Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы RH в следах крови реакцией абсорбции-элюции с применением высокоактивных протеаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат биологических наук Кондратова, Ирина Владимировна

• Кондратова, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кондратова, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И ФУНКЦИИ f" ЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ. ГЕНЕТИКА И НОМЕНКЛАТУРА RH

АНТИГЕНОВ, МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ В СЛЕДАХ КРОВИ обзор литературы).

1.1. Структура и функция эритроцитарных антигенов, топография на эритро-цитарной мембране.

1.2. Генетика и номенклатура Rh-антигенов, распределение у различных народов, их трансфузионное и судебно-медицинское значение.

1.3. Методы выявления Rh-антигенов в следах крови

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. АДАПТАЦИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ РАЭ К ВЫЯВЛЕНИЮ РЕЗУС

АНТИГЕНОВ В СЛЕДАХ КРОВИ.

3.1. Ревизия основных этапов РАЭ.

3.2. Подбор пригодных для РАЭ сывороток анти-D.

Глава 4. О СЕРОЛОГИЧЕСКИ ВЫЯВЛЯЕМОМ НАЛИЧИИ В СЛЕДАХ КРОВИ

РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ( cde ) ЛИЦ D-ПОДОБНОГО РЕЗУС

АНТИГЕНА

4.1. Наличие D-подобного резус-антигена в эритроцитах резус-отрицательных (cde) лиц. Гемотрансфузионное и судебно-медицинское значение этого феномена.

Глава 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-АНТИГЕНОВ

В СЛЕДАХ КРОВИ.

5.1. Разработка способа модификации иммуноглобулинов IgG анти-D.

5.2. Разработка техники исследования полученных элюатов.

5.3. Разработка способа подсчета агглютинации эритроцитов (Scoring system).

5.4. Разработанная техника определения Rh-антигенов в следах крови.

Глава 6. ВЫЯВЛЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕХНИКОЙ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ RH ф В СЛЕДАХ КРОВИ. v 6.1. Выявление антигена D в пятнах крови живых лиц и в пятнах трупной крови

6.2. Выявление минорных резус-антигенов С, Cw, с, Е, е.

6.3. Определение резус-принадлежности крови экспертных пятен.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы RH в следах крови реакцией абсорбции-элюции с применением высокоактивных протеаз»

Из всех известных и наиболее значимых эритроцитарных антигенных систем -ABO, Rh, MNS, Kell, Duffy, Kidd, система Резус (Rh) обладает наиболее выраженным антигенным полиморфизмом и высокой информативностью. Это делает исключительно актуальным ее использование в судебно-медицинских целях, в частности, при разграничении следов крови на вещественных доказательствах.

Именно высокой значимостью указанной системы объясняются многочисленные попытки исследователей разработать чувствительные, пригодные для практической экспертизы, методики выявления Rh-антигенов в пятнах крови.

Анализ этих работ показывает, что такими методами чаще всего является реакция абсорбции-элюции (РАЭ) с использованием различных ферментных тестов. Так, в отечественной судебно-медицинской практике в качестве метода выявления Rh-антигенов в следах крови в настоящее время наиболее часто применяется разработанная Е.Е. Гальцевой (1973) трипсин-альбуминовая модификация РАЭ. В зарубежной практике обычно используется модификация РАЭ с применением папаина [87, 88].

Недавно отечественными исследователями [39, 40, 41] была разработана техника с использованием высокоактивных микробных и растительных протеаз для обработки не только стандартных тест-эритроцитов, но и исследуемых следов крови и выделений. Эта техника, названная авторами модифицированной РАЭ, позволяла значительно повысить чувствительность и специфичность выявления антигенов АВО в микроследах крови и выделений.

Поэтому, нами было предпринято изучение возможности повышения чувствительности и специфичности выявления в следах крови с помощью модифицированной РАЭ также и Rh-антигенов. Для этого было проведено широкое сравнительное изучение возможностей протеазной, папаиновой и трипсин-альбуминовой модификаций РАЭ, применявшихся при выявлении Rh-антигенов и выполнявшихся с использованием как классической техники, так и техники модифицированной РАЭ, в том числе и с применением модифицированных иммуноглобулинов IgG анти-D (пептидов анти-D). Подобные исследования выполнены впервые и для судебной медицины являются актуальными.

Цель работы

Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы Rh в следах крови реакцией абсорбции-элюции (РАЭ) с использованием на различных ее этапах высокоактивных протеаз микробного и растительного происхождения.

Задачи работы

1) Адаптация модифицированной РАЭ к выявлению Rh-антигенов в следах крови.

2) Выяснение сущности неспецифичности РАЭ при выявлении в следах крови резус - антигена D.

3) Разработка способа модификации иммуноглобулинов IgG анти-D с целью устранения неспецифичности РАЭ.

4) Разработка чувствительного и специфичного способа определении резус-принадлежности следов крови с применением пептидов анти-D.

5) Разработка чувствительной и специфичной техники определения в следах крови минорных резус-антигенов С, Cw, с, Е, е .

Научная новизна

Впервые серологическими методами установлена абсорбция антител анти-D энзимированным материалом резус-отрицательных (cde) лиц. Серологически этот феномен проявляется как D или D-подобный антиген. Экспериментально установлено значение этого D-подобного резус-антигена как причины неспецифичности РАЭ при определении резус-принадлежности следов крови. Разработан оригинальный способ устранения указанной неспецифичности (патент № 2209434 от 27.07. 2003 г.). Установлены также оптимальные сроки давности образования пятен крови для специфического выявления в них Rh-антигенов.

Практическая значимость работы

Разработана чувствительная, простая и надежная техника определения антигенов Rh-Hr в следах крови, что существенно повышает дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств.

Апробация работы и внедрение результатов Материалы диссертации доложены на научной конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ в декабре 2002 г. Апробация работы состоялась 21 февраля 2006 г. на расширенной конференции отдела судебно-медицинского исследования вещественных доказательств ФГУ РЦ СМЭ Росздрава. На апробации диссертации присутствовали специалисты из отдела судебно-медицинской идентификации личности и танатологического отдела ФГУ РЦ СМЭ, приглашенные специалисты из ГНЦ РАМН по специальности 14.00.29. - гематология и переливание крови. В Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию России представлена на утверждение подготовленная Сахаровым Р.С. и Кондратовой И.В. усовершенствованная медицинская технология: «Выявление антигенов системы Rh в следах крови», М., 2005 г.

Публикация результатов работы По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, из них 5 - в центральной печати. Получен патент № 2209434 от 27.07.2003 г.

Структура диссертации Диссертация изложена на 142 страницах компьютерной печати и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы. Текст иллюстрирован 38 таблицами и 3 рисунками. Список литературы содержит 159 источников, из которых на русском языке - 61 и 98 - на английском и других языках.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Кондратова, Ирина Владимировна

выводы

1. Разработана специфичная и чувствительная техника определения Rh антигенов D, С, Cw, с, Е, е.

2. Впервые серологическими методами обнаружен D- подобный антиген на цитоплазматической поверхности резус- отрицательных эритроцитов.

3. Доказано, что неспецифическая реакция в РАЭ обусловлена наличием указанного D- подобного антигена, что затрудняетопределениерез/с- принадлежности сухих пятен крови на вещественных доказательствах. В частности, при выявлении антигена D в РАЭ необходимо использовать пептиды анти-D.

4. Разработан способ получения пептидов IgG анти- D, не реагирующих с D-подобным антигеном резус-отрицательных эритроцитов (патент № 2209434 от 27.07.2003 г. «Способ получения резус-пептидов анти- D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений»).

5. Принимая во внимание протеиновую природу Rh-антигенов, менее устойчивую во внешней среде, целесообразно ограничить выявление антигена D с помощью пептидов анти-D пятнами крови с давностью образования не более 5 месяцев, а выявление минорных антигенов С, Cw, с, Е, е - пятнами крови с давностью образования 3 -4 месяца. Соблюдение указанных условий позволяет говорить о гарантированном определении Rh-антигенов крови пятен.

6. Установлено, что вследствии нестабильности, а часто и полностью отрицательных получаемых результатов, моноклональные антитела (во всяком случае, клоны МКА, имевшиеся в нашем распоряжении) непригодны для использования в РАЭ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С открытием в 1940-45 г.г. антигенов системы Rh (D, С, Cw, с, Е, е) стало ясно, что эта высоко полиморфная система может иметь большое значение не только для иммунологии, но и для судебной медицины. Так, например, выявление в пятнах крови 18 резус-фенотипов, образуемых указанными выше 6-ю антигенами, позволяет на треть повысить дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы [31].

Однако, первые исследования по выявлению Rh-антигенов в следах крови ингибиционной (абсорбционной) техникой, выполненные спустя несколько лет после открытия резус-антигенов, привели к обескураживающим результатам. Так, оказалось, что антиген D переставал выявляться уже через 2 часа после высыхания D-положительного пятна крови (П.Н. Косяков, М.А. Умнова, 1950; М.А. Бронникова, В.А. Багдасаров, Л.О. Барсегянц, 1957). Поэтому, подводя итоги указанным исследованиям, П.Н. Косяков и М.А. Умнова, (1950) писали: «Своей неустойчивостью к высушиванию антиген D существенно отличается от других содержащихся в эритроцитах человека антигенов - видовых, групповых А и В, а также типовых М и N. В силу этого использование антигена D в судебно-медицинской практике идентификации пятен крови при современных методах исследования встречает большие трудности». Только лишь с разработкой в 1960-70 г.г. высокочувствительной реакции абсорбции-элюции (РАЭ) [11, 65, 66, 100, 101, 120, 130] стали получать удовлетворительные результаты выявления Rh-антигенов в следах крови.

В 80-х годах, после расшифровки химического строения Rh-антигенов, стала понятна их неустойчивость к различным внешним воздействиям. Оказалось, что Rh-антигены - единственные из множества антигенов других эритроцитарных антигенных систем, которые не имеют опорного углеводного каркаса, т.е. являются чисто протеиновыми структурами [4, 67, 73, 123].

Современные методы выявления Rh-антигенов в следах крови базируются, в основном, на применении реакции абсорбции-элюции (РАЭ), активность и специфичность получаемых элюатов которой исследуется с помощью высокочувствительных ферментных тестов - папаинового, протеазного, трипсин-альбуминового и др. Недавно отечественными исследователями [39, 40] была разработана техника, названная авторами модифицированной РАЭ, предназначенная для выявления антигенов АВО в следах крови и выделений, заключающаяся в применении серологически активных протеаз для обработки не только стандартных эритроцитов, но и исследуемых пятен крови и выделений. Эта методика существенно повышает чувствительность выявления антигенов АВО, что значительно расширяет экспертные возможности, позволяя, в частности, выявлять указанные антигены в микроследах.

Поэтому, целью наших первоначальных исследований, представленных в главе 3, было изучение возможности повышения чувствительности выявления антигенов системы Rh путем адаптации модифицированной РАЭ применительно также и к выявлению антигенов указанной системы. При выполнении модифицированной РАЭ в качестве протеаз использовались ферментные препараты микробного (протеаза-С) и растительного (папаин) происхождения. В опытах сравнения использовался также животный трипсин, а получаемые элюаты иногда исследовались антиглобулиновым и поликати-онным тестами. При проведении исследований все этапы реакции абсорбции-элюции были подвергнуты ревизии, т.е. выполнялись при различных условиях с целью разработки техники, наиболее пригодной для выявления Rh-антигенов в следах крови. Такая ревизия РАЭ была тем более необходима, поскольку влияние предварительной обработки исследуемых пятен крови указанными высокоактивными протеазами при выявлении в них Rh-антигенов, в судебно-медицинской иммунологии изучалось впервые.

Как известно, фиксация материала при определении Rh-антигенов в следах крови уже давно не применяется, поскольку в 1967 г. Bargagna и Pereira [65] доказали, что обработка пятен крови такими реактивами, как 100% метанол, полностью ингибирует выявляемость антигена D в следах крови с помощью РАЭ.

Причиной, побудившей нас исследовать возможность применения фиксирования следов крови при выявлении в них Rh-антигенов, явилось понимание того факта, что Rh-антигены, в отличие от гликопротеиновых антигенов всех других изосерологических систем, являются чисто протеиновыми структурами, для которых может быть далеко не безразличным воздействие на пятна высокоактивных, в том числе микробных, протеаз, применяющихся при постановке модифицированной РАЭ. При этом мы полагали, что как и в случае выявления антигенов системы АВО [33, 39, 40], предварительное фиксирование создаст ту защитную пленку денатурированных сывороточных белков, которая защитит протеиновые структуры Rh-антигенов от прямого воздействия протеаз при энзимировании пятен, поскольку действие протеаз в первую очередь будет направлено на «растворение» наиболее доступных для них белков этой защитной пленки.

В качестве фиксирующих средств нами испытывались 100% метанол и глютаро-вый альдегид, ранее примененный Greenwalt et al. (1992) для фиксирования на предметных стеклах эритроцитов при выявлении в них резус-антигена D. Опыты показали, что в случае применения как метанола, так и глютарового альдегида, в не энзимированных после фиксирования пятнах также наблюдалось выраженное ингибирование чувствительности РАЭ; однако, если после фиксирования пятен они затем подвергались энзимированию, то в пятне крови, фиксированном метанолом, и после энзимиро-вания наблюдалось полное ингибирование выраженности РАЭ. В то же время, если фиксированное глютаровым альдегидом пятно крови затем подвергалось энзимированию, то в этом пятне наблюдалось выраженное выявление антигена D (табл. 4).

Таким образом, широко распространенное мнение о недопустимости фиксирования пятен крови при определении Rh-антигенов - нуждается в коррекции в том смысле, что этот постулат справедлив не для всех фиксирующих реактивов. В частности, глю-таровый альдегид вполне может быть использован для фиксирования пятен при выявлении антигена D, как это показано в табл. 4. Однако, наши дальнейшие многочисленные эксперименты в этом направлении с разными сыворотками анти-D, с пятнами разных лиц и с пятнами разной давности образования, заставили нас внести существенные уточнения и дополнения в это утверждение.

Прежде всего, необходимо отметить, что наши опасения о небезразличности воздействия высокоактивных протеаз на протеиновые структуры Rh-антигенов оказались оправданными и они были связаны с давностью образования исследуемых пятен. Так, опыты показали, что пятна крови с небольшой давностью образования (до 6 месяцев) и, особенно, свежеобразованные пятна крови (2 недели - 1 месяц) не надо ни в коем случае ни обрабатывать протеазами, ни фиксировать, т.к. энзимирование пятен крови в этих случаях может привести не только к ухудшению выраженности, но и к полной ингибиции реакции выявления антигена D (табл. 9). Применение же фиксирования с последующим энзимированием повышало неспецифичность РАЭ. В то же время, при исследовании пятен крови с достаточно длительной давностью образования (9 месяцев и выше) применение энзимирования пятен является обязательным, т.к. значительно повышает чувствительность выявления антигена D (табл. 8). Особенно наглядно это установлено при исследовании очень старых пятен крови (в наших опытах -с давностью образования 14 лет). Обработка этих пятен крови протеазой-С позволила достоверно выявить в них антиген D, при полной несостоятельности трипсин-альбуминового теста (табл. 10).

В целом, при однократной постановке РАЭ с одним и тем же кусочком материала, применение фиксирования оказалось ненужным, т.к. свежеобразованные пятна надо исследовать нативными, а старые пятна не нуждаются в фиксации, по-видимому, за счет достаточного количества денатурированных белков, образовавшихся в процессе хранения пятен.

Мы полагаем, что современные знания о химическом строении Rh-антигенов и их топографии на поверхности эритроцита как чисто протеиновых структур, лишенных обычного для эритроцитарных антигенов углеводного опорного каркаса и глубоко утопленных в липидный матрикс эритроцитарной мембраны, позволяет предположить, что при высыхании пятен, т.е. дегидратации крови, происходят конформационные (пространственные) изменения поверхностных структур мембраны эритроцитов, что приводит в той или иной степени к недоступности Rh-антигенов для соответствующих антител, т.е. к невозможности осуществления реакции антиген-антитело. Эти структурные изменения в известной степени аналогичны процессу, отображенному на рис. 2. Доказательством сказанного явились опыты, по применению модифицированной РАЭ (т.е. с предварительным энзимированием высокоактивной протеазой исследуемых пятен), когда антиген D был четко выявлен в очень старых (14-летних) пятнах крови при полной несостоятельности трипсин-альбуминового теста (глава 3, табл. 10). Мы полагаем, что эти данные наглядно подтверждают высказанное выше положение о причине невыяв-ляемости антигена D в старых пятнах как следствие «замуровывания» этого антигена старыми денатурированными сывороточными белками, освободившись от которых посредством энзимирования пятен крови, он вновь становится доступен для антител анти-D и начинает четко выявляться.

К сожалению, дальнейшие эксперименты показали, что высокоактивные сыворотки анти-D со «зрелыми» иммуноглобулинами IgG анти-D, специфически реагирующие в РАЭ, подобно сыворотке, использованной нами при выявлении антигена D в 14-летних пятнах крови, встречаются исключительно редко и эти, действительно, прекрасные возможности подлинной (с энзимированием исследуемых пятен крови) модифицированной РАЭ еще ждут своих специфически реагирующих гипериммунных антител IgG анти-D.

В отличие от распространенного в судебно-медицинской серологии мнения о специфичности, чувствительности и надежности РАЭ с использованием протеаз при выявлении Rh-антигенов в следах крови, в случае применения протеаз, особенно микробной протеазы-С, мы столкнулись с проблемой неспецифичности РАЭ при выявлении резус-антигена D с помощью обычных сывороток анти-D. Она заключалась в том, что при исследовании получаемых элюатов, с Rh(+) энзимированными эритроцитами реагировали элюаты не только из Rh(+), но и из rh(-) пятен крови, при полном отсутствии реакции с rh(-) энзимированными эритроцитами. Если же модифицированная РАЭ применялась при исследовании старых пятен, то наряду с резким повышением выраженности специфической реакции, одновременно заметно повышалась выраженность и неспецифической реакции. Точно также при исследовании свежих пятен (которые нельзя обрабатывать протеазой), наряду с ухудшением выраженности специфической реакции, снижалась выраженность и неспецифической реакции.

Ревизия всех этапов РАЭ: исследование материала, фиксированного различными фиксаторами, его обработка перед абсорбцией белковыми средами, подбор разведений стандартных сывороток анти-D перед введением их в этап абсорбции, количества абсорбируемого материала и числа отмываний от несвязавшихся антител, определение температурного оптимума элюции в различных средах, сравнение различных серологических методов (коллоидных, поликатионных, ферментных, антиглобулинового теста) при учете активности получаемых элюатов - при всех вариантах этапов РАЭ не было получено специфических результатов (глава 3).

Это заставило обратить особое внимание на сущность неспецифической реакции, которую часто имели элюаты нативных сывороток анти-D, независимо от того, какой протеазой (животного, растительного или микробного происхождения), были обработаны тест-эритроциты, использовавшиеся для исследования элюатов.

В результате проведенных многочисленных абсорбционно-элюционных экспериментов мы пришли к парадоксальному выводу о наличии в резус-отрицательных ( cde) эритроцитах антигена со специфичностью резус-антигена D (или D-подобного антигена).

Этот вывод основан на следующем: специфичность элюатов как из Rh(+), так и из rh(-) пятен крови серологически определялась как антитела анти-D (табл. 14); увеличение числа процедур отмывания сенсибилизированного материала с 6 до 12 не приводило к устранению неспецифичности РАЭ (табл. 15); попытка устранения неспецифичности РАЭ предварительной абсорбцией сывороток анти-D резус-отрицательными энзимированными эритроцитами оставляла без изменения неспецифичность реакции; однако, применение для этой цели материала rh(-) - отрицательных энзимированных пятен крови приводило к тому, что элюат переставал реагировать с Rh(+) эритроцитами, особенно при повторении абсорбционных процедур; аналогичным образом можно было инактивиро-вать не только элюаты, но даже и сыворотки анти-D (табл. 16). В силу своей хорошей изолированности от внешней среды (от плазмы крови) на внутренней (цитоплазматической) стороне мембраны резус-отрицательных эритроцитов, он не принимает участия в обычных иммунологических реакциях и потому не имеет трансфузионного значения и не должен приниматься в расчет при типировании эритроцитов в случае, когда они сохраняют свою морфологическую целостность.

Что же касается судебно-медицинской серологии, то наличие антигена D в резус-отрицательных эритроцитах создает серьезные трудности при определении резус-принадлежности крови в пятнах, имеющихся на вещественных доказательствах.

С точки зрения современных представлений [5, 62 73 123, 147], негликолизиро-ванные протеиновые змеевидные нити, каковыми являются антигены Rh, не только вы ступают над поверхностью эритроцита, но и проникают сквозь мембрану на ее внутреннюю сторону, выполняя свои физиологические функции в цитоплазме эритроцита -транспорт ионов и мембранную стабилизацию. По-видимому, эти же функции выполняет антиген D и в резус-отрицательных эритроцитах.

В настоящее время методами иммунохимии расшифрована даже аминокислотная последовательность Rh-протеинов, полученных из Rh-антигенов разной специфичности. Однако, знание этой последовательности не позволяет установить, каким конкретно из антигенов (С, Cw, с, D, Е, е) является данный белок, поскольку установить его иммунологическую специфичность возможно только с помощью антител, взаимодействующих с нативным Rh-белком [64, 69].

В связи с этим, является далеко не случайным, что обнаружение нами резус-антигена D в резус-отрицательных эритроцитах связано с использованием в экспериментах простых, чувствительных и специфичных серологических методов исследования.

Таким образом, мы пришли к такому положению, когда определение антигена D в следах крови с помощью имевшихся в нашем распоряжении сывороток анти-D, было практически невозможно из-за неспецифичности, связанной, как мы полагаем, с наличием D-подобного антигена в резус-отрицательных эритроцитах, так и с реагированием сывороток анти-D с предметами-носителями.

Результаты наших экспериментов и данные других авторов (Plapp et al., 1979) показывали, что антигены D резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов имеют разную топологию, а именно: антиген D резус-положительных эритроцитов находится на наружной (плазматической) стороне мембраны эритроцитов, тогда как антиген D резус-отрицательных эритроцитов находится на внутренней (цитоплазматиче-ской) стороне эритроцитарной мембраны. Другими словами, разница в расположении между этими антигенами на резус-положительном и на резус-отрицательном эритроците составляет, примерно, толщину мембраны эритроцитов, т.е. хотя и малую, но вполне дискретную величину.

Анализируя результаты исследований, мы пришли к пониманию того, что для устранения неспецифического реагирования сывороток анти-D в РАЭ нужно воздейст вовать непосредственно на их молекулярное строение так, чтобы они не могли связываться с D-подобной структурой резус-отрицательных пятен крови (и с материалом предметов-носителей), что возможно, по-видимому, при укорочении длины молекулы антител анти-D.

Для этой цели было решено непосредственно в сыворотку анти-D добавлять микробную протеазу - протеазу-С. Ее количество, а также продолжительность ферментативной реакции отрабатывались экспериментально. Кроме того, для остановки дальнейшего действия фермента, чтобы он не разрушал уже образовавшиеся пептиды оптимального размера, необходимо было подобрать и условия ингибиции протеазы-С.

В результате экспериментальных исследований была разработана техника получения пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген D в следах крови и не реагирующих с материалом предметов-носителей. На разработанную технику был получен патент № 2209434 от 27.07.2003 г.: «Способ получения резус-пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений».

Была разработана также оригинальная техника постановки РАЭ с применением кратных разведений пептидов анти-D на этапе абсорбции исследуемого материала, с элюцией сенсибилизированного материала на предметных стеклах в физиологический раствор с последующим добавлением в полученные элюаты соответствующих стандартных энзимированных эритроцитов, с подсчетом выраженности агглютинации (Scoring system) и расчетом коэффициента неспецифичности (КН). Это позволило четко определять резус-принадлежность исследуемых следов крови также и в тех случаях, когда с контрольными образцами резус-отрицательной (ccddee) крови наблюдается небольшая неспецифическая агглютинация.

Исключительно важными явились экспериментальные данные об ингибиции активности пептидов анти-D в РАЭ при исследовании пятен крови, предварительно обработанных протеазами (глава 5, табл. 26). Эти данные, по-видимому, отражают способность пептидов реагировать с наиболее поверхностно расположенными резус-антигенами и являются одной из серологических особенностей свойств пептидов анти-D, отличающих их от нативных сывороток анти-D. серологических особенностей свойств пептидов анти-D, отличающих их от нативных сывороток анти-D.

Не менее важны также и экспериментальные данные, показавшие, что не все ал-лоиммунные сыворотки анти-D, даже имеющие примерно равные титры антител, одинаково пригодны для получения активных в РАЭ пептидов анти-D. При этом моноклональные антитела анти-D, даже с высоким титром антител, для получения пептидов анти -D практически не пригодны.

Выявление антигенов системы Rh-Hr с помощью разработанной техники РАЭ (глава 6) показало, что антиген D, в том числе и его слабовыраженный вариант - антиген Du, четко выявляется в пятнах крови живых лиц, а антиген D - также и в пятнах незажившей трупной крови (табл. №№ 31, 32, 33, 34).

Вместе с тем, мы наблюдали несколько образцов крови резус-отрицательных лиц, пятна которых в течение 4-5 и даже 6 месяцев в РАЭ реагировали совершенно специфично; однако в процессе хранения пятен, через 9-10 месяцев они начинали давать выраженную неспецифическую реакцию, не позволявшую определять резус-принадлежность их крови (КН находился в зоне неопределенности). Предсказать заранее развитие такой ситуации - невозможно. Поэтому, несмотря на то, что мы впервые в мире доказали возможность выявления антигена D модифицированной РАЭ в чрезвычайно старых (14-летних) пятнах крови, в условиях отсутствия централизованного изготовления и снабжения сыворотками антирезус, отвечающих требованиям выявления резус-антигенов в пятнах крови, целесообразно ограничить выявление антигена D с помощью пептидов анти-D пятнами крови, имеющими давность образования не более 5 месяцев. Это позволит гарантировать точное определение резус-принадлежности крови пятен.

Такой вывод практически соответствует имеющимся литературным данным. Так, например, Gaensslen et al., [87], используя сыворотки, специально предназначенные для исследования пятен крови, считают, что «ложно-положительные реакции не являются проблемой при исследовании в сроки, оптимальные для выявления Rh-антигенов». Такими оптимальными сроками эти авторы считают давность образования исследуемых пятен не более б месяцев. Martin [125] также смог обнаруживать присутствие всех Rh-антигенов в пятнах возрастом до 6 месяцев с использованием техники, сходной с примененной Gaensslen et al. [87]. Bargagna et al. [65] нашли антиген D определяемым в пятнах до 6-месячного возраста.

Исследования показали, что при наличии достаточно активных и специфичных соответствующих сывороток, не имеется каких-либо проблем в выявлении в пятнах крови и минорных резус-антигенов: С, Cw, с, Е, е. В отличие от антител к мажорному антигену D, антитела к минорным антигенам не требуют превращения их перед использованием в РАЭ в соответствующие пептиды. Более того, из этих антител пептиды получить обычно и не удается. Вместе с тем, как и антитела анти-D, не все антитела к минорному антигену любой специфичности, были активны в РАЭ и требовалась предварительная проверка каждого минорного антитела на его пригодность применения в РАЭ.

Исследования показали, что наиболее надежное и стабильное выявление минорных антигенов обеспечивается применением в РАЭ соответствующих поликлональ-ных аллоиммунных резус-антител как неполной, так и, особенно, полной формы. Применяя активные в РАЭ указанные антитела в титре 1:32-1:64, мы во всех исследованных случаях наблюдали четкое и специфическое выявление соответствующих минорных антигенов.

Вместе с тем, не следует забывать о протеиновой природе Rh-антигенов, которая может напомнить о себе при неправильном хранении вещественных доказательств. При экспертном выявлении Rh-антигенов должна обеспечиваться безусловная надежность результатов РАЭ. Такое гарантированное выявление всех минорных Rh-антигенов (С, Cw, с, Е, е) разработанной нами ферментной техникой обеспечивается при исследовании пятен крови, хранившихся в условиях, близким к комнатным и имеющих давность образования не более 3-4 месяцев. Как мы уже отмечали выше, при выявлении антигена D, давность образования пятен не должна превышать 5 месяцев.

Полученные нами результаты, как мы уже отмечали выше, полностью совпадают с имеющимися современными литературными данными (Gaensslen et al., [87], Martin, [125], Bargagna et al.,[65]).

Апробация разработанной техники определения резус-принадлежности крови пятен на экспертном материале показала, что эта методика, разработанная на экспери ментальных пятнах крови, в реальных экспертизах дает такие же результаты, что и в эксперименте. Это позволяет обоснованно рекомендовать разработанную технику определения резус-антигенов в пятнах крови в экспертную практику.

Исследование смешанных пятен крови и выделений не входило в число решаемых задач нашей работы. Тем не менее, немногочисленные ориентировочные опыты со смешанными пятнами (крови и спермы) показали, что сыворотка, прекрасно выявляющая антиген D в пятне крови, может и не выявить этот антиген в смешанном пятне резус-положительной крови и резус-отрицательной спермы. И, наоборот, другой образец сыворотки с тем же титром антител анти-D, в этом же смешанном пятне может прекрасно выявлять этот антиген.

Молекулярные механизмы этого феномена пока не совсем ясны.

С практической точки зрения, по-видимому, при исследовании смешанных пятен крови и выделений (спермы, слюны, вагинальных выделений), активность вводимых в РАЭ сывороток (анти-D) должна быть предварительно проверена со смешанными пятнами. Мы полагаем, что выявление резус-антигенов в смешанных пятнах крови и выделений - должно явиться темой дальнейших научных исследований. В связи с этим, разработанную технику выявления резус-антигена D, пока не следует применять в экспертизах, связанных с сексуальными мотивациями.

Выполненные нами исследования убедительно свидетельствуют о необходимости налаживания централизованного производства антирезусных сывороток, специально предназначенных для выявления антигенов Rh-Hr в пятнах крови и выделений. Более того, как мы уже отмечали выше, эта задача является одной из наиболее актуальных задач практической судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, поскольку введение в практику экспертиз выявления резус-антигенов Rh-Hr, (в том числе и с исследованием резус-фенотипов), позволит почти на треть (на 28%) повысить дифференцирующие возможности экспертизы объектов биологического происхождения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кондратова, Ирина Владимировна, 2006 год

1. Абдина А.С. Группы крови у хакасов. // Дис. . канд. мед. наук. - М., 2000.

2. Барсегянц Л.О. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы). // Руководство для судебных медиков. М, Медицина, 1999, -272 с.

3. Барсегянц Л.О., Большакова Е.В. Влияние некоторых биологических факторов на изоантигены системы АВО. // Суд.-мед. экспертиза, 2002, № 5, -С. 22-23.

4. Белкина Е.В. Гетерогибридомы, секретирующие моноклональные IgM антитела к антигену D системы резус. // Дис. .канд. биол. наук. М., 1994.

5. БернетФ. Клеточная иммунология (перев. с англ.). М.: Мир.-1971.

6. Биочинская Л.М. Выявление антигена D системы резус в органах и тканях загнивших трупов реакцией абсорбции-элюции. // Суд.-мед. экспертиза, 1984, №2, -С.41-43.1

7. Бронникова М.А., Багдасаров В.А., Барсегянц Л.О. К вопросу обопределении групп изосерологических систем Льюис и Резус. // Суд.-мед. экспертиза, 1958, №3, -С. 194-198.

8. Буренкова Л.В. Аплоантигенные эритроцитарные маркеры человека, ихзначение в происхождении иммунологических конфликтов и особенности диагностики резус-иммунизации. Дисс. д-ра мед наук. Фрунзе. -1983.

9. Васильева З.Ф. Значение резус-фактора в судебной медицине. // Дис.канд. мед. наук, -Л., 1960.

10. Гавриляк Л.Г. К вопросу об определении групповой принадлежности крови в пятнах методом абсорбции-элюции. // В кн.: Матер. V Всесоюзн. научн. конф. суд. мед. Л., «М», 1969, Т. 2, - С. 231-233.

11. Гальцева Е.Е. Выявление антигена D системы резус в пятнах крови реакцией абсорбции-элюции в судебно-медицинских целях. //Дисс. канд. мед. наук. -М., 1973, 171 с.

12. Доссе Ж. Иммуногематология (перев. с франц.), М., -1959. -638 с.13а. Донсков С.И. Группы крови системы Rhesus (теория и практика).-М., 2005, -392с.

13. Загрядская А.П., Федоровцев А.П., Королева В.И. Судебно-медицинское исследование клеток и тканей. М., Медицина, 1984, -104с.

14. Зотиков Е.А. Антигенные системы организма человека и гомеостаз. М., Наука, 1982,-187с.

15. Зотиков Е.А., Уринсон P.M. Изменение антигенных свойств эритроцитов подвлиянием некоторых химических агентов. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1965, № 7. -С.83-88.

16. Иммуносерология (нормативные документы). Составители : А.Г. Башлай, С.И.1. Донсков. М., 1998, 194 с.

17. Колоколова Г.П. Применение протеазы-С при определении антигена Pi реакцией абсорбции-элюции в следах крови. // Суд.-мед. экспертиза, 2000, № 5, С. 37-39.

18. Косяков П.Н. Изоантигены и изоантитела человека в норме и патологии. -М.1974.-360 с.

19. Косяков П.Н., Умнова М.А. Действие высушивания и температуры на резус-антиген человека. // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1950, 29, С.76.

20. Лапенков М.И. Анти-АВН-Lewis моноклональные антитела: получение, определение эпитопной специфичности и применение в судебной медицине. Дис. докт. мед. наук. М., 2002, -273 л.

21. Мороков В.А. Типирование эритроцитов доноров как возможный способ профилактики посттрансфузионных осложнений. // Гематол и трансфузиол. -1988, 3 7. -С.54-57.

22. Мороков В.А. Серология системы резус. М. - 1995.

23. Нофаль Х.К. Роль протеаз рослинного та тваринного походження в пщвищеншчутливост1 реащй, яки виявляють антитта i антигеш системи АВО при судовомедичних дослщженнях слщов кров1. Дис. . канд. мед. наук, Киев, 1994,-177л.

24. Перепечина И.О. Применение моноклональных антител к групповым антигенам А, В, Н при судебно-медицинском исследовании крови и выделений человека. Дис. канд. мед. наук. М., 1990. - 171 л.

25. Пискунова Т.М. Изучение некоторых изоантигенов крови человека и созданиекадров доноров и резерва замороженной крови редких групп. Дис. . канд. биол. наук. М., 1970, - 241 л.

26. Попов Н.В. Индивидуальное исследование кровяных пятен при помощи изоагглютинации. // Тр. Смоленского общества естествоиспытателей и врачей. -1930. -№ 4. -С. 173-229.

27. Рассулин Ю.А., Сахаров Р.С. Изучение серологической активности протеолитического комплекса Streptomyces griseus проназы и ее аналога протелина.//Вопросы медицинской химии, 1973, №3, -С.312-318.

28. Рассулин Ю.А., Сахаров Р.С. Изучение серологической активности эластолитического комплекса Actinomyces rimosus. // Вопросы медицинской химии. 1973, №4, С.368-371.

29. Сахаров Р.С. О повышении чувствительности реакции выявления антител иантигенов некоторых изосерологических систем. Дис. . канд. мед. наук, М., 1968, -271л.

30. Сахаров Р.С. Применение протеолитических ферментов в изоиммунологии исудебной медицине. Автореферат дисс. докт. мед. наук. -М., 1988, 48 с.

31. Сахаров Р.С. Состояние и перспективы науки в области судебно-медицинскойэкспертизы объектов биологического происхождения. // Суд.-мед. экспертиза, 2001, №3, С.15-17.

32. Сахаров Р.С., Перепечина И.О., Виха Г.В. Методы выявления эритроцитарныхизоантигенов и изоантител с использованием положительно заряженных полимеров. //Лаб. Дело, 1986, № 1, -С. 666-670.

33. Сахаров Р.С., Перепечина И.О., Крестьянова И.Н. Протеазный методвыявления резус-антигенов при исследовании жидкой крови в судебно-медицинских целях. // Суд.-мед. экспертиза, 1986, № 3,- С. 26-30.

34. Сахаров Р.С., Нофаль Х.К. Частота групп крови АВО, выраженность групповыхантигенов и изогемагглютининов у арабов Сирии. // Суд.-мед. экспертиза, 1996, № 2,- С. 34-36.

35. Сахаров Р.С., Каверзнева Е.Д. Условия сохранения видовой специфичностикрови в пятнах при ферментативном гидролизе. // Суд.-мед. экспертиза, 1988, № 1, -С.25-27.

36. Сахаров. Р.С., Лазаренко Ю.П. Экспресс-метод определения антигенов системы Rh-Hr с помощью протелина. // Пробл. гемат. и перел. крови, 1971, №3, С.54-56.

37. Сахаров Р.С., Федулова М.В. Применение протеаз для повышения чувствительности выявления антигенов системы АВО реакцией абсорбции-элюции в следах крови. // Суд.-мед. экспертиза, 1998, № 5. С. 73-74.

38. Сахаров Р.С., Федулова МБ. Применение протеаз для повышения чувствительности выявления антигенов системы АВО реакцией абсорбции-элюции при исследовании следов выделений человека. // Суд.-мед. экспертиза, 1999, № 6 С. 29-32.

39. Сахаров Р.С., Федулова М.В. Патент на изобретение № 2138812 «Способполучения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции сывороток анти-А(а), анти-В (/?) при выявлении антигенов А, В в следах выделений человека» // Бюллетень № 27 от 27.09.99 г.

40. Сахаров Р.С., Вихман А.А., Панкратьева Е.В. Эритроцитарные изоантигены,изосерологические систмы и группы крови у карпа Ciprinus carpio L. // Генетика, 1999, т. 35, № 2,- С. 263-265.

41. Сахаров Р.С., Кондратова И.В., Федулова М.В., Гургенидзе Е.В. Современныепредставления о структуре и функции эритроцитарных антигенов (обзор литературы к 100-летию открытия групп крови). // Суд.-мед. экспертиза, 2001, № 5,- С. 38-43.

42. Сахаров Р.С., Кондратова И.В., Федулова М.В., Крестьянова И.Н. О серологически выявляемом наличии в следах крови резус-отрицательных (cde) лиц резус -антигена D. // Суд.-мед. экспертиза, 2002, №2, с.25-28.

43. Сахаров Р.С., Юдина Г.С., Зарецкая Е.Ф., Колоколова Г.П., Федулова М.В.

44. Методические рекомендации: "Применение протеаз для повышения чувствительности выявления антигенов изосерологических систем АВО, Lewis, Р при судебно-медицинском исследовании следов крови и выделений»(№2001/104, утв. МЗ РФ 26.04.01), 14с.

45. Свирский М.С. Модификация метода смешанной агглютинации. // Вопр. суд.-мед. экспертизы, М., 1968, вып. IV, -С.240-242.

46. Свирский М.С. Применение методов абсорбции-элюции и смешанной агглютинации в экспертизах вещественных доказательств // Суд.-мед. эксперт, и криминалистика на службе следствия. Ставрополь, 1971, вып. 6, -С.149-150.

47. Серебрянников П.В. Метод избирательной абсорбции при определении кровяных групп в кровяных пятнах. // Суд.-мед. экспертиза, 1928, № 8, С. 3.

48. Серопян А.К. К вопросу об определении агглютиногенов крови в пятнах ничтожно малого размера // Суд.-мед. эксперт, и криминалистика на службе следствия. Ставрополь, 1967, вып. 5, -С. 614-617.

49. Томилин В.В., Барсегянц J1.0., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. М., Медицина,1989, 304 с.

50. Томилин В.В., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование крови в делах о спорном отцовстве, материнстве и замене детей. М., Медицина, 1981,-240 с.

51. Туманов А.К. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. М., 1961, -580 с.

52. Туманов А.К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. М., Медицина, 1975,-515с.

53. Туманов А.К., Томилин В.В. Наследственный полиморфизм изоантигенов и ферментов крови в норме и патологии человека. М., Медицина, 1969, -436 с.

54. Умнова М.А., Прокоп О., Пискунова Т.М. и др. Распределение различных факторов крови у населения Москвы. М., Наука, 1964, -8 с.

55. Чимиддуламын Ш. Групповые свойства крови у монголов. Автореферат дисс. канд. мед. наук. М., 1970, -25 с.

56. Шабашова И.В. Лекции по клинической иммунологии.- СПБ.—1988, -113с.

57. Юдина Г.С. Исследование антигенов систем MNSs и Lewis в пятнах крови в судебно-медицинских целях. Дис. канд. мед. наук. -М., 1976.

58. Юдина Г.С., Зарецкая Е.Ф. Антигенная дифференциация по системем Lewisследов крови в судебно-медицинской экспертизе. // Суд.-мед. экспертиза, 2002, № 3, С. 24-27.

59. Юдина Г.С., Зарецкая Е.Ф., Перепечина И.О. Выявление антигена Р системы

60. Рр в костной ткани и волосах человека.- // Сборник работ 69-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН, I часть, Курск, 2004, с. 122-123.

61. Agree P., Cartron J. P. // Blood. 1991. - Vol. 78, N 3,- P.551-563.

62. Allen F.H., Tippett P.A. A New Rh Blood Type Which Reweals the Rh Antigen G. // Vox Sanguinis< Vol. 3, N 5, 1958, p.p. 321-330.

63. Arce M.A., Thompson E.S., Wagner S., Coyne K.E., Ferdman B.A., Lublin D.M. : Molecular cloning of RhD cDNA devived from a gene present in RhD-positive, but not RhD-negative individuals. // Blood 82: 651, 1993.

64. Bargagna M., Pereira M. A Studi of Absorption-Elution as a Method of Identification of Rhesus Antigens in Dried Bloodstains. //Journal of Forensic Science Society, Vol 7,1967, p.p. 123-130.

65. Bargagna M., Sabelli M., Giacomelli C. The Detection of Rh Antigens (D, С, с, E, e) on Bloodsstains by a Microelution Technicue Using Low Ionic Strength Solution

66. SS) and Papain-Treated Red Cells. // Forensic Science International, Vol. 19, N 2, 1982, p.p. 197-203.

67. Blay C., Blanchar D., Lambin P. // Mol. Immunol. 1988. Vol. 25, N 9. - P. 92659300.

68. Caren I.D., Bellavance R., Grumet F.C. Demonstration of gene dosage effect on antigens in the Duffy, Ss and Rh system using on ensime-linked immunosorbent assay. //Transfusion. -1982, vol. 22. -P.475-478.

69. Cartron J.P., London J. : The protein and gene structure of red cell glycophorins, in Agre P.C., Carton J.P. (eds): Protein Blood Group Antigens of the Human Red Cell. Baltimore, MD, John Hopkins, 1992, P.101.

70. Cartron J.P. Structure and function of red cell antigens. // Proceeding of the ISBT,5th regional (4 european) Congress: ed. U. Rossi et al., 1997, P. 605-610.

71. Clausen H., White Т., Takio К et al. Isolation to homogenety and partial characterization of a histo-blood group A defined Fuca 1 -> 2 Gala 1 -» 3 N -acetylgalactosaminyltransferase from human lung tissue // J. Biol. Chem. - 1990; 265:1139-45.

72. Cheikha I., Khayat H.Groupes sanguins en Syrie // Rev. Fr. Transfus. Immunohematol/ -1996. vol. 29, N 1. -P.41-43.

73. Cherif-Zahar В., Bloy C., Le Van Kim C., Bailly P., Hermand R., Salmon C., Cartron

74. J.P., Colin Y.: Molecular cloning and protein structure of a human blood group Rh polipeptide .// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6243, 1990.

75. Chaudhuri A., Zbrzezna V., Polyakova J., Pogo A.O., Hesselgesser J., Horuk R.: Expression of the Duffy antigen in К 562 cells/// J. Biol. Chem. 269: 7835, 1994.

76. Closon J. L antigene Rh dans le sang desseche. // Acta Medicinae Legalis and

77. Socialis, Vol. 2, 1949, p.p.227-230.

78. Colin Y., Bailly P., Cartron J. P.: Molecular genetic Basis of Rh and LW bloodgroups. //Vox Sang. 67: 67, 1994 (suppl. 3).

79. Colin Y., Cherif-Zachar В., Le Van Kim C. et al. Genetic basis of the Rh-positive and

80. Rh-negative blood group polymorfism as determined by Sousern analysis. // Blood 1991:78; 2747-52.

81. Denault G.C., Takimoto H.H., Kwan Q.Y., Crim D., Pallos A., Detectubility ofselected genetic markers in dried blood on agin. // J. Forensic Sci , 1980, 25 : 479-498.

82. Douglas R., Staweley J. Rh and Kell typings of dried blood stains. // J. For Sci. Soc.,1969, 14, 2, 255-262.

83. Ducos J. Etude de Г Absobtions des Anticorps Anti-Rhesus par le Sang See

84. Application an Grouppage des Taches de Sang), thesis, Doctor of Medicine Imprinerie L1 Lider, Toulouse, France, 1954.

85. Ebert M., Met J., Weiker H., Roelcke D. Die Ficin-katalysierte Fragmentierung von

86. Erythrozytenmembran Glycoprotein. // Hoppe-Seuler's Z. Physiol. Chem. -1971, Bd. 352. -S.1309-1318.

87. Evans J.P., Brown P.J., Sinor L.T., Tilzer L.L., Beck M., Plapp F.V. Detection of anantigen on the inner surface of Rh negative erythrocytes which binds anti-D IgG. // Mol. Immunol. 1983 - 20(5), 529-536.

88. Faraone G. Si di una technica di microestrazione a cardo delle agglutinine nellemacchine di sangue. // Sacchia . -1942. -Vol. 6. -P. 188.

89. Finne J., Krusius Т., Rauvala H. et al. Alkali-stable blood group A-and B-active polyglycosyl)-peptides from human erythrocyte membrane. // FEBS. Lett. -1978. -V/ 89. -P.111-115.

90. Fiori A., Marigo M., Benciolini P. Modified Absorption-Elution Method of Siracusafor ABO and MN Grouping of Bloodstains. // Journal of Forensic Sciences, Vol. 8, N 3, 1963, p.p. 419-455 and 535-567.

91. Funaro A., Spagnoli G.C., Momo M., Knapp W., Malavasi F.: Stimulation of T-cellsvia CD 44 requires leucocyte-function-associated antigen interactions and interleukin-2 production. // Hum. Immunol. 40: 267, 1944.

92. Gaensslen R.E., Lee G.C., Pagliaro E.M., Bremser I.K. Evaluation of antisera forbloodstain grouping I. ABH, MN, and Rh // J. Forens. Sci. 1985. - Vol. 30, N 3. - P. 632-654.

93. Gaensslen R.E., Lee G.C., Pagliaro E.M., Bremser I.K. Evaluation of antisera forbloodstain grouping II. Ss, Kell, Duffy, Kidd and Gm/Km // J. Forens. Sci. 1985. -Vol. 30, N3.-P. 655-676.

94. Gaensslen R.E. Sourcebook in Forensic Serology, Immunology and Biochemimistry.

95. U.S. Government Printing Office. Washington, DC, 1983.

96. Gamberg C.G., Jokinen M., Anderson L.C. Expression of the major red cell sialoglycoprotein, glycophorin A in the human leucemic cell line К 562. // J. Biol. Chem. 1979. -Vol. 254, N 15. -P.7442-7448.

97. Greenwalt T.J., Dumasvala U.J., Siongco A., Domino M.M. An Enzyme-Linked

98. Antiglobulin test to detect red cell globulins after glutaraldenyde fixation. // Vox Sang., 1992, -v. 63, -p. 262-267.

99. Haest C.W.M. Interaction between sceleten proteins and the intrishing domain of theerythrocyte membrane. // Bioch. Biophys. Acta. -1982. -Vol. 694. -P. 331-352.

100. Hartel-Schenk S., Agre P.: Mammalian red cell membrane Rh polypeptides areselectively palmitoy-lated subunits of a macromolecular complex. // J. Biol. Chem. 267: 5569, 1992.

101. Holzer F.J. Ein enfaches Verfahren zur Gruppenbestimmung an vertrocknetem Blutdurch Agglutininbindung. // Deutsche Zeitschrift fur die Gesamte Gerichtliche Medizin. //Vol. 16, N 1, 1931, p.p. 445-458.

102. Horuk R., Chitnis C.E., Darboune W.C., Colby T.J., Rubicki A., Hadley T.J., Miller

103. H.: A receptor for the malarial parasite Plasmodium vivax: the erythrocite chemokine receptor. // Science 261:1182, 1993.

104. Hughes-Jones N.C., Gardner В., Telford B. The effect of pH and ionic strength onthe reaction between anti-D and erythrocytes. // Immunology. -1964. -Vol. 7. -P. 72.

105. Hughes-Jones N.C. Red cell antigens, antibodies and their interaction. // Clin.

106. Haemat. -1975. -Vol. 4. -P.29.

107. Issitt P.D. Serology and Genetics of the Rhesus Blood System. Montgomery Scientific Publishers, Cincinnati, OH 1979.

108. Issit P.D. and Issit C.H., Applied Blood Group Serology, 2d ed., Spectra Biologicals, Division of Becton-Dickinson, Oxnard, CA, 1976.

109. Kind S.S. Absorbtion-Elution Grouping of Dried Blood Smears. // Nature, Vol. 185, N4710, 1960, p.p. 397-398.

110. Kind S.S. Absorbtion-Elution Grouping of Dried Blood-stains on Fabrics. Vol. 187, N4739, 1960, p.p. 789-790.

111. Kind S. A modified absorbtion technigue determining the ABO group in blood stains. //Vox Sang. -1955. -Vol. 5. -P. 15-19.

112. Kleeman J.E., Masouredis S.P., Victoria E.J. Exposure of the Rh0(D) antigen on the surface and cytoplasmic domains of the red cell membrane/ // Immunologie -1982. -45; 27.

113. Landsteiner K., Wiener A.S. An agglutinable factor in human blood recognised by immune sera for rhesus blood. // Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. (N.Y.). -1940. -V.43.- № № 1, P.223-224.

114. Landsteiner K., Levine P. A new agglutinable factor differentiating individual human bloods. // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). -1927. -Vol. 24. -P.600.

115. Landsteiner K. Uber Agglutinationserscheinungen normalen menschlihen Blutes // Wiene Klinische Wochenschrift, Vol. 14, N 46, 1901, p.p. 1132-1134.

116. Landsteiner К and Richter M. Uber die Verwertbarkheit individueller Blutdifferencer fur die forensische Praxis. // Zeitschrift fur Medizinalbeamte, Vol. 16, N 3, 1903, p.p. 85-89.

117. Landsteiner K., Wiener A.S. Studies of an Agglutinogen (Rh) in Human Blood Reacting with Antirhesus Sera and with Human Isoantibodies. // Journal of Experimental Medicine, Vol. 74, N 4, 1941, p.p. 309-320/

118. Landsteiner K., Miller C.P. Serologigal Studdies on the Blood of the Primates. II. The Blood Groups in Antropoid Apes. // Journal of Experimental Medicine, Vol. 42, N6, 1925. P.p. 853-862.

119. Lattes L. Sull applicazione pratica della prova di agglutinazione per la diagnosti specifica di individuale di sngue umano. // Archivo di Antropologia Criminale, Psichiatria a Medicina Legale.//Vol. 34 (4 ser. Vol. 5), 1913, p.p. 310-325.

120. Lattes L. Lindividualita del sangue umano e la sua dimostrazione medocolegale. // Archivo di Antropologia Criminale, Psichiatria e Medicina Legale, Vol. 36 (4 ser. Vol. 7), 1915, p.p. 422-44 and 538-554.

121. Lee H.C. Identification and Grouping of Bloodstains, in Forensic Science Handbook, Salerstein R, Ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs, N 1, 1982, p.p. 267337.

122. Lee S., Zambas E.D., Marsh W.L., Redman C.M.: Molecular cloning and primary structure of Kell blood group protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6353,1991.

123. Le Van Kim C., Mouro J., Cherif-Zahar В., Raynal V., Cherrier C., Cartron J.P., Colin Y.: Molecular cloning and primary structure of the human blood group RhD polypeptide. // Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10925, 1992.

124. Lewin B. Genes III. New York: Wiley, 1987.

125. Levine P., Stetson R.E. An Unusual Case of Intragroup Agglutination. // Journal of the American Medical Association, Vol. 113,1939, p.p. 126-127.

126. Lincoln P.J., Dodd В. E. The Detection of the Rhesus Antigens C, Cw, c, D, E, e and the Antigen S of the MNSs System in Blood Syains. // Medicine, Science and the Law, Vol 8, 1968, p.p. 298-295.

127. Lincoln P.J., Dodd B.E. An Evaluation of the Factors Affecting the Elution of Antibodies from Bloodstains. // Journal of the Forensic Society, Vol. 13, N 1, 1973, p.p. 37-45.

128. Lope Z.M. Le groupe sanguine Cis AB. Etude quantitative et qualitative des antigenes ABH. // Rev. Franc. Transf. -1976. -T.19, N 1. -P.117-121.

129. Lotterle J., Glos R., Bauer J. Die Probenforbereitung fur die ABO-Bestimmung bei verschiedenen Spurentragern. //Arch. Fur Kriminologie. -1989. -H.1-2. S. 38-47.

130. Lutz P., Dzik W.H. Molekular biology of red cell group genes. // Transf. -1992. -Vol. 32, N 2. -P.467-483.

131. Marsh W.L., Lee S., Zambas E. Et al. Ibid. 1991. - Vol. 31. - Suppl. - P. 445.

132. Martin P.D. A Manual Method for the Detection of Rh Antigens in Dried Bloodstains. // Journal of the Forensic Science Society, Vol. 17, N 2 and 3, 1977, p.p. 139-142.

133. McDowall M.J., Lincoln P.J., Dodd B.E. Observation on the Use of Autoanalyser and a Manual Technique for the Detection of the Red Cell Antigens C, D, E, с, К and S in Bloodstains. // Forence Science, Vol. 11, N 2,1978, p.p. 155-164.

134. Misawa S. Selection of anti-sera for stains grouping. On the significance of IgM-, IgA- and IgG-globulin antibody in the absorption test, elution test and mixed agglutination method. //Jap. J. Leg. Med., 1968, 22, 5, 431-453.

135. Moore S., Woodrow C.F., Brian A.D., McClelland I.: The isolation of membrane components associated with human red cell antigens Rh(D), (c) and Fya. // Nature. -1982. -Vol. 295. -P. 529-53.

136. Mourant A. A new Rhesus antibody. // Nature, 1945, 155, 542.

137. Nickols L.C., Pereira M. A Study of Modern Methods of Grouping Dried Bloodstains. // Medicine, Science and the Law, Vol. 2, N 3, 1962, p.p. 172-179.

138. Pereira M Quot.: Culliford B.

139. The Examination and typing of blood stains in the Crime Laboratory. London-Washington, 1971.

140. Perkins S.I., Kerkaert J.P., Louxeax-Lefebvre M.H. The shapes of biantennary and try/tetraantennary щ acid glycoprotein by small-angle neutron and X-ray scattering. // Eur. J. Biochem. 1985. -Vol. 147, N 3. -P. 525-531.

141. Plapp F.V., Kowalsky M.M., Tilzer L., Brown P.Y., Evans Y., Chida M. Partial purification of Rh0(D) antigens from positive and negative erythrocytes/ //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1979- Vol. 76,№ 6.- P.2964-2968.

142. Prokop O., Uhlenbruck G. Lehrbuch der menschlichen Blut- und Serumgruppen. VEB GEORG THEME. LEIPZIG. -1963.

143. Race, Tailor, Boorman et al. Recognition of the Rh genotypes in man. // Nature, 1943, 152,563-564.

144. Redman C.M., Marsh W.L., Scarborough A., Jonson C.L., Rabin B.I., Overbeeke M.: Biochemical studies on McLeod phenotype red cells and isolation of Kx antigen. // Brit. J. Haematol. 68:131,1988.

145. Rouger P., Dosda F., Girard M. Et al. Etude de la sesibilite de Г antigene Yta aux enzyme proteolitiques. // Rev. Franc. Transf. Et Immuno-Hemat. -1992. -T.25, N 1. -P.323-325.

146. Rochna, Huges-Jones. Quot.: Giblett E. Quantitative study ofthe combination of lime beannn lectin with human erythrjcytes. // J. Immunol., 1962, 4, 463-470.

147. Ruypers F., van Linde-Siberius-Trip M., Roelofsen B. Et al. Rhnuii human erythrocytes have an abnormal membrane phospholipid organization. // Biochem J., 1984; 221:931-4.

148. Ruddle F.H., Ricciuri F., McMorvis F.A., Darlington G., Chen Т.: Somatic cell genetic assignment of peptidase С and Rh-linkage group to chromosome A-1 in man. // Science 1972: 176, 429-31.

149. Ruffie J., Ducos J. Sur ^identification des Taches de Sang Sec: I) Recherche des Facteurs CDE du Systeme Rhesus. //Ann. Med. Leg., 1952, 32, 351-361.

150. Rosenfield R., Allen F., Swisher S. Et al. A review of Rh serology and presentation of a new terminology. // Transfusion (Philad.). -1962. -V. 2. -P.287.

151. Sagisaka K., Tokiwa K., Yoshioka N. Action of proteolytic enzimes on agglutinability of M and N blood group red cells. //Tohoky J. Exp. Med. -1972. -Vol.106.-P.191-197.

152. Salmon C., Cartron J.P. Le renforcement allelique. // Rev. Franc. Transfus. -1976. -T.19, N1.-P. 145-156.

153. Singer M., Berg P. Genes and genomes: a changing perspective. Mill. Valley, CA: University Science Books, 1991.

154. Sinor L.T., Eastwood K.L., Plapp F.V. Dot-blot purification ofthe Kidd blood group antigen. // Med. Lab. Sci. 1987; 44: 294-6.

155. Smith R.E., Daleke D.L. Phosphatidylserine transport in Rhnuii erythrocytes. // Blood 76: 1021, 1990.

156. Spielman W., Seidl S. Immunhaematologie und Transfusionsmedizin. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim (Bundesrepublik Deutschland). -1990. 213 S.

157. Schenkel-Brunner H., Cartron J.-P., Doinel C. Localization of blood-group A and I antigens sites on inside-out and right-side-out human erythrocyte membrane vesicle. // Immunologie. 1979. - 36; 33.

158. Schutze H. Haemagglutination and its Medicolegal Bearing, with Obserwations on the Theorie of Isoagglutinins. // British Journal of Experimental Pathology, V ol. 2, N 1, 1921, p.p. 26-33.

159. Siracusa V. La sostanca isoagglutinabile del sangue. // Archivo Antropologie Criminale, Psichiatria e Medicina Legale, Vol. 43 (4 ser. Vol. 14), 1923, p.p. 362384.

160. Schiff F. Die Technik der Blutgruppenuntersuchungen fur Kliniker und Gerichtsarzte. Nebs-Berucksichtigung ihrer Anwendung in der Anthropologie und der Vererbungs- und Konstitutions forschung. Julius Springer Verlag, Berlin, 1926.

161. Telen M.J. Erythrocyte Blood Group Antigens: Not So simple after All. // Blood. -1995. -V.852. -P.299-306.

162. Tesar J. Prukas Rh factoru ve skvrnach kravnich. // Casopis Lekaru ceskich, 1957, 9622, 687-688.

163. Viitala J., Jarnefelt J. The red cell surface revisited // Trends in Biochemical Sciences. -1985. -V.10, N10. -P.392-395.

164. Von Brocke Die Darstellung der Rhesus Untergruppen in Blutflecken und Korperflussigkeiten. // Z. Imm. Forasch., 1954, III/3,184-186.

165. Watson J.D. Molecular biology of the gene. // 4th ed. Menlo Park: Benjamin Cummings, 1987.

166. Wiener A. Haemolytic reactions following transfusion of blood of gomologous group II. Further observations on the role of property Rh, particularly in cases without demonstrable isoantibodies. //Arch. Of Path., 1941, 32, 227-250.

167. Wiener A.S., Peters H.R. Hemolytic Reaction Following Transfusion of Blood of the Homologous Group, with three Cases in Which the Same Agglutinogen Was Responsible. //Annals of Internal Medicine, Vol. 13, N 12,1940, p.p. 2306-2322.