Глутатион S-трансферазы рыб из озер Северной Карелии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Борвинская, Екатерина Витальевна

• Борвинская, Екатерина Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Борвинская, Екатерина Витальевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Характеристика семейства глутатион S-трансфераз

1.1.1. Биологическая роль

1.1.2. Физико-химическая характеристика

1.1.3. Современная классификация

1.2. Глутатион S-трансферазы рыб

1.2.1. Структурные и функциональные особенности GST рыб

1.2.2. GST рыб как биомаркеры загрязнения окружающей среды

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Характеристика места сбора материала

2.3. Методы исследования

2.3.1. Разрушение клеток и экстракция

2.3.2. Спектрофотометрическое определение активности GST

2.3.3. Определение кинетических характеристик очищенного фермента

2.3.4. Определение концентрации белка

2.3.5. Гель-фильтрация

2.3.6. Аффинная хроматография

2.3.7. SDS-электрофорез

2.3.8. Изоэлектрическое фокусирование

2.4. Статистическая обработка данных

3.1. Влияние эколого - физиологических факторов на активность GST рыб

3.1.1. Видовая и тканевая специфичность активности GST рыб

3.1.2. Зависимость активности GST от пола

3.1.3. Влияние возраста на активность GST

3.1.4. Субстратная специфичность активности GST

3.1.5. Активность GST у рыб из водоемов подвергшихся техногенной трансформации

3.2.1. Методические особенности получения очищенного фермента

3.2.2. Физические свойства и субъединичный состав

3.2.3. Влияние рН среды на активность GST

3.2.4. Влияние температуры на активность GST

3.2.5. Кинетические свойства очищенного фермента

3.6. Субстратная специфичность

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

GST - глутатион-Б-трансфераза

GSH - восстановленный глутатион

CDNB - 1 - хлор -2,4-динитробензол

DCNB - 1,2-дихлор-4-нитробензол

гРВ - транс-4-фенил-3-бутен-2-он

БСА - бычий сывороточный альбумин

PBS - калий - фосфатный буфер

SDS - додецилсульфат натрия

EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия

DTT - дитиотриэтол

ПААГ - полиакриламидный гель

АОЗ - антиоксидантная защита

ПОЛ - перекисное окисление липидов

UDPGT - УДФ - глюкуронилтрансфераза

PCB - полихлорированные бифенилы

EROD - экоксирезоруфин-О-диэтилаза

ЖХВД - жидкостная хроматография высокого давления

ТМ - тяжелые металлы

ПАУ - полиароматические углеводороды

БП - бензпирен

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Глутатион S-трансферазы рыб из озер Северной Карелии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Система ферментов биотрансформации ксенобиотиков была приобретена организмами в ходе эволюции для защиты внутренней среды от вредоносного действия экзо- и эндогенных метаболитов. Диапазон адаптивных возможностей организмов в неблагоприятных условиях среды напрямую определяется эффективностью, с которой они способны обезвреживать различные токсины. Важнейшим компонентом клеточного метаболизма, ответственным за индивидуальную чувствительность организма к токсичным веществам, являются глутатион S-трансферазы (Е.С.2.5.1.18) - большое семейство ферментов в составе системы биотрансформации ксенобиотиков (фаза II). Основная функция глутатион S-трансфераз (GST) заключается в обезвреживании элек-трофильных соединений, в том числе, образующихся в ходе окислительного стресса (Hayes, Strange, 1995; Кулинский, 1999). Изучение этих ферментов имеет большое значение для клинической медицины, так как от них во многом зависит возникновение, течение и исход ряда онкологических заболеваний (Strange et al., 2001). С этим был связан повышенный интерес изучению свойств GST, что привело к большому количеству исследований, которые были выполнены на теплокровных позвоночных. В свою очередь данных об особенностях регуляции, структуре и функциях GST рыб существенно меньше и они в значительной мере носят фрагментарный характер. Вместе с тем, подобные исследования необходимы для понимания фундаментальных механизмов адаптации рыб к изменяющимся условиям среды. Кроме того, GST рыб могут применяться в качестве биомаркера для оценки качества среды и здоровья организмов в условиях возрастающей антропогенной нагрузки. Поэтому необходимость подобных исследований, в том числе для разработки стандартизированных программ эколого-биохимического мониторинга, не вызывает сомнений.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в характеристике глутатион S-трансфераз в тканях пресноводных рыб и изучении влияния некоторых антропогенных факторов на активность исследуемых ферментов.

Основные задачи настоящей работы заключались в следующем:

- определить активность GST у плотвы, сига и щуки в зависимости от пола, возраста;

- выявить органо-тканевую специфику активности GST;

- изучить активность GST в органах щуки, сига и плотвы из водоемов с разным уровнем антропогенного воздействия;

- выделить GST из печени щук, охарактеризовать ее структурные и каталитические особенности.

Личное участие автора в получении результатов научных исследований, изложенных в диссертации. Автор принимал участие в экспедиционных работах по сбору объектов. Обработка материала исследования, проведение лабораторных экспериментов и статистического анализа полученных данных, обсуждение, интерпретация и обобщение полученных результатов, формулировка выводов, написание научных статей выполнены автором лично.

Научная новизна. Впервые получены данные по активности GST в органах щук, сига и плотвы из водоемов расположенных в зоне промышленной добычи железной руды и обнаружено влияние техногенного загрязнения на этот показатель. Изучена естественная вариабельность данного фермента у щуки, сига и плотвы в зависимости от физиологического статуса рыб. Впервые проведена оценка субстратной специфичности GST из тканей щуки и сига. Проведено выделение и очистка GST из печени щук и частично охарактеризованы её структурные и каталитические особенности.

Практическое значение работы. Работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра РАН в рамках программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга» на 2009-2011 гг., гранта Президента РФ «Ведущие научные школы» (НШ-894.2003.4; НШ-3731.2010.4) и программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие на 2009-2011 гг.». Полученные в ходе работы результаты могут быть интегрированы в систему эколого-биохимического мониторинга и тестирования пресноводных экосистем. Материал может быть использован при чтении курса лекций «Экологическая биохимия животных» для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены на 7 международных и 3 всероссийских конференциях: XVI Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2009); международной конференции в Москве «17th International Environmental Bioindicators Conference», XXVIII международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 2009), международной научно-практической конференции в Мурманске "Сохранение биологического разнообразия наземных и морских экосистем в условиях высоких широт", IV международной конференции «Balwois - 2010. Water observation and information system for décision support» (Ohrid, Republic of Macedonia, 2010), III международной конференции с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010), международном научно-практич. семинаре с элементами школы для молодых ученых «Биологические ресурсы Арктики и Субарктики - потенциал для биотехнологии: исследования и инновации» (Петрозаводск, 2010), международной научной конфе-

7

ренции «Природа морской Арктики: современные вызовы и роль науки» (Мурманск, 2010), V Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), I Всерос. конференции с межд. участием "Современное состояние биоресурсов внутренних водоемов" (Борок, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 5 статей, из них 3 из перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 22 таблицы. Список литературы включает 220 источников, из них 30 отечественные.

Благодарности. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н. Льву Павловичу Смирнову, директору Института биологии КарНЦ РАН, член-корр. РАН, проф., д.б.н. Немовой H.H. Благодарю за помощь в работе и ценные рекомендации сотрудников лаборатории ихтиологии и паразитологии Института биологии КарНЦ РАН. Искренне признательна всем сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН за постоянную помощь и поддержку.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика семейства глутатион 8-трансфераз 1.1.1. Биологическая роль

Живые организмы постоянно сталкиваются с необходимостью

«обезвреживания» продуктов собственного метаболизма, а также

вредоносных соединений, поступающих из окружающей среды. Способность

нейтрализовать и разрушать токсичные соединения, представляет собой

фундаментальное биологическое свойство, возникшее в процессе эволюции и

развившееся до многоуровневой системы защиты (ЗЬееЬап & а1., 2001).

Одним из ее важнейших звеньев является процесс биотрансформации

ксенобиотиков, который осуществляется на молекулярном уровне с

помощью набора ферментов, превращающих липофильные молекулы в менее

токсичные гидрофильные соединения, которые легко удаляются из

организма. В этом процессе выделяют две основные фазы, интегрированные

в единую систему. На первом этапе происходит активация чужеродной

молекулы, то есть введение в ее структуру полярных групп, в основном с

помощью цитохром Р450-гидроксилазной системы и микросомальных

эпоксид-оксидаз (ЗЬееЬап е1 а1., 2001; Кулинский, 1999). На втором этапе

происходит связывание активированных соединений с эндогенными

водорастворимыми субстратами, такими как восстановленный глутатион

(вБИ), УДФ-глюкуроновая кислота или глицин.

Присоединение глутатиона (ОЭН) катализирует семейство ферментов,

называемых глутатион Б-трансферазами (Е.С.2.5.1.18). Эта реакция во

многих случаях является главной во второй фазе биотрансформации (ЗЬееЬап

е1 а1., 2001). В результате образуются конъюгаты ксенобиотиков с

глутатионом, которые могут выводиться с желчью, либо далее

метаболизироваться до производных меркаптуровой кислоты (14-

ацетилцистеина) и экскретироваться почками (НаЬ^ е1 а1., 1974; СЬазБеаис!,

1979). В отличие от других реакций второй фазы биотрансформации, таких

как сульфирование или глюкуронизация, присоединение вЗН не требует

9

энергетических затрат на образование интермедиатов, хотя АТФ расходуется на этапе синтеза восстановленного глутатиона (Chasseaud, 1979).

Широчайшая субстратная специфичность является важнейшим свойством глутатион S-трансфераз (GST), определяющим их биохимическую значимость как универсальных перехватчиков токсинов. Фермент обеспечивает ионизацию глутатиона до глутатионового тиолат аниона GS-, который легко взаимодействует практически с любыми соединениями, обладающими электрофильными центрами (Jakoby, Ziegler, 1990; Sheehan et al., 2001).

GST катализируют 4 основных типа реакций (Кулинский, Колесниченко, 1990; Salinas, Wong, 1999; Левина и др., 2007):

1. конъюгация

R (органический радикал) + GSH —»HRSG;

2. нуклеофильное замещение

RX + GSH RSG + НХ, где X = Hal", N02\ HS04", RO , RS", CN" и др.;

3. восстановление органических пероксидов до спиртов ROOH + 2GSH -> ROH + Н20 + GSSG;

4. изомеризация (стероидов и др.) с промежуточным присоединением GSH.

Обезвреживание большинства токсинов осуществляется по первому и второму типу реакций. Субстратами фермента обычно являются продукты первой фазы биотрансформации ксенобиотиков либо различные реактивные синтетические соединения. К ним относятся всевозможные аралкилгалогениды, эпоксиды, органические нитраты, органические сульфаты, фосфорорганические соединения и различные а,Р-ненасьпценные соединения (Boyland, Chausseaud, 1969). Субстратами GST также являются некоторые соединения эндогенного происхождения. Например, конъюгация стероидов с глутатионом (эстрадиол-17р, этинилэстрадиол и др.) предупреждает их ковалентное связывание с белками и ограничивает тератогенное действие этих гормонов.

Зачастую глутатион S-трансферазы исправляют «ошибки» первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, когда в результате химических модификаций исходные вещества преобразуются в более токсичные метаболиты. Например, некоторые изоформы GST способны обезвреживать бензпирен-4,5-оксид - производное бензпирена активированное в первой фазе биотрансформации ксенобиотиков (Foureman, Bend, 1984). С другой стороны, в некоторых случаях активность глутатион S-трансфераз является причиной метаболической активации некоторых опасных соединений, что, однако, случается значительно реже, чем с ферментами первой фазы биотрансформации (Chasseaud, 1979; Ruus et al., 2002).

Еще одна важнейшая биологическая функция GST - защита клеток от окислительного стресса, наряду с другими ферментами системы антиоксидантной защиты (АОЗ). Избыток свободных радикалов, образующихся в ходе клеточного метаболизма или в результате химически индуцированного стресса, может спровоцировать каскад перекисного окисления липидов (ПОЛ), и, в конечном итоге, гибель клетки (Raza et al., 2002).

Ферментативная защита от активных форм кислорода осуществляется с

помощью ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионовой

антиоксидантной системы (глутатион пероксидаза, глутатион редуктаза и

GST), которые последовательно восстанавливают супероксид радикалы,

пероксид водорода и органические гидроперекиси. Глутатион S-трансферазы

катализируют конъюгацию с глутатионом главных и наиболее токсичных

продуктов ПОЛ, таких как 4-гидрокси-2-ноненаль, холестерин-а-оксид,

хиноны (например, ДОФА - хинон) и др. (Yang et al., 2003; Левина и др.,

2007). Эти реакции имеют большое значение для поддержания целостности

мембран и регуляции ПОЛ - индуцированного апоптоза. Помимо этого

некоторые изоферменты GST обладают пероксидазной активностью и

способны непосредственно восстанавливать пероксид водорода,

гидроперекиси триацилглицеринов, фосфолипидов и свободных

11

ненасыщенных жирных кислот. GST входят в состав хроматина, где восстанавливают продукты пероксидации свободных нуклеотидов и ДНК. Интересно, что в отличие от цитозоля, где в общей глутатион пероксидазной активности основную роль играют глутатион пероксидазы (68%), в ядрах основная нагрузка ложится на глутатион трансферазы (86%)(Tan et al., 1988).

Все перечисленные свойства свидетельствуют о важной роли GST для

защиты клеток от чужеродных соединений и токсичных продуктов

метаболизма. Это обуславливает необходимость в углубленном изучении

свойств этого фермента, так как эти сведения помимо фундаментального,

имеют большое прикладное значение для медицины, сельского хозяйства и

экологической токсикологии. Значительный интерес вызывает определение

роли, которую GST играют в развитии раковых заболеваний. Большинство

канцерогенов являются субстратами для глутатион трансфераз, так как

представляют собой сильные электрофильные агенты, способные ковалентно

связываться с ДНК, РНК и клеточными белками. Соответственно,

эффективность обезвреживания канцерогенов этими ферментами напрямую

связана с предрасположенностью к развитию злокачественных

новообразований. Уже получены данные о том, что генетический

полиморфизм GST человека может определять течение и исход таких

заболеваний как астма, рак легких, рак молочной железы, рак кожи, лейкемия

и др. (Strange et al., 2001). Довольно подробную информацию о роли GST в

развитии канцерогенеза можно получить из обзоров посвященных этой теме

(Ketterer et al., 1992; Hayes, Pulford, 1995; Hayes, Strange, 2000; Townsend,

Tew, 2003). С другой стороны, чрезвычайная эффективность глутатион S-

трансфераз в обезвреживании ксенобиотиков может значительно осложнить

применение лекарственных препаратов. Активность GST лежит в основе

возникновения устойчивости многих паразитов к антигельминтным

препаратам, инсектицидам, гербицидам, антибиотикам, а также является

причиной снижения чувствительности раковых клеток к химиотерапии (Clark

et al., 1989; Liebau et al., 1997; Ahmad, Srivastava, 2007; Torres-Rivera, Landa,

12

2008).

Третьим аспектом, определяющим биологическую роль глутатион S-трансфераз, является ряд функций этих ферментов не связанных с детоксикацией. Так, показана способность некоторых изоформ GST осуществлять изомеризацию из эндопероксидов простагландинов в простагландины. Например, глутатион S-трансферазы, выделенные из печени крысы, трансформируют эндопероксиды простагландинов преимущественно в простагландины F2 и Е2, a GST из легких овцы в простагландин F2 и D2 (Christ-Hazelhof et al., 1976). В яичниках и семенниках крыс была обнаружена стероидная изомеразная активность GST: А5-3-кетостероиды превращаются в соответствующие а,|3-ненасыщенные Д4-3-кетостероиды. Особенностью реакции изомеризации является то, что в процессе не расходуется глутатион (Benson et al., 1977).

Глутатион S-трансферазы также являются важным компонентом системы трансмембранного переноса гидрофобных соединений, осуществляемого как внутри клетки, так и между клеткой и средой. Например, антоцианин и другие пигменты растений транспортируются через мембраны вакуолей в виде конъюгатов глутатиона по специальному АТФ -зависимому насосу (Marrs, 1996).

Помимо участия в сопряжении электрофильных субстратов с

глутатионом, уникальным свойством некоторых изоформ GST является

способность некаталитическим путем связывать широкий круг эндо- и

экзогенных гидрофобных соединений. Лиганды могут блокировать активный

центр фермента, действуя наподобие конкурентных ингибиторов, либо

присоединяться в особом центре («binding site»), не сказываясь, таким

образом, на каталитической активности фермента (Ketley et al., 1975; Liebau

et al., 1997; Higgins, Hayes, 2011). GST могут пассивно связывать такие

клеточные метаболиты как гемм, билирубин, эстрадиол, кортизол и

тестостерон, желчные кислоты, ауксины растений, а также различные

синтетические вещества, такие как сульфобромофталеин, тетрациклин,

13

пенициллин и др. (Salinas, Wong, 1999; Higgins, Hayes, 2011). Это свойство фермента может быть механизмом дополнительной пассивной детоксикации, в особенности в условиях истощения запасов глутатиона. Таким образом, например, происходит связывание антигельминтных препаратов изоформой GST EII, выделенной из ленточного червя Moniezia expansa (Brophy et al., 1989). Согласно другой гипотезе, GST необходимы для внутриклеточного транспорта и депонирования метаболитов, подобно альбуминам плазмы крови выступая в роли «биохимической губки» для различных гидрофобных соединений типа гемма и эндогенных липидов (Булавин и др., 1996; Mannervik, 1985; Liebau et al., 1997).

Можно заключить, что глутатион S-трансферазы представляют собой важнейший компонент клеточного метаболизма, ответственный за индивидуальную чувствительность организмов к токсичным веществам, а также принимают участие во внутри- и межклеточном транспорте и метаболизме некоторых гормонов. Значение этих ферментов для поддержания жизнедеятельности клеток трудно переоценить.

1.1.2. Физико-химическая характеристика

Интенсивное изучение глутатион S-трнсфераз началось в 60-х годах XX века (Booth et al., 1961; Goldstein,Combes, 1966; Boyland, Chasseaud, 1968) и уже на первых этапах стала очевидна множественность форм этих ферментов в клетках, которые обозначали в соответствии с их субстратной специфичностью, например глутатион S-арилтрансферазы, S-эпоксидтрансферазы, S-алкилтрансферазы, S-алкентрансферазы, S-аралкилтрансферазы и т.п. Однако вскоре стало ясно, что эти формы обладают широкой и перекрывающейся субстратной специфичностью, то есть один и тот же фермент может катализировать различные реакции (Chasseaud, 1979). Неизменной во всех случаях оставалась только избирательность GST по отношению к глутатиону. Поэтому в 1969 Бойланд и Шассо (Boyland, Chasseaud, 1969) высказали предположение, что

14

возможная биологическая роль блока GSH-GST заключается в защите содержимого клетки от электрофильных агентов.

Очищенная до гомогенного состояния GST была впервые получена из печени крыс исследовательской группой Уильяма Якоби (Habig et al., 1974). В ходе исследования выяснилось, что глутатион S-трансферазы идентичны белку лигандину (ligandine), способному некаталитическим образом связывать различные гидрофобные метаболиты, открытому другой группой ученых (Litwack et al., 1971; Kaplowitz et al., 1973; Ketterer et al., 19756; Wolkoff et al., 1978).

В связи с возможным значением для фармакологии и лечения онкологических заболеваний, наибольшее количество исследований было сосредоточено на изучении глутатион S-трансфераз млекопитающих. Энзимология этих белков, регуляция и генетический полиморфизм были изучены очень тщательно. Накопленная информация обобщена в ряде обзоров (Chasseaud, 1979; Rushmore, 1993; Landi, 2000; Hayes, Strange, 2000; Townsend, Tew, 2003; Dourado et al., 2008; Higgins, Hayes, 2011).

Фермент встречается у всех без исключения эукариот, а также у аэробных бактерий (Angelucci et al., 2000; Növoa-Valinas et al., 2002). To, что глутатион отсутствует у анаэробных прокариот, подтверждает гипотезу о том, что первичной функцией GSH и ферментов связанных с его метаболизмом была защита от последствий окислительного стресса (Кулинский, Колесниченко, 1990).

Многочисленные представители суперсемейства глутатион S-трансфераз могут значительно отличаться друг от друга, как в структурном, так и в функциональном отношении. Однако для большинства из них характерен единый план старения: GST представляют собой гомо- и гетеродимеры с массой субъединиц 22-27 кДа. Диапазон молекулярных масс димеров в основном составляет 40 - 55 кДа. У некоторых организмов выявлены микросомальные GST в форме тримеров и тетрамеров, молекулярная масса

о

субъединиц которых составляет около 14-17 кДа (Alander et al., 2009). Также

15

было обнаружено небольшое количество мономерных форм (Overbaugh et al., 1988; Dean et al., 1995).

Основная часть ферментативной активности GST выявляется в цитозоле, также обнаружены мембраносвязанные микросомальные (MAPEG) и митохондриальные формы фермента (Ahmad, Srivastava, 2007). Последние, вероятно, играют важную роль в метаболизме активных соединений, образующихся в дыхательной цепи митохондрий и при работе микросомальных монооксигеназ и, по причине своей липофильности, остающихся внутри мембран (Raza et al., 2002; Townsend, Kenneth, 2003).

Генеральная функция GST - это ионизация сульфгидрильной группы GSH, т.е. увеличение ее нуклеофильности. Благодаря этому электрофильные субстраты более активно связываются с глутатионовым тиолатным анионом GS , чем с другими нуклеофильными соединениями, присутствующими в клетке. Считается, что именно механизм облегчения нуклеофильной атаки глутатиона лежит в основе широкой субстратной специфичности фермента (Chasseaud, 1979). Следует также отметить, что многие реакции, катализируемые GST, могут протекать спонтанно, но с участием фермента конъюгация активных метаболитов с GSH протекает быстрее Bcero(Pabst et al., 1974).

Маннервиком с соавторами (Mannervik et al., 1985) была предложена модель, по которой димерная молекула GST обладает двумя независимыми активными центрами, по одному на каждой субъединице. Активный центр GST состоит из двух доменов: для связывания глутатиона (G-сайт) и для связывания гидрофобных субстратов (Н-сайт). Субстраты в активном центре реагируют друг с другом без ковалентного взаимодействия с ферментом, поэтому конформационных изменений белка не происходит.

Необходимым условием функционирования G-сайта является наличие в

его структуре аминокислотного остатка с основными свойствами,

оттягивающего протон водорода от глутатиона и стабилизирующего

тиолатный ион GS". Выяснилось, что у разных классов GST роль

16

стабилизирующего остатка выполняют различные аминокислоты, хотя учитывая строгую селективность фермента по отношению к глутатиону, изначально предполагалось достаточно консервативное строение G-сайта (Clark, 1989).

В свою очередь, структурными свойствами Н-сайта, специфичного для разных классов GST, определяется избирательность фермента к электрофильным субстратам. Сходство аминокислотных

последовательностей Н-сайта GST различных классов редко превосходит 35% (Blanchette et al., 2007).

1.1.3. Современная классификация

У большинства организмов обычно присутствует целый набор изоферментов с различными каталитическими свойствами, приспособленных к различным функциям в клетке. Спектров изоформ GST отдельных тканей, вероятно, определяется их особыми детоксикационными требованиями. Известно, что в печени крыс синтезируется как минимум десять различных изоформ фермента, тогда как в плаценте и эритроцитах человека обнаружена только одна (Aydemir, Kavrayan, 2009). На качественный и количественный состав экспрессируемых GST также оказывают влияние пол, возраст, физиологическое состояние организма, воздействие химических индукторов и т.д. (Carletti et al., 2008). Образно говоря, спектр генов, кодирующих эти трансферазы можно сравнить с набором отмычек, каждая из которых может «подойти» для решения определенной метаболической «проблемы».

Уже на ранних этапах изучения наиболее однородные группы GST стали

объединять в так называемые «классы», обозначаемые буквами греческого

алфавита. К критериям, по которым осуществляется классификация

изоферментов GST, относятся субстратная специфичность, сходство

первичной последовательности аминокислот белка и нуклеотидов

кодирующего гена. GST принадлежащие одному и тому же классу обладают

50-60% идентичностью первичной последовательности аминокислот белка,

17

тогда как изоферменты, принадлежащие к разным классам, по этому показателю сходны менее чем на 20% (Hayes, Pulford, 1995; Sheehan et al., 2001).

В настоящее время у млекопитающих выделены и охарактеризованы следующие классы GST - а, ц, я, 0, а и ю, а также митохондриальный к класс (Higgins, Hayes, 2011). В дополнение к этому, некоторые специфические классы GST были описаны у других таксонов, например р класс у бактерий, X, <р и т классы у растений, 5, £, и U класс у насекомых, а также р класс, специфичный для рыб (Sheehan et al., 2001; Konishi et al., 2005a). Известно как минимум 16 генов, кодирующих цитозольные изоформы GST, и как минимум 6 генов - мембраносвязанные (Strange et al., 2001).

Немногие работы, посвященные подробному изучению GST рыб, указывают на наличие у них изоформ цитозольной GST наиболее близких к классам а, ц, тг и 9 млекопитающих (Gallagher et al.,1996; Liao et al., 2006; Landi, 2000; Perez-Lopez et al., 2000; Dominey et al.,1991; Fu, Xie, 2006). Кроме того, некоторые GST костистых рыб были выделены в отдельный класс р, родственный классу 9 млекопитающих (Konishi et al., 2005а; Fu, Xie, 2006).

Особенностью а класса является то, что его представители могут проявлять стероидную изомеразную активность, например с субстратом Д5-андростен -3,17-дионом, и пероксидазную активность с субстратом кумен гидропероксидом. GST а также характеризуются высокой активностью в присутствии этакриновой кислоты (EtA) и продукта перекисного окисления липидов 4-гидроксиноненаля (Raza et al., 2002). Лигандиноподобная активность, то есть способность некаталитическим образом связывать органические анионы (бромосульфофталеин), соли желчных кислот, билирубин и гематин также в значительной мере присуща этим трансферазам (Pham et al., 2002; Lee et al., 2006; Trute et al., 2007). Было показано участие GST а в обезвреживании таких опасных соединений как метилпаратион и

производных афлотоксина (Trute et al., 2007).

18

GST |i класса высоко активны с 1,2-дихлор-4-нитробензолом (DCNB) и различными эпоксидами типа trans-Stilbene oxide (tSO). GST n класса обладают выраженной активностью с диуретиком EtA и рядом лекарственных препаратов, таких как хлорамбуцил, адриамицин, антрациклин, а также метаболизируют широкий ряд мутагенов и канцерогенов, таких как пестицид атразин и производные бензпирена (бенз[а]пирен-7,8-диол-9Д0-эпоксид) (Gallagher et al., 1996; Trute et al., 2007). GST |1ия играют важную роль в биотрансформации ксенобиотиков, поэтому мутации генов, кодирующих эти ферменты у человека, связаны с повышенным риском развития различных форм рака (рак легких, рак молочной железы, лейкемия)(8пееЬап et al., 2001).

GST Э класса представляют собой группу, заметно отличающуюся от других трансфераз и довольно гетерогенную по составу. Так, в отличие от других глутатион трансфераз, GST 0 млекопитающих не способны катализировать реакцию с «универсальным» субстратом глутатион S-трансфераз 1-хлоро-2,4-динитробензолом (CDNB) и не удерживаются аффинными матрицами с иммобилизованным глутатионом. Это связано со строением G-сайта GST 9, менее доступным для глутатиона, чем у GST ц, тг и а классов (Blanchette et al., 2007). GST 9-класса обладают выраженной конъюгационной активностью с такими субстратами как /?-нитробензил хлорид (Lee et al., 2006). Нулевой фенотип GST 9 у человека связан с повышенным риском рака ротовой полости, глотки и гортани (Townsend, Kenneth, 2003).

Классификация глутатион S-трансфераз - это продолжающийся процесс.

Ситуация, когда открывают новую GST со свойствами, по одной

классификационной методике принадлежащими одному классу, а по другой

методике другому, не редкость. Прежде всего, это связано с отсутствием

четких стандартов для классификации GST. Взятые поодиночке, такие

общепринятые параметры как субстратная специфичность, перекрестное

реагирование антител и аминокислотная последовательность белка и

19

структуры гена должны использоваться с большой осторожностью. Но даже в случаях довольно полного описания, бывает трудно установить «истинный» класс GST из-за противоречивости получаемых результатов.

Например, гомодимерная GST1 мидий Mytilus edulis по сходству аминокислотной последовательности белка и иммунологическим свойствам (положительная реакция с антисывороткой GST я крыс) может быть отнесена к я классу, а по чувствительности к ингибиторам сульфобромофталеину и гематину изофермент ближе к а классу. Кинетические характеристики в данном случае расходятся с результатами изучения структурных свойств GST1 (Fitzpatrick et al., 1995).

Не менее интересна вторая изоформа белка с массой субъединиц 26,5 кДа, выделенная из М. edulis, которая имеет 61% гомологии аминокислотной последовательности N-конца с GST класса ц. При этом у полученного белка полностью отсутствовала активность в присутствии «универсального» субстрата - CDNB, а также реакция с антисыворотками а и ц классов. Поэтому гомодимер не был отнесен ни к одному из известных классов GST, и, несмотря на структурное сходство с GST ц, был обозначен как GSH-связывающий белок (Fitzpatrick et al., 1995).

В связи с недостаточной изученностью особенно большие трудности возникают при попытках классифицировать глутатион трансферазы эволюционно древних водных организмов. Дело в том, что эволюционное древо GST до сих пор до конца не расшифровано. Не ясно, в каком порядке классы GST отщеплялись от общего архетипа. Например, Салинас, Вонг (Salinas, Wong, 1999) и Армстронг (Armstrong, 1997) предложили такой сценарий развития событий, при котором отщепление отдельных классов GST в ходе эволюции шло постепенно, через этапы промежуточных форм (например ст/а/р/л, а/ц/я, а/я или а/ц). Наличие таких GST может объяснять противоречивые свойства, которые демонстрируют трансферазы некоторых гидробионтов.

1.2. Глутатион S-трансферазы рыб

1.2.1. Структурные и функциональные особенности GST рыб

По сравнению с ферментами млекопитающих, глутатион трансферазы рыб изучены довольно слабо. Классификация GST гидробионтов затруднена тем, что в основном исследователи концентрируют внимание на выяснении возможности их применения для оценки загрязнения водной среды. Такие исследования дают лишь общие представления об этих ферментах (Blanchette et al., 2007). Для более глубокого понимания роли глутатион трансфераз в метаболических процессах и их филогенетических отношений между собой, необходимы детальные описания ферментов, с применением целого спектра различных методик, включая иммунологические, биохимические, молекулярно-генетические, физико-химические и др. Такие детальные характеристики были получены лишь для малой части GST рыб (James, 1998; Leaver et al., 1993; Martinez-Lara et al., 2002; Angelucci et al., 2000; Perez-Löpez et al., 2000; Pham et al., 2002; Konishi et al., 2005a,6; Lee et al., 2006; Trute et al., 2007; Carletti et al., 2008). Гораздо шире список GST рыб охарактеризованных лишь частично. Тем не менее, по уже имеющимся данным можно сделать вывод о том, что GST рыб по некоторым биохимическим свойствам значительно отличаются от GST млекопитающих.

Одними из первых достаточно подробно были охарактеризованы глутатион трансферазы из печени камбалы Pleuronectes. platessa (George, Buchanan, 1990; George, Young, 1988; Leaver et al, 1993; Martinez-Lara et al., 2002). Было показано, что большая часть активности GST в цитозоле гепатоцитов связана с гомодимерной изоформой GST Айв меньшей степени с гомодимерной GST В. Еще небольшая часть активности обусловлена гетеродимерным ферментом GST AM (George, Buchanan, 1990).

Антитела к основной глутатион S-трансферазе печени камбалы GST А

перекрестно не реагируют с GST а, ц и л классов млекопитающих, также

слабой является активность этой формы с большинством субстратов, за

исключением CDNB и DCNB (субстрат ц класса). Молекулярное

21

клонирование и экспрессия кДНК кодирующей изофермент, с последующим анализом данных о первичной последовательности белка, полученных из этой кДНК, позволило отнести GST А с классу 9, который встречается у насекомых, растений и млекопитающих. (Leaver et al., 1993).

Гомологи GST А были обнаружены не только у камбаловых (Pleuronectes vetulus, Platichthys stellatus, Solea senegalensis), но и у других рыб, включая большеротого окуня Micropterus salmoides, пагра Pagrus major, угря Anguilla anguilla, тиляпию Oreochromis niloticus, лаврака Dicentrarchus labrax, мраморного ривулуса Rivulus marmoratus, кефаль Mugil cephalus и лососевых рыб (Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus tshawytscha). При этом идентичность аминокислотных последовательностей во всех случаях составляет не менее 64%, что свидетельствует о большой консервативности этого гена среди рыб. При этом GST 0 рыб более близки к некоторым GST растений (до 24% сходства аминокислотных последовательностей белка), чем с GST 9 млекопитающих (идентичность последовательностей не превышает 1 l-18%)(Lee et al., 2006; Carletti et al., 2008).

Особенностью GST 9 рыб является то, что они, в отличие от GST 9 млекопитающих, удерживаются аффинным носителем с иммобилизованным глутатионом и метаболизируют субстрат CDNB. Кроме того, Кониши с коллегами (Konishi et al., 2005а), на примере GST R1-1 пагра P. major, показали, что ген GST 9 рыб состоит из шести экзонов, а не из пяти, как у млекопитающих. Поэтому, исходя из выявленных различий, ими было предложено выделить трансферазы гомологичные GST А камбалы в отдельный класс, обозначенный как класс р, филогенетически родственный классу в млекопитающих, растений и насекомых, но пока обнаруженный только у рыб (Konishi et al., 2005а). Следует уточнить, что буквой р также была обозначена глутатион трансфераза выделенная из эритроцитов млекопитающих и птиц, но она не имеет отношения к GST р рыб (Aydemir, Kavrayan, 2009).

Интересно, что аминокислотная последовательность GST представителя семейства карповых Danio rerio на 45% идентична GST 0 млекопитающих и менее чем на 25% идентична группе GST рыб, обозначенных Кониши как р. Подобная GST была также обнаружена у карпа Cyprinus carpió. Таким образом, похоже, что из изученных рыб только у этих видов обнаружена изоформа, которая может быть обозначена как истинная GST 0 (Konishi et al., 2005а; Fu, Xie, 2006; Lee et al., 2006).

Большое количество работ посвящено изучению GST лососевых рыб (Ramage, Nimmo, 1984; Ramage et al., 1986; Dominey et al., 1991; Pérez-López et al., 2000; Nóvoa-Valiñas et al., 2002; Donham et al., 20056; Trute et al., 2007). Сравнение полной аминокислотной последовательности основной GST печени кумжи Salmo trutta и радужной форели Oncorhynchus mykiss выявило, что этот фермент имеет очень большое сходство с GST л млекопитающих (Dominey et al., 1991). В последствие было показано, что GST л составляют основную часть пула глутатион трансфераз и у других лососевых рыб: О. kisutch, О. tshawytscha, S. salar, S. trutta (Nóvoa-Valiñas et al., 2002; Donham et al, 20056; Trute et al., 2007).

С этим, однако, не согласуются результаты изучения субстратной

специфичность GST, полученные Рамаджем с соавторами (Ramage et al.,

1986). Из двух групп изоформ, выделенных из печени лосося S. salar, у одной

полностью отсутствовала активность GST в присутствии EtA (субстрат л

класса млекопитающих) и наблюдалась высокая активность в присутствии

DCNB (ц), ^ш«с-4-фенил-3-бутен-2-она (ц) и /?-нитробензил хлорида (а/ц).

В группе, где наблюдалась активность в присутствии EtA, была выявлена

небольшая активность в присутствии Д5-андростен-3,17-диона (а класс) и

бромосульфофталеина (р класс) и высокая активность в присутствии с 1,2-

эпокси-З-(р-нитрофенокси) пропана (р), DCNB (р) и /7-нитробензил хлорида

(а/ц). При этом активность в присутствии DCNB во всех группах

значительно превосходила таковую с EtA. Таким образом, обе группы

изоферментов по каталитическим свойствам больше напоминали р класс

23

млекопитающих, чем я класс. В свою очередь в работе Новоа-Валиньяса с соавторами (Nóvoa-Valiñas et al., 2002), наоборот, активность в присутствии EtA смеси афинно очищенных GST из печени лосося S. salar и кумжи S. trutta, в среднем, в семь раз превосходила активность в присутствии DCNB, а в почках в 32 раза. Таким образом, данные о субстратной специфичности GST лососевых рыб требуют дальнейшего уточнения.

Помимо лососевых рыб GST я обнаружены у карповых (С. carpió, D. rerio, Carassius auratus, Hypophthalmichthys molitrix, Danio rerio), канального сомика I. punctatus и угря A. anguilla (James, 1998; Suzuki et al., 2005; Fu, Xie, 2006; Liang et al., 2007; Carletti et al., 2008). Эти ферменты также очень близки по структуре к GST я млекопитающих, с идентичностью аминокислотной последовательности не менее 57% (Carletti et al., 2008), что позволяет говорить об эволюционной консервативности этого класса глутатион трансфераз.

Довольно много внимания было уделено изучению GST рыб семейства карповых, в связи с участием этих ферментов в обезвреживании микроцистинов (бактериальных токсинов, которые продуцируются сине-зелеными водорослями во время «цветения» водоемов) (Cazenave et al., 2006). У обыкновенного карпа С. carpió были расшифрованы и клонированы сразу девять генов глутатион трансфераз, включая а, р, р, 9, я GST цитозоля, митохондриальную GST к и микросомальные mGSTl, mGST2 и mGST3 (Fu, Xie, 2006). Было показано, что у устойчивого к микроцистину толстолобика Я. molitrix после введения токсина увеличивается экспрессия изоформы GST р, и, в особенности, GST а, тогда как у чувствительного к этому яду белого амура Ctenopharyngodon idellus экспрессия этих изоформ не изменяется (Liang et al., 2007).

Следует отметить, что, так как в цитируемых работах в основном были использованы молекулярно-генетические методы, то практически отсутствует информация о физико-химических особенностях этих ферментов

и в этом отношении GST карповых остаются мало изученными.

24

Помимо других видов карповых рыб (С. auratus, Aristichthys nobilis, Cirrhinus molitorella) GST а класса были обнаружены у лаврака D. labrax (DL-GST-8.2), пагра P. major (GST Al-1 и GST A2-2), канального сомика Ictalurus punctatus, тиляпии О. niloticus, мраморного ривулуса R. marmoratus, камбалы P. platessa и лососевых рыб (О. kisutch, О. tshawytscha, О. mykiss). При этом по структуре они довольно близки к GST а млекопитающих и птиц (George, Buchanan, 1990; Angelucci et al, 2000; Perez-Lopez et al., 2000; Donham et al., 20056; Lee et al., 2006; Liao et al., 2006; Trute et al., 2007).

Интересно отметить, что по уровню конституциональной экспрессии у лососеобразных рыб, а также у осетра и канального сомика, преобладают GST класса я, у карпообразных и ривулуса (карпозубообразные) GST класса а, а у окунеобразных, камбалообразных, а также угря, основная изоформа представлена GST класса р (Lee et al., 2006; Liang et al., 2007). В свою очередь, у всех рыб GST класса р составляют пул минорных изоформ (George, Buchanan, 1990; Perez-Lopez et al., 2000; Donham et al., 20056; Fu, Xie, 2006; Trute et al., 2007). Это может указывать на эволюционный отбор у различных групп рыб отдельных белков, которые, в свою очередь, могут обуславливать различные стратегии защиты от окислительного стресса и воздействия токсинов. Так как надотряд Перкоидные (Percomorpha), включающий окунеобразных и камбалообразных, является самой большой группой среди костистых рыб, можно предположить, что их успешное выживание и распространение может быть связано, в том числе, с преимущественной экспрессией GST р класса (Liang et al., 2007).

Некоторые глутатион трансферазы рыб имеют характеристики

«промежуточных» классов. Например, GST кошачьего сома /. punctatus

положительно реагирует одновременно с антисыворотками к GST а и л

класса, и ограниченно с р, a GST морского языка P. vetulus с

антисыворотками как р так и л класса (Gallagher et al., 1996). У чавычи О.

tshawytscha в одном из пиков, полученных с помощью ЖХВД, содержался

белок, аминокислотная последовательность одних фрагментов молекулы

25

которого полностью совпадала с таковыми GST я нерки, а других - с фрагментами GST а класса мышей, курицы и камбалы. При этом белок проявил гомогенность при SDS электрофорезе (Donham et al., 20056). Для более точной классификации этих белков требуются дополнительные исследования.

Следует отметить, что установленное родство исследуемой GST рыб с тем или иным хорошо охарактеризованным классом GST млекопитающих не обязательно означает сходство их биохимических свойств. Так, трансфераза лаврака DL-GST-6.7 отнесенная к классу р на основе сравнения аминокислотной последовательности белка, обладает слабой активностью в присутствии специфичного для этого класса субстрата - /?-нитробензил хлорида, но проявляет значительно большую активность в присутствии т/?£Шс-нон-2-еналя (ц и а класс), А5-адростен-3,17-диона (а класс) и EtA (а и я класс). В свою очередь, другая GST этой рыбы - DL-GST-8.2, принадлежащая к GST класса а, хотя и проявляет специфическую активность в присутствии сульфобромфталеина, тем не менее, не способна метаболизировать Д5-адростен-3,17-дион (а класс), и в пять раз активнее с р-нитробензил хлоридом по сравнению с DL-GST-6.7 (Angelucci et al., 2000).

Среди изоформ GST из печени кижуча О. kisutch преобладают GST класса я, на втором месте по содержанию GST класса р (Trute et al., 2007). Тем не менее, активность GST при добавлении в инкубационную среду р-нитробензил хлорида (субстрат р класса) в 6 раз выше, чем при использовании EtA (субстрат для GST класса я). Кроме того, в гепатоцитах кижуча не осуществляется реакция связывания глутатиона с пестицидом атразином, который является субстратом для GST я человека и грызунов (Trute et al., 2007).

GST В камбалы структурно сходны с GST а млекопитающих, так как перекрестно реагирует с антителами к GST а класса, найденной у крыс. При этом активность GST В с субстратами а класса довольно слабая (включая

EtA и отсутствие GSH-пероксидазной активности) на фоне заметной активности с субстратом р класса DCNB (George, Buchanan, 1990).

Таким образом, анализ имеющейся в нашем распоряжении информации позволяет сделать вывод о том, что рыбы, как правило, обладают набором изоформ GST достаточно разнородных функционально и генетически. Накопленные к настоящему моменту данные свидетельствуют о длительной и независимой эволюции различных классов GST, которые структурно мало отличаются в пределах крупных таксонов, таких как отряды, классы и даже царства. Тем не менее, некоторые биохимические свойства, такие, как, например, как субстратная специфичность, могут иметь видоспецифичекие особенности.

1.2.2. GST рыб как биомаркеры загрязнения окружающей среды

В настоящее время мир живого сталкивается и вынужден адаптироваться к постоянному росту в окружающей среде уровня и разнообразия чужеродных химических соединений техногенного происхождения, не встречающихся в природе. В связи с этим, все больший интерес привлекают возможности применения разнообразных биохимических показателей (биомаркеров) для определения качества среды и здоровья организмов в составе той или иной экосистемы (Немова, Высоцкая, 2004).

Использование только химико-аналитических методов обнаружения

загрязнения не дает полной информации о его биологических последствиях,

так как не учитывает комбинированные кумулятивные или

антагонистические эффекты нескольких загрязнителей, продуктов их

трансформации и взаимодействия с природными веществами. В свою

очередь изменение физиолого-биохимических показателей дают

информацию о том, что токсин проник в организм, распределился в тканях и

оказывает на них токсический эффект (Van der Oost et al., 2003). Применение

таких показателей позволяет измерить биодоступность и токсичность тех или

27

иных загрязнителей и определить зависимость эффекта от концентрации токсинов.

Так как эффектам на высших иерархических уровнях всегда предшествуют изменения на ранних уровнях организации, биохимические маркеры являются «сигналами раннего оповещения». Биохимические изменения проявляются при низкой силе негативного воздействия, до того как нарушения процессов, протекающих в организме (поведение, рост, размножение и выживание и т.д.) затронут популяционный уровень и станут необратимыми (Кашулин и др., 1999; Немова, Высоцкая, 2004; Van der Oost et al., 2003).

Наиболее интенсивно в качестве потенциальных биомаркеров загрязнения водных экосистем изучаются ферменты, вовлеченные в процесс биотрансформации ксенобиотиков и их метаболитов (ферменты биотрансформации и антиоксидантные ферменты), так как в соответствии с их биологической ролью они первыми реагируют на поступление токсинов. В связи с этим, идея применения глутатион S-трансфераз гидробионтов в качестве биомаркера получила широкое распространение (Varanasi et al., 1987; Van der Oost et al., 2003). В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных данных о влиянии антропогенного загрязнения на активность GST рыб и список подобных работ непрерывно растет (Dierickx, 1984; Lindstrom-Seppa, Oikari, 1989; Stalker et al., 1991; Lau et al., 2004; Song et al., 2006; Krca et al., 2007; Silva et al., 2009).

Так, было показано участие глутатион трансфераз в обезвреживании различных галогенированых углеводородов. К активации GST приводит внутрибрюшинная инъекция карасям (С. auratus) хлорбензола, 1,3-дихлорбензола, 1,4-дихлорбензола и /»-хлорметилбензола (Qian et al., 2004). Повышение активности GST при кратковременном воздействии низких концентраций 1,2-дихлорбензола и 1,4-дихлорбензола растворенного в воде было зафиксировано в жабрах и мозгу дженинзии Jenynsia multidentata, тогда

как активность GST в печени не изменяется (Monferran et al., 2008).

28

Многочисленные аквариальные эксперименты по воздействию полихлорированных бифенилов (PCB) на GST лосося S. salar, радужной форели О. mykiss, угря A. anguilla и карпа С. carpió показывают стойкий длительный эффект (до 9 недель) дозо- и времязависимой индукции (Pérez-López et al., 2000; Pérez-López et al., 2002a,6; Schmidt et al., 2004; Arukwe, Nordb0, 2008). С другой стороны, планарный 3,3',4,4',5-пентахлорбифенил ("антиэстроген") вызывает снижение активности GST у форели (О. mykiss), тогда как у трески Gadus morhua активность GST не изменяется, даже при увеличении содержания PCB в тканях в 1000 раз (Bernhoft et al, 1994). В полевых исследованиях 3-х кратное (относительно контроля) превышение активности GST в печени американского карликового сомика Ameiurus nebulosus, было зафиксировано у рыб, пойманных в загрязненной зоне реки Сент-Лоуренс (Канада), в мышцах которых концентрация PCB была в 22 раза выше по сравнению с рыбами из чистой зоны (Otto, Moon, 1996). В тоже время в печени леща Abramis brama, выловленного из зоны загрязненной PCB, наблюдали пониженную активность GST на фоне повышенного уровня перекисного окисления липидов (Morozov et al, 2010).

Различные фенольные производные, в том числе 4-нонилфенол, также модулируют активность GST. Как было показано, эти соединения играют роль аналогов естественных эстрогенов у многих водных видов, в том числе у рыб. Увеличение активности GST, которое затем сменилось снижением, было зафиксировано у молоди радужной форели О. mykiss, атлантической трески G. morhua и дорады Sparus aurata после воздействия 4-нонилфенола (Uguz et al., 2003; Sturve et al., 2006; Carrera et al., 2007). С другой стороны инъекция 50 мг/кг 4-нонилфенола самцам лаврака (D. labrax) приводила к время- и дозозависимому ингибированию активности GST (Hughes et al., 2004; Vaccaro et al., 2005).

Увеличение активности GST было показано под действием разнообразных пестицидов и фунгицидов у личинок севрюги и молоди карпа,

при этом отмечались время- и дозозависимые эффекты (Левина и др., 2007).

29

У многих видов рыб отмечается различная чувствительность GST к действию полиароматических углеводородов (ПАУ), включая бензпирен (БП) и его галогензамещенные производные. Так, внутрибрюшинные инъекции БП приводили к повышению активности GST у арктического гольца Salvelinus alpinus, дорады S. auraîa и морского карася Rhabdosargus sarba (Xu et al., 2001; Padrós et al, 2003; Banni et al., 2008). Присутствие в воде растворенного БП вызывает индукцию активности GST в печени мраморного клариаса Ciarías gariepinus и селезенке морского ерша S. marmoratus (Mdegela et al., 2006a,6; Wu et al., 2007). В свою очередь в мозгу молоди карпа С. carpió происходит снижение активности GST и уменьшение доли восстановленного глутатиона под воздействием водного раствора гексахлорбензола. Отсутствие изменения активности GST после воздействия БП в концентрации 2 - 50 мг/кг наблюдалось в печени морского ерша Sebasticus marmoratus, лиманды Limanda limanda и морского языка P. vetulus (Collier, Varanasi, 1991; van Schanke et al, 2001; Wang et al., 2006). В последнем случае также отсутствовала реакция GST на такие характерные индукторы как tSO, фенобарбитал и полихлорбифенилы.

Показано участие GST в защите от токсичесого действия сложных

смесей различных ПАУ в составе нефтяных загрязнений. Так, индукция GST

мраморного бубыря Pomatoschistus microps под действием 15 и 30%-го

раствора топливного масла #4 WAF по величине в два раза превосходит

индукцию вызванную действием раствора чистого бензпирена(У1епа et al.,

2008). Такой же результат был получен в другом токсикологическом тесте,

где молодь савало Prochilodus lineatus в течение 15 дней была подвержена

действию растворенной в воде фракции дизельного топлива (Simonato et al.,

2008). В полевых исследованиях повышенный уровень GST обнаружен у

камбалы мегрима Lepidorhombus boscii отловленной спустя пять месяцев

после массированного разлива нефти (Martínez-Gómez et al., 2006), тогда как

у белой атлантической камбалы 5. senegalensis активность GST

демонстрирует сильную положительную корреляцию с содержанием ПАУ в

30

грунте и маркерами гистопатологии (Jiménez-Tenorio et al., 2008).

В ряде полевых исследований GST успешно применялась в качестве биомаркера загрязнения водной среды тяжелыми металлами (ТМ). Так, повышенная активность GST была обнаружено в печени ельца Leuciscus alburnoides из водоема, расположенного в зоне медного рудника (Lopes et al., 2001) и в печени, почках и сердце мраморного клариаса С. gariepinus, выловленного в промышленных районах Нигерии (Farombi et al., 2007). В аквариальных экспериментах по влиянию тяжелых металлов, было показано, что кривые зависимости активности GST от концентрации металла имеют выраженную колоколообразную форму, когда при увеличении дозы металла активность фермента сначала нарастает, а затем начинает ингибироваться (Liu et al., 2006). В острых токсических экспериментах высокие концентрации ТМ вызывали заметную редукцию активности GST в почках угря A. anguilla (Ahmad et al., 2006), гепатопанкреасе и почках карася С.. auratus (Bagnyukova et al., 2006) и жабрах карпа С. carpió (Franco et al., 2008). Комбинированный эффект тяжелых металлов (CuCl2, CdCl2, FeCl2 и NiCl2) в сублетальных концентрациях также приводил к снижению активности GST в тканях пятнистого змееголова Channa punctata на фоне снижения уровня восстановленного глутатиона (Pandey et al., 2008).

С точки зрения использования GST в системе эколого-биохимического мониторинга наибольший интерес вызывает возможность применять этот биомаркер для оценки общего антропогенного загрязнения, вызванного промышленными, бытовыми и сельскохозяйственными отходами, так как поллютанты обычно присутствуют в окружающей среде в виде сложной смеси, компоненты которой могут либо усиливать, либо подавлять действие друг друга (Fernandes et al., 2008). Повышение активности GST под воздействием неспецифического загрязнения у рыб из промышленных районов выявлено у тиляпии О. niloticus, лаврака D. labrax, мраморного бубыря Р. microps, карпа С. carpió, радужной форели О. mykiss, окуня Perca fluviatilis и плотвы Rutilus rutilus (Pathiratne et al., 2008; Stien et al., 1998;

31

Tuvikene et al., 1999; Huang et al., 2007; Monteiro et al., 2007). В аквариальном эксперименте у лаврака D. labrax наблюдался рост активности GST уже через четыре часа после добавления 1% раствора промышленно-городских стоков города Авейру, Португалия (Gravato, Santos, 2003). Слабая индукция GST была показана у речной камбалы Platichthys flesus и карася С. auratus, после воздействия на них осадков собранных из загрязненных областей Китая и Италии (Viganó et al., 2001; Chen et al., 1998).

C.A. Ирейкина (Ирейкина, 2008), исследуя активность GST полосатой камбалы Liopsetta pinnifasciata, отловленной в разных по уровню антропогенного загрязнения зонах залива Петра Великого в Японском море, обнаружила более высокие значения активности GST у рыб из акватории, сильно загрязненной хлорорганическими пестицидами, нефтепродуктами и тяжелыми металлами, по сравнению с таковыми из чистой зоны.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что активность GST рыб может быть рассмотрена в качестве перспективного биомаркера загрязнения окружающей среды. Также многие исследователи отмечают наличие у GST рыб путей регуляции экспрессии, независимых от системы фазы I биотрансформации ксенобиотиков, что делает их уникальными биомаркерами некоторых видов загрязнения.

Однако чувствительность глутатион трансфераз к загрязнению в целом

ниже, чем у ферментов первой фазы биотрансформации, таких как

этоксирезоруфин-О-диэтилаза (EROD) и цитохром Р450. Так в 43

лабораторных и 39 полевых исследованиях по влиянию различных видов

загрязнения на GST рыб, проанализированных в обзоре Рона ванн дер Оста

(Van der Oost et al., 2003), значительное повышение активности GST

наблюдалось лишь в 33% лабораторных исследований и 33% полевых

исследований и у ограниченного числа видов. Это связано с тем, что уровень

глутатион трансферазной активности зависит от суммы многих факторов: от

эффективности ферментов фазы I биотрансформации, от способности

активированных электрофилов достичь цитозоля с расположенными в нем

32

GSH и GST, от субстратной специфичности изоформ GST, от устойчивости GST к ингибированию субстратом, другими электрофилами или продуктом реакции, от концентрации GSH и т.д. (Chasseaud, 1979).

По специальной шкале перспективности того или иного биомаркера для оценки качества среды, предложенной ванн дер Остом (Van der Oost et al., 2003), ферменты второй фазы биотрансформации, GST и UDPGT, уступают таким биомаркерам как активность EROD, содержание продуктов биотрансформации флуоресцентных ароматических соединений желчи и конъюгатов ДНК с реактивными метаболитами, однако превосходят остальные типы биомаркеров, включая такие популярные, как активность антиоксидантных ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза) и гистологические показатели (Van der Oost et al., 2003).

В целом, трудности, ограничивающие применение GST, являются, по

сути, общими для всех биохимических маркеров и заключаются в

недостаточной изученности особенностей функционирования самого

фермента. Успешное применение биомаркера требует хорошего понимания

механизмов лежащих в основе его ответа. Однако, учитывая недостаточное

количество работ, посвященных особенностям функционирования GST у

рыб, становится понятным, почему исследователи зачастую испытывают

затруднения при интерпретации полученных результатов. Ситуация

усложняется еще и тем, что необходимо иметь в виду влияние на активность

GST абиотических факторов среды (температура воды, соленость,

концентрация кислорода). Кроме того, вариабельность показателей может

быть обусловлена таксономической принадлежностью, органной

спецификой, физиологическими изменениями, связанными с годовым

циклом, полом, возрастом (Ruus et al., 2002; Napierska, Podolska, 2005;

Napierska et al., 2006; Kopecka, Pempkowiak, 2008). Также мало информации

собрано относительно субстратной специфичности GST, обусловленной

разнообразием классов и изоформ фермента. Очень часто эти моменты не

учитываются во время проведения эколого-токсикологических иследований.

зз

По этой причине Международным союзом морских исследований (Council for the Exploration of the Sea) в 1994 GST были отнесены к категории биомаркеров состояния окружающей среды, которые требуют дополнительного изучения.

Можно заметить, что большая часть работ с использованием GST в качестве биоиндикатора загрязнения посвящена мониторингу морских экосистем (Ирейкина, 2008; Porte et. al., 2002; Ferreira et. al., 2006; Burgeot et. al., 1996; Blanchette et. al., 2007), значительно реже в качестве модельных объектов используют обитателей пресноводных водоемов. Особенно мало работ связанно с изучением особенностей функционирования этого фермента, у видов рыб, являющихся сочленами северных пресноводных экосистем: за исключением форели (Tuvikene et al., 1999; Almli et al., 2002; Uguz et al., 2003) и лосося (Arukwe et al., 2000; Elskus et al., 2004; Arabi, Alaeddini, 2005; Növoa-Valinas et al., 2002; Greco et al., 2007; Arukwe A., Nordb0, 2008), исследования GST y них единичны (Lindström-Seppä, 1988; 1990; Tuvikene et al., 1999; Larose et al., 2008; Setlikovâ, Wiegand, 2009). Тем не менее, данные об особенностях функционирования этих ферментов, их физико-химических свойствах, могут расширить наши знания об особенностях функционирования системы биотрансформации у водных организмов северного региона и внести определенный вклад в развитие системы эколого-биохимического мониторинга и тестирования водоемов Севера.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Борвинская, Екатерина Витальевна

выводы

1. Активность глутатион S-трансфераз у исследованных рыб варьирует в зависимости от вида, ткани, выбранного субстрата и ряде случаев от пола и возраста. Выявленная субстратная специфичность указывает на то, что в тканях глутатион S-трансферазы существуют в виде набора изоформ.

2. Глутатион S-трансфераза из печени щук является типичным представителем семейства глутатион S-трансфераз и представляет собой гомодимер с кажущейся молекулярной массой 53 кДа, массой субъединиц -29 кДа и значением pi 6.4. Каталитические свойства фермента наиболее близки к таковым у глутатион S-трансфераз класса р рыб и классов я и а млекопитающих.

3. GST щук, плотвы и сигов участвуют в развитии ответной реакции организма рыб на изменение среды, вызванное техногенной трансформацией водоема. Ее характер на уровне органов и тканей специфичен для каждого из исследованных видов. Применение серии специфических субстратов при определении активности глутатион S-трансфераз позволяет с большей долей вероятности выявить ответную реакцию, чем при использовании только универсального субстрата (1-хлор-2,4-динитробензола).

4. Активность тканевых глутатион S-трансфераз как один из показателей адаптивных возможностей организма в комплексе с другими индикаторами может быть использована в системе эколого-биохимического мониторинга и тестирования для оценки состояния рыб в водоемах, подвергшихся антропогенному воздействию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Семейство глутатион S-трансфераз это ключевые ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков, которые обезвреживают широкий круг токсических веществ и защищают клетки от последствий окислительного стресса. Определение активности GST широко применяется в эколого -биохимическом мониторинге в качестве показателя (биологического маркера) благополучия организмов под воздействие различных факторов среды (в том числе антропогенных).

В органах щуки, сига и плотвы глутатион S-трансферазы существенно различаются, как по уровню активности, так и по изоферментному составу. Самый высокий уровень суммарной активности GST обнаружен в жабрах и печени плотоядной щуки, что, по нашему мнению, может быть эволюционно возникшей преадаптацией к накоплению токсинов в пищевой пирамиде. В свою очередь различия в изоферментных спектрах GST могут быть связаны как с физиологическими особенностями, так и с таксономической принадлежностью изучаемых объектов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что показатели активности GST у исследованных рыб обладают естественной изменчивостью. Снижение активность GST по мере увеличения возраста рыб обнаружено в печени сигов и в печени, почках и жабрах плотвы, тогда как в мышцах щук наблюдается обратная зависимость. Также у щуки в почках в 2009 и 2011 г. обнаружена половая специфика: у самок активность GST была выше, чем у самцов. Наличие вариабельности, связанной с изменениями факторов внутренней среды, необходимо учитывать при использовании фермента в качестве биомаркера в эколого-биохимическом мониторинге.

Установлено, что минерализованные воды оз. Костомукшское оказывают модифицирующее действие на активность глутатион S-трансфераз. При этом характер ответной реакции изменялся в зависимости от выбранной ткани, видовых и экологических особенностей рыб.

Применение методов позволяющих оценивать вклад отдельных изоформ в общую активность глутатион трансфераз позволил существенно повысить информативность этого показателя. Так как некоторые изоформы более чувствительны к техногенному загрязнению отходами Костомукшского ГОКа, показатели их активности могут быть предложены в качестве специфических биомаркеров загрязнения данного типа.

Не удалось выявить значительных изменений активности GST в оз. Окуневое, расположенного ниже по течению от оз. Костомукшское. Это может указывать на более слабое воздействие загрязнения на гидробионтов населяющих этот водоем, что может быть связано как с разбавлением техногенных вод, так и с возможностью свободной миграции рыбы в водоемы расположенные ниже по течению.

Не ясно, какие именно составляющие стоков Костомукшского ГОКа оказывают наибольшее влияние на систему биотрансформации у рыб. Можно предположить, что механизм индукции GST связан с развитием стресса (в том числе окислительного) в результате хронического действия избытка некоторых ионов и аккумуляции в организме тяжелых металлов, содержащихся в воде хвостохранилища. Индукция GST может быть связана с действием нефтепродуктов в небольшом количестве содержащихся в воде хвостохранилища. Также, раздражающее действие на эпителий жабр могут оказывать мелкодисперсные частицы минеральной взвеси.

Полученные результаты показали, что при проведении мониторинга загрязнения водной среды важно выбрать подходящие виды-биоиндикаторы. Среди изученных рыб показатели активности GST щуки отличались наибольшей чувствительностью и стабильно воспроизводились в разные годы. Данный вид рыб является типичным обитателем внутренних водоемов Севера, что делает его доступным объектом для эколого-токсикологического тестирования данного региона.

В результате очистки этого фермента из печени щуки с использованием методов гель - хроматографии и аффинной хроматографии была выделена

105 одна изоформа, гомогенная по критерию подвижности в электрическом поле при SDS-электрофорезе и изоэлектрофокусировании, а также по кинетическим характеристикам. GST из печени щуки обладает теми же структурными свойствами, которые характерны для цитозольных GST млекопитающих. Выделенный белок представляет собой гомодимер с молекулярной массой субъединиц около 29 кДа. По субстратной специфичности полученный фермент ближе к GST р класса рыб и GST а и я классов млекопитающих. Фермент катализирует конъюгацию с глутатионом 4-нитрохинолин N-оксида (NNO), субстрата GST р и я классов млекопитающих, и субстратом а и я классов этакриновой кислотой (EtA). Значение Км GST из печени щуки в присутствии различных концентраций субстрата CDNB составляет 0,75 ± 0,13 мМ CDNB, Vmax = 12,81 ± 0,82 рМ CDNB/мин/мг белка, что, в целом, не противоречит данным полученными для очищенных форм GST высших позвоночных.

В целом, на основании полученных данных о структурных и кинетических свойствах GST из печени щуки можно сделать вывод о том, что E1-GST является частью общего семейства глутатион S-трансфераз, выявленных как у рыб, так и млекопитающих.

Как показал анализ литературы, существует достаточное большое число работ, посвященных изучению влияния различных факторов среды, в основном антропогенного происхождения, на активность глутатион S-трансфераз у рыб. Тем не менее, информация о свойствах и специфике функционирования этого фермента у данной группы организмов, в особенности это касается обитателей пресноводных водоемов Севера, остается незначительной и нередко противоречивой. Данные, полученные в ходе этой работы, вносят определенный вклад в общий пул знаний по этой проблеме.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Борвинская, Екатерина Витальевна, 2012 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Алабастер Д., Ллойд Р. Критерий качества воды для пресноводных рыб. М.: Легкая и пищевая пром-ть. 1984. 343 с.

2. Антропогенная трансформация биоты северных озер (ихтиологические, паразитологические и биохимичекие аспекты). Изд-во КарНЦ РАН. 210 с.

3. Булавин Д.В., Карпищенко А.И., Губанов А.И., Решетов A.B. Глутатион S-трансфераза Р1-1 в нормальной и опухолевой тканях легкого: свойства, функции и возможные механизмы регуляции активности // Биохимия, 1996. Т. 61. № 6. С. 1015-1021.

4. Виноградов Г.А. Процессы ионной регуляции у пресноводных рыб и беспозвоночных. М.: Наука. 2000. 216с.

5. Гаврицков В.Ю., Дудкин С.И.. Глутатион-S - трансферазы как фактор устойчивости существования рыб в загрязненных водных экосистемах // Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем: материалы Межд. конференции. 2010. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://ecotext2.ru/358.html

6. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир. 1970. 252 с.

7. Ильмаст Н.В., Стерлигова О.П., Такшеев С.А., Кучко Я.А. Плотва Костомукшского хвостохранилища // Проблемы изучения и сохранения позвоночных животных антропогенных водоемов: материалы Всерос. науч. конф. с международ, участием. Саранск. 20106. С. 67-70.

8. Ирейкина С. А. Молекулярные биомаркеры антиоксидантной системы и биотрансформации загрязняющих веществ у рыб и моллюсков из импактных районов залива Петра Великого (Японское море) // Автореферат на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Владивосток. 2008. 20 с.

9. Калинкина Н.М., Куликова Т.П. Эволюционная обусловленность реакции гидробионтов на изменение ионного состава воды (на примере пресноводного зоопланктона) // Известия РАН. Серия биологическая. 2009. № 2. С. 243-248.

10. Калинкина Н.М., Куликова Т.П., Морозов А.К., Власова Л.И. Причины

108

техногенного изменения сообщества пресноводного зоопланктона // Известия РАН. Серия биологическая, 2003. 6. С. 747-753.

П.Кашулин H.A., Лукин A.A., Амундсен П.-А. Рыбы пресных вод Субарктики как биоиндикаторы техногенного загрязнения. Апатиты: Кол. науч. центр РАН, 1999. 142 с.

12. Козлов A.B., Слепышева В.В. Определение белка в сыворотке крови // Terra Medica, приложение «Лабораторная диагностика». 2005. № 3 [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.terramedica.spb.ru/ld3_2005/kozlov.htm

13. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 1. С. 8-12.

14. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. 1990. Т. 110. № 1. С. 20-23.

15. Левина И.Л., Москвичев Д.В., Зинчук O.A. Экологические аспекты токсичности азоловых пестицидов для гидробионтов. Ростов-на-Дону: Медиа-полис, 2007. 180 с.

16. Матей В.Е. Жабры пресноводных костистых рыб. Морфофункциональная организация, адаптация, эволюция. Спб.: «Наука». 1996. 204 с.

17. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир. 1971. 258 с.

18. Немова H.H., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука. 2004. 215 с.

19. Первозванский В.Я. Рыбы водоемов района Костомукшского железорудного месторождения. Петрозаводск: Изд-во «Карелия», 1986. 216 с.

20. Поверхностные воды Калевальского района и территории Костомукши в условиях антропогенного воздействия. Петрозаводск: Изд-во Карельского НЦ РАН, 2001. 168 с.

21. Смирнов Л.П., Богдан В.В. Липиды в физиолго-биохимических

109

адаптациях эктотермных организмов к абиотическим и биотическим факторам среды. М.: Наука. 2007. 182 с.

22. Состояние водных объектов Республики Карелия. По результатам мониторинга 1998-2006 гг. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 2007. 210 с.

23. Суховская И.В. Борвинская Е.В., Смирнов Л.П., Немова H.H.. Сравнительный анализ методов определения концентрации белка -спектрофотометрии в диапазоне 200-220 ни и по Бредфорд// Труды Карельского Научного Центра РАН. 2010. № 2. С. 68-71.

24. Сущук А. А. Почвенные нематоды трансформированных экосистем Карелии: дис. ... канд. биол. наук. Петрозаводск, 2009. С. 99-102.

25. Такшеев С.А. Содержание некоторых тяжелых металлов в печени и мышцах рыб костомукшского хвостохранилища // Экологические проблемы Северных регионов и пути их решения: материалы Межд. конф. Часть 1. Апатиты, 2004. с. 215 - 216.

26. Такшеев С.А. Состояние рыбной части сообщества Костомукшского хвостохранилища и его оценка биохимическими методами // Диссертация на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Петрозаводск. 2005. 171 с.

27. Филатов H.H., Куликова Т.П., Лозовик П.А. Современное состояние водных объектов Республики Карелия. По результатам мониторинга 19921997. Петрозаводск: КарНЦРАН. 1998. 188с.

28. Хлебович В.В. Критическая соленость биологических процессов. Л.: «Наука». 1974. 230 с.

29. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. 568

с.

30. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

31. Ahmad I., Maria V.L., Oliveira M., Pacheco M., Santos M.A. Oxidative

stress and genotoxic effects in gill and kidney of Anguilla anguilla L. exposed to

no

chromium with or without pre-exposure to beta-naphthoflavone // Mutat. Res. 2006. Vol. 608. Nl.P.16-28.

o

32. Alander J., Lengqvist J., Holm P.J., Svensson R., Gerbaux P., van den Heuvel R.H.H., Hebert H., Griffiths W.J., Armstrong R.N., Morgenstern R.. Microsomal glutathione transferase 1 exhibits one-third-of-thesites-reactivity towards glutathione // Arch. Biochem. Biophys. 2009. Vol. 487. № 1. P. 42-48.

33. Al-Ghais S.M. Species variation and some properties of renal glutathione S-transferase of fish from arabian gulf // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997. Vol. 59. P. 976-983

34. Al-Ghais S.M., Ali B. Xenobiotic Metabolism by Glutathione S-transferase in gill AZof fish from arabian gulf // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. Vol. 55. P. 201-208

35. Al-Ghais S.M., Ali B. Inhibition of glutathione S-transferase catalyzed xenobiotic detoxication by organotin compounds in tropical marine fish tissues // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1999. Vol. 62. P. 207-213.

36. Almli B., Egaas E., Christiansen A., Eklo O.M., Lode O., Kallqvist T. Effects of three fungicides alone and in combination on glutathione S-transferase activity (GST) and cytochrome P-450 (CYP 1A1) in the liver and gill of brown trout (Salmo trutta) // Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 54. N 3-5. P. 237-240.

37. Angelucci S., Sacchetta P., Moio P., Melino S., Petruzzelli R., Gervasi PG, Di Ilio C. Purification and characterization og glutathione transferases from the Sea Bass (Dicentrarchus labrax) liver // Archives of biochemistry and biophysics. 2000. Vol. 373. № 2. P. 435-441.

38. Ankley G.T., Agosin M. Comparative aspects of hepatic UDP-glucuronisyltransferases and glutathione S-transferases in bluegill and channel catfish // Comp. Biochem. Physiol. 1987. Vol. 87B. N 4. P. 671-673.

39. Arabi M., Alaeddini M.A. Metal-ion-mediated oxidative stress in the gill homogenate of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): antioxidant potential of manganese, selenium, and albumin // Biol. Trace Elem. Res. 2005. Vol. 108. N 13. P.155-168.

40. Armstrong R.N. Structure, Catalytic Mechanism, and Evolution of the Glutathione Transferases // Chem. Res. Toxicol. 1997. Vol. 10. P. 2-18

41. Arukwe A., Celius T., Walther B.T., Goks0yr A. Effects of xenoestrogen treatment on zona radiata protein and vitellogenin expression in Atlantic salmon (Salmo salar) // Aquat. Toxicol. 2000. Vol. 49. N 3. P. 159-170.

42. Arukwe A., Nordb0 B. Hepatic biotransformation responses in Atlantic salmon exposed to retinoic acids and 3,3',4,4'-tetrachlorobiphenyl (PCB congener 77) // Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2008. Vol. 147. № 4. p. 470-482.

43. Atif F., Parvez S., Pandey S., Ali M., Kaur M., Rehman H., Khan H.A., Raisuddin S. Modulatory effect of cadmium exposure on deltamethrin-induced oxidative stress in Channa punctata Bloch // Arch. Environ. Contam. 2005. Toxicol. Vol. 49. P. 371-377

44. Awasthi S, Srivastava SK, Ahmad F, Ahmad H, Ansari GA.Interactions of glutathione S-transferase-pi with ethacrynic acid and its glutathione conjugate // Biochim Biophys Acta. 1993. Vol. 1164. N 2. P. 173-178.

45. Aydemir T., Kavrayan D. Purification and Characterization of Glutathione-S-Transferase from Chicken Erythrocyte // Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 2009. Vol. 37. P. 92-100.

46. Bagnyukova T.V., Chahrak O.I., Lushchak V.I. Coordinated response of goldfish antioxidant defenses to environmental stress // Aquat. Toxicol. 2006. Vol. 78. N4. P. 325-331.

47. Banni M., Bouraoui Z., Ghedira J., Clerandeau C., Guerbej H., Narbonne J.F., Boussetta H. Acute effects of benzo[a]pyrene on liver phase I and II enzymes, and DNA damage on sea bream Sparus aurata II Fish Physiol. Biochem. 2008. Vol. 35. N 2. P. 293-299.

48. Basha P.S., Rani A.U. Cadmium-induced antioxidant defense mechanism in freshwater teleost Oreochromis mossambicus (Tilapia) // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2003. Vol. 56. P. 218-221.

49. Benson A.M., Talalay P., Keen J.H., Jakoby W.B. Relationship between the

112

soluble glutathione-dependent delta 5-3-ketosteroid isomerase and the glutathione S-transferases of the liver // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. N 1. P. 158-162.

50. Bernhoft A., Hektoen H., Skaare J.U., Ingebrigtsen K. Tissue distribution and effects on hepatic xenobiotic metabolising enzymes of 2,3,3V4,4'-pentachlorobiphenyl (PCB-105) in cod (Gadus morhua) and rainbow trout 0Oncorhynchus mykiss) U Environ. Pollut. 1994. Vol. 85. N 3. P.351-359.

51. Blanchette B., Feng X., Singh B.R. Marine Glutathione S-Transferases // Mar. Biotechnol. 2007. Vol. 9. N 5. P. 513-542.

52. Booth J., Boyland E., Sims P. An enzyme from rat liver catalysing conjugations with glutathione // Biochem. J. 1961. Vol. 79. P. 516-523.

53. Bouraoui Z., Banni M., Ghedira J., Clerandeau C., Guerbej H., Narbonne J.F., Boussetta H. Acute effects of cadmium on liver phase I and phase II enzymes and metallothionein accumulation on sea bream Sparus aurata // Fish Physiol. Biochem. 2008. Vol. 34. N 3. P. 201-207.

54. Boyland E., Chasseaud L.F. Enzymes catalysing conjugations of glutathione with a,P-Unsaturated carbonyl compounds // Biochem. J. 1968. Vol. 109. P. 651661

55. Boyland E., Chasseaud L.F. The role of glutathione and glutathione S-transferases in mercapturic acid biosynthesis // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1969. Vol. 32. P. 173-219.

56. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

57. Brophy P.M., Southan C., Barret J. Glutathione transferases in tapeworm Moniezia expansa// Biochem. J. 1989. Vol. 262. P. 939-946.

58. Burgeot T., Bocquene G., Porte C., Dimeet J., Santella R.M., Garcia de la Parra L.M., Pfhol-Leszkowicz A., Raoux C., Galgani F. Bioindicators of pollutant exposure in the northwestern Mediterranean Sea // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1996. Vol. 131. P. 125-141.

59. Cailleaud K., Maillet G., Budzinski H., Souissi S., Forget-Leray J. Effects of salinity and temperature on the expression of enzymatic biomarkers in Eurytemora affinis (Calanoida, Copepoda) //Comparative Biochemistry and Physiology. 2007. Part A. Vol. 147. P. 841-849.

60. Carletti E., Sulpizio M., Bucciarelli T., Del Boccio P., Federici L., Di Ilio C., Glutathione transferases from Anguilla anguilla liver: Identification, cloning and functional characterization // Aquatic Toxicology. 2008. Vol. 90. P. 48-57.

61. Carrera E.P., Garsia-Lopes A., Martin del Rio Mdel P., Martines-Rodriguez G., Sole M., Mancera J.M. Effects of 17beta-estradiol and 4-nonilphenol on osmoregulation and hepatic enzymes in gillhead sea bream (Sparatus auratus) II Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2007. V.145. N 2. P. 210-217

62. Cazenave J., Bistoni M.A., Pesce S.F., Wunderlin D.A. Differential detoxification and antioxidant response in diverse organs of Corydoras paleatus experimentally exposed to microcystin-RR //Aquat. Toxicol. 2006. Vol. 76. P. 112.

63. Chapman L.M., Roling J.A., Bingham L.K., Herald M.R., Baldwin W.S. Construction of a subtractive library from hexavalent chromium treated winter flounder (.Pseudopleuronectes americanus) reveals alterations in non-selenium glutathione peroxidases // Aquat. Toxicol. 2004. Vol. 67. N 2. P. 181-194.

64. Chasseaud L.F. The role of glutathione and glutathione S-transferases in the metabolism of chemical carcinogens and other electrophilic agents // Advances in cancer research. 1979. Vol. 29. P. 176-255.

65. Chen G., Xu Y., Xu L., Zheng Y., Schramm K.W., Kettrup A. Influence of dioxin and metal-contaminated sediment on phase I and II biotransformation enzymes in silver crucian carp // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1998. Vol. 40. N 3. P.234-238.

66. Choi C. Y., An K. W., An M. I. Molecular characterization and mRNA expression of glutathione peroxidase and glutathione S-transferase during osmotic stress in olive flounder {Paralichthys olivaceus) II Comparative Biochemistry and Physiology. 2008. Vol. 149. Part A. P. 330-337.

114

67. Christ-Hazelhof E., Nugteren D.H., Van Dorp D.A. Conversions of prostaglandin endoperoxides by glutathione-S-transferases and serum albumins // Biochim Biophys Acta. 1976. Vol. 450. N 3. P. 450-461.

68. Clark A.G. The comparative enzymology of the glutathione S-transferases from non-vertebrate organisms // Comp. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 92B. N 3. P. 419-226.

69. Coban T., Beduk Y., Iscan M. In vitro effects of cadmium and nickel on glutathione, lipid peroxidation and glutathione S-transferase in human kidney // Toxicol. In Vitro. 1996. Vol.10. P. 241-245.

70. Collier T.K., Singh S.V., Awasthi Y.C., Varanasi U. Hepatic xenobiotic metabolizing enzymes in two species of benthic fish showing different revalences of contaminant-associated liver neoplasms // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992. Vol. 113. P.319-324.

71. Collier T.K., Varanasi U. Hepatic activities of xenobiotic metabolizing enzymes and biliary levels of xenobiotics in English sole (Parophrys vetulus) exposed to environmental contaminants // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1991. Vol. 20. N4. P. 462-473.

72. Compton S.J, Jones C.G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay // Anal. Biochem. 1985. Vol. 151. N 2. P. 369-374.

73. Dierickx P.J. Glutathione S-transferase in aquatic macro-invertebrates and its interaction with different organic micropollutants // The Science of the Total Environment. 1984. Vol. 40. P. 93-102.

74. Dominey RJ, Nimmo IA, Cronshaw AD, Hays JD. The major glutathione S-transferase in salmonid fish livers is homologous to the mammalian pi-class GST // Comp. Biochem. Physiol. 1991. Vol. 100B. N 1. P. 93-98.

75. Donham R.T., Luna A.D., Chang S., Morin D., Jewell W.T., Tjeerdema R.S. Characterization of cytosolic glutathione S-transferases in California Halibut {Paralichthys californicus) // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2007. Vol. 66. P. 133-138.

76. Donham R.T., Morin D., Jewell W.T., Burns S.A., Mitchell A.E., Lamé M.W., Segall H.J., Tjeerdema R.S. Characterization of glutathione ^-transferases in juvenile white sturgeon // Aquatic Toxicology. 2005a. Vol. 71. P. 203-214.

77. Donham R.T., Morin D., Jewell W.T., Lamé M.W., Segall H.J., Tjeerdema R.S. Characterization of cytosolic glutathione ^-transferases in juvenile Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) II Aquatic Toxicology. 20056. Vol. 73. P. 221-229.

78. Donham R.T., Morin D., Tjeerdema R.S. Salinity effects on activity and expression of glutathione S-transferases in white sturgeon and Chinook salmon // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2006. Vol. 63. P. 293-298.

79. Donnarumma L., De Angelis G., Gramenzi F., Vittozzi L. Xenobiotic metabolizing enzyme systems in test fish III. Comparative studies of liver cytosolic glutathione S-transferases // Ecotoxicology and environmental safety. 1988. Vol. 16. P. 180-186.

80. Dourado D.F.A.R., Fernandes P. A., Mannervik B., Ramos M.J. Glutathione Transferase: New Model for Glutathione Activation // Chem. Eur. J. 2008. Vol. 14. P. 9591-9598

81.Elskus A.A. Estradiol and estriol suppress CYP1A expression in rainbow trout primary hepatocytes // Mar. Environ. Res. 2004. Vol. 58. P. 463^-67.

82. Farombi E.O., Adelowo O.A., Ajimoko Y.R. Biomarkers of oxidative stress and heavy metal levels as indicators of environmental pollution in African cat fish (■Clarias gariepinus) from Nigeria Ogun River // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2007. Vol. 4. N 2. P. 158-165.

83. Fernandes C., Fontainhas-Fernandes A., Ferreira M., Salgado M.A. Oxidative stress response in gill and liver of Liza saliens, from the Esmoriz-Paramos Coastal Lagoon, Portugal // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2008. Vol. 55. P. 262-269.

84. Fernandes C., Fontainhas-Fernandes A., Ferreira M., Salgado M. A. Oxidative stress response in gill and liver of Liza saliens, from the Esmoriz-

Paramos coastal lagoon, Portugal // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2008. Vol. 55. P. 262-269.

85. Ferreira M., Moradas-Ferreira P., Reis-Henriques M.A. The effect of long-term depuration on phase I and phase II biotransformation in mullets (Mugil cephalus) chronically exposed to pollutants in River Douro Estuary, Portugal // Mar. Environ. Res. 2006. Vol. 61. P. 326-338.

86. Filho D. W., Giulivi C., Boveris A. Antioxidant defences in marine fish. I. Teleosts // Comp. Biochem. Physiol. 1993. Part C. N 106. P. 409-413.

87. Filho D.W., Torres M.A., Tribess T.B., Pedrosa R.C., Soares C.H.L. Influence of season and pollution on the antioxidant defenses of the cichlid fish acara (Geophagus brasiliensis) // Braz. J. Med. Biol. Res. 2001. Vol. 34. P. 719726.

88. Fitzpatrick P.J., Krag T.O.B., H0jrup P., Sheehan. Characterization of a glutathione S-transferase and a related glutathione-binding protein from gill of the blue mussel, Mytilus edulis // Biochem. J. 1995. Vol. 305. P. 145-150.

89. Forlin L., Lemaire P., Livingstone D.R. Comparative studies of hepatic xenobiotic metabolizing and antioxidant enzymes in different fish species // Marine Enviromental Research. 1995. Vol. 39. P. 201-204.

90. Foureman G.L., Bend J.R. The hepatic glutathione transferases of the male little skate, Raja erinacea II Chem.-Biol. Intteractions. 1984. Vol. 49. P. 89-103.

91. Franco J.L., Posser T., Mattos J.J., S6nchez-Chardi A., Trevisan R., Oliveira C.S., Carvalho P.S., Leal R.B., Marques M.R., Bainy A.C., Dafre A.L. Biochemical alterations in juvenile carp (Cyprinus carpio) exposed to zinc: glutathione reductase as a target // Mar. Environ. Res. 2008. Vol. 66. N 1. P.88-89.

92. Fu J., Xie P. The acute effects of microcystin LR on the transcription of nine glutathione ^-transferase genes in common carp Cyprinus carpio L. // Aquatic Toxicology. 2006. Vol. 80. P. 261-266.

93. Fujita S., Kitagawa H., Ishizawa H., Suzuki T., Kitani K. Age associated alterations in hepatic glutathione S-transferase activities // Biochem. Pharmacol. 1985. Vol.34. N 21. P. 3891-3894.

94. Gadagbui B.K.M., James M.O. Activities of affinity-isolated glutathione S-transferase (GST) from channel catfish whole intestine // Aquatic Toxicology. 2000. Vol. 49. P. 27-37.

95. Gallagher E.P., Di Giulio R.T. A comparison of glutathione-dependent enzymes in liver, gills and posterior kidney of channel catfish (Ictalurus punctatus) II Camp. Biochem. Physiol. 1992. Vol. 102C, N 3. P. 543-547.

96. Gallagher E.P., Gross T.S., Sheehy K.M. Decreased glutathione S-transferase expression and activity and altered sex steroids in Lake Apopka brown bullheads (Ameiurus nebulosus) // Aquat. Toxicol. 2001. Vol. 55. N 3-4. P. 223237.

97. Gallagher E.P., Stapleton P.L., Slone D.H., Schlenk D., Eaton D.L. Channel catfish glutathione S-transferase isienzyme activity toward (±)-anti-benzo[a]pyrene-trans-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide // Aquatic Toxicology. 1996. Vol. 34. P. 135-150.

98. George S.G., Buchanan G. Isolation, properties and induction of plaice liver cytosolic glutathione-S-transferases // Fish Physiology and Biochemistry. 1990. Vol. 8. N 6. P. 437-449.

99. George S.G., Young P. Purification and properties of plaice liver cytosolc glutathione-S-transferases // Marine Environmental Research. 1988. Vol. 24. P. 9396.

100. Goldstein J., Combes B. Spectrophotometric assay of liver enzyme that catalyzes sulfobromophthalein-glutathione conjugation // J. Lab. and Clin. Med. 1966. Vol 67. N 5. P. 863-872.

101. González J.F., Reimschuessel R., Shaikh B., Kane A.S. Kinetics of hepatic phase I and II biotransformation reactions in eight finfish species // Mar. Environ. Res. 2009. Vol. 67. N4-5. P. 183-188.

102. Gravato C., Santos M.A. Dicentrarchus labrax biotransformation and genotoxicity responses after exposure to a secondary treated industrial/urban effluent // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2003. Vol. 55. N 3. P. 300-306.

103. Greco L, Capri E, Rustad T. Biochemical responses in Salmo salar

118

muscle following exposure to ethynylestradiol and tributyltin // Chemosphere. 2007. Vol. 68. N 3. P. 564-571.

104. Habig W. H., Pabst M. J., Jakoby W. B. Glutathione S-Transferases.The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. of Biol. Chem. 1974. Vol. 249. N 22. P. 7130-7139.

105. Harman D. Free radical theory of aging: dietary implication // The American Journal of Clinical Nutrition. 1972. Vol. 25. P. 839-843.

106. Hatayama I., Satoh K., Sato K. Developmental and normal regulation of the major form of hepatic glutation S-transferase in male mice // Biochemical and Biophysical research communications. 1986. Vol. 140. N 2. P. 581-588.

107. Hayes J. D., Strange R. C. Invited commentary potential contribution of the glutathione S-transferase supergene family to resistance to oxidative stress // Free Radical Research. 1995. V. 22. N 3. P. 193-207.

108. Hayes J., Pulford D. The glutathione S-transferase supergene family: regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1995. Vol. 30. N 6. P. 445-600.

109. Hayes J., Strange R.C. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences // Pharmacology 2000. N 61. P. 154-166.

110. Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowsey I.R. Glutathione transferases // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. Vol. 45. P. 51-88.

111. Hayes J.D., Mantle T.J. Anomalous electrophoretic behaviour of the glutathione S-transferase Ya and Yk subunits isolated from man and rodents. A potential pitfall for nomenclature // Biochem. J. 1986. Vol. 237 P. 731-740.

112. Higgins L.G., Hayes J.D. Mechanisms of induction of cytosolic and microsomal glutathione transferase (GST) genes by xenobiotics and proinflammatory agents // Drug Metabolism Reviews. 2011. Vol. 43. N 2. P. 92-137.

113. Huang D.J., Zhang Y.M., Song G., Long J., Liu J.H., Ji W.H. Contaminants-induced oxidative damage on the carp Cyprinus carpio collected from the upper Yellow River, China // Environ. Monit. Assess. 2007. Vol. 128. N

119

1-3. P. 483-488.

114. Huang Q., Liang L., Wei T., Zhang D., Zeng Q.-Y. Purification and partial characterization of glutathione transferase from the teleost Monopterus albus //Comparative Biochemistry and Physiology. 2008. Part C. Vol. 147. N 1. P. 96-100.

115. Hughes E.M., Gallagher E.P. Effects of 17-beta estradiol and 4-nonylphenol on phase II electrophilic detoxification pathways in largemouth bass (Micropterus salmoides) liver // Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2004. Vol. 137. N 3. P. 237-247.

116. Iscan M., Coban, T., Eke B.C., Iscan, M.Y. Differential responses of hepatic monooxygenases and glutathione S-transferases of mice to a combination of cadmium and nickel // Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 1995. V. 111. N l.P. 61-68.

117. Ivarsson Y., Mackey A.J., Edalat M., Pearson W.R., Mannervik B. Identification of residues in glutathione transferase capable of driving functional diversification in evolution. A novel approach to protein redesign // The Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278. N 10. P. 8733-8738.

118. Jakoby W.B., Ziegler D.M. The enzymes of detoxication // The journal of biological chemistry. 1990. Vol. 265. N 34. P. 20715-20718.

119. Jiménez-Tenorio N., Salamanca M.J., Garcia-Luque E., Gonzalez de Canales M.L., Delvalls T.A. Chronic bioassay in benthic fish for the assessment of the quality of sediments in different areas of the coast of Spain impacted by acute and chronic oil spills // Environ Toxicol. 2008. Vol. 23. N 5. P. 634-642.

120. Ketley J.N., Habig W.H., Jacoby W.B. Binding of nonsubstrate ligands to the glutathione S-transferases // The Journal of Biological Chemistry. 1975. Vol. 250. N 22. P. 8670-8673.

121. Ketterer B., Harris J.M., Talaska G., Meyer D.J., Pemble S.E., Taylor

J.B. Lang N.P., Kadlubar F.E. The human glutathione S-transferase supergene

family, its polymorphism, and its effects on susceptibility to lung cancer //

Environmental Health Perspectives. 1992. Vol. 98. P. 87-94.

120

122. Ketterer B., Tipping E., Meuwissen J., Beale D. Ligandin // Biochem Soc Trans. 1975. Vol. 3. N 5. P. 626-630.

123. Kim J.-H., Raisuddin S., Rhee J.-S., Lee Y.-M., Han K.-N., Lee J.-S. Molecular cloning, phylogenetic analysis and expression of a MAPEG superfamily gene from the pufferfish Takifugu obscurus II Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2009. V. 149. P. 358-362.

124. Kolayli S., Keha E. A comparative study of antioxidant enzyme activities in freshwater and seawater-adapted rainbow trout // J. Biochem. Molecular Toxicology. 1999. Vol. 13. N 6. P. 334-337.

125. Konishi T, Kato K, Araki T, Shiraki K, Takagi M, Tamaru Y. Molecular cloning and characterization of alpha-class glutathione S-transferase genes from the hepatopancreas of red sea bream, Pagrus major // Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2005. Vol. 140. N 3-4. P. 309-320.

126. Konishi T., Kato K., Araki T., Shiraki K., Takagi M., Tamaru Y. A new class of glutathione S-transferase from the hepatopancreas of the red sea bream Pagrus major // Biochem. J. 2005. Vol. 388. P. 299-307.

127. Kopecka J., Pempkowiak J. Temporal and spatial variations of selected biomarker activities in flounder (Platichthys flesus) collected in the Baltic proper // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2008. Vol.70. N 3. P.379-391.

128. Krca S., Zaja R., Calic V., Terzic S., Grubesic M. S., Ahel M., Smital T. Hepatic biomarker responses to organic contaminants in feral chub (leuciscus cephalus)—laboratory characterization and field study in the Sava river, Croatia // Environmental Toxicology and Chemistry. 2007. Vol. 26. N 12. P. 2620-2633.

129. Kumari S., Panjabi V.S., Kushwaha H. R., Sopory S. K., Singla-Pareek S. L., Pareek A. Transcriptome map for seedling stage specific salinity stress response indicates a specific set of genes as candidate for saline tolerance in Oryza sativa L. II Funct. Integr. Genomics. 2009. Vol. 9. P. 109-123.

130. Laemmli U.K. Cleavage of proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P 680 - 685.

131. Landi S. Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens: a review // Mutation Research. 2000. Vol. 463. P. 247-283.

132. Larose C., Canuel R., Lucotte M., Di Giulio R.T. Toxicological effects of methylmercury on walleye (Sander vitreus) and perch (Perca flavescens) from lakes of the boreal forest // Comparative Biochemistry and Physiology. 2008. Vol. 147. PartC. P. 139-149.

133. Lau, P.S., Wong, H.L., Garrigues, Ph. Seasonal variation in antioxidative responses and anticholinesterase activity in Perna viridis in eastern oceanic and western estuarine waters of Hong Kong // Cont. Shelf Res. 2004. Vol. 24. P. 1969-1987.

134. Lauren D.J., Halarnkar P.P., Hammock B.D., Hinton D.E. Microsomal and cytosolic epoxide hydrolase and glutathione S-transferase activities in the gill, liver, and kidney of the rainbow trout, Salmo gairdnery. Baseline levels and optimization of assay conditions // Biochemical Pharmacology. 1989. Vol. 38. N6. P. 881-997.

135. Laurent T.S., Killander J.A. A theory of gel filtration and its experimental verification// J. Chromotog. 1964. Vol. 14. P. 317-330.

136. Leaver M.J., Scott K., George S.G. Cloning and characterization of the major hepatic glutathione S-transferase from a marine teleost flaffish, the plaice (Pleuronectes platessa), with structural similarities to plant, insect and mammalian Theta class isoenzymes // Biochem. J. 1993. Vol. 292. P. 189-195.

137. Leaver M.J., Wright J., George S.G. Structure and expression of a cluster of glutathione S-transferase genes from a marine fish, the plaice (Pleuronectesplatessa) II Biochem. J. 1997. Vol. 321. P. 405-412.

138. Lee Y.-M., Seo J.S., Jung S.-O., Kim I.-C., Lee J.-S.Molecular cloning and characterization of 9-class glutathione S-transferase (GST-T) from the hermaphroditic fish Rivulus marmoratus and biochemical comparisons with a-class glutathione S-transferase (GST-A) // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. Vol. 346. P. 1053-1061.

139. Lehto J., Lusa M., Virkanen J., Paatero J., Varkonyi G., Heikkila R.,

122

Kashevarov B., Ieshko E. Metal pollution in lakes surrounding the kostomuksha iron mine and ore dressing mill in northwestern russia // Boreal Env. Res. 2007.

140. Liang X.-F., Li G.-G., He S., Huang Y. Transcriptional responses of alpha- and rho-class glutathione S-transferase genes in the liver of three freshwater fishes intraperitoneally injected with microcystin-LR: relationship of inducible expression and tolerance // J. Biochem. Molecular Toxicology. 2007. Vol. 21. N 5. P. 289-298.

141. Liao W.-Q., Liang X.-F., Wang L., Lei L.-M., Han B.-P. Molecular Cloning and Characterization of Alpha-Class Glutathione ^-Transferase Gene from the Liver of Silver Carp, Bighead Carp, and Other Major Chinese Freshwater Fishes // J. Biochem Molecular Toxicology. 2006. Vol. 20. N 3. P. 114-126.

142. Lindstrom-Seppa P. Biomonitoring of oil spill in a boreal archipelago by xenobiotic biotransformation in perch (Perca fluviatilis) II Ecotoxicol. Environ. Saf. 1988. Vol. 15. N 2. P. 162-170.

143. Lindstrom-Seppa P. Biotransformation in fish: monitoring inland water pollution caused by pulp and paper mill effluents // Publications of the University of Kuopio. 1990.

144. Lindstrom-Seppa P., Oikari A. Biotransformation and other physiological Responses in whitefish caged in lake receiving pulp and paper mill effluents //Ecotoxycol. Environ. Saf. 1989. Vol. 18. P.191-203.

145. Litwack G., Ketterer B., Arias I.M. Ligandin: a hepatic protein which binds steroids, bilirubin, carcinogens and a number of exogenous organic anions // Nature. 1971 Vol. 234.P.466-467.

146. Liu H., Wang W., Zhang J., Wang X. Effects of copper and its ethylenediaminetetraacetate complex on the antioxidant defenses of the goldfish, Carassius auratus II Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006. V. 65. № 3. P.350-354.

147. Lopes P.A., Pinheiro T., Santos M.C., da Luz Mathias M., Collares-Pereira M.J., Viegas-Crespo A.M. Response of antioxidant enzymes in freshwater fish populations (Leuciscus alburnoides complex) to inorganic pollutants exposure // Sci. Total. Environ. 2001. V. 280. № 1-3. P.153-163.

123

148. Lushchak V.I., Bagnyukova T.V. Temperature increase results in oxidative stress in goldfish tissues. 2. Antioxidant and associated enzymes // Comparative Biochemistry and Physiology. 2006. Vol. 143. Part C. P. 36-41.

149. Mannervik B., Alin P., Guthenberg C., Jensson H., M. Kalim Tahir, Warholm M., Jornvall H. Identification of three classes of cytosolic glutathione transferase common to several mammalian species: Correlation between structural data and enzymatic properties // Proc. Nati. Acad. Sci.1985. Vol. 82. P. 7202-7206

150. Marrs K.A.The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1996. Vol. 47. P.127-158.

151. Martínez-Álvarez R.M., Hidalgo M.C., Domezain A., Morales A.E., García-Gallego M., Sanz A. Physiological changes of sturgeon Acipenser naccarii caused by increasing environmental salinity // The Journal of Experimental Biology. 2002. Vol. 205. P. 3699-3706.

152. Martínez-Gómez C., Campillo J.A., Benedicto J., Fernández B., Valdés J., García I., Sánchez F. Monitoring biomarkers in fish (Lepidorhombus boscii and Callionymus lyra) from the northern Iberian shelf after the Prestige oil spill // Mar. Pollut. Bull. 2006. Vol. 53. N 5-7. P.305-314.

153. Martinez-Lara E., Leaver M., George S. Evidence from heterologous expression of glutathione S-transferases A and Al of the plaice (Pleuronectes platessa) that their endogenous role is in detoxification of lipid peroxidation products // Environmental Research. 2002. Vol. 54. P. 263-266.

154. Mdegela R.H., Myburgh J., Correia D., Braathen M., Ejobi F., Botha C., Sandvik M., Skaare J.U. Evaluation of the gill filament-based EROD assay in African Sharptooth Catfish (Ciarías gariepinus) as a monitoring tool for waterborne PAH-type contaminants // Ecotoxicology. 2006a. Vol. 15. P. 51-59.

155. Mdegela R.H., Braathen M., Correia D., Mosha R.D., Skaare J.U., Sandvik M. Influence of 17a-ethynylestradiol on CYP1A, GST and biliary FACs responses in male African sharptooth catfish (Ciarías gariepinus) exposed to waterborne Benzo[a]Pyrene // Ecotoxicology. 20066. Vol.15. N 8. P. 629-637.

156. Melgar Riol M.J., Nóvoa-Valiñas M.C., García Fernández M.A., Pérez-López M. Glutathione ^-transferases from rainbow trout liver and freshly isolated hepatocytes: purification and characterization // Comparative Biochemistry and Physiology. 2001. Vol. 128. Part C. P. 227-235.

157. Mitchell A.E., Morin D., Lakritz J., Jones A.D. Quantitative profiling of tissue- and gender-related expression of glutathione S-transferase isoenzymes in the mouse // Biochem. J. 1997. Vol. 325. P. 207-216.

158. Monferran M.V., Pesce S.F., Cazenave J., Wunderlin D.A. Detoxification and antioxidant responses in diverse organs of Jenynsia multidentata experimentally exposed to 1,2- and 1,4-dichlorobenzene // Environ. Toxicol. 2008. Vol. 23. N 2. P.184-192.

159. Monteiro M., Quintaneiro C., Nogueira A.J., Morgado F., Soares A.M., Guilhermino L. Impact of chemical exposure on the fish Pomatoschistus microps Kr0yer (1838) in estuaries of the Portuguese Northwest coast // Chemosphere. 2007. Vol. 66. N3. P. 514-522.

160. Moriwaki H., Osborne M.R., Phillips D.H. Effects of mixing metal ions on oxidative DNA damage mediated by a Fenton-type reduction // Toxicol. In Vitro. 2008. Vol. 22. P. 36^14.

161. Morozov A., Chuiko G., Podgornaya V., Brodsky E. Antioxidant System in the Liver of Bream (Abramis brama L.) from the Rybinsk Reservoir as Bioindicator of Environmental Pollution With Poly chlorinated Biphenyls // Fourth International Conference on Water Observation and Information System for Decision Support"BALWOIS 2010": Abstracts and Proceedings. Ohrid, 2010. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://balwois.com/balwois/administration/full_paper/ffp-1772.pdf

162. Napierska D., Kopecka J., Podolska M., Pempkowiak J. Hepatic glutathione S-transferase activity in flounder collected from contaminated and reference sites along the Polish coast // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006. Vol. 65. N 3. P. 355-363.

163. Napierska D., Podolska M. Biomarkers of contaminant exposure:

125

results of a field study with flounder (Platichthys flesus) from the southern Baltic Sea // Mar. Pollut. Bull. 2005. Vol. 50. N 7. P. 758-767.

164. Noble J.E., Bailey M.J.A. Quantitation of proteins // Methods in enzymology. 2009. Vol. 463. P. 73-95.

165. Novoa-Valinas M.C., Perez-Lopez M., Melgar M.J. Comparative study of the purification and characterization of the cytosolic glutathione S-transferases from two salmonid species: Atlantic salmon (Salmo salar) and brown trout (Salmo trutta) // Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2002. Vol. 131. N2. P. 207-213.

166. Oliveira M., Pacheco M., Santos M.A.. Organ specific antioxidant responses in golden grey mullet (Liza aurata) following a short-term exposure to phenanthrene // Science of the Total Environment. 2008. Vol. 396. P. 70-78.

167. Otto D.M., Moon T.W. Phase I and II enzymes and antioxidant responses in different tissues of brown bullheads from relatively polluted and non-polluted systems // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1996. Vol. 31. N 1. P. 141147.

168. Pabst M.J., Habig W.H., Jakoby W.B. Glutathione S-transferase A. A novel kinetic mechanism in which the major reaction pathway depends on substrate concentration // The Journal of Biological Chemistry. 1974. Vol. 249. N 22. P. 7140-7150.

169. Padros J., Pelletier E., Ribeiro C.O. Metabolic interactions between low doses of benzo[a]pyrene and tributyltin in arctic charr (Salvelinus alpinus): a long-term in vivo study // Toxicology and Applied Pharmacology. 2003. Vol. 192. P. 45-55.

170. Pandey S., Parvez S., Ansari R.A., Ali M., Kaur M., Hayat F., Ahmad F., Raisuddin S. Effects of exposure to multiple trace metals on biochemical, histological and ultrastructural features of gills of a freshwater fish, Channa punctata Block // Chem. Biol. Interact. 2008. Vol. 174. N 3. P. 183-192.

171. Pangrecar J., Sikka H.C. Xenobiotic metabolizing enzyme activity in

the liver and kidney of the broun bullhead {Ictalurus nebulosus) II Marine

126

Enironmental Research. 1992. Vol. 34. P. 287-291.

172. Pathiratne A., Chandrasekera L.W., Pathiratne K.A. Use of ' biomarkers in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) to assess the impacts of

pollution in Bolgoda Lake, an urban water body in Sri Lanka // Environ. Monit Assess. 2009. Vol. 156. P. 361-365.

173. Pérez-Lôpez M., Anglade P., Bec-Ferté M.P., Debrauwer L., Perdu E., Cravedi J.P., Rouimi P. Characterization of hepatic and extrahepatic glutathione S-transferases in rainbow trout (Onchorhynchus my kiss) and their induction by 3,3',4,4'-tetrachlorobiphenyl // Fish Physiology and Biochemistry. 2000. N 22. P. 21-32.

174. Pérez-Lôpez M., Nôvoa Valinas M.C., Melgar Riol M.J. Induction of cytosolic glutathione S-transferases from Atlantic eel (Anguilla Anguilla) after intraperitoneal treatment with polychlorinated biphenyls // Sci. Total. Environ. 2002a. Vol. 297. N 1-3. P.141-151.

175. Pérez-Lôpez M., Nôvoa-Valinas M.C., Melgar-Riol M.J. Glutathione S-transferase cytosolic isoforms as biomarkers of polychlorinated biphenyl (Arochlor-1254) experimental contamination in rainbow trout // Toxicol. Lett. 20026. Vol. 136. N 2. P. 97-106.

176. Pham R.T., Gardner J.L., Gallagher E.P. Conjugation of 4-hydroxynonenal by largemouth bass (Micropterus salmoides) glutathione S-transferases // Marine Environmental Research. 2002. Vol. 54. P. 291-295.

Ill. Porte C., Escarpin E., Garcia de la Parra L.M., Biosca X., Albaigés J. Assessment of coastal pollution by combined determination of chemical and biochemical markers in Mullus barbatus // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2002. Vol. 235. P. 205-216.

178. Qian Y., Yin D., Li Y., Wang J., Zhang M., Hu S. Effects of four chlorobenzenes on serum sex steroids and hepatic microsome enzyme activities in crucian carp, Carassius auratus II Chemosphere. 2004. Vol. 57. N 2. P.127-133.

179. Rabahi F., Brûlé S., Sirois J., Beckers J.F., Silversides D.W., Lussier J.G. High expression of bovine alpha glutathione S-transferase (GSTA1, GSTA2)

127

subunits is mainly associated with steroidogenically active cells and regulated by gonadotropins in bovine ovarian follicles // Endocrinology. 1999. Vol. 140. N 8. P. 3507-3517.

180. Ramage P. I. N., Nimmo I.A. The substrate specificities and subunit compositions of the hepatic glutathione S-transferases of rainbow trougt (Salmo gairdnery) II Comp. Biochem. physiol. 1984. Vol. 78B! N 1. P. 189-194.

181. Ramage P. I. N., Rae G. H. and Nimmo I. A. Purification and properties of the hepatic glutathione ^-transferases of the atlantic salmon (Salmo salar) // Comp. Biochem. Physiol. Vol. 83B. 1986. N 1. P. 23-29.

182. Raza H., Robin M.-A., Fang Ji-k., Avadhani N.G. Multiple isoforms of mitochondrial glutathione S-transferases and their differential induction under oxidative stress // Biochem. J. 2002. Vol. 366. P. 45-55.

183. Rushmore T.H., Pickett C.B. Glutathione S-transferases, structure, regulation, and therapeutic implications // The Journal of Biological Chemistry. 1993. Vol. 268. N 16. P. 11475-11478.

184. Ruus A., Sandvik M., Ugland K.I., Skaare J.U. Factors influencing activities of biotransformation enzymes, concentrations and compositional patterns of organochlorine contaminants in members of a marine food web // Aquat. Toxicol. 2002. Vol. 61. N 1-2. P.73-87.

185. Salinas A.E., Wong M.G. Glutathione S-transferases - A review // Current Medicinal Chemistry. 1999. Vol. 6. P. 279-309.

186. Schmidt K., Steinberg C.E., Pflugmacher S., Staaks G.B. Xenobiotic substances such as PCB mixtures (Aroclor 1254) and TBT can influence swimming behavior and biotransformation activity (GST) of carp (Cyprinus carpio) II Environ. Toxicol. 2004. Vol. 19. N 5. P. 460-470.

187. Sen A., Semiz A. Effects of metals and detergents on biotransformation and detoxification enzymes of leaping mullet (Liza saliens) II Ecotoxicol. Environ. Saf. 2007. Vol. 68. N 3. P. 405-411.

188. Setlikova I., Wiegand C. Hepatic and branchial glutathione S-

transferases of two fish species: Substrate specificity and biotransformation of

128

microcystin-LR // Comparative Biochemistry and Physiology. 2009. Part C. N 149. P.515-523

189. Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A. Structure, function and evolution of glutathione transferases : implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily // Biochem. J. 2001. Vol. 360. P. 1-16.

190. Silva C.A., Oliveira Ribeiro C.A., Katsumiti A., Araújo M.L., Zandoná E.M., Costa Silva G.P., Maschio J., Roche H., Silva de Assis H.C. Evaluation of waterborne exposure to oil spill 5 years after an accident in Southern Brazil // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2009. Vol. 72. N 2. P. 400-409.

191. Simonato J.D., Guedes C.L., Martinez C.B. Biochemical, physiological, and histological changes in the neotropical fish Prochilodus lineatus exposed to diesel oil // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2008. Vol. 69. N 1. P. 112-120.

192. Simons P.C. and Vander Jagt D.L. Purification of glutathione S-transferase from human liver by glutathione-affinity chromatography // Analytical biochemistry. 1977. Vol. 82. P. 334-341.

193. Singhal S.S, Saxena M., Awasthi S., Mukhtar H., Zaidi S.I.A., Ahmad H., Awasthi Y.C. Glutathione S-transferases fhuman skin: qualitative and quantitative differences in men and women // Biochimica Biophysica Acta. 1993. Vol. 1163. P. 266-272.

194. Solé M., Rodríguez S., Papiol V., Maynou F., Cartes J.E.. Xenobiotic metabolism markers in marine fish with different trophic strategies and their relationship to ecological variables // Comparative Biochemistry and Physiology. 2009. Vol. 149. Part C. P. 83-89.

195. Song S.B., Xu Y., Zhou B.S. Effects of hexachlorobenzene on antioxidant status of liver and brain of common carp (Cyprinus carpió) // Chemosphere. 2006. Vol. 65. N 4. P. 699-706.

196. Stalker M.J., Kirby G.M., Kocal T.E., Smith I.R., Hayes M.A. Loss of glutathione S-transferases in pollution-associated liver neoplasms in white suckers (Catostomus commersoni) from Lake Ontario // Carcinogenesis. 1991. Vol. 12. N

129

12. P. 2221-2226.

197. Stanley J. S., Benson A.M. The conjugation of 4-nitroquinoline 1-oxide, a potent carcinogen, by mammalian glutathione transferases // Biochem. J. 1988. Vol. 256. P. 303-306.

198. Stien X., Percic P., Gnassia-Barelli M., Roméo M., Lafaurie M. Evaluation of biomarkers in caged fishes and mussels to assess the quality of waters in a bay of the NW Mediterranean Sea // Environ. Pollut. 1998. Vol. 99. N 3. P. 339-345.

199. Strange R.C., Spiteri M.A., Ramachandran S., Fryer A.A. Glutathione-S-transferase family of enzymes // Mutation Research. 2001. Vol. 482. P. 21-26.

200. Sturve J., Hasselberg L., Faith H., Celander M., Fôrlin L. Effects of North Sea oil and alkylphenols on biomarker responses in juvenile Atlantic cod 0Gadus morhua) II Aquat. Toxicol. 2006. Vol. 78. P. 73-78

201. Sugiyama Y.,Yamada T., Kaplowitz N. Glutathione S-transferases in elasmobranch liver. Molecular heterogeneity, catalytic and binding properties, and purification // Biochem. J. 1981. Vol. 199. P. 749-756.

202. Tan K.H., Meyer D.J., Gillies N., Ketterer B. Detoxification of DNA hydroperoxide by glutathione transferases and the purification and characterization of glutathione transferases of the rat liver nucleus // Biochem. J. 1988. Vol. 254. P. 841-845.

203. Taysse L., Chambras C., Marionnet D., Bosgiraud C., Deschaux P. Basal level and induction of cytochrome P450, EROD, UDPGT, and GST activities in carp (Cyprinus carpio) immune organs (spleen and head kidney) // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1998. Vol. 60. P. 300-305.

204. Townsend D.M., Kenneth D.T. Cancer drugs, genetic variation and the glutathione-S-transferase gene family // Am. J. Pharmacogenomics. 2003. Vol. 3.N3. P. 167-172.

205. Trute M., Gallis B., Doneanu C., Shaffer S., Goodlett D., Gallagher E.

Characterization of hepatic glutathione ^-transferases in coho salmon

130

(iOncorhynchus kisutch) // Aquatic Toxicology. 2007. Vol 81. P. 126-136.

206. Tuvikene A., Huuskonen S., Koponen K., Ritola O., Mauer U., Lindstrom-Seppa P. Oil shale processing as a source of aquatic pollution: monitoring of the biologic effects in caged and feral freshwater fish // Environ. Health Perspect. 1999. Vol. 107. N 9. P.745-752.

207. Udomsinprasert R., Pongjaroenkit S., Wongsantichon J., Oakley A.J., Prapanthadara L., Wilce M.C.J., Ketterman A.J. Identification, characterization and structure of a new Delta class glutathione transferase isoenzyme // Biochem. J. 2005. Vol. 388. P. 763-771.

208. Uguz C., Iscan M., Ergiiven A., Isgor B., Togan I. The bioaccumulation of nonyphenol and its adverse effect on the liver of rainbow trout 0Onchorynchus mykiss) II Environ. Res. 2003. Vol. 92. N 3. P. 262-270.

209. Vaccaro E., Meucci V., Intorre L., Soldani G., Di Bello D., Longo V., Gervasi P.G., Pretti C. Effects of 17beta-estradiol, 4-nonylphenol and PCB 126 on the estrogenic activity and phase 1 and 2 biotransformation enzymes in male sea bass (Dicentrarchus labrax) II Aquat. Toxicol. 2005. Vol. 75. N 4. P. 293-305.

210. Van der Oost R., Beyer J., Vermeulen P.E. Fish Bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2003. Vol. 13. P. 57-149.

211. Van Schanke A., Holtz F., van der Meer J.P., Boon J.P., Ariese F., Stroomberg G., van den Berg M., Everaarts J.M. Dose- and time-dependent formation of biliary benzo[a]pyrene metabolites in the marine flatfish dab (Limanda limanda) //Environ. Toxicol. Chem. 2001. Vol. 20. N 8. P. 1641-1647.

212. Varanasi U., Stein J.E., Nishimoto M., Reichert W.L., Collier T.K. Chemical Carcinogenesis in Feral Fish: Uptake, Activation, and Detoxication of Organic Xenobiotics // Environ. Health Perspect. 1987. Vol. 71. P. 155-170.

213. Vieira L.R., Sousa A., Frasco M.F., Lima I., Morgado F., Guilhermino L. Acute effects of Benzo[a]pyrene, anthracene and a fuel oil on biomarkers of the common goby Pomatoschistus microps (Teleostei, Gobiidae) II Sci. Total. Environ. 2008. Vol. 395. N 2-3. P. 87-100.

214. Vigano L., Arilloi A., Falugi C., Melodia F., Polesello S. Biomarkers of exposure and effect in flounder (Platichthys flesus) exposed to sediments of the Adriatic sea // Mar. Pollut. Bull. 2001. Vol. 42. N 10. P. 887-894.

215. Walker P.A., Bury N.R., Hogstrand C. Influence of culture conditions on metal-induced responses in a cultured rainbow trout gill epithelium // Environ. Sci. Technol. 2007. Vol. 41. N 18. P. 6505-6513.

216. Wang C., Zhao Y., Zheng R., Ding X., Wei W., Zuo Z., Chen Y. Effects of tributyltin, benzo[a]pyrene, and their mixture on antioxidant defense systems in Sebastiscus marmoratus // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006. V. 65. N 3. P. 381-387.

217. Wolkoff A.W., Ketley J.N., Waggoner J.G., Berk P.D., Jakoby W.B. Hepatic accumulation and intracellular binding of conjugated bilirubin // J. Clin. Invest. 1978. Vol. 61. N 1. P. 142-149.

218. Wu Y.Q., Wang C.G., Wang Y., Zhao Y., Chen Y.X., Zuo Z.H. Antioxidant responses to benzo[a]pyrene, tributyltin and their mixture in the spleen of Sebasticus marmoratus II J. Environ. Sci. 2007. Vol. 19. N 9. P. 1129-1135.

219. Xu L., Chen J., Zhang Y., Cheung C.C., Lam P.K. Biomarker studies on gold-lined sea bream (Rhabdosargus sarba) exposed to benzo[a]pyrene // Water. Sci. Technol. 2001. Vol. 43. N 2. P. 155-160.

220. Yang Y., Sharma R., Sharma A., Awasthi S., Awasthi Y.C. Lipid peroxidation and cell cycle signaling: 4-hydroxynonenal, a key molecule in stress mediated signaling // Acta Biochimica Polonica. 2003. Vol. 50. N 2. P. 319-336.