Иммунологические методики в комплексном анализе микрообъектов судебно-биологической экспертизы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.24, кандидат медицинских наук Александрова, Вера Юрьевна

• Александрова, Вера Юрьевна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Александрова, Вера Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Основные иммунологические методы для установления групповой принадлежности по системе АВО.

1.2Использование моноклональных антител в традиционных и новых методах СМЭВД.

1.3Выявление антигенов системы АВО в различных объектах СМЭВД.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Моноклональные антитела.

2.2Получение глобулиновой фракции с помощью высаливания сульфатом аммония.

2.3 Получение глобулиновой фракции гель-фильтрацией.

2.4Получение антител, меченных флуоресцеином.

2.5Получение конъюгата МКА с пероксидазой хрена.

2.60бъекты исследования.

2.7Иммунологические методики.

2.7.1 Методика дот-ИФА.

2.7.2 Основная схема РАЭ.

3 УСТАНОВЛЕНИЕ ГРУППОВЫХ СВОЙСТВ ПЯТЕН КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

3.1 Выбор модификации РАЭ для выявления АВН антигенов в следах крови с использованием МКА.

3.2Изучение возможности использования гель-фильтрации для исследования серийных образцов крови.

4 ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСЛЕДОВ СЛЮНЫ В СИСТЕМЕ КОМПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА.

4.1 Одностадийный дот-ИФА для выявления ABH-Lewis антигенов.

4.2Раздельное выявление АВН антигенов в клеточном осадке и жидкой части слюны методом РАЭ.

4.3 Стандартизация условий проведения иммунологических реакций.

5 ВОЗМОЖНОСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧАСТИЦ ПЕРХОТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

6 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ АВО В МИКРОФРАГМЕНТАХ ВОЛОС.

6.1 Подбор МКА, методов их очистки, условий хранения и необходимых титров для исследования волос.

6.2Особенности пробоподготовки и проведения РАЭ при выявлении антигенов системы АВО в микрофрагментах волос.

7 МЕТОДИКА ДОТ-РИФ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА МИКРООБЪЕКТОВ.

8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕСТА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КОМПЛЕКСНОМ АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ СМЭВД.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунологические методики в комплексном анализе микрообъектов судебно-биологической экспертизы»

Актуальность проблемы

Получение криминалистически значимой информации при анализе следов биологического происхождения представляет собой сложную задачу, требующую применения различных методов. В настоящее время наиболее доказательными являются молекулярно-генетические исследования (МГИ). Их значение в практике судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств (СМЭВД) трудно переоценить. Однако ставшие давно классическими различные иммунологические методы все еще широко применяются. Их использование обусловлено рядом факторов. В частности, определение групповой принадлежности по системе АВО позволяет, во-первых, дифференцировать поступающие на исследование объекты и биологические образцы от конкретных лиц; во-вторых, получать разыскные сведения. Кроме того, при исследовании объектов, МГИ которых невозможно или затруднено вследствие отсутствия или недостаточного количества ДНК, только иммунологические методы могут предоставить информацию, которая в случае исключающего вывода носит доказательный характер. Немаловажным фактором является также низкая стоимость иммунохимических исследований.

В настоящее время для выполнения каждого вида анализа в большинстве судебно-медицинских лабораторий используется отдельная часть исследуемого объекта. При этом экспертами, выполняющими какой-либо вид биологических исследований, не учитываются потребности и особенности проведения иных видов анализа. Такой подход может быть допустим при наличии биологического материала в достаточном количестве. Однако следы крови, выделений и тканей человека, выявляемые на различных предметах, часто имеют малую величину. В таких случаях при назначении первичной биологической экспертизы, а уже затем дополнительной - молекулярно-генетической, для более информативных МГИ может просто не хватить биологического материала. С другой стороны, проведение только генетических исследований микрообъектов не всегда целесообразно, так как при получении отрицательного результата остается открытым вопрос, чем это вызвано: деградацией ДНК, потерей материала во время пробоподготовки или исследованием объекта, происходящего не от человека.

При исследовании микрообъектов необходим комплексный подход, который предполагает параллельное или последовательное исследование биологического материала различными специалистами по заранее выработанной схеме с последующим анализом полученных данных и формулированием совместных выводов.

Идея использования одного экстракта для разрешения нескольких вопросов, поставленных перед экспертом, появилась в 60-е годы прошлого века (A. Fiori, 1963). В 1982 году во Всесоюзном НИИ МВД СССР были разработаны «комплексированные» методики анализа микроследов крови, которые предусматривали раздельное исследование осадка и надосадочной" жидкости экстракта из пятна крови, а также фиксированных компонентов следа на предмете-носителе (М.А. Бронникова, М.В. Кисин, Т.В. Стегнова, 1982). Что касается комплексных исследований выделений человека, то в доступной нам литературе встретилась только одна статья (Н. Noda et al., 2002), авторы которой предлагают раздельно исследовать клетки цитологическим и имму-ногистохимическим методами, а жидкую часть слюны иммуноферментным методом.

Создание такой схемы, которая обеспечивала бы оптимальное распределение анализируемого материала для каждой методики в соответствии с криминалистической значимостью получаемых данных, является важной задачей.

В связи с внедрением в экспертную практику генотипирования, следует определить роль и место иммунологических методов в комплексном анализе объектов судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств (СМЭВД). Как справедливо указывают П.Л. Иванов и В.А Клевно (2008), «.центр тяжести переместится именно на молекулярно-генетические технологии. Все другие востребованные методические составляющие судебно-медицинской биологии при этом также будут применяться, но в качестве вспомогательных и дополняющих». Соответственно, иммунологические методы, кроме выполнения своих традиционных задач, таких как установление наличия биологического материала, видовой и групповой принадлежности, должны применяться в качестве скрининга для отбора объектов с целью более успешного проведения в последующем МГИ.

Для осуществления такого подхода необходимо признать разделение судебно-биологической и молекулярно-генетической экспертизы искусственным явлением. «Судебно-биологические отделения должны стать экспертными подразделениями нового типа, отвечающими за комплексное исследование вещественных доказательств» (П.Л. Иванов, В.А Клевно, 2008). В противном случае при поступлении на исследование микрообъектов теряется часть поисковой информации, а также могут быть зря израсходованы дорогостоящие реактивы и непроизводительно затрачено время эксперта.

В связи с изменившейся ролью классических иммунологических исследований изменились и требования к их проведению. Поскольку данные методы предлагается использовать на первых стадиях экспертизы, они должны быть применены так, чтобы обеспечить сохранение ДНК-содержащего материала для дальнейших МГИ. Например, установление наличия крови и выделений путём выявления гемоглобина, простатоспецифического антигена, амилазы предпочтительно проводить, исследуя надосадочную жидкость. Групповую принадлежность также желательно устанавливать по той части биологического материала, которая непригодна для генотипирования. Сохранности биологического материала для дальнейших исследований способствует внедрение методик, обладающих высокой чувствительностью или носящих недеструктивный характер.

Кроме того, поскольку основные силы лаборатории должны быть направлены на получение идентификационных данных, а МГИ характеризуются сложностью и трудоемкостью, желательно, чтобы иммунологические методы отличались высокой технологичностью, простотой в исполнении и экс-прессностыо, что значительно снизит трудозатраты при определении групповой и видовой принадлежности.

В судебной серологии в нашей стране основными методами для установления групповой принадлежности являются реакция абсорбции-элюции (РАЭ), количественная реакция абсорбции (КРА), реакция «смешанной агглютинации» (РСА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ). В тоже время, такие методы, как иммуноферментный анализ (ИФА) и метод иммунохрома-тографии, ещё не нашли широкого распространения в практике СМЭВД.

Представляется крайне актуальным в соответствии с изменившимися требованиями к анализу объектов СМЭВД разработать соответствующую схему, пробоподготовки биологических микрообъектов, модифицировать иммунологические методики и определить очерёдность их применения для получения максимально возможной информации. Цель работы

Разработка иммунологических методов исследования, пригодных для использования в системе комплексного анализа микроследов человека, с целью получения максимально возможного объема информации.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Подобрать МКА, пригодные для использования в РАЭ с целью установления групповой принадлежности таких объектов СМЭВД, как следы крови, слюны, микрофрагменты волос, частицы перхоти. Приготовить реагенты на основе доступных МКА.

2. Определить влияние различных факторов на специфичность и чувствительность иммунологических реакций. Разработать как общие, так и характерные для каждого вида биологических объектов способы повышения специфичности и чувствительности иммунологических реакций.

3. Разработать схему пробоподготовки и определить оптимальные условия проведения иммунологических реакций при исследовании каждого типа биологических микрообъектов.

4. Подобрать модификации иммунологических реакций для установления групповой и видовой принадлежности, позволяющие исследовать серийные образцы и проводить экспресс-анализ.

5. Разработать общие принципы комплексного анализа следов человека. Определить место иммунологических методик в системе комплексного анализа.

6. Провести экспертную апробацию разработанных методик и тактических подходов.

Научная новизна

1. Проведена комплексная оценка факторов, влияющих на специфичность высокочувствительных модификаций РАЭ. На основе этого выработаны правила работы с целью соблюдения стандартных условий проведения иммунологических реакций и эмпирически показана эффективность использования в РАЭ неионного детергента твин 20.

2. Показана возможность использования гель-фильтрации для оценки результатов РАЭ. Разработана комбинированная методика РАЭ — гель-фильтрация с использованием карточек «Скангель», что предоставляет возможность проведения серийных исследований.

3. Разработан вариант РИФ для установления групповой и видовой принадлежности в дот-варианте, предоставляющий возможность экспресс-анализа с целью отбора объектов для дальнейшего исследования.

4. Обоснована тактика проведения экспертизы объектов СМЭВД на основе комплексного анализа с учётом экспертной значимости МГИ. Определено место иммунологических методов в системе комплексного анализа.

Практическая значимость

1. Подбор МКА для каждого вида биологических объектов, приготовление на их основе реагентов с требуемыми свойствами, соблюдение стандартных условий проведения иммунологических реакций, применение разработанных способов повышения чувствительности и специфичности иммунологических реакций обеспечивает получение достоверных результатов при использовании МКА для проведения анализа объектов СМЭВД.

2. Предложенные модификации РАЭ, дот-ИФА, дот-РИФ для микроколичеств выделений обладают высокой степенью чувствительности и позволяют получать информацию при анализе отдельных составных частей объекта, что во многих случаях позволяет сберечь ядерный материал для МГИ.

3. Предложенные иммунологические реакции, а именно гелевый вариант оценки результатов РАЭ, дот-ИФА и дот-РИФ, способствуют сокращению времени анализа и уменьшению трудозатрат при проведении экспертиз.

4. Исследование частиц перхоти в качестве объекта СМЭВД повышает доказательность получаемой информации при исследовании биологических следов с таких предметов как шапки, предметы верхней одежды, шапки-маски и т.п.

5. Предложенная схема комплексного исследования следов выделений человека позволяет определить место каждой методики в соответствии с важностью получаемых данных, оптимально распределить исследуемый материал и, в результате, получить максимально возможную информацию.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Подобраны МКА и приготовлены реагенты на их основе для каждого вида биологических объектов и для используемых модификаций иммунологических реакций.

2. Предложены способы повышения чувствительности и специфичности иммунологических реакций.

3. Разработаны модификации РАЭ для определения антигенов системы АВО с помощью МКА в следах крови, следах слюна (на поверхности клеток буккального эпителия и в надосадочной части), микрофрагментах волос и частицах перхоти.

4. Показана возможность применения дот-РИФ и дот-ИФА в качестве методик для отбора биологических объектов по видовому и групповому признаку.

5. Разработана комбинированная методика РАЭ - гель-фильтрация для выявления АВН антигенов в пятнах крови.

6. Обоснована тактика комплексного исследования объектов СМВД. Разработана подробная схема комплексного анализа следов выделений человека. Определено место иммунологических методик в соответствии с важностью получаемых данных

Апробация результатов работы

Материалы диссертационной работы были доложены на следующих научных форумах: на Всероссийских научно-практических семинарах экспертов-биологов МВД России в Нижнем Новгороде, 2001 г., в Великом Новгороде, 2002 г., в Волгограде, 2007 г; на Второй Всероссийской научно-практической конференции по криминалистике и судебной экспертизе ЭКЦ МВД РФ в Москве, 2004 г.; на рабочих совещаниях экспертов-биологов МЗ РФ в Анапе, 2006 г., в Новосибирске, 2006 г; на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств» в Воронеже, 2007 г., на заседании биологической секции Московского научного общества судебных медиков, 2007 г.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в работу Института Криминалистики Центра специальной техники ФСБ РФ (Приложение А). Методика дот-ИФА для выявления антигенов в следах выделений и методика РАЭ для выявления антигенов в частицах перхоти используются в практике ряда криминалистических подразделений МВД РФ и судебно-медицинских бюро МЗ РФ.

На методики «Определение антигенов АВН и Lewis в следах выделений человека с помощью иммуноферментного анализа в дот-варианте», «Определения антигенов системы АВО в следах крови с помощью реакции аб-сорбции-элюции с использованием карточек «Скангель», «Определение групповой принадлежности микрофрагментов волос с помощью реакции аб-сорбции-элюции с использованием моноклональных антител», «Определение антигенов системы АВО в реакции абсорбции-элюции с помощью моноклональных антител в системе комплексного анализа микроследов слюны» получены положительные отзывы и материалы переданы в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития для оформления новых и усовершенствованных технологий.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано две печатные работы: одна статья в журнале «Судебно-медицинская экспертиза» и одни тезисы. На три статьи получены положительные отзывы и они приняты к печати в журнале «Судебно-медицинская экспертиза».

Изданы два информационных письма Российского центра судебно-медицинской экспертизы (№ 570/01-05 от 24.05.2001 «О судебномедицинском исследовании частиц перхоти» и № 408/01-07 от 12.04.2002 «Определение групповой принадлежности микрофрагментов волос»).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы.

Заключение диссертации по теме «Судебная медицина», Александрова, Вера Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработанные высокочувствительные и специфичные модификации РАЭ позволяют выявлять антигены системы АВО в следах крови, в следах слюны (на поверхности клеток буккального эпителия и в жидкой части), в микрофрагментах волос и в частицах перхоти. Условия проведения пробоподготовки и этапов реакции оптимизированы в соответствии с учётом морфологических и биохимических свойств различных мирообъектов и свойств МКА.

2. Подбор для каждого исследуемого объекта подходящих по свойствам МКА из линейки антител с различной эпитопной специфичностью, и, при необходимости, приготовление реагентов из асцитной жидкости путем проведения соответствующей очистки и концентрирования иммуноглобулинов, позволяет успешно использовать МКА для выявления антигенов с помощью РАЭ.

3. Предложенные способы предотвращения неспецифических взаимодействий, общие (использование неионного детергента твин 20, предварительное прогревание биологического материала на водяной бане) и характерные для каждого вида биологических объектов, позволяют повысить чувствительность методик при исследовании микрообъектов.

4. Строгое соблюдение разработанной системы правил проведения иммунологических реакций и хранения реагентов позволяет стандартизировать условия проведения реакций и получать стабильные результаты.

5. Разработанные методики РАЭ — гель-фильтрация, одностадийный вариант дот-ИФА метода ИФА позволяют успешно исследовать серийные образцы.

6. Предложенное использование ПВДФ мембраны и разработка методики РИФ в дот-варианте позволяет проводить экспресс-анализ групповой и видовой принадлежности биологических микрообъектов.

7. Внедрение в экспертную практику разработанных принципов комплексного подхода, выбор соответствующих методик и использование их по определённой схеме в соответствии с важностью получаемых данных, с учетом характера и состояния объектов, подлежащих исследованию, позволяет получить максимально возможную информацию при исследовании микроследов. Раздельное исследование составных элементов биологического материала следа (клеточного осадок и надосадочной жидкости) иммунологическими методами позволяет сэкономить биологический материал для МГИ, получать более достоверные данные при исследовании загрязненных объектов, а также предоставляет возможность более корректной оценки результатов реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В СМЭВД с начала прошлого столетия до появления молекулярно-генетических методов центральное место занимали иммунологические методы, РАЭ, КРА, РСА, РИФ, ИФА, которые позволяли дифференцировать выделения и ткани организма человека по групповым характеристикам. Многие авторы разрабатывали модификации данных методов, пригодные для исследования различных биологических объектов: крови, выделений, фрагментов тканей, волос. Наиболее чувствительные из них предназначались для типи-рования микроследов, анализ которых является одним из сложных разделов данного вида экспертизы. При работе с объектами, которые содержат незначительное количество детектируемых структур, должное внимание следует уделять не только выбору чувствительных методов анализа и подбору качественных реагентов, но и разработке новых методических приёмов. В доступной литературе нам встретилась только одна работа, посвящённая данной проблеме. М.А. Бронникова, М.В. Кисин и Т.В. Стегнова [6] предложили «комплексированные» методики для экспертизы следов крови малой величины, предусматривающие раздельное исследование осадка и надосадочной жидкости экстракта из пятна крови, а также фиксированных компонентов следа на предмете-носителе. К сожалению, в настоящее время в большинстве судебно-медицинских лабораторий для выполнения каждого вида анализа (установление наличия биологического материала, его видовой и групповой принадлежности, определение генотипа) используется отдельная часть биологического объекта. Такая ситуация резко ограничивает возможности экспертизы, особенно экспертизы микрообъектов.

Напротив, использование комплексного подхода позволяет получить максимально возможный объём информации, поскольку экономия материала и его рациональное использование предоставляют возможность применить большее числа методов для анализа одного объекта.

В диссертации предложены две схемы комплексного анализа, выбор которых зависит от структуры объекта. При параллельном исследовании выделенный из объекта биологический материал делится на составные части, которые исследуются различными методами. Если исследуемый объект не позволяет провести вышеописанную процедуру, то оптимальной представляется «последовательная» схема анализа: неразрушающие методы, затем методы, частично изменяющие структуру объекта и, наконец, разрушающие методы. На завершающих этапах экспертизы полученные результаты объединяют, анализируют и делают совместные выводы.

Схема комплексного анализа позволяет добиться наилучших результатов при исследовании в первую очередь микрообъектов. Хотя, с нашей точки зрения, в настоящее время следует к любому объекту относиться как к микрообъекту. При таком подходе, в результате экономии биологического материала возникает возможность использовать в исследовании большее количество методов, получать более объективные и достоверные результаты, сохранить биологический материал для проведения повторных и дополнительных экспертиз.

На современном этапе развития СМЭВД проведение любой экспертизы должно начинаться с иммунологических исследований, основная роль которых — проведение скрининга для отбора объектов с целью более успешного проведения в последующем МГИ. Для осуществления такого подхода необходимо признать разделение судебно-биологической и молекулярно-генетической экспертизы искусственным явлением. В противном случае теряется часть поисковой информации, и также могут быть зря израсходованы дорогостоящие реактивы и непроизводительно затрачено время эксперта.

В связи с изменившимися местом и ролью иммунологических методов исследования, необходимо определить первоочередные требования к их выполнению. Поскольку иммунологические методы используются на первых стадиях экспертизы, они должны быть применены так, чтобы обеспечить сохранение ДНК-содержащего материала для дальнейших МГИ. Установление групповой принадлежности желательно проводить по части материала, полученного из объекта и непригодного для генотипирования. Экономии биологического материала также способствует внедрение методик, обладающих высокой чувствительностью или носящих недеструктивный характер. Поскольку основные усилия экспертов должны быть направлены на получение идентификационных данных, а МГИ характеризуются сложностью и трудоемкостью, желательно, чтобы новые иммунологические методы отличались высокой технологичностью, простотой в исполнении и экспрессностью, что значительно снизит трудозатраты при определении групповой и видовой принадлежности и позволит проводить серийные исследования при поступлении на экспертизу большого количества однотипных образцов. Кроме того, желательно, повысить объективность оценки результатов, получаемых с помощью иммунологических методов.

В результате проведенных исследований разработан ряд иммунологических методик, пригодных для использования в системе комплексного анализа. В частности разработаны модификации РАЭ, которые позволяют использовать коммерчески доступные МКА для выявления антигенов АВН в микроследах крови (в том числе и с применением гелевой технологии), микроследах слюны (в надосадочной жидкости и в осадке), частицах перхоти и микрофрагментах волос. Разработан одностадийный вариант методики дот-ИФА для определения антигенов системы А, В, Н и Lea, Leb в микроследах слюны. Предложена методика дот-РИФ для экспресс-анализа с целью отбора объектов для дальнейшего исследования по видовому и групповому признаку.

Уменьшить трудозатраты и сократить продолжительность выполнения экспертиз, особенно в случаях поступления на экспертизу большого количества образцов, позволяет замена традиционного микроскопического метода оценки результатов РАЭ на гелевые технологии при исследовании следов крови. Такие же преимущества предоставляет дот-ИФА при исследовании выделений человека и дот-РИФ для предварительного отбора образцов.

Важно также отметить, что при использовании данных методик уменьшается или полностью исключается вероятность контакта рук эксперта с тест-эритроцитами крови, что особенно актуально в наше время в связи с распространением СПИДа и гепатитов.

Кроме того, имеется возможность подтвердить экспертные выводы документально, что повышает объективность полученных данных.

Методика одностадийного варианта дот-ИФА по сравнению с разработанным ранее двустадийным вариантом более экспрессна, надежна, методически проста, менее трудоемка. Также она предоставляет информацию не только о групповой характеристике, но одновременно и о статусе выделительства. Значит, отпадает необходимость постановки КРА, которая требует много материала и непригодна для микрообъектов.

Поскольку методика дот-ИФА выявляет антигены в жидкой части выделений, она позволяет сохранить клеточный материал для проведения моле-кулярно-генетического анализа. Такие же преимущества предоставляет модификация РАЭ, разработанная для выявления АВН антигенов слюны в на-досадочной жидкости. Данные два метода пригодны для установления групповой принадлежности следов только от лиц — выделителей групповых факторов. В слюне невыделителей антигены выявляют с помощью модификации РАЭ на поверхности клеток.

В результате разделения биологического материала и раздельного исследования фиксированных на клеточной поверхности и свободных антигенов слюны достигается экономия материала, возможность оптимального его распределения для каждой методики в соответствии с важностью получаемых данных. При таком подходе также создаются более благоприятные условия для получения корректных результатов в случае загрязнённых препаратов, в том числе при их обсеменении микроорганизмами. Кроме того, учитывая, что специфичность реакции зависит от соотношения антигенов и антител, типирование клеточного материала предоставляет еще одно преимущество, позволяя контролировать количество материала, взятого в реакцию.

Всё это способствует более правильной оценки экспертом результатов реакции.

При исследовании волос целесообразно групповые антигены выявлять в стержне, оставляя луковицу для МГИ. В данном случае возникают проблемы, связанные с биохимическими и структурными особенностями данного объекта. Для их разрешения в разработанной методике предложены ряд манипуляций как в пробоподготовке, так и в ходе самой реакции. Так, впервые предлагается прогревание стержня волоса на кипящей водяной бане. Данная процедура предотвращает появление неспецифических результатов. Кроме того, разрыхление кератиновой структуры стержня вследствие прогревания облегчает доступ антител к антигенным структурам волоса и тем самым приводит к усилению выраженности специфической реакции. В результате повышается надежность типирования микрофрагментов волос и волос от лиц со слабыми вариантами антигенов системы АВО.

Частицы перхоти являются информативным судебно-медицинским объектом. Многие из частиц могут содержать ядерную ДНК. Разработанная методика РАЭ по выявлению антигенов АВН в данном объекте позволяет исследовать данный объект как иммунологическими, так и молекулярно-генетическими методами. Таким образом можно предоставить идентифицирующую и разыскную информацию, необходимую для суда и следствия, при судебно-медицинском исследовании таких предметов, как шапки, воротники верхней одежды, шапки-маски и т. п.

Особый интерес представляет тот факт, что все методики разработаны с учетом особенностей МКА и позволяют с достаточной степенью надежности использовать их в практике судебно-медицинской экспертизы. В связи с тем, что в настоящее время судебно-медицинские лаборатории столкнулись с трудностями в получении активных изогемагглютинирующих сывороток, данное обстоятельство является особенно актуальным. Ряд исследователей, в том числе в нашей стране, исследовал возможность использования МКА в судебной серологии. В частности И. О. Перепечиной [16, 32] была отработана методика использования МКА в РАЭ. Не смотря на это, до сих пор отношение экспертов к данным реагентам неоднозначно. Связано это с несколькими факторами.

Во-первых, трудности возникают в связи с изменением первоначальных свойств МКА при хранении. Нам не удалось подобрать каких-либо компонентов для стабилизации. Добавление БСА, желатина, стабилизирующего раствора для антител, среды для роста клеток ДМЕМ не приводило к желаемому результату. В связи с этим мы предлагаем разливать МКА на аликвоты для проведения ежедневных исследований и хранить в замороженном виде. По нашему опыту МКА при таком способе сохраняют свои свойства в течение нескольких лет.

Во-вторых, производители МКА не всегда учитывают специфические потребности судебной серологии, в частности титр антител бывает недостаточно высокий, что приводит к невозможности использования данных реагентов для типирования, например, таких сложных объектов как волосы. В связи с этим была отработана методика приготовления очищенных реагентов с желаемым титром из культуральных и асцитных жидкостей путем осаждения глобулинов сульфатом аммония с последующей гельфильтрацией на колонке, заполненной сефадексом G-25. Оказалось, что для выявления А антигена в волосах целесообразно использовать иммуноглобулины, полученные осаждением сульфатом аммония при 40%-ом насыщении раствора солью, в то время как для выявления В и Н антигенов - при 50%-ом насыщении.

Результаты, полученные в ходе разработки методик, подтвердили литературные данные о необходимости, с одной стороны, подбирать МКА для каждого вида исследуемых объектов, для каждого варианта иммунологических реакций, а, с другой стороны, модифицировать сами реакции с учётом свойств новых реагентов.

В ходе выполнения исследований был разработан комплекс мер, которые способствуют снижению нежелательных реакций антител с посторонними агентами и в результате приводят к повышению специфичности реакции.

Первый способ состоит в прогревании биологического материала на кипящей водяной бане. Это, вероятно, приводит к инактивации пептидов, содержащихся в исследуемом образце и взаимодействующих неспецифически с антителами. Проведение такой пробоподготовки при исследовании волос усиливает специфическую реакцию, что связано, по-видимому, с повреждениями кератиновой структуры и обеспечением доступа антител к антигенным структурам волоса. Более выраженная реакция может быть также объяснена демаскировкой антигенных детерминант кипячением. В то же время при нагревании надосадочных жидкостей, полученных в результате центрифугирования экстрактов следов выделений, в ряде случаев наблюдается выпадение осадка, что приводит к уменьшению содержания групповых антигенов в растворе. С другой стороны, только так можно избавиться от неспецифических взаимодействий. Поэтому при постановке дот-ИФА со спермой и влагалищными выделениями, было предложено кипятить фрагменты НЦМ с нанесённой надосадочной жидкостью.

Второй способ состоит в использовании неионного детергента твин 20, который, в силу своих свойств, препятствует неспецифическому связыванию антител. Такой подход широко применяется в реакциях ИФА. Эффективным он оказался и для РАЭ. Данный реагент добавляют в раствор антител и фосфатно-солевой буфер для отмывания несвязавшихся антител. Впоследствии он легко удаляется и не препятствует реакции гемагглютина-ции.

В ряде случаев неспецифические реакции могут быть не связаны со свойствами антител или анализируемого объекта. Оказалось, что микробное загрязнение используемой воды, приготовленных реактивов и предметных стекол, а также сдвиг кислотно-щелочного равновесия реагентов могут привести к ложноположительным результатам. С целью предотвращения этих явлений были разработаны меры для соблюдения стандартных условий проведения иммунологической реакции и хранения реагентов, в частности, использование ФСБ вместо физиологического раствора; подготовка дистиллированной воды для проведения экстракции путём её фильтрации через мембраны с размером пор 0,45 мкм; хранение реагентов, разлитых на аликвоты, при температуре минус 20°С; использование реагентов после размораживания в течение одного рабочего дня.

Использование данных способов для блокировки неспецифических процессов, а также изменение параметров реакции позволяет применять МКА в классической реакции судебной серологии РАЭ.

Таким образом, в результате проведенных исследований были отработаны и проверены в экспертной деятельности методики РАЭ для выявления групповых антигенов системы АВО с использованием МКА. А также выработаны правила работы с МКА для получения специфических результатов.

Использование высокочувствительных и недеструктивных методов, разработка тактики экспертиз на основе комплексного анализа приведёт к экономии биологического материала. В результате возникает возможность для разработки и использования новых методик анализа биологических следов. Например, применяя методы ИФА в пятнах крови, следах выделений можно определить остаточные количества наркотиков, котинин. Введение объектсберегающих методик ИК-спектроскопии и микроспектрофлуоромет-рии позволит получить дополнительную информацию о цвете и искусственной обработке волос, а определение групповой принадлежности вышеопи1 санным методом сохранит материал стержня волоса для его использования в анализе митохондриальной ДНК. Внедрение новых методов в схему комплексного анализа значительно обогатит экспертизы и повысит достоверность получаемых результатов.

134

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Александрова, Вера Юрьевна, 2008 год

1. Антитела. Методы : кн. 2 / пер. с англ. ; под ред. Д. Кетти. М. : Мир, 1991.-287 с. - ISBN 5-03-002364-Х.

2. Барсегянц, JI. О. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы) : рук. для судеб, медиков / Л. О. Барсегянц. М.: Медицина, 1999. - 271 с. - ISBN 5-225-04441-7.

3. Богуславский, В. Л. К вопросу о возможности определения групповой принадлежности ткани в гистологических препаратах / В. Л. Богуславский, М. С. Свирский // Судеб.-мед. экспертиза. 1975. - №2. - С. 45-46.

4. Бромилов, И. М. Гелевая технология в серологии групп крови / И. М. Бромилов // Вестник службы крови России. — 1998. — №1. — С. 14-17.

5. Бронникова, М. А. Диагностика групповой принадлежности выделений человека при "парадоксальном" выделительстве / М. А. Бронникова, М. С. Свирский, Т. В. Стегнова // Судеб.-мед. экспертиза. 1984. - №3. -С. 40-43.

6. Бронникова, М. А. Особенности судебно-биологической экспертизы следов крови малой величины : метод, рек. / М. А. Бронникова, М. В. Кисин, Т. В. Стегнова; ВНИИ МВД СССР Л., 1982. - 78 с.

7. Верещака, М.Ф. Исследование антигенов А, В, Н, Р и S в одной вырезке из пятна крови / М. Ф. Верещака // Судеб.-мед. экспертиза. 1975. - №2. -С. 47-48.

8. Выявление антигенов системы АВО в фрагментах костей, ногтей и зубов / С. В. Гуртовая и др. // Судеб.-мед. экспертиза. 1996. - №4. - С. 23-25.

9. Гуртовая, С. В. Определение антигенов с помощью карточек «скангель» / С. В. Гуртовая, М. В. Маяцкая // Судеб.-мед. экспертиза. 2001. - №4. -С. 39-40.

10. Гуртовая, С. В. Применение обти-теста для определения наличия и вида крови в пятнах / С. В. Гуртовая, Л. Н. Тучик, О. Б. Курджиева // Судеб.-мед. экспертиза. — 1999. №5. - С. 23-25.

11. Дианова, Т. Н. Выявление группового антигена А в пятнах выделений методами иммуноэлектрофореза / Т. Н. Дианова, О. В. Николенко // Судеб.-мед. экспертиза. 1987. — № 2. - С. 32-33.

12. Дианова, Т. Н. О выявлении групповых антигенов системы АВО в стержнях волос методом абсорбции-элюции / Т. Н. Дианова // Судеб.-мед. экспертиза. 1974. - №1. - С.67-70.

13. Друзь, А. Ф. Использование моноклональных антител при анализе следов крови и слюны реакцией смешанной агглютинации / А. Ф. Друзь, Н. А. Мазная, Т. О. Хоменок // Судеб.-мед. экспертиза. — 1990. №4. - С. 15-16.

14. Друзь, А. Ф. О применении моноклональных антител анти-А и анти-В в судебной медицине / А. Ф. Друзь, Т. О. Хоменок // Судеб.-мед. экспертиза. -1989.-№2.-С. 22-23.

15. Друзь, А. Ф. Об установлении групповой принадлежности изолированных клеток с использованием моноклональных антител анти-А и анти-В / А. Ф. Друзь, Т. О. Хоменок // Судеб.-мед. экспертиза. 1989. -№3. - С. 42— 43.

16. Иванов, П. JI. Судебно-биологическая экспертиза реалии и перспективы / П.Л. Иванов, В.А Клевно // Судеб.-мед. экспертиза. — 2008. - №1. — С. 19— 24.

17. Использование моноклональных антител при экспертизе следов крови и выделений человека : методические рекомендации / И.О. Перепечина и др.. М. : ВНКЦ МВД СССР, 1991.-21 с.

18. Кисин, М. В. Определение групп системы АВО в потожировых отпечатках пальцев рук / М. В. Кисин, Т. В. Стегнова // Судеб.-мед. экспертиза. -1973.-№1.-С. 22-26.

19. Колоколова, Г. П. Диагностика группы ABSe системы АВО(Н) в следах слюны, спермы и секрета вдагалища с помощью реакции смешанной агглютинации / Г. П. Колоколова // Судеб.-мед. экспертиза. 2006. - №4. — С. 32-34.

20. Колыш, М. Ш. Выявление группоспецифических антигенов в волосах после контакта их с кровью и выделениями / М. Ш. Колыш, Т. И. Уточкина // Судеб.-мед. экспертиза. 1992. — №2. - С. 27-28.

21. Лапенков, М. И. Анти-АВН-LEWIS моноклональные антитела. Получение, определение эпитопной специфичности и применение в судебной медицине : дисс. . д-ра. мед наук / Лапенков Михаил Иванович. -М., 2002. -273 с.

22. Лапенков, М. И. Использование моноклональных антител для анализа следов биологического происхождения / М. И. Лапенков. Судеб.-мед. экспертиза. - 1995. -№1. - С. 29-33.

23. Лапенков, М. И. Получение, определение специфичности и применение анти-Le моноклональных антител / М. И. Лапенков, Т. Л. Николаева, Е. А. Аборина // Судеб.-мед. экспертиза. 2000. - № 4. - С. 25-29.

24. Моноклональные антитела к группоспецифическому антигену человека / Е. И. Дерюгина и др. // Судеб.-мед. экспертиза 1989. - № 4. - С. 35-39.

25. Моноклональные антитела к Н-антигену человека / Е. В. Дерюгина и др. // Судеб.-мед. экспертиза. 1992. - №4. - С. 18-20.

26. Об использовании метода иммунофлюоресценции для установления групповой принадлежности (по системе АВО) крови и изолированных клеток в следах на вещественных доказательствах : метод, рек. / В. П. Ольхо-вик и др.-М., 1988,- 14 с.

27. Об определении групп изосерологической системы АВО в волосах : метод. письмо / МЗ СССР. М., 1968. - 7 с.

28. Об определении групповой принадлежности волос по клеткам сохранных луковиц / В. В. Малоярославцева и др. // Судеб .-мед. экспертиза. — 2003. — №1.- С. 30-32.

29. Перепечина, И. О. Исследование пятен крови и выделений реакцией аб-сорбции-элюции с помощью моноклональных антител анти-Н / И. О. Перепечина, Р. С. Сахаров / Судеб.-мед. экспертиза. 1990. - №4 — С. 16-19.

30. Применение иммуноферментного анализа для определения АВН-антигенов в следах слюны и спермы / Е. И Дерюгина и др. // Судеб.-мед. экспертиза. 1992. - №2. - С. 23-26.

31. Свирский, М. С. Изучение методов абсорбции-элюции и смешанной агглютинации в судебно-медицинских целях : автореф. дисс. канд. мед. наук / М. С. Свирский. М., 1969. - 24 с.

32. Сигал, Е. Р. Определение групповой принадлежности слюны по системе АВО методом ракетного иммуноэлектрофореза / Е. Р. Сигал, Г. Е. Рукавишников, М. И. Потапов // Судеб.-мед. экспертиза. 1986. - №4. - С. 4042. ,

33. Сидоров, В. JL Физико-химические и иммунологические аспекты исследования пятен крови и спермы на объектах носителях : автореф. дисс. . канд. биол. наук / Сидоров Владимир Леонидович — СПб., 2000. — 22 с.

34. Сметанина, Н. И. Об исследовании групповой специфичности потожиро-вых выделений кожи рук / Н. И. Сметанина, И. В. Исакова, Е. Е. Гальцева // Судеб.-мед. экспертиза. 1996. - №3. - С. 35-36.

35. Стегнова, Т. В. Определение групп АВО в волосах методом абсорбции-элюции / Эксперт, практика. — 1977. №9. -С. 34-35.

36. Стегнова, Т. В. Волосы головы человека как объект судебно-биологической экспертизы : учеб. пособие / Т. В. Стегнова, В. JT. Печер-ский, С. Н. Князенков. М.: ВНИИ МВД СССР, 1990. - 40 с.

37. Стегнова, Т. В. Об исследовании гнилостно изменённых следов крови и выделений человека : информ. письмо / Т. В. Стегнова, И. О. Перепечина, Л. П. Уалерианова. М. : ЭКЦ МВД России, 1992. - 8 с.

38. Стегнова, Т. В. Основы формирования заключения эксперта при производстве судебно-биологической экспертизы : метод, рек. — М.: ЭКЦ МВД России, 1993.-24 с.

39. Томилин, В. В. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств / В. В Томилин, JI. О. Барсегянц, А. С. Гладких — М. : Медицина, 1989.-303 с.

40. Экспертные методики исследования тканей и выделений человека : учеб. пособие. М.: ЭКЦ МВД России, 2006. - 72 с.

41. Эпитопная характеристика анти-АВН моноклональных антител / М. И. Лапенков и др. // Проблемы гематологии. 1999. - № 2. — С. 39-44.

42. Юдина, Г. С. Новые подходы к исследованию костной ткани по изосеро-логической системе АВО / Г. С. Юдина, Е. Ф. Зарецкая, И. О. Перепечина // Судеб.-мед. экспертиза — 2005. — № 6. — С. 34-37.

43. A new membrane permeabilization method for the detection of intracellular antigens by flow cytometry / G. Hallden et al. // J. Immunol. Methods. 1989. -Vol. 124, N 1. - P. 103-109.

44. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for ABO blood typing of semen by using anti-p 84 monoclonal antibody as a marker of blood group substance in semen / I. Sato et.al. // J. Forensic Sci. 2000. - Vol. 45, N 4. - P. 795-800.

45. A simple dot enzyme-linked immunosorbent assay for ABO blood typing of biological fluid and stains : effects of heating samples / K. Hamada et al. // Leg. Med. 2002. - Vol. 4, N 4. - P. 217-222.

46. ABH Antigen Typing in Bone Tissue 1 / H. C. Lee et al. // J. Forensic Sci. -1989.-Vol. 34, N 1. — P. 7-14.

47. ABO blood grouping of fingerprint by means of immunohistochemical procedure / Z. Lin et al. // Nippon Hoigaku Zasshi. 1993. - Vol. 47, N 2. - P. 98107.

48. ABO blood grouping of hairs using an avidin-biotin peroxidase complex technique / K. Nishi et al. // Z. Rechtsmedizin. 1989. - Vol. 102, N 4. - P. 247254.

49. ABO Blood Grouping of Human Hair by Universal Immuno-Peroxidase Polymer (UIP) Technique / Y. Hisashi et al. // Jap. J. Sci. and Technol. for Identification. 2003. - Vol. 7, N 2 - P. 145-153.

50. ABO blood grouping of saliva from mixed body fluids by sandwich methods using monoclonal antibodies to tissue specific epitopes on blood group substance in saliva / A. Kimura et al. // Int. J. Legal. Med. 1991. - Vol. 104, N 4. - P. 189-192.

51. ABO blood grouping of semen from mixed body fluids with monoclonal antibody to tissue-specific epitopes on seminal ABO blood group substance / A. Kimura et al. //Int. J. Legal. Med. 1991. - Vol. 104, N 5 - P. 255-258.

52. Absorbtion-elution grouping of single pieces of human hair measuring only 0.5 cm in length / S. Yada et al. // Acta Crim. Japon. 1974. - Vol. 40. - P. 187189.

53. Akaishi, S. Studies on the group-specific double combination method / Akaishi S. // Jpn. J. Legal Medicine. 1965. - Vol. 19, N3.-P. 177-187.

54. Analysis of blood group active glycolipids in hairs and nails, and development of a novel blood grouping method / Y. Saito et. al. // J. Wakayama Med. Soc. — 2003.-Vol. 54,N 1.-P. 21-29.

55. Application of ABO Blood Grouping Monoclonal Antibodies to Forensic Samples / T. Ohmori et al. // Jpn. J. Forensic Sci. Tech. 1996. - N. 1 - P. 43 -48.

56. Biwasaka, H. Detection of ABH blood group antigens from minute human hairs using polyvinylidene difluoride membrane with elution — ELISA method /

57. H. Biwasaka, N. Nakayashiki, Y. Aoki // Jpn. J. Legal. Med. 1998. - Vol. 52, N 1. - P. 37—41.

58. Blood group A glycosphingolipid accumulation in the hair of patients with al-pha-N-acetylgalactosaminidase deficiency / A. Kimura et al. // Life Sci. — 2005.-Vol. 76, N 16.-P. 1817-1824.

59. Blood grouping of mixed bloodstains using immunocytochemical methods / Y. Bunai et al. // J. Forensic. Sci. 1999. - Vol. 44, N 1. - P.l00-104.

60. Bolton, S. Enzyme Linked Immunosorbent Assay for A and В Water Soluble Blood Group Substances / S. Bolton., J. W. Thorpe // J. Forensic. Sci. 1986. -Vol. 31, N 1.- P. 27-35.

61. Comparison of presumptive blood test kits including Hexagon OBTI / E. Johnston et al. // J. Forensic. Sci. 2008. - Vol. 53, N 3. - P. 687-689.

62. Comparison of tube and gel techniques for antibody identification / M. C. Z. Novaretti et al. // Immunohematology. 2000. - Vol. 16, N 4. - P. 138-141.

63. Coombs, R. R. A. A and В blood-group antigens of human epidermal cells demonstrated by mixed agglutination / R.R.A. Coombs, D. Bedford, L.M. Rouil-lard // Lancet. 1956. -N 1. - P. 461-^63.

64. Demonstration of pneumoccocal antigen in tissues by use of fluorescent antibody / A.H. Coons et al. // J. Immunol. 1942. - Vol. 4, N 3. - P. 159-170.

65. Determination of ABO blood grouping from human oral squamous epithelium by the highly sensitive immunohisto chemical staining method EnVision+ / H. Noda et al. // J. Forensic. Sci. 2002. - Vol. 47, N 2. - P. 341-344.

66. Difference in the ability of blood group-specific lectins and monoclonal antibodies to recognize the ABH antigens in human tissues / N. Ito et al. // Histochem. J. 1990. - Vol. 22, N 11. - P. 604-614.

67. Farr, A. G. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review / A.G. Farr, P.K. Nakane // J. Immunol. Meth. 1981. - Vol. 47, N 2. - P. 129-144.

68. Fiori, A. Modifed Absorption-Elution Method of Siracusa for ABO and MN Grouping of Bloodstains / A. Fiori, M. Marigo, P. Benciolini // J. Forensic. Sci. -1963. Vol. 8, N 3. - P. 419-445.

69. Forensic Examination of Hair / edited by James Robertson. London: Taylor and Francis, 1999. - 280 p.

70. Gaensslen, R. E. Evaluation of monoclonal anti-A and anti-B and affinity-purified Ulex europaeus lectin I for forensic blood grouping / R. E. Gaensslen, H. C. Lee, J. E. Carroll // Z. Rechtsmed. 1984. - Vol. 93, N 4. - P. 259-268.

71. Herber, B. DNA typing of human dandruff / B. Herber, K. Herold // J. Forensic Sci. 1998. - Vol. 43, N 3. - P. 648-656.

72. Histochemical localization and analysis of blood group-related antigens in human pancreas using immunostaining with monoclonal antibodies and exoglyco-sidase digestion / N. Ito et al. // J. Histochem. Cytochem. 1990. - Vol. 38, ,N 9.-P. 1331-1340.

73. Kind, S. S. Absorbtion-Elution Grouping of Dried Blood Smears / S. S. Kind // Nature. 1960. - Vol. 185, N 4710. - P. 397-398.

74. Kirov, K. Immunofluorescent study of the blood-group antigens A and В in the buccal cells of human secretors and non-secretors / K. Kirov, I. Boulanov // Dokl. Bulg. Acad. Nauk. 1969. - Vol. 22, N 8. - P. 959-962.

75. Kiyoyuki, W. Highly Sensitive Method for Determination of ABO Blood Groups Using Absorption-Elution Test Combined with ELISA and Its Automation / W. Kiyoyuki // Jpn. J. Forensic Sci. Tech. 2002. - Vol. 7, N 1. - P. 6169.

76. Kobayashi, T. Effects of solvent displacementon sensitivity and specificity of monoclonal antibodies for ABO blood grouping of forensic specimens with ab-sorbtion-elution test / T. Kobayashi II Legal Med. 1999. -N 1. - P. 68-75.

77. Kronick, M. N. The use of phycobiliproteins as fluorescent labels in immunoassay / M. N. Kronick // J. Immunol. Meth. 1986. - Vol. 92. - P. 1-13.

78. Lincoln, P. J. The use of monoclonal antibodies for the detection of red cell antigens in stain material / P. J. Lincoln, P. H. Watts // Adv. Forensic Haemogenet. 1988.-N2.-P. 284-289.

79. Lindqvist, L. Determination of salivary ABH-blood group antigens by rocket affinoelectrophoresis / L. Lindqvist // Vox. Sang. 1982. -N 3. - P. 124-130.

80. Maeda, H. Application of commercially available monoclonal blood grouping reagents to detection of antigens in forensic materials / H. Maeda , M. Imura // Nihon Hoigaku Zasshi. 1992. - Vol. 46, N 6. - P. 428-430.

81. Mudd, J.L. The detection of soluble ABH blood group substances in semen and saliva using monoclonal blood grouping reagents / J.L. Mudd, D.E. Adams // J. Forensic Sci. 1989. - Vol. 34, N 5. - P. 1082-1089.

82. Nakane, P.K. Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens / P.K. Nakane, G.B. Pierce, Jr. // J. Cell. Biol. — 1967.-Vol. 33, N2.-P. 307-318.

83. Noguchi, K. Modification of Acid Elution Method Using Commercial Monoclonal Antibodies for ABO Blood-Typing / Noguchi Kasumi, Nara Manpei, Ohmori Takeshi // Jpn. J. Forensic Sci. Tech. 2004. - Vol. 9, N 1. - P. 79-88.

84. Ohmori, T. Improvement of absorbtion-elution test using commercially available anti-A, anti-B monoclonal antibodies — ABO blood typing from hair samples / T. Ohmori, H. Sato // Jpn. J. Legal. Med. 1999. - Vol. 53, N 3. - P. 338 -344.

85. Origin of an 84-kDa protein with ABH blood-typing antigen activity in human seminal plasma /1. Sato et.al. // J. Androl. 1999. - Vol. 20, N 4. - P. 481-486.

86. Parigian, M. J. An ELISA procedure for the detection of soluble ABH blood group substance in semen, saliva, and vaginal samples / M. J. Parigian // J. Forensic Sci. 1995. - Vol. 40, N 1. - P. 122-1255.

87. Pfeiffer, H. Immunohistochemical detection of an ABO-incompatible blood transfusion in formalin-fixed tissue / H. Pfeiffer, C. Ortmann, B. Brinkmann // Int. J. Legal Med. 2002. - Vol. 116, N 1. - P. 33-35.

88. Pflug, W. ABO and Lewis typing of secretion stains on nitrocellulose membranes using a new dot-blot-ELISA technique / W. Pflug, G. Bassler, B. Eberspacher // Forensic Sci. Int. 1989. - Vol. 43, N 2. - P. 171-182.

89. Preparation of latex reagents combined with IgM and its F(ab')2 fragment from commercial ABO blood grouping reagent / H. Nakanishi et al. // Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2007. - Vol. 54, N 1.-P. 114-117.

90. Rao, D. V. A simple dipstick immunoassay for detection of A and В antigens / D. V. Rao , V. K. Kashyap // J. Immunoassay. 1992. - Vol. 13, N 1. - P. 1530.

91. Reliability of blood grouping of aged blood by two direct hemagglutination methods and absorption elution method / K. Nishi et al. // Nippon Hoigaku Zasshi. 1985. - Vol. 39, N 2. - P. 131-137.

92. Semen specific gamma-glutamyltransferase carries ABH antigens: a sandwich ELISA for simultaneous semen detection and its ABO blood typing / S. Abe et al. // Clin. Chim. Acta. 1999. - Vol. 283, N 1/2. - P. 183-194.

93. Szulman, A. E. The histological distribution of blood group substances A and В in man / A. E. Szulman // J Exp Med. 1960. - Vol. 111, N 6. - P. 785800.

94. Takatori, T. Lewis Typing of Human Bloodstains by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Using Monoclonal Anti-Lea and Anti-Leb / T. Takatori, Y. Tustsubushi, K. Terasawa // J. Forensic Sci. — 1987. Vol. 32, N 4. — P. 900-905.

95. Takatori, T. An ELISA Avidin-Biotin Complex for the Determination of ABH Group from Saliva / T. Takatori, Y. Tustsubushi // Forensic Sci. Int. — 1986. Vol. 31, N 1. - P. 61-68.

96. The ABO blood grouping of a minute hair sample by the immunohisto-chemical technique / S. Miyasaka et al. // Forensic Sci. Int. — 1987. Vol. 34, N 1/2. - P. 85-98.

97. The gel test : a new way to detect red cell antigen-antibody reactions / Y. Lapierre et al. // Transfusion. 1990. - Vol. 30. - P. 109-113.

98. The rapid measurement of ABO blood type by using surface-plasmon resonance sensor / K. Nanameki et al. // Jpn. J. Forensic Sci. Tech. — 1999. Vol. 48, N 7. - P. 669-672.

99. Two-dimensional absorbtion-ingibition / C. Henry et al. // J. Forensic. Sci. 1988. - Vol. 33, N 5. - P. 1127-1138.

100. Unique and sensitive ELISA technique for typing ABH antigens in bloodstains using UEA-I lectin — the removal of detergent with a Sephadex G-25 mini-column improves sensitivity / K. Matsubara et al. // J. Forensic Sci. 1996. — Vol. 4, N 1.-P. 35-39.

101. Yodoya, J. The Modified Mixed Cell Agglutination Reaction on Method with Monoclonal Antibodies to Determine ABO Blood Groups from Forensic Samples / J. Yodoya, K. Igarashi // Jpn. J. Forensic Sci. Tech. — 2002. — Vol. 6, N 2. P. 85-97.

102. Yodoya, J. Application of the Mixed Cell Agglutination Reaction Technique with Mouse Monoclonal Antibodies to Determination of ABO Blood

103. Groups from Forensic Biological Specimens / J. Yodoya, K. Ameno, K. Igara-shi// Acta Criminol. Medicin. Legal. Japon. 2004. - Vol. 70, N 5 - P. 153-158.