТУ, 1985. - 80с

57. Эмирбеков Э.З., Мейланов И.С., Львова С.П., Кличханов Н.К., Нурмаго-медова П.М., Мусаев Б.С., Халилов Р.А. Клеточные мембраны при зимней спячке // Вестник ДГУ.Естест.науки. 1995. - С.47-69

58. Adelroth P., Sigurdson Н., Hallen S., Brzezinski P. Kinetic coupling between electron and proton transfer in cytochrome с oxidase: Simultaneous measurements of conductance and absorbance changes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1996.-V.93.-P. 12292-12297

59. Adolph E.F. Effects of low body temperature on tissue oxygen utilization //The physiology of induced hypothermia. National Academy of Sciences National Research Council. W., D.C. Proceeding of a Symposium. 1956. - P.8-25

60. Agranoff B.W., Hajra A.K. Lipids. In: Basic Neurochemistry. G. Siegel, B. Agranoff R.W., Albers P.B., Malinoff eds. Raven Press N.Y. 1994. - P.97-116

61. Azzan N.A., Hallenbeck I.M., Kachar B. Membrane changes during hibernation // Nature. 2000. - V.407. - P.317-318

62. Babcock D.F., Herrington J., Park Y-B., Hille B. Mitochondrial participation in the intracellular Ca2+ network // J. Cell Biol. 1997. - V.136. - P.833-843

63. Babcock D.F., Hille B. Mitochondrial oversight of cellular Ca signaling // Curr. Opin. Neurobiol. 1998. - V.8. - P.398-404

64. Becker G.L., Fuskum G., Leninger A.L. Regulation of free Ca by liver mitochondria and endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1980. - Y.245. - P.9009-9012

65. Belke D.D., Wang L.C.H., Lopaschuk G.D. Effects of hypothermia on energy metabolism in rat and Richardson's ground squirrel hearts // J. Appl. Physiol.-1997. V.82, №4. - P.1210-1218

66. Bergstedt K., Hu B.R., Wieloch T. Postishaemic changes in protein synthesis in the rat brain: effects of hypotermia // Exp. Brain Res. 1993.-V.95. - P.91-99

67. Bernardi P., Azzone G.F. ATP synthesis during exogenous NADH oxidation // Biochim. et biophys. Acta.-1982.-V.679, №1.-P. 19-27

68. Bernardi P., Azzone G.F. Cytochrome c as electron shuttle between the outer and inner mitochondrial membranes // J. Biol. Chem.-1981.-V.256, №14.1. P.7187-7192

69. Beutner G., Ruck A., Riede B., Welte W., Brdiczka D. Complexes between kinases, mitochondrial porin and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability transition pore // FEBS Lett.-1996.-V.396.-P.189-195

70. Black P.R., Stephen van Devanter M.D. Effects of hypotermia on systemic and organ system metabolism and function //J.of Swedical Research.- 1976.-V. 20.-P. 49-63.

71. Borle A.B. Control, modulation and regulation of cell calcium // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol.-1981 .-V.90.P. 13-153

72. Brand M., Chein Lee-Feng, Aincow E., Rolfe D., Porter R. The causes and functions of mitochondrial proton leak // Biochim. Et biophys. Acta. Bioenerg. 1994.-V.l 187, №2.-P. 132-139

73. Brand M., Chein Lee-Feng, Diolez P. Experimental discrimination between proton leak and redox slip during mitochondrial electron transport // J. Bio-chem. 1994. - V.297, №1. - P.27-29

74. Brawand F., Folly G., Walter P. Relation between extra- and intramitochondrial ATP/ADP ratios in rat liver mitochondria // Biochim. Biophys. Acta.-1990.-V.590.-P.285-289

75. Busto R., Dietrich W.D., Globus M.Y.-T. et al. Small differences in intrais-chemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neuronal injury // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1987.- V.7. -P. 729-738

76. Cadet J.L., Brannock G. Free radicals and the pathology of brain dopamine systems // Neurochemistry Int. -1998. V.32. - P. 117-131

77. Cairns C.B., Walther J., Harken A.H., Banerjee A. Mitochondrial oxidative phosphorylation thermodynamic efficiencies reflect physiological organ roles // Am. J. Physiol. 1998. - V.274 (Regulatory Integrative Comp.Physiol.43). -P.R1376-R1383

78. Canevari L., Console A., Tendi E. et al. Effect of postischaemic hypothermia on the mitochondrial damage induced by ischaemia and reperfusion in the gerbil // Brain Res.- 1999. V.817. - P.241-245

79. Capaldi R.A. Arrangement of proteins in the mitochondrial inner membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V.694, №3. - P.291-306

80. Chance B., Williams J. The respiratory chain and oxidative phosphorylation // Advan. Enzymol. -1956. V. 17, №1. - P.65-69

81. Ciocatto E., Querci M., Pattono R. Physiopathology of general hypothermia //Minerva Med. 1965. - V.56. - P. 1859

82. Clark J.B., Nicklas W.J. The Metabolism of Rat Brain Mitochondria // J. Biol. Chem. -1970. V.245, №18. - P.4724-4731

83. Crompton M. Role of mitochondria in intracellular calcium regulation / Intracellular calcium regulation/ Ed. F.Bronner. Alan R. Liss Inc., 1990. P. 181-209

84. Dennis S.C., Clark J.B. The pathway of glutamate metabolism in rat brain mitochondria // Biochem. J. 1977. - V.168. - P. 521-527

85. Denton R.M., McCormac J.G. Ca as a second messenger within mitochondria for the heart and other tissues // Am. Rev. Physiol. 1986. - V.52. - P.451-456

86. Denton R.M., McCormac J.G. Ca transport by mammalian mitochondria and its role in hormone action // Am. J. Physiol. 1985. - V.249, №5. - P.E543-E554

87. Dufour S., Rousse N.,Canioni P., et al. Top-down control analysis of temperature effect on oxidative phosphorylation // Biochem. J. 1996. - V.314. - P.743-751

88. Esposti M.D. Inhibitors of NADF-ubiquinone reductase: an overview// Bio-chimica et Biophysica Acta. 1998. - 1364. - P.222-235

89. Farber I.L. The role of culcium in the cell death // Life Sci. 1981. - Y.29, №13. - P.1285-1289

90. Fedotcheva N.I., Mironova G.D., Iliasova E.N., Kolaeva S.F. Appearance of the external pathway of NADH oxidation in mitochondria during hibernation // CryoLetters. 1984. - №5. - P.27-32

91. Fuhrman F.A. Oxygen consumption of mammalian tissues at reduced temperatures // The physiology of induced hypothermia. National Academy of Sciences National Research Council. W., D.C. Proceeding of a Symposium. 1956. - P. 50-51

92. Fuller S.D., Capaldi R.A., Henderson R. Structure of cytochrome c oxidase in deoxycholate-derived two-dimensional crystals // J. Mol. Biol. 1979. - V.134, №2. - P.305-327

93. GalanteY.M., Hatefi Y. Purification and molecular and enzymic properties of mitochondrial NADH-dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophys. 1979. -V.192, №2. - P.559-568

94. Gennis R.B. How does cytochrome oxidase pump protons? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.12747-12749

95. Gunter T.E., Pfeiffer D.R. Mechanism by which calcium mitochondria transport // Am. J. Physiol.-1990.-V.258, №5.-Pt.l.-P.C755-C786

96. Hall A.C., Willis J.S. The temperature dependence of passive potassium permeability in mammalian erythrocytes // Cryobiology. 1986. - V.23. -P.395-405

97. Hatefi Y. ATP synthesis in mitochondria // Eur. J.Biochem. 1992. - V.218. -P.759-767

98. Hoge D.R., Atkinson J., Gill B. et al. Linear coupling between cerebral blood flow and oxygen consumption in activated human cortex // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V.96. - P.9403-9408

99. Ichas F., Mazat J-P. From calcium signaling to cell death: two conformations for the mitochondrial permeability transition pore. Switching from low- to high-conductance state //Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1366. - P.33-50

100. Igushi A. Determination of safe interval of circulatory arrest from the cerebral metabolic aspect // J. IPN Assoc. Thorac. Surg. 1986. - V.34, №9.1. P.1638-1647

101. Imlay J. A., Fridowich I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli // J/Biol/Chem/ 1991. - V.266, №11. - P.6957-6965

102. Inoue M., Nishikawa M., Kasahara E. et al. Role of superoxide, NO and oxygen in the regulation of energy metabolism and suppression of senile diseases // Mech. Of Ageing and Develop. 1999 - V. 111. - P. 89-95

103. Isaitis A.A., Krivicriene L.L. Kinetic characteristics and physiological significance of the intermembrane electron transport in mitochondria // Europ. Bioenerg. Conf. Ref.-Bologna. 1980. - V.l. - P.l 11-112

104. Joseph S.K., Coll K.E., Cooper R.H., Marks J.S., Williamson J.R. Mechanisms Underlying Calcium Homeostasis in Isolated Hepatocytes // J. Biol. Chem.-1983. V.258, №2. - P.731-741

105. Kataoka K., Yanase H. Mild hypothermia a revived countermeasure aganst ischemic neuronal damages // Neurosci. Res. - 1998. - V.32. - P. 103-117

106. Kats S., Wals R.A. Mitochondrial reticular cytostructure in liver cell // Biochem. J. - 1983. - Y.214, №3. - P.795-813

107. Klinberg M., Grebe K., Appel M. Temperature dependence of ADF/ATP translocation in mitochondria // Eur. J. Biochem. 1982. - V.126. - P. 263 -269.

108. Kondrashova M.N., Doliba N.M. Polarographic observation of substratelevel phosphorylation and its stimulation by acetylcholine // FEBS Lett.1989. V.243, №2. P.153-155

109. Kuroda S., Siesjo Bo K. Reperfusion damage following focal ischemia: pathophysiology and therapentic windows // Clinical Neeeuroscience. 1997. -V.4.-P. 199-212

110. Leonard K., Wingfleld P., Arad T., Weiss H. Three-dimensional structure of ubiquinoncytochrome c reductase from Neurispora mitochondria determined by electron microscopy of membrane crystals // J. Molec. Biol. 1981. - V.149. -P.259-274

111. Little D.M. Hypothermia // Anestesiology. 1959. - V.20, №6. - P.842-877

112. Mc Cormack J.G. The effect of spermin on calcium transport in rat heart and liver mitochondria as assessed using the intramitochondrial calcium-sensitive dehydrogenases // Biochem. Soc. Trans. 1987. - V.15, №5. - P.830-831

113. Mc Cormack J.G., Halestrap A.P., Denton R.M. Role of calcium ions in the regulation of mammalian intramitochondrial metabolism // Physiol. Rev.1990. V.70. - P.391-425

114. Miller R.J. The control of Neuronal Ca homeostasis // Progr. Neurobiol.1991. V.37, №3. - P.255-285

115. Mitani A., Kataoka K. Critical levels of extracellular glutamate mediating gerbil hippocampal delayed neuronal death during hypothermia: brain microdi-alysis study // Neuroscience. 1991. - V.42. - P.661-670

116. Nicholls D.G. A role for mitochondrion in the protection of cells against calcium overload // Proc. Brain Res. 1985. - V.63, №1. - P.97-106

117. Nicholls D.G. Intracellular Ca2+ homeostasis // Br. med. Bull. 1986. - V.42, №2. - P.353-358

118. O'Gorman E., Beujner G., Dolder M., Koretsky A.P., Brdiczka D., Walli-man T. // The role of creatine kinase in inhibition of mitochondrial permeability transition//FEBS Lett. 1997. - V.414. - P.253-257

119. Palade J.E. Electron microscopy of cytoplasmic structures. In: Enzymes: Units of Biological Structure and Function (Gabber edit.). NY: Academic Press. -1956. - Chap.9

120. Pechowich D.J., Wang L.C.H. Temperature dependence of mitochondrial Ca transport in a hibernating and non-hibernating ground squirrel //Acta Uni-versitatis Carolinae. Biologica. 1979. - 1981, №9. - P.291-293

121. Pellerin L., Magistretti P.J. Excitatory amino acids stimulate aerobic glycolysis in astrocytes via an activation of the Na+/K+ATPase // Develop.Neurosci. -1996. V. 18, №5-6. - P.336-342

122. Polla B.S., Kantengawa S., Francois D. et al. Mitochondria are selective targets for the protective effects of heat shock against oxidative injury // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. - V.93. - P.6458-6463

123. Popovic V., Popovic P. Hypotermia in biology and in medicine // New York, San-Francisco, London. Grune I. Stratton. -1974

124. Ranson N.A.,White H.E., Saibil H.R. Chaperonins // Biochem. J. 1998. -V.333. - P.233-242

125. Rice M. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain // Trends. Neurochem. J. 2000. - V.23. - P. 206-216

126. Rottenberg H. The generation of proton electrochemical potential gradient by cytochrome c oxidase // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1364. - P. 1-16

127. Rottenberg H., Marbach M. Regulation of Ca transport in brain mitochonj idria. I. The mechanism of spermine enhancement of Ca uptake and retention // BBA Bioenerg. 1990. - V.1016, №1. - P.77-78

128. Sahlin K., Alvestrand A., Brandt R., Hedman S.E. Intracellular pH and bicarbonate concentration in human muscle during recovery from exercise // J. Appl. Physiol. 1978. - V.45, №3. - P.474-480

129. Schurr A., Payne R.S., Miller J.J., Rigor B.U. Brain lactate, not glucose, fuels the recovery of synaptic function from hypoxia upon reoxygenation: an in vitro study // Brain. 1997. - V.744, №1. - P.105-111

130. Sensi S.L., Yin H. Z., Carriedo S.G. et al. Preferential Zn influx through Ca2+-permeable AMPAJ kainate channels triggers prolonged mitochondrial superoxide production // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V.96. - P. 2414-2419

131. Simpson P.B., Russel J.T. Role of mitochondrial Ca regulation in neuronal and glial cell signaling // Brain Res. Rev. 1998. - V.26. - P.72-81

132. Sjostrand F.S. Ultrastructure of cells as revealed by the electron microscope // Intern. Rev. Cytol. 1956. - V.5. - P.455

133. Slater E.C. The Q-cycle an ubiquitous mechanism of electron transfer // Trends in Biochem. Sci. 1983. - V.8, №7. - P.239-242

134. Sokoloff L. Energetics of functional activation in neural tissues // Neuro-chem. Res. 1999. - V.24, №2. -P.321-329

135. Southard I.H., Senzig K.A., Belzer F.O. Effects of hypothermia on canine kidney mitochondria // Cryobiology. 1980. - V.17, №2. - P.148-153

136. Stucki J.W. Thermodynamic optimization of biological energy conversions // Biochem. Soc. Trans. 1983. - V.l 1. - P.45-47

137. Tamimoto M., Okada Y. The protective effect of hypothermia on hippo-campal slices from guinea pig during deprivation of oxygen and glucose //Brain Res. 1987. - V.417, №2. - P.239-246

138. Todd R.D., Douglas M.J. A model for the structure of the yeast mitochondrial adenosine triphosphatase complex // J. Biol. Chem. -1981. V.256, №3. -P.6984-6989

139. Verkhovski M.I., Morgan J.E., Verkhovskaia M.L., Wikstrom M. Translocation of electrical charge during a single turnover of cytochrome c oxidase // Biochim. Biophys. Acta. 1997. - V. 1818. - P.6-10

140. Vigh L., Maresca B., Harwood J.L. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? // TIBS. 1998. - V.23. -P. 369-374

141. Vygodina T.V., Capitanio N., Papa S., Konstantinov A.A. Proton pumping by cytochrome c oxidase is coupled to peroxidase half of its catalytic cycle // FEBS Lett. 1997. - V.412. - P.405-409

142. Wang L.C.H., Lee T.F. Torpor and hibernation in mammals; metabolic, physiological and biochemical adaptations. In:Handbook of Physiology. Fregly M.S. and Blatteis C.M. (eds). Oxford unives. Press. N.Y., 1996. P. 507-531

143. Widmann R., Kuroiwa T., Bonnekoh P., HossmanK.-A. 14C.Leucine incorporation into brain proteins in gerbils after transient ishemia: relationship to selective vulnerability of hyppocampus // J. Neurochem. 1991. - V.57. - P.789-796

144. Wikstrom M., Morgan J.M., Verkhovsky M.I. Proton and electrical charge translocation by cytochrome c oxidase // Biochim. Biophys. Acta. 1997.-V.1318. - P.299-306

145. Williamson J.R., Cooper R.H., Hock J.B. Role of calcium in the hormonal regulation of liver metabolism // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.639, №314. - P.243-248

146. Yan L.-J., Sohal R.S. Mitochondrial adenine nucleotide translocase is modi fied oxidatively during aging // Proc. Natl. Acad. Sci. V.95. - P. 12896 -12901

147. Yarovsky P.J., Ingvar D. Neuronal activity and energy metabolism // Fed. Proc. -1981. V.40, №9. - P.2353-2362