Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Гранда Харамильо Роберто Карлос

• Гранда Харамильо Роберто Карлос
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гранда Харамильо Роберто Карлос

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Промышленное Цветоводство 9 1.1.1 Хризантема

1.2. Размножение декоративно-цветочных культур в условиях in vitro

1.3. Культивирование хризантем в условиях in vitro

1.4. Оздоровление посадочного материала от вирусов

1.5. Карлавирусы

1.5.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц

1.5.2. Симптоматика и круг хозяев

1.5.3. Цитопатология

1.6. В Вирус хризантемы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования

2.2. Культура изолированных тканей хризантемы

2.2.1. Техника культивирования in vitro

2.2.2. Условия культивирования

2.2.3. Статистическая обработка результатов

2.3. Выделение тотальной РНК из растительной ткани 44 2.3.1 .Выделение тотальной растительной РНК тризольным методом

2.3.2. Выделение тотальной растительной РНК по модифицированному методу Хомчинского

2.3.3. Выделение тотальной растительной РНК на основе LiCl

2.4. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

RT-PCR)

2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот

2.6. Выделение амплифицированных фрагментов из продукта PCR

2.7. Секвенирование продуктов PCR

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Методы выделения тотальной РНК

3.2.Идентификация В вируса хризантем методом RT-PCR 54 3.2.1 .Характеристика праймеров, используемых для выявления

ВВХ методом RT-PCR 54 3.2.2. Влияние концентрации РНК хризантем для обратной транскрипции на протекание RT-PCR

3.3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в условиях теплицы

3.4. Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВВХ, распространенного в растениях хризантем

3.5. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro

3.5.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов

3.5.2. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем

3.5.3. Культивирование черенков хризантем in vitro IS

3.5.4. Зависимость микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания

3.6. Оздоровление посадочного материала от ВВХ 83 3.6.1. Схема получения оздоровленных растений хризантем

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала»

Хризантемы сегодня входят в список наиболее популярных цветочных культур, которые распространены по всему миру. Для потребителя предлагаются как срезочные, так и горшечные, садовые и тепличные растения. По объему продаж хризантемы уступают только розам. Более чем за 2000-летнию историю культуры создано около 7000 сортов хризантем, часть из которых используют в кулинарии, в фармацевтической промышленности, а также в качестве инсектицидов.

В настоящее время существует много различных сортов хризантем отечественной и зарубежной селекции, которые являются перспективными для использования их в озеленении, особенно в южных районах Российской Федерации. Для выращивания в средней полосе европейской части России предпочтение отдают финским, немецким, английским, голландским и местным сортам; французские и китайские используют на юге.

Выращивание хризантем часто связано с физиологическими проблемами. Например, культивирование растений в условиях ограниченного пространства питания часто приводит к угнетению роста, нарушению образования бутонов и развитию дегенеративных цветков, поражению листьев. Данные физиологические отклонения могут привести к гибели растения (Миронова, 2006).

Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.

Цели и задачи исследований: идентификация в растениях хризантем ВВХ и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала. В задачи исследований входило:

1. Подбор оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем.

2. Подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.

3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в тепличных условиях.

4. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro.

5. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем in vitro.

6. Изучение зависимости микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания.

7. Создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала и тестирование пробирочных растений на наличие вируса.

Научная новизна и значимость. Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории Главного Ботанического сада, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков' введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.

Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), на Международной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науке» (Москва, 2009).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гранда Харамильо Роберто Карлос

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика диагностики ВВХ на основе метода RT-PCR, позволяющая идентифицировать вирус в интактных и пробирочных растениях хризантем. Оптимизация заключалась в подборе оптимального метода выделения тотальной РЕК из тканей хризантем, в подборе праймеров и температурных условий для проведения RT-PCR, а также в определении оптимальной концентрации РЕК для проведения обратной транскрипции. Методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения.

2. Из 13 исследуемых сортов хризантем ВВХ обнаружен в.Ы:, среди которых симптомы поражения вирусом в полевых условиях не проявлялись у двух сортов (Академик Жеримунский и Аметист). Исследуемые сорта Помпон сиреневый: и Лучистая являются перспективными для дальнейшего их включения в, селекционном процессе, так как вирус в них не идентифицирован.

3. В результате изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей ДНК установлена степень гомологии между обнаруженными в исследованных сортах штаммах ВВХ и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 95% и 94% соответственно.

4. Усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс.растений в год с одного узла, независимо от сроков введения в культуру in vitro при выращивании растений в условиях теплицы. Оптимальной питательной средой на этапе размножения хризантем была среда Мурасиге и Скуга с добавлением 0,5 мг/л ИУК, 15 г/л сахарозы, и культивирование при температуре 20-25°С.

5. Выявлено, что распространение В вируса^ хризантем в пробирочных растениях имеет выраженный ярусный характер, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

6. Проведенные исследования показали, что использование в качестве экспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхнего яруса пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) позволяет получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение, или, как в случае с сортом Лебединая песня, осуществлять оздоровление посадочного материала.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гранда Харамильо Роберто Карлос, 2009 год

1. Ахметова, А.Ш. Размножение in vitro клонов гибридных форм тюльпанов / А.Ш. Ахметова, Р.К. Байбурина, JI.H. Миронова // Биотехнология. 2007. - № 2. - С. 3-7.

2. Байбурина, Р.К. Клональное микроразмножение гетерозисных гибридов сосны и тополя / Р.К. Байбурина, Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко, Н.В. Старова //Бюл.Гл.ботан.сада. 1992. - Т. Вып.163. - С. 83-86.

3. Байбурина, Р.К. Эндогенный гормональный статус растений и культивирование in vitro / Р.К. Байбурина // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. 2001. - С. 138.

4. Байбурина, Р.К. Сохранение и воспроизводство флористического разнообразия методами биотехнологии / Р.К. Байбурина, A.A. Зарипова, А.Ш. Ахметова, A.A. Мухаметвафина // Роль ботан. садов в сохранении биоразнообразия. Ростов-на-Дону, 2002. - С. 7-9.

5. Барабаш, Т.Н. Термотерапия при микроклональном размножении / Т.Н. Барабаш, Л.Д. Радилова, В.Ф. Бленда // Соврем.пробл.плодоводства. -Самохваловичи, 1995. С. 128.

6. Бутенко, Р.Г Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Р.Г. Бутенко Г.С. Муромцев, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. М.: ВО Агропромиздат, 1990. - 384 с.

7. Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение растений. Культура клеток растений и биотехнология / В.А. Высоцкий. Под ред. Бутенко Р.Г. М.: ВО Агропромиздат, 1987. 360с.

8. Гаврикова, Л.И. Продуктивность микропобегов хризантем в культуре in vitro / Гаврикова, В.Н. Андрианов // Известия ТСХА. 1994. - № 4. - С. 240-244.

9. Горинг, X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при микроклональном микроразмножении / X. Горинг. Интродукция растений. Ростов-на-Дону, 1993. - 64с.

10. Дьянченко, Н.Г. Хризантемы корейские./ Н.Г. Дьянченко. М.: издательский дом МСП, 2004. 48 с.

11. Захарова, O.A. Каллусная культура как альтернативный источник микроклон / O.A. Захарова, JI.A. Любаковская, Н.С. Турина, Е.В. Спиридович // Всерос. науч.-исслед. ин-т охотничьего хоз-ва и звероводства им. проф^ Б.М.Житкова. Киров, 2004. - С. 54-55.

12. Иддагода, Н. Особенности получения асептической культуры и клональное микроразмножение взрослых растений чая (Camellia sinensis L.) / Н. Иддагода, H.B. Катаева, Р.Г. Бутенко // С.-х. биология. Сер. Биология растений. 1990. - Т. 5. - С. 98-104.

13. Калашникова, Е.А. Использование изолированных тканей и органов взрослых растений сосны обыкновенной и ели обыкновенной для клонального микроразмножения / Е.А. Калашникова // Науч.тр./Моск.ун-т леса, 1993. Вып.265. - С. 96-100.

14. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова*. М.: КолосС, 2006. - 144 с.

15. Канюка, К.В. Структура 3'- концевой области РНК М вируса картофеля и возможные механизмы экспрессии генома вируса: автореф. дис.канд. биол/К.В. Канюка.- М.\ 1991. -19с.

16. Катаева, Н.В. Клональное размножение растений / Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. - 97с.

17. Катаева, Н.В. Значение гормонов в формировании верифицированных побегов яблони при микроразмножении / Н.В. Катаева, И.Г. Александрова, Е.В. Драгавцева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М, 1991. С. 189-192.

18. Ковалева, И.С. Усовершенствование методики микроклонального размножения малино-ежевичного гибрида Тайберри / И.С. Ковалева, Н.В.Дицина, Т.В. Данилова, О.И. Молканова // Бюл.Гл.ботан.сада, 2000.1. Вып.179. С. 136-144.

19. Лапшин, П.В. Клеточная селекция яровой мягкой пшеницы на устойчивость к действию УФ-Б радиации / П.В. Лапшин, Р.Г. Бутенко B.C. Шевелуха // Изв.Тимирязев.с.-х.акад. 2001. - Вып.2. - С. 136-144.

20. Левай, К.Э. Структурная организация генома карлавирусов: М вирус картофеля и В вирус хризантемы: автореф. дис.канд. биол./ К.Э. Левай.- М.:, 1991.-18с.

21. Миронова, О.Ю. Разработка и совершенствование технологийfклонального микроразмножения декоративно-цветочных культур: автореф. дис.канд. биол./ О.Ю. Миронова.- М.:, 2004. -18с.

22. Миронова, О.Ю. Микроклональное размножение хризантем, для промышленного цветоводства / О.Ю. Миронова // Овощеводство и теплич. хоз-во, 2006. N 7. - С. 58-59.

23. Митрофанова О.В. Вирусные болезни промышленных культур и биотехнологические приемы их оздоровления: автореф. докт. диссертации./ О.В. Митрофанова. -М.:, 1992. 42с.

24. Молканова, О.И. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов Syringa vulgaris L. / О.И. Молканова, O.A. Чурикова, Л.Н. Коновалова, И.Б. Окунева // Вестн.Моск.ун-та.Сер.16, 2002. -№4.-С. 8-14i