Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Латкин, Александр Тимофеевич

• Латкин, Александр Тимофеевич
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Латкин, Александр Тимофеевич

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ 9 ШИГЕЛЛЕЗОВ

ГЛАВА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА

ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ БАКТЕРИЙ В ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ

ГЛАВА 3. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ КАК 3? МЕТОД ГЕНОИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 2. ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ ШИГЕЛЛ

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ 64 ИМБС в.80ШЕ1, ОПРЕДЕЛЯЕМЫЙ С ПОМОЩЬЮ АТФ-МЕТРИИ И ПОДСЧЕТОМ КОЕ/МЛ

ГЛАВА 4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СОРБЦИИ ИМБС КЛЕТОК 76 в.вОГШЕ!1 ФАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ПЦР

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне»

Актуальность темы. Шигеллезы относятся к числу острых кишечных инфекций, эпидемиологическая значимость которых возрастает как в развитых, так и в развивающихся странах [5]. Отмечен постоянный уровень количества случаев шигеллезов в мире, равный 165 млн случаев в год[81]. В последнее десятилетие число смертельных случаев возросло с 660 тыс до 1 млн 100 тыс в год. В Российской Федерации отмечается сохраняющийся высокий уровень заболеваемости шигеллезами среди населения, включая спорадические случаи и вспышки, в том числе внутрибольничные [5,20]. В Москве (согласно данным Центра Госсанэпиднадзора) на протяжении 1993-1999 гг. возникло 310 эпидемических вспышек острых кишечных инфекций различной этиологии, при этом 81 вспышку (26,1%) вызвали шигеллы Зонне [25].

На этом фоне в связи с возможной контаминацией молока и молочнокислых продуктов бактериями З.эоппе! значительно возросла потребность надежного обнаружения возбудителя в исследуемом материале. Немаловажным остается обследование декретированных групп, в частности, работников пищеблоков, на носительство шигелл. Для определения шигелл в пробах предложено несколько различных методов индикации возбудителя, к которым относится классический бактериологический анализ, иммунофлюоресцентная микроскопия, реакция коагглютинации, иммуноферментный анализ, обнаружение ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции и др.

Появившаяся в последние годы угроза биологического терроризма, периодическое возникновение чрезвычайных ситуаций природного или техногенного происхождения с последующим ухудшением санитарно-эпидемиологической обстановки, наличие природных очагов особо опасных инфекций диктует необходимость дальнейшего совершенствования методов экспресс-индикации возбудителей как одного из ведущих разделов специфической индикации с целью оценки степени опасности эпидемического очага и экспертизы подлежащих исследованию объектов. Высоко чувствительными методами обнаружения возбудителя является обнаружение ДНК с помощью различных модификаций ПЦР и биолюминесцентой АТФ-метрии [10,11,14,15,22,103,127,141].

Практически все известные индикационные методы исследования предусматривают разовый отбор исследуемых проб ограниченного объема, не превышающего, как правило, 1-50 мл. При этом возбудители могут присутствовать в отобранных пробах в низких концентрациях, что требует проведения предварительного концентрирования патогенных микроорганизмов в исследуемых образцах с отделением их от сопутствующей микрофлоры.

Для этого могут быть использованы различные сорбенты, в том числе иммуномагнитные сорбенты, используемые при выделении и идентификации различных патогенных микроорганизмов и их специфических антигенов [14,15]. Магнитные свойства носителей таких сорбентов делают их управляемыми в магнитном поле, что обеспечивает возможность автоматизации процесса при работе с ними. Выступая в качестве твердой фазы, иммуномагнитные сорбенты нашли применение в комплексе с иммунофлюоресцентным, биолюминесцентным и амплификационным методами индикации ряда возбудителей [17,28,127]. Традиционные микробиологические методы: микроскопия мазков и культуральное исследование даже центрифугированных образцов малоэффективны. Экспрессные системы культивирования, в которых используются жидкие питательные среды с радиометрической или флуоресцентной регистрацией результатов, позволяют определить рост бактерий, как правило, в течение 2-х дней. К тому же после регистрации положительного результата бактериального роста требуется еще 5-6 дней для идентификации таксономической принадлежности и молекулярно-биологической характеристики изолированной культуры.

В последнее время внимание широкого круга специалистов привлекают различные экспресс-методы индикации патогенных микроорганизмов как в биологических пробах, объектах окружающей среды, так и в питьевой воде и пищевых продуктах. В этом плане интерес представляет биолюминесцентный метод индикации аденозинтрифосфата микробных клеток (биолюминесцентная АТФ-метрия), в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и люциферина, сопровождающееся выделением энергии в виде излучения фотона. При этом время анализа значительно сокращается по сравнению с рутинными методами, а высокая его чувствительность позволяет определить 500-1000 микробных клеток в 1 мл образца [17,28,127]. Однако биолюминесцентный метод АТФ-метрии неспецифичен, так как и соматические клетки макроорганизма и микробные клетки сапрофитов и патогенов содержат АТФ. В связи с указанным, актуальной является разработка экспресс-метода индикации возбудителя после специфической иммуносорбции микробных клеток. Цель работы - разработка комплексного экспресс-метода индикации З.БОппе! I фазы на основе биолюминесцентной АТФ-метрии после предварительной иммуномагнитной сепарации для идентификации возбудителя в исследуемом материале.

Задачи исследования:

1. Разработать эффективный иммуномагнитный биосорбент (ИМБС), пригодный для иммобилизации сывороточных у-глобулинов против микробных клеток З.БОппе! I фазы.

2. Отработать методику иммуномагнитной сепарации З.Боппе! I фазы из образцов, содержащих смесь бактерий различных таксономических групп, и оценить чувствительность и специфичность метода.

3. Применить сочетанный способ иммуномагнитной сепарации с последующей индикацией микробных клеток З.эоппе! I фазы путем измерения количества бактериального аденозинтрифосфата (АТФ-метрии).

Научная новизна и практическая значимость работы.

- Впервые показана принципиальная возможность использования ферромагнитных носителей, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана, для иммобилизации на композитных частицах у-глобулинов к 8. 80ппе1 I фазы. Примененная методика металлохелатного связывания белков сохраняет специфическую активность у-глобулинов, обеспечивая их прочную фиксацию.

- Разработана технология обнаружения З.БОппе! I фазы после предварительной концентрации микробных клеток в исследуемом материале с помощью иммуномагнитного биосорбента с последующим обнаружением возбудителя путем биолюминесцентной АТФ-метрии. Специфичность связывания биосорбентом клеток З.БОппе! подтверждена в ПЦР с праймерами, выявляющими последовательности плазмидного ¡раН гена шигелл, контролирующего инвазию возбудителя.

- Иммуномагнитная сепарация в сочетании с биолюминесцентной АТФ-метрией позволяет обнаружить жизнеспособные микробные клетки в образце, содержащем 500-1000 бактериальных тел в 1 мл, в то время как с помощью ПЦР выявляется ДНК как живых, так и нежизнеспособных клеток возбудителя.

Комплексный подход, основанный на йммуносорбции Б^оппе! I фазы с последующим проведением АТФ-метрии, позволяет увеличить производительность диагностического лабораторного анализа за счет сокращения времени его проведения. Повышение чувствительности и специфичности метода экспресс-индикации бактерий играет важную роль как при тестировании возбудителей в образцах, так и при оценке контаминации патогенными микроорганизмами объектов окружающей среды.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на Московском обществе Эпидемиологов, Микробиологов и Паразитологов (21 февраля, 2003), XII Международной конференции "Новые технологии в биологии и медицине" (Гурзуф, 2004), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней" (Москва, 19-21 октября 2004). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 16 марта 2005 г.

Объем и структура работы. Работа изложена на 106 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 30 отечественных и 111 зарубежных авторов. Содержит 11 рисунков и 11 таблиц.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Латкин, Александр Тимофеевич

У. выводы

1. Разработан иммуномагнитный биосорбент, полученный на основе иммобилизованных у-глобулинов к Э. 50ппе1 I фазы на композитных феррочастицах размером 2-5 мкм, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана.

2. Для получения иммуномагнитного биосорбента использован металлохелатный способ связывания у-глобулинов, обеспечивающий фиксацию до 80 мг иммуноглобулинов на 1 г носителя. Использованная методика связывания иммуноглобулинов сохраняет специфическую активность антител и обеспечивает их прочную фиксацию. Срок хранения препарата до 6 месяцев.

3. Иммуномагнитный биосорбент позволяет сконцентрировать микробные клетки 8.80ппе1 I фазы из образца, содержащего не менее 0,8+0,2 х 103 КОЕ/мл, что в дальнейшем обеспечивает определение возбудителя в материале с помощью биолюминесцентой АТФ-метрии.

4. Использование диметилсульфоксида для извлечения бактериального АТФ из комплексов "иммуномагнитный биосорбент-бактерии" обеспечивает быстрое высвобождение аденозинтрифосфата и его стабильное сохранение в образце, что значительно ускоряет последующий этап АТФ-метрии.

5. Разработанная методика иммуномагнитной сепарации в сочетании с биолюминесцентной АТФ-метрией обеспечивает концентрацию целевых клеток в 15-20 раз и индикацию шигелл Зонне I фазы в смеси с другими видами бактерий в течение 5-6 часов.

6.Специфичность связывания иммуномагнитным биосорбентом шигелл Зонне I фазы подтверждена в ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности плазмидного 1раН гена, контролирующего инвазию возбудителя в эпителий кишечника.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в процессе работы разработана методика иммуномагнитной сепарации и показано, что при использовании металлохелатного связывания очищенных гамма-глобулинов сохраняется специфическая активность антител и обеспечивается их прочная фиксация. Последующее использование биолюминесцентной АТФ-метрии завершает обнаружение жизнеспособных целевых микробных клеток, захваченных иммуномагнитным биосорбентом. На модели шигелл подтверждено, что величина светового потока в происходящей реакции биолюминесценции прямо пропорциональна количеству бактериальных клеток, из которых высвобождается АТФ. Продемонстрирована принципиальная возможность использования иммуномагнитного биосорбента с гамма-глобулинами к 8.Б0Ппе1 I фазы, иммобилизованными на феррочастицах, для специфической сорбции шигелл. Специфичность гамма-глобулиновой фракции показана отсутствием реакции агглютинации на стекле с бактериями эталонных штаммов 16 видов бактерий различных таксономических групп. Эффект специфической сорбции клеток 8.зоппе1 I фазы подтвержден результатами постановки ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности гена инвазивности (¿раН). Иммуномагнитный биосорбент извлекает также и нежизнеспособные клетки шигелл. В этом случае использование АТФ-метрии позволяет определять в материале только жизнеспособные клетки возбудителя. Применение ПЦР, выявляющей специфические последовательности ДНК возбудителя в данном случае не позволяет дифференцировать в пробе жизнеспособные клетки от инактивированных, что выгодно отличает АТФ-метрию от использованного в работе амплификационного метода. Изучение влияния на иммуносорбцию температуры, обогащение проб глюкозой, времени сорбции и возраста бактериальных клеток на результаты биолюминесцентной АТФ-метрии позволили определить оптимальные условия для проведения иммуномагнитной сепарации с последующей детекцией З.БОппе! I фазы биолюминесцентной АТФ-метрией. Иммуномагнитная сепарация не только концентрирует и ускоряет, но и обеспечивает специфичность метода обнаружения возбудителя при последующем использовании метода АТФ-метрии. Эксперименты на поликомпонентных бактериальных суспензиях при использовании иммуномагнитной сепарации позволили выявлять З.БОппе! I фазы из образцов, содержащих 500-1000 клеток в 1 мл, концентрируя их в 10-20 раз, что подтверждалось регистрацией биолюминесцентного сигнала АТФ-метрии, статистически значимая величина которого соответствовала концентрации 2,5±0,5 х 104 КОЕ/мл. Иммуномагнитный биосорбент позволяет сконцентрировать микробные клетки З.БОПпе! I фазы из образца, содержащего не менее 0,8±0,2 х

1(Г КОЕ/мл, что в дальнейшем обеспечивает определение возбудителя в материале с помощью биолюминесцентой АТФ-метрии.

Было показано, что предел концентрационной чувствительности метода иммуномагнитной сорбции с последующей индикацией шигелл Зонне с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии практически идентичен чувствительности ПЦР, значительно превосходящих чувствительность других известных экспресс-методов индикации возбудителей. Как нами отмечено выше, может возникать ситуация, когда образец для лабораторного анализа значительно разводится, например, при экстракции бактериальных возбудителей из твёрдых пищевых продуктов или из консервированных субстанций. В этом случае возникает проблема с предварительным концентрированием микробов из большого объёма водной фазы. Используемое в ряде подобных случаях центрифугирование является достаточно сложной (необходимы большие ускорения для больших объёмов), опасной (значительный контакт с потенциально загрязнённым материалом) и малоэффективным (осадок может содержать подавляющее количество посторонних примесей, ингибирующих АТФ-метрию).

С теоретических позиций достаточно просто предсказать, что данную проблему легко решить с использованием селективных сорбентов. Вот почему наши исследования были направлены на изыскание методов селективной сорбции.

Было сочтено целесообразным отработать метод иммуномагнитной сепарации. В этом методе используются магнитоносители с ковалентно связанными антителами (гамма-глобулинами). В данном исследовании использован иммуномагнитный биосорбент (ИМБС), несущий антитела к 8.Боппе1 I фазы. После этапа антиген-антительного взаимодействия, искомые бактериальные клетки плотно сорбируются на магнитоносителе. Собрать из объёма сорбированный на ИМБС материал не представляется сложным с помощью наружного постоянного магнитного поля у дна пробирки.

С позиций нашего интереса, индикация шигелл в молоке требовала решения ряда сложных проблем. Во-первых, сам биоматериал по составу относится к числу наиболее сложных. Во-вторых, это достаточно многокомпонентная и агрессивная среда (наличие гидролитических энзимов, способных разрушать образуемые антиген-антительные комплексы). Наконец, условия подготовки образца к исследованию предполагают значительные разведения, что приводит к снижению титра клеток возбудителя, в данном случае, 8.зоппе1 I фазы. Вот почему установление принципиальной возможности селективного концентрирования шигелл в образце актуально для практической бактериологии в целом.

Собранный магнитно-сорбционный материал, освобожденный от молока путем отмывания в магнитном поле, подвергался лизису с помощью ДМСО.

Установлено, что только при концентрации S.sonnei I фазы в магнитно-сорбционном материале порядка 103 - 104 клеток в мл подобранные условия АТФ-метрии позволяют отчётливо детектировать присутствие возбудителя. Следует отметить, что биолюминесцентная АТФ-метрия все же несколько более чувствительна, хотя и неспецифична. Однако ее постановка осуществляется намного быстрее, чем ПЦР, и в отличие от последней детектирует только жизнеспособные микробные клетки.

Известно, что классический бактериологический анализ трудоемок и длителен. Ответ на присутствие в пробе S.sonnei может быть получен после изоляции культуры и ее последующей идентификации по биохимическим и серологическим свойствам. Разработанный комплексный подход, основанный на иммуносорбции S.sonnei с помощью специфических магнитных антител с последующим проведением АТФ-метрии или ПЦР позволят улучшить лабораторный анализ, увеличив его производительность и сократить время исследования. Предварительное обогащение пробы и последующее использование ПЦР или АТФ-метрии позволят осуществить индикацию S.sonnei в течение 5-6 часов. В работе продемонстрирована принципиальная возможность использования магнитоносителей с иммобилизованными антителами для индикации шигелл. В плане адаптации метода к требованиям практики санэпидслужбы максимально упрощена методика подготовки образцов к исследованию и показана принципиальная возможность детекции инвазивных штаммов S.sonnei. Вместе с тем, для широкого внедрения апробированных подходов в практическую деятельность бактериологических служб, предстоит решить проблему организации производства магнитоносителей с иммобилизованными специфическими антителами и обеспечения лабораторий люминометрами.

90

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Латкин, Александр Тимофеевич, 2005 год

1. Бондаренко В.М. "Острова" патогенности бактерий. Журн. микробиол. 2001, 4, 67-74.

2. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. Журн. микробиол. 1999, №5, с.34-39.

3. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условнопатогенных бактериях. Журн. микробиол., 1997, №4, с.20-26.

4. Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Угарова H.H. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы. Приклад, биохим. 1991,27(1): 134-140.

5. Бухарин О.В., Бондаренко В.М., Малеев В.В. Шигеллы и шигеллезы. Екатеринбург.,2003.

6. Воробьев A.A., Гинцбург А.Л., Бондаренко В.М. Мир микробов. Вестник РАМН. 2000, 11:11-14.

7. Воробьев A.A., Бондаренко В.М.,Шабанова H.A., Фиалкина C.B. ПЦР тест-системы для геноиндикации энтерогеморрагическихэшерихий. Журн. микробиол., 2000, №6, с.90-94.

8. Гинцбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний. Журн. микробиол. 1998, 3:86-95.

9. Государственный доклад "О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2001 году". М., 2002.

10. Греков Л.И., Владимцева И.В., Ефременко В.И. и др. Способ получения сорбента. A.C. 1643073 от 23.04.91.

11. П.Дементьева Е.И.,Угарова Н.Н.,Кобболд П.Х. Измерение АТР в интактных клетках Eschèrichia coli, содержащих рекомбинатную люциферазу светляков. Биохимия.1996,61(7):1285-1293.

12. Духович А.Ф., Ефимов А.И., Щеголев A.A. и др. Инактивация люциферазы светляков длинноцепочечными производными холина. Биохимия. 1993,58(4):648-654.

13. Егорова Т.Н., Бондаренко В.М., Зверев Д.В. и др. Роль бактериальных токсинов в патогенезе гемолитико-уремического синдрома, вызываемого энтерогеморрагическими эшерихиями. Журн. микробиол. 2001, №1, с.82-89.

14. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней. Журн. микробиол. 1997, 2:102-106.

15. Ефременко В.И., Кальной С.М. Способ получения сорбентов. A.c. SU. 2070439 от 20.12.96.

16. Карцев А.Д. Цикличность и прогнозирование заболеваемости шигеллезами в России. Журн. микробиол. 2000, 1:57-60.

17. Кузиков А.Н., Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Применение биолюминесцентного метода определения бактериального аденозинтрифосфата (АТФ-метрии) в микробиологии. Журн. микробиол. 2003, 1:80-89.

18. Мавзютов А.Р., Латкин А.Т., Бондаренко В.М.Ингибиторы полимеразной цепной реакции. Журн. микробиол. 2003, 3:93-98.

19. Орлова К.А., Мазепа В.Н., Махова М.А. и др. Выявление генов факторов патогенности в клинических изолятах энтеробактерий методом ПЦР. В сборнике "Генодиагностика инфекционных болезней". М.,2004.Том.2. С.96-98.

20. Савицкая К.И., Миронов А.Ю., Аваш Ю.Б. и др. Мониторинг возбудителей острых кишечных инфекций в регионе Московской области. Журн. микробиол. 2002, 6:10-13.

21. Солодовников Ю.П., Волкова H.A., Зайцев Б.Е. и др. Динамика нозологической структуры эпидемических вспышек кишечных инфекций в Москве в последние годы. Журн.микробиол. 2001, 2:120-122.

22. Шабанова H.A., Бондаренко В.М., Кузиков А.Н. и др. Биомагнитная сепарация с последующей ПЦР-индикацией энтерогеморрагических эшерихий. В сб. материалов "Генодиагностика инфекционных болезней". М., 2004. Том.2. С.141-143.

23. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы. Вестн.РАМН. 2000,1:22-28.

24. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ (Обзор). Биохимия. 1993, 58 (9):1352-1372.

25. Филиппов В.И., Владимирский М.А., Андросова М.В. Мартрица иммуносорбента. Патент РФ № 2140084.-1999.

26. Фрунджян В.Г., Бабунова B.C., Бровко Л.Ю. и др. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока. Прикладная биохимия и микробиол. 1999,35(3): 1-7.

27. Alamanos Y., Maipa V., Levidiotou S.,Gessouli E. A community waterborne outbreak of gastro-enteritis attributed to Shigella sonnei. Epidemiol.Infect.2000, 125(3):499-503.

28. Amicosante M., Richeldi L., Trenti G., Paone G., Campa M., Bisetti A., Saltini С. Inactivation of polymerase inhibitors for Mycobacterium tuberculosis DNA amplification in sputum by using capture resin. J.Clin.Microbiol. 1995, 33: 629-630.

29. Beckers В., Lang H.R. Rapid diagnosis of bacteriemia by measuring bacterial ATP in blood culture bottles using bioluminescence.Med.Microbiol.Immunol. 1983,172(2): 117-122.

30. Blais B.W., Booth R.A., Philippe L. et al. Polymacron™ Enzyme Immunoassay system for detection of Escherichia coli 0157 inoculated into foods. J. Food Protection. 1997, 60: 98-101.

31. Blostein J. Shigellosis from swimming in park pond in Michigan. Publ.Health Rep. 1991,7(5):317-322.

32. Bossuit R. A 5-minute ATP platform test for judging the bacteriological quality of raw milk. Neth.Milk Diary J. 1982,36:355-364.

33. Calvert R.M.,Hopkins H.C.,Reilly M.J. et al. Caged ATP-an internal calibration method for ATP bioluminescence assays.Lett.Appl.Microbiol.2000,30(3):223-227.

34. Chen M., Delpech V.,0'Sullivan B.,Donovan B. Shigella sonnei: another cause of sexually acquired reactive arthritis. Int.J.STD AIDS. 2002, 13(2):135-136.

35. Chen K.T., Chen C.J., Chiu J.P. A school waterborne outbreak involving both Shigella sonnei and Entamoeba histolytica. J Environ. Health. 2001, 64(4):9-13.

36. Codita I., Popesku C. Rapid test for the detection of methicilline-resistance of staphylococci by ATP-dependent bioluminescence. Roum.Arch.Microbiol.Immunol. 1996, 55(4):323-331.

37. Corbitt A.J.,Bennion N.,Forsythe S J. Adenylate kinase amplification of ATP bioluminescence for hygiene monitoring in the food and beverage industry.Lett.Appl.Microbiol.2000,30(6):443-447.

38. Davidson C.A.,Griffith C.J.,Peters A.C. et al. Evaluation of two methods for monitoring surface clean-line ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing.Luminescence.l999,14(l):33-38.

39. De Filippes F.M. Decontaminating the polymerase chain reaction. BioTechniques. 1991, 10: 26-30.

40. De Lomas J.G., Sunzeri F.J., Busch M. P. False-negative results by polymerase chain reaction due to contamination by glove powder. Transfusion. 1992, 32: 83-85.

41. Deneer H.G., Knight I. Inhibition of the polymerase chain reaction by mucolytic agents. Clin.Chem. 1994, 40: 171-172.

42. DiMichele L.J., Lewis M.J. Rapid, species-specific detection of lactic acid bacteria from beer using the polymerase chain reaction. J.Am.Brew.Chem.Soc. 1993, 51: 63-66.

43. Dorward D.W., Garon C.F. DNA is packaged within membrane-derived vesicles of gram-negative but not gram-positive bacteria. Appl.Environ.Microbiol. 1990, 56: 1960-1962.

44. Espy M.J., Smith T.F., Persing D.H. Dependence of polymerase chain reaction product inactivation protocols on amplicon length and sequence composition. J.Clin.Microbiol. 1993, 31: 2361-2365.

45. Fleet J.C. A new role for lactoferrin: DNA binding and transcription activation. Nutr.Rev. 1995, 53: 226-227.

46. Fleming C.A., Caron D., Gunn J.E. et al. An outbreak of Shigella sonnei associated with a recreational spray fountain. Am.J.Public Health.2000, 90(10):1641-1642.

47. Fluit A.C., Widjojoatmodjo M.N., Verhoef J. Detection of Salmonella species in fecal samples by immunomagnetic separation and PCR. J.Clin.Microbiol. 1995, 33: 1046-1047.

48. Furrer B., Candrian U., Wieland P., Luthy J. Improving PCR efficiency. Nature. 1990, 346: 324.

49. Gannon V.P.J., King R.K., Kim J.Y., Goldsteyn Thomas E.J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl.Environ.Microbiol. 1992, 58: 3809-3815.

50. Garcia-Fulgueiras A., Sanchez S., Guillen J.J. et al. A large outbreak of Shigella sonnei gastroenteritis associated with consumption of fresh pasteurised milk cheese. Eur J Epidemiol. 2001;17(6):533-538.

51. Gastrin B.,Gustafsson R.,Lundin A. Evaluation of bioluminescence assay for the detection bacteriuria.Scand.J.Infect.Dis. 1989,21 (4):409-419.

52. Gibson J.R., Sutherland K., Owen RJ. Inhibition of DNAse activity in PFGE analysis of DNA from Campylobacter jejuni. Lett.Appl.Microbiol. 1994, 19: 357-358.

53. Gericke B., Liesegang A., Reissbrodt R. Analysis of foodborne Shigella sonnei outbreak in Northern Europe by conventional and molecular methods. Med.Microbiol.Lett. 1995, 4:165-172.

54. Girotti S., Ferri E., Cascione M.L.et al. Methodological problems of direct bioluminescent ATP assay in platelets and erythrocytes. Analyt. Biochem. 1991,192:350-357.

55. Gracia E.,Fernandez A.,Conchello P. et al. In vitro development of S.aureus biofilms using slime-producing variant and ATP-bioluminescence for automatic bacterial quantification.Luminescence.l999,14(l):23-31.

56. Grif K., Diench M.P., Allerberge, F. Dynabeads plus 3M petrifilm HEC versus Vitek immunomagnetic assay system for detection of E. coli 0157 in minced meat. Lett.Appl. Microbiol. 1998, 26: 199-204.

57. Griffiths, M.W. The role of ATP bioluminescence in the food industry: new light on old problems. Food Technol.1996, 50: 62-73.

58. Griffiths M.W. Bioluminescence and the food industry. J. Rapid Methods and Automation in Microbiology. 1995, (4):65-75.

59. Griffiths M.W. Application of bioluminescence in the dairy industry. J. Dairy Science. 1993,76(10):3118-3125.

60. Jacobsen C.S., Rasmussen O.F. Development and application of a new method to extract bacterial DNA from soil based on separation of bacteria from soil with cation-exchange resin. Appl.Environ.Microbiol. 1992, 58: 2458-2462.

61. Hallander H.O., Kallner A., Lundin A. et al. Evaluation of rapid methods for the detection of bacteriuria in primary health care. Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.l986,33(Sect.B):39-49.

62. Himba A.M., Jassim S.A., Griffiths M.W. In vivo bioluminescence to detect the attachment of L-form of Listera monocytogenes to food and clinical contact surfaces. Int.J.Food Microbiol. 1996, 33(2-3): 157-167.

63. Höjer H., Nilsson L., Änsehn S. et al. Evaluation of a rapid semiautomated bioassay of antibiotics. Curr. Chemother. 1978,1:523-525.

64. Huang S.W., Chang T.C.Specific identification of Escherichia coli 0157:H7 by an immunostick method using commercially available antibodies. J. Food Protect. 1996, 59: 670-674.

65. Jung R., Lubeclce C., Wagener C., Neumaier M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. BioTechniques. 1997, 23: 24-28.

66. Kapperud G., Rorvik L.M., Hasseltvedt V. et al. Outbreak of Shigella sonnei infection traced to imported iceberg lettuce. J.Clin.microbial.1995, 33(3):609-614.

67. Katcher H.L., Schwartz I. A distinctive property of Tth DNA polymerase: enzymatic amplification in the presence of phenol. BioTechniques. 1994, 16: 84-92.

68. Katzman M. Use of oil overlays in "oil-free" PCR technology. BioTechniques. 1993, 14: 36-40.

69. Keene W.E., McAnulty J.M., Hoesly F.C. et al. A swimming-associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli 0157:H7 and Shigella sonnei.N.Eng.J.Med.1994, 331(9):579-584.

70. Khan G., Kangro H.O., Coates P.J., Heath R.B. Inhibitory effects of urine on the polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA. J.Clin.Pathol. 1991, 44: 360-365.

71. Kim D.W. Real-time quantitative PCR. Exp. Mol.Med. 2000, 21:101109.

72. Koba T., Arisawa K., Ryu S. et al. An epidemiological study on Shigella sonnei outbreak associated with contaminated drinking water— Nagasaki, Japan, 1998. Nippon Koshu. Eisei. Zassi.2001, 48(11): 903-913.

73. Kotloff K.L., Winickoff B., Ivanoff B. et al. Global burden of Shigella infection: implication for vaccine development and implementation. Bull.WHO.1999, 77:651-656.

74. Kreader C.A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32: protein. Appl.Environ.Microbiol. 1996, 62: 1102-1106.

75. Lang H.R., Beckers S.B. Rapid detection of positive blood cultures with bioluminescence assay in comparison to Gram staining. Zbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.(A).l 984,25 8(4):464-471.

76. Lantz P.-G., Tjerneld F., Borch E. et al. Enhanced sensitivity in PCR detection of Listeria monocytogenes in soft cheese through use of an aqueous two-phase system as a sample preparation method. Appl.Environ.Microbiol. 1994, 60:3416-3418.

77. Lappalainen J., Loikkanen S., Havana M. et al. Microbial testing methods for detection of residual cleaning agents and disinfectants-prevention of ATP bioluminescence measurements errors in the food industry. J.Food Prot.2000, 63(2): 210-215.

78. Lau J.Y.N., Qian K., Wu P.C., Davis G.L. Ribonucleotide vanadyl complexes inhibit polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2777.

79. Lee J.Y., Deininger R.A. Detection of E.coli in beach water within 1 hour using immunomagnetic separation and PCR ATP bioluminescence. Luminescence.2004, 19:31-36.

80. Lima A.A., Sidrim J.J., Lima N.L. et al. Molecular epidemiology of multiply antibiotic-resistant Shigella flexneri in Fortaleza, Brazil. J.Clin.Microbiol. 1997,35:1061 -1065.

81. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993,362: 709-715.

82. Lindqvist R., Norling B., Lambertz S.T. A rapid sample preparation method for detection of food pathogens based on buoyant density centrifiigation. Appl.Microbiol. 1997, 24: 306-310.

83. Lin C.S., Wang T.K., Tsai J.L. et al. Relatedness of Shigella sonnei isolates from six outbreaks in Tao-Yuan area, Taiwan. J.Micobiol.Immunol.Infect.l999,32(4):278-282.

84. Litwin C.M., Leonard R.B., Carroll K.C. et al .Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid DNA analysis and pulsed-gield gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J.Infect.Dis.1997,175:864-870.

85. Liu P.Y., Lau Y.J., Shyr J.M. et al. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing methods. J.Clin.Microbiol.1995, 33:1779-1783.

86. Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass enzymes and metabolites. Methods Enzymol. RT C. 2000,305:346-370.

87. Maguire H.C., Seng C., Chambers S. et al. Shigella outbreak in a school associated with eating .canteen food and person to person spread. Common Dis.Public.Health. 1998, 1(4): 279-280.

88. Matsumoto M., Suzuki Y., Saito M. et al. Epidemiologic study of Shigella sonnei from sequential outbreaks and sporadic cases using different typing techniques. Microbiol.Immunol.1998, 42(4):259-264.

89. McCall B., Stafford R.,Cherian S. et al. An outbreak of multi-resistant Shigella sonnei in a long-geriatric nursing centre. Commun.Dis.Intell.2000,24(9):272-275.

90. Meier A., Persing D.H., Finken M., Bottger E.C. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implicationsfor a general approach to detection of uncultured pathogens. J.Clin.Microbiol. 1993,31: 646-652.

91. Mermel L.A., Josephson S.L., Dempsey J. et al. Outbreak of Shigella sonnei in a clinical microbiology laboratory. J.Clin.Microbiol. 1997, 35(12):3163-3165.

92. Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A. et al. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. J.Clin.Microbiol. 1997, 35: 995-998.

93. Nataro J.P.,Seriwatana J.,Fasano A. et al. Identification and cloning of a novel plasmid-encoded enterotoxin of enteroinvasive E.coli and Shigella strains.Infect.Immun.l995,63(12):4721-4728.

94. Nilsson L.E., Molin Ö., Ansehn S.et al. Bioluminescent assay of bacterial ATP for rapid detection of bacterial growth in clinical blood cultures. J. Biolumin.Chemilumin. 1989, 3(3): 101-104.

95. Niroomand F., Lord C. Comparison of rapid technique for the detection of Escherichia coli 0157:H7. J. Rapid Method. Automat. Microbiol. 1994,3:85—96.

96. Oleen P., Lantz P.-G., Backman A., Radstrom P. Rapid diagnosis of bacterial meningitis by a seminested PCR strategy. Scand.J.Infect.Dis. 1995, 27: 537-539.

97. Pass M. A., Odedra R. Batt R. M. Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(5): 20012004.

98. Partis L., Newton K., Murby J., Wells R.J. Inhibitory effects of enrichment media on the Accuprobe test for Listeria monocytogenes. Appl.Environ.Microbiol. 1994, 60: 1693-1694.

99. Paton A. W., Paton J.C. Detection and characterization of shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E.coli hlyA, rfbOlll, and rfb0157. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(2): 598-602.

100. Persing D.H, Cimino G.D. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; 1993: 105-21.

101. Pollard P.R., Johnson W.M., Lior H. et al. J.clin.microbiol.1990,28:540-545.

102. Powell H.A., Gooding C.M., Garrett S.D., Lund B.M., McKee R.A. Proteinase inhibition of the detection of Listeria monocytogenes in milk using the polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 1994, 18: 59-61.

103. Prince A.M., Andrus L. PCR: how to kill unwanted DNA. BioTechniques. 1992, 12: 358-360.

104. Raina K., Chandlee JJVi. Recovery of genomic DNA from a fungus (Sclerotinia homoeocarpa) with high polysaccharide content. Bio-Techniques. 1996,21: 1030-1032.

105. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int.J.Food Microbiol. 1992, 17: 37-45.

106. Sarkar G., Sommer S.S. Shedding light on PCR contamination. Nature. 1990, 343: 27.

107. Saulnier P., Andremont A. Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 1992, 30: 2080-2083.

108. Simon M.C., Gray D.I., Cook N. DNA extraction and PCR methods for the detection of Listeria monocytogenes in cold-smoked salmon. Appl.Environ.Microbiol. 1996, 62: 822-824.

109. Stambach M.N., Falkow S., Tomkins L.S. Species-specific detection of Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. J.Clin.Microbiol. 1989, 27: 1257-1261.

110. Sakakibara T., Murakami S., Nattori N.et al. Enzymatic treatment to eliminate the extracellular ATP for improving the detectability of bacterial intracellular ATP. Analyt.Biochem.1997, 250:157-161.

111. Sarkis G.J., Jacobs W.R., Hatfull G.F. L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria. Mol. Microbiol. 1995,15(6): 1055-1067.

112. Schifman R.B., Wieden M., Brooker J.et al. Bacteriuria screening by direct bioluminescence assay of ATP. J. Clin. Microbiol. 1984, 20(4):644-648.

113. Selan L., Berlutty F., Passariello C. et al. Reliability of bioluminescence ATP assay for detection of bacteria. J. Clin. Microbiol. 1992, 30(7): 1739-1742.

114. Sobel J., Cameron D.N., Ismail J. et al. A prolonged outbreak of Shigella sonnei infections in traditionally observant Jewish communities in North America caused by a molecularly distinct bacterial subtype. J.Infect.Dis.1998, 177(5): 1405-1409.

115. Stewart G.S., Denyer S.P., Lewington J. Microbiology illuminated: gene engineering and bioluminescence. Trends Food Sci.Technol. 1991,2(1):7-10.

116. Stewart G.S., Williams P. Lux genes and the application of bacterial bioluminescence. J. Gen.Microbiol. 1992,138:1289-1300.

117. Sun W., Khosravi F.,Albrechtsen H.et al. Comparison of ATP and in vivo bioluminescence for assessing the efficiency of immunomagnetic sorbents for live E.coli 0157:H7 cells.J.Appl.Microbiol.2002,92:1021-1027.

118. Talcenaka T. An ATP bioluminescence assay for the analysis of bacteria biofilms. Kansenhogaku Zasshi.l994,68(6):759-766.

119. Tornieporth et al. J.Clin.Microbiol.1995, 33: 1371-1374.

120. Tsai Y.-L., Olson B. H. Detection of low numbers of bacterial cells in soils and sediments by polymerase chain reaction. Appl. Environ.Microbiol. 1992,

121. Tu S.I., Patterson D., Briggs C. et al. Detection of immunomagnetically captured Escherichia coli 0157:H7 by antibody-conjugated alkaline phosphatase. J.Industr.Microbiol.2001, 26:345-349.

122. Vaneechoutte M., Van Eldere J. The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology. J.Med.Microbiol. 1997, 46: 188-194.

123. Vesley D., Hartman H.M. Laboratory-acquired infections and injuries in laboratories: a 1986 survey. Am.J.Publ.Health.l988, 78:1213-1215.

124. Walker A.J., Holah J.T., Denyer S.P. et al. The antibacterial activity of Virkon measured by colony growth and bioluminescence of lux recombinant L.monocytogenes. Lett. Appl.Microbiol. 1992,15:80-82.

125. Wernars K., Delfgou E., Soentoro P.S., Notermans S. Successful approach for detection of low numbers of enterotoxigenic Escherichia coli in minced meat by using the polymerase chain reaction. Appl.Environ.Microbiol. 1991,57: 1914-1919.

126. Wheat P.F., Spenser R.C., Hastings J.G. A novel luminometer for rapid antimicrobial susceptibility tests on gram-positive cocci by ATP bioluminescence.J.Med.Microbiol.1989, 29(4):277-282.

127. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl.Environ.Microbiol. 1997,. 10: 3741-3751.

128. Wilson I.G., Cooper J.E., Gilmour A. Some factors inhibiting amplification of the Staphylococcus aureus enterotoxin CI (sec 1) by PCR. Int.J.Food Microbiol. 1994, 22: 55-62.

129. Yamada S.,Ogata K.,Rato R. et al. Outbreak case caused by different colicin type of Shigella sonnei in a day nursery in Tokyo (1998). Kansenshogaku Zasshi. 1999,73(11):1130-1139.

130. Young C., Burghoff R.L., Keim L.G. et al. Polyvinylpyrrolidone-agarose gel electrophoresis purification of polymerase chain reaction-amplifiable DNA from soils. Appl.Environ.Microbiol. 1993, 59: 1972-1974.

131. Yu N., Bruno J.G, Immunomagnetic-electrochemiluminiscent detection of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water samples. Appl. Envir. Microbiol. 1996 62: 587-592.