Иммунная и детоксицирующая системы насекомых при развитии различных типов микозов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.05, кандидат биологических наук Ярославцева, Ольга Николаевна

• Ярославцева, Ольга Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ярославцева, Ольга Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микозы насекомых

1.1.1. Краткая историческая справка

1.1.2. Морфо-биологические и систематические группы энтомопатогенных аскомицетов

1.1.3. Систематическое положение МегагЫгшт шшорИае и близких видов грибов

1.1.4. Основные особенности биологии М. сишорИае и близких видов грибов

1.1.5. Механизм проникновения энтомопатогенных грибов через кутикулу и их развитие в полости тела хозяев

1.2. Механизмы резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам

1.2.1. Внешние барьеры насекомых

1.2.2. Детоксицирующая система насекомых

1.2.2.1. Монооксигеназы

1.2.2.2. Неспецифические эстеразы

1.2.2.3. Глутатион-Б-трансферазы

1.2.2.4. Роль ферментов детоксицирующей системы

насекомых

1.2.3. Иммунитет насекомых

1.2.3.1. Клеточный иммунитет

1.2.3.2. Гуморальный иммунитет

1.3. Факторы, влияющие на течение микозов

насекомых

1.3.1. Дозы конидий и вирулентные свойства 46 штаммов

1.3.2. Влияние сопутствующих инфекций

1.3.3. Влияние абиотических факторов среды

1.3.4. Влияние химических инсектицидов

1.4. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Насекомые

2.2. Грибы

2.3. Бактерии

2.4. Инсектициды

2.5. Заражение насекомых

2.6. Оценка токсичности культуральной жидкости штаммов Metarhizium anisopliae

2.7. Измерение активности детоксицирующих ферментов, параметров клеточного и гуморального иммунитета

2.8. Объемы выборок и статистическая обработка

данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Активность ферментов детоксицирующей системы личинок Locusta migratoria при микозах, вызванных разными дозами инфекции Metarhizim anisopliae

3.1.1. Динамика смертности насекомых

3.1.2. Активность ферментов детоксицирующей системы

3.1.3. Обсуждение результатов

3.2. Активность ферментов детоксицирующей системы и уровень инкапсуляции нейлоновых имплантантов в организме личинок Leptinotarsa decemlineata и Locusta migratoria при микозах, вызванных штаммами с различным уровнем токсинообразования

3.2.1. Токсигенные и патогенные свойства штаммов

3.2.2. Защитные механизмы насекомых при заражении штаммами М. атБОрНае

3.2.3. Обсуждение результатов

3.3 Активность ферментов детоксицирующей системы и интенсивность инкапсуляции у личинок Leptinotarsa decemlineata при смешанной бактериально-грибной инфекции, вызванной Metarhizim anisopliae и Bacillus

thuringiensis var. tenebrionis

3.3.1. Динамика смертности насекомых

3.3.2. Защитные реакции насекомых

3.3.3. Обсуждение результатов

3.4. Активность фенолоксидазы в кутикуле и интенсивность инкапсуляции у личинок Gallería mellonella при микозах, протекающих в условиях разных температур

3.4.1. Динамика смертности насекомых

3.4.2. Защитные реакции насекомых

3.4.3. Обсуждение результатов

3.5. Активность ферментов детоксицирующей системы и интенсивность инкапсуляции у личинок Leptinotarsa

decemlineata при совместной обработке фосфорорганическим

инсектицидом и заражении Metarhizim

ат8орНае

3.5.1. Динамика смертности насекомых

3.5.2. Защитные реакции насекомых

3.5.3. Обсуждение результатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунная и детоксицирующая системы насекомых при развитии различных типов микозов»

ВВЕДЕНИЕ

На популяционную динамику численности насекомых влияют различные факторы абиотической и биотической природы. Из биотических факторов существенную роль играют различные патогены. Среди последних можно выделить энтомопатогенные грибы, с которыми насекомые тесно контактируют в биоценозах. В процессе коэволюции у насекомых возник ряд защитных приспособлений, препятствующих или ограничивающих проникновение грибов и их развитие в организме хозяев.

Первым физическим и химическим барьером на пути проникновения грибов в организм насекомых является кутикула. На поверхности кутикулы, в эпикутикуле содержатся различные соединения (воска, жиры, жирные кислоты), препятствующие адгезии и росту грибов. Кроме того, в кутикуле насекомых присутствуют различные ферменты, способные предотвратить развитие грибов. В первую очередь, это ряд ферментов, объединенных в профенолоксидазный каскад, при активации которого запускается меланогенез. В результате этих ферментативных реакций образуется меланин, обладающий высокой прочностью, химической устойчивостью и способствующий локализации проникшего паразита. Кроме того, при меланогенезе образуются семихиноновые радикалы, которые являются токсичными для патогенов.

При развитии микоза в организме насекомых активизируются системы клеточного (фагоцитоз, инкапсуляция, гранулообразование) и гуморального (антимикробные белки, коагуляция, фенолоксидазы (ФО)) иммунитета. Одной из важных реакций иммунитета является инкапсуляция - процесс, при котором патоген заключается в капсулу, образуемую гемоцитами, с последующей меланизацией (Rosales, 2011). В организме насекомого грибы продуцируют ряд ферментов и токсинов, способных разрушать различные ткани и органы хозяев. В деградации и инактивации данных метаболитов грибов могут принимать участие

детоксицирующие ферменты: глутатион-Б-трансферазы, эстеразы и монооксигеназы (Серебров и др., 2003).

Анаморфный аскомицет Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin является одним из наиболее распространенных энтомопатогенных грибов. Он способен поражать сотни видов насекомых из разных отрядов. Кроме того, данный гриб активно используется во всем мире для создания микоинсектицидных препаратов (Charnley, Collins, 2007; Wraight et al., 2007).

Восприимчивость насекомых к энтомопатогенным грибам зависит от ряда факторов. В первую очередь, это свойства самого патогена, определяющие его агрессивность (продукция ферментов, токсинов и др.). Во-вторых, это количество инфекционного начала, необходимое для успешного заражения насекомых. Перечисленные факторы могут влиять на характер микозов, которые протекают по-разному: от вялотекущих до быстроразвивающихся - с максимальной гибелью в первые несколько суток после заражения. При этом остается мало изученным вопрос о роли иммунной и детоксицирующей систем организма насекомого при развитии различных типов грибной инфекции.

Кроме того, на патогенез микозов может оказывать сильное влияние фоновая зараженность хозяев другими энтомопатогенами. Учитывая, что смешанные инфекции чрезвычайно широко распространены в природе, они могут существенно влиять на численность популяций хозяев. Исследования в этой области ранее проводились с целью создания комбинированных биопрепаратов (Bajan, Kmitowa, 1972; Lewis, Bing, 1991; Costa et al., 2001; Wraight, Ramos, 2005; Lednev et al. 2008; Mwamburi et al., 2009). Однако, защитные механизмы насекомых при смешанных инфекциях практически не изучены.

Успешное инфицирование насекомых энтомопатогенными грибами и дальнейшие развитие микоза зависит от абиотических факторов среды, в особенности от температуры и влажности (Vidal, Fargues, 2007). При этом

оптимальные условия для развития патогена и насекомого могут не совпадать, что в свою очередь либо ускоряет, либо замедляет развитие микоза. Так, при оптимальных условиях, насекомые могут быть более устойчивы к инфекции вплоть до полного «выздоровления» (Blanford et al., 2000; Ouedraogo et al., 2004). Остается открытым вопрос о механизмах устойчивости насекомых к патогенам при различных гигротермических режимах.

Помимо биотических и абиотических условий значительное воздействие на течение микозов могут оказывать и различные антропогенные факторы. Начиная с середины XX века, исследователи обнаружили синергистическое действие между энтомопатогенными грибами и химическими инсектицидами (Теленга, 1956; Огарков, 1999; Павлюшин, 2000; Серебров и др., 2003, 2005; Delgado et al., 1999; Furlong, Groden, 2001). При этом остается малоизученным вопрос о биохимических механизмах данных синергистических эффектов (Hiromori, Nishigaki, 2001).

Цель исследования - анализ параметров клеточного и гуморального иммунитета и активности ферментов детоксицирующей системы насекомых при различных типах микозов, вызванных Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok.

Задачи:

1. Оценить активность неспецифических эстераз и глутатион-s-трансфераз у личинок азиатской саранчи Locusta migratoria при микозах, вызывающих различный уровень смертности;

2. Оценить активность неспецифических эстераз, глутатион-s-трансфераз и интенсивность инкапсуляции у личинок азиатской саранчи L. migratoria и колорадского жука Leptinotarsa decemlineata при микозах, вызванных штаммами грибов с различным уровнем токсинообразования;

3. Оценить активность неспецифических эстераз, глутатион-s-трансфераз и интенсивность инкапсуляции у личинок колорадского жука L. decemlineata при смешанной бактериально-грибной инфекции, вызванной Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni var. tenebrionis и M. anisopliae;

4. Оценить активность фенолоксидаз в кутикуле и интенсивность инкапсуляции у личинок большой вощиной огневки Galleria mellonella при развитии микозов в условиях оптимальных и субоптимальных для гусениц температур;

5. Оценить активность неспецифических эстераз, глутатион-s-трансфераз и интенсивность инкапсуляции у личинок колорадского жука L. decemlineata при обработке фосфорорганическим инсектицидом и заражении М. anisopliae.

Научная новизна. Впервые установлено, что экспрессия ферментов детоксицирующей системы в гемолимфе насекомых наблюдается только при заражении токсигенными штаммами М. anisopliae. Получены уникальные данные, свидетельствующие, что при сублетальном заражении личинок колорадского жука бактериями Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni var. tenebrionis происходит снижение интенсивности инкапсуляции, а также подавление активности ферментов детоксицирующей системы, что в свою очередь может резко снижать устойчивость личинок к энтомопатогенным грибам и служить одной из причин синергизма при смешанных бактриально-грибных инфекциях. Впервые показано, что при грибной инфекции, протекающей в условиях субоптимальных для G. mellonella температур, происходит снижение интенсивности инкапсуляции в гемолимфе и более поздняя активация фенолоксидазы в кутикуле, что может снижать устойчивость насекомых к энтомопатогенным грибам. Выявлено ингибирование неспецифических эстераз и глутатион-з-трансфераз, а также снижение интенсивности

инкапсуляции у личинок L. decemlineata на фоне низких доз фосфорорганического инсектицида, что может являться одной из причин синергистическго действия энтомопатогенных грибов и химических инсектицидов.

Практическая значимость. Выявленные синергистические эффекты в динамике смертности насекомых при совместном инфицировании М. anisopliae и В. thuringiensis, а так же при совместной обработке М. anisopliae и фосфорорганическим инсектицидом, позволяют рекомендовать данные сочетания для дальнейшей разработки препаратов, используемых в регуляции численности насекомых - вредителей сельского и лесного хозяйства. Данные, полученные при изучении жизненных стратегий энтомопатогенных грибов, могут быть использованы для создания биопрепаратов с эпизоотийным и токсическим механизмами действия.

Апробации работы. Материалы, полученные в ходе исследований, докладывались на IV Съезде Паразитологического общества РАН «Паразитология в XXI веке: проблемы, методы, решения» (Санкт-Петербург, 2008), международном симпозиуме «Биологический контроль инвазивных организмов» (Златибор, Сербия, 2009), III Межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию проф. К.П. Федорова (Новосибирск, 2009), Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010), VIII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010), Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011) и межлабораторных семинарах ИСиЭЖ СО РАН (2009, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 13 научных работ, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Крюков В. Ю., Мартемьянов В. В., Половинка М. П., Лузина О. А., Дубовский И. М., Серебров В. В., Ходырев В. П., Малярчук А. А., Гербер О. Н., Ярославцева О. Н., Боярищева Е. А., Левченко М. В., ГлуповВ.В., Салахутдинов Н. Ф., Толстиков Г. А. Усниновая кислота -перспективный синергист для биопрепаратов на основе энтомопатогенных микроорганизмов // Доклады академии наук. 2008. Т. 423. № 2. С. 279-282.

2. Крюков В. Ю., Ходырев В. П., Ярославцева О. Н., Каменова А. С. Дуйсембеков Б. А., Глупов В. В. Синергетическое действие энтомопатогенных гифомицетов и бактерий Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni при инфицировании личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata //Прик. биохим. и микробиол. 2009. Т. 45. № 5. С. 571-576.

3.Крюков В. Ю, Ярославцева О. Н., Левченко М. В., ЛедневГ. Р., ГлуповВ.В. Фенотипическая изменчивость природных изолятов энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana II Микология и фитопатология. 2009. Т. 43. Вып. 6. С. 514-521.

4. Ярославцева О. Н., Дубовский И. М., Крюков В. Ю., Ходырев В. П., ГлуповВ.В. Активность реакций клеточного иммунитета и компонентов детоксицирующей системы у личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata при развитии смешанной инфекции, вызванной грибом Metarhizium anisopliae и бактерией Bacillus thuringiensis II Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. № 1 С. 142-143.

5. Крюков В. Ю., Ярославцева О. Н., Леднев Г. Р., Борисов Б. А. Локальные эпизоотии, вызванные телеоморфными кордиципитоидными грибами (Ascomycota: Hypocreales) в популяциях лесных чешуекрылых и

пилильщиков летне-осеннего комплекса в Сибири // Микология и фитопатология. 2010. Т. 44. Вып. 4. С. 315-328.

6. Половинко Г. П., Ярославцева О. Н., Тешебаева 3. А., Крюков В. Ю. Доминирующие виды энтомофильных анаморфных аскомицетов Западной Сибири, Приморья и Киргизии // Сиб. экол. журн. 2010. №5. с. 709-716.

7. Крюков В. Ю., Леднев Г. Р., Левченко М. В., Ярославцева О. Н., Макаров Е. М., Баймагамбетов Е. Ж., Дуйсембеков Б. А., Глупов В. В. Влияние различных наполнителей на биологическую эффективность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana против саранчовых в условиях Казахстана//Агрохимия. 2010. № 12. С. 26-30.

8. Dubovskiy I. М., Kryukov V. Yu., Benkovskaya G. V., Yaroslavtseva O. N., Surina E. V., Glupov V. V. Activity of detoxificative enzymes system and encapsulation rate in Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata larvae under organophosphorus insecticide treatment and entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae infection // Euroasian Entomol. J. 2010. Vol. 9. № 4. P. 577-582.

9. Крюков В. Ю., Дубовский И. М., Ярославцева О. Н., Левченко М. В., Слямова Н. Д., Белгибаева А. Б., Ходырев В. П., Леднев Г. Р., Глупов В. В. Сравнительный анализ двух штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae с разными жизненными стратегиями // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45. Вып. 2. С. 164-176.

10. Дубовский И. М., Слямова Н. Д., Крюков В. Ю., Ярославцева О. Н., Левченко М. В., Белгибаева А. Б., Адилханкызы А., Глупов В. В. Активность неспецифических эстераз и глутатион-S-трансфераз у личинок азиатской саранчи Locusta migratoria при развитии грибной инфекции Metarhizium anisopliae //Зоол. журн. 2011. Т. 90. №11. С. 1360-1364.

Материалы конференций:

1. Ярославцева О. Н., Крюков В. Ю. Локальная эпизоотия Cordyceps militaris в Западной Сибири // Материалы V Всероссийского съезда паразитологического общества при российской академии наук «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения» СПб. 2008. Т.З. С. 245-246.

2. Ярославцева О. Н., Крюков В. Ю., Левченко М. В., ЛедневГ. Р., Ходырев В. П., ГлуповВ. В. Синергизм грибных и бактериальных патогенов при смешанных инфекциях у массовых саранчовых и колорадского жука // Материалы международного симпозиума «Биологический контроль инвазивных организмов». Сербия, Златибор. 2009. С. 64-65.

3. Ярославцева О. Н., Дубовский И. М., Крюков В. Ю., Левченко М. В., Барашкова П. В., Глупов В. В. Изменение физиологических и биохимических параметров организма насекомых при микозах, вызываемых грибами Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae И Материалы международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». СПб: Изд-во С.-Петербургского ун-та, 2011. С.182.

Благодарности. Автор выражает благодарность д.б.н., профессору В.В. Глупову (ИСиЭЖ СО РАН) за руководство научной работой, к.б.н. В.Ю. Крюкову и к.б.н. И.М. Дубовскому (ИСиЭЖ СО РАН) за помощь на всех этапах исследования, к.б.н. H.A. Крюковой (ИСиЭЖ СО РАН) за ценные замечания, сделанные при работе с рукописью. За помощь в проведении экспериментальной работы я признательна всем сотрудникам лаборатории патологии насекомых (ИСиЭЖ СО РАН), сотрудникам лаборатории биотехнологии НИИЗиКР (г. Алматы), д.б.н. Г.В. Беньковской и Е.В. Суриной (ИБиГ УНЦ РАН, г. Уфа), к.б.н. Г.Р. Ледневу, к.б.н. М.В.Левченко, П.В. Митьковец (ВИЗР РАСХН, г.

Санкт-Петербург), к.б.н. Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН), а также сотрудникам Отдела прикладной энтомологии (Swansea University, Wales, Great Britain).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микозы насекомых 1.1.1. Краткая историческая справка

Возбудители грибных инфекций насекомых были первыми из энтомопатогенных организмов, описанных в литературе. Возможно, это связано с тем, что грибные заболевания наиболее заметны (яркий цвет мицелия, образование плодовых тел). Одно из первых упоминаний об энтомопатогенных грибах в Европе относится к началу XVIII века (Вейзер, 1972). Также упоминания об энтомопатогенных грибах присутствует в древних китайских источниках, но как об обладателях целебных свойств (Holiday, Cleaver, 2008). В частности, грибы рода Cordy сер s применялись как лекарственное средство и упоминаются в легендах Китая с начала второго тысячелетия. К настоящему времени данные грибы активно исследуются, в основном как продуценты биологически активных веществ для фармакологии (Paterson, 2008; Юй и др., 2009).

Активное изучение микозов насекомых началось с работ А. Басси, который в 1835 году впервые описал гриб из рода Beauveria на гусеницах тутового шелкопряда (Борисов и др., 2001). Погибшие насекомые были покрыты белым мицелием и похожи на засахаренный фрукт или мускатные конфеты, отчего и получили свое название «белой мускардины». А. Басси также доказал, что данные грибы могут передаваться от одного насекомого к другому. В дальнейшем белая мускардина была обнаружена на многих насекомых - вредителях сельского хозяйства (Евлахова, 1974). Позже, после работ А. Баси, во второй половине XIX века микологи К. Робин, Г. Фрезениус, Ф. Кон, К.А. Бэйл, О. Брефельд, Г. Лоде сообщали о разных видах грибов, паразитирующих на насекомых (Штейнхаус, 1952). Однако приведенные

выше работы по микозам насекомых имели описательный характер. Начало же их детального изучения, в том числе и экспериментального, было положено И.И. Мечниковым в 80-х гг. XIX в, с описания «зеленой мускардины» хлебного жука Anisoplia austriaca Hrbst. - гриба Entomophtora anisopliae (позже Metarhizium anisopliae Metch. (Sorokin)). В дальнейшем И.И. Мечников совместно с И.М. Красильщиком провели работы по массовому культивированию энтомопатогенного гриба М. anisopliae и применению его на сельскохозяйственных полях против личинок и жуков свекловичного долгоносика латынь. Данные работы проводились на базе биоэнтомологической станции, организованной И.М. Красильщиком в городе Смела (Украина). Здесь проводилась массовая наработка спор М. anisopliae. Фактически это был первый завод по производству биопрепаратов для защиты растений (Вейзер, 1972).

Начиная с работ И.И. Мечникова и И.М. Красильщика, главным направлением в исследованиях энтомопатогенных аскомицетов стало создание микоинсектицидных препаратов на основе энтомопатогенных грибов и разработка различных подходов к повышению их биологической эффективности. В бывшем СССР первым грибным препаратом против насекомых стал Боверин, разработанный на основе Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Лапа, Гораль, 1985; Гештовт, 2002; Борисов и др., 2001; Штерншис, 2010). Боверин применялся против табачного трипса {Thrips tabaci Lindeman) на огурцах и томатах в условиях защищенного грунта (Боверин, ж), против белокрылок (Aleyrodidae) и некоторых видов тлей (Андреева, Штерншис, 1997), а также против колорадского жука в условиях открытого грунта (Боверин, схп). (Штерншис и др., 2004). В настоящее время наиболее известны препараты на основе энтомопатогенного гриба Metarhizium acridum, например Green Muscle, который используется для контроля массовых видов саранчовых в Австралии, Африке, Южной и Северной Америке (Lomer et al., 2001; Charnley, Collins, 2007). В США, Metarhizium используется для контроля

различных жуков, термитов, мух, комаров, клещей и трипсов (Maniania et al., 2003). В других странах виды Metarhizium используются как биологические агенты контроля личинок жуков (Scarabaeidae, Geotrupidae), пенниц (Aphrophoridae) (Milner et al 2002; Blanford et al., 2005).

Следует отметить, что применение энтомопатогенных грибов в качестве агентов биоконтроля до сих пор имеет ряд недостатков. В частности, их биологическая активность может зависеть от абиотических и биотических факторов среды, стабильности штаммов, длительности латентного периода микоза др. В связи с этим постоянно существует необходимость совершенствования биопестицидов на их основе.

Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии позволило повысить эффективность энтомопатогенных грибов как агентов контроля численности насекомых. Исследователи производили различные модификации генов М. anisopliae и В. bassiana, ответственных за продукцию различных токсинов, а также ферментов, участвующих в деградации кутикулы, для усиления вирулентности. Так был создан гибридный штамм В. bassiana содержащий хитин-связывающий домен, предварительно полученный из насекомого. Данный штамм показал сокращение времени смертности насекомых по сравнению с исходным штаммом (Fan et al., 2007). Другие исследователи произвели дупликацию гена Prl М. anisopliae, ответственного за деградацию кутикулярных белков. При этом также был получен эффект в сокращении времени гибели хозяев (St. Leger et al., 1996). Были получены трансгенные энтомопатогенные грибы со встроенным геном яда скорпиона, отвечающим за синтез нейротоксина (Pava-Ripoll et al., 2008).

В настоящее время помимо прикладных биотехнологических разработок активно ведутся исследования геносистематики и филогении энтомопатогенных грибов, изучение их физиологии, биохимии, адаптаций к хозяевам и другим компонентам биоценозов, а также изучение защитных систем насекомых при микозах (Bidochka et al., 2001, 2002; Jaronski et al.,

2003; Roberts, St. Leger, 2004; Roy et al., 2006; Sung et al., 2007; Mullen, Goldsworthy, 2006; Zare, Garns, 2008; Bischoff et al., 2009; Meyling, Hajek, 2010.). При этом основные исследования сосредоточены на видах трех родов: Baeuveria, Metarhizium и Isaria, имеющих значительный потенциал для прикладных работ.

1.1.2. Морфо-биологические и систематические группы энтомопатогенных аскомицетов

Систематика аскомицетов претерпела множество изменений. Основные проблемы в систематике данных грибов связаны с тем, что один и тот же вид может иметь две стадии размножения: половая (телеоморфа) и бесполая (анаморфа), значительно различающихся по морфологии, географическому распространению, биотопической приуроченности, специфичности по отношению к насекомым-хозяевам (Борисов и др., 2001; Sung et al., 2007; Крюков и др., 2010). Условия перехода из анаморфной стадии гриба в телеоморфную до сих пор изучены очень слабо. В связи с этим анаморфную и телеоморфную стадии очень часто относили к разным биологическим видам. В прежних классификациях существовал формальный класс (Deuteromycetes), включающий именно анаморфные виды аскомицетов (Горленко, Соколов, 1976). Отчасти это было оправдано, поскольку эволюция аскомицетов шла в направлении утраты полового размножения и переходу к оказавшимся более выгодному парасексуальному процессу, гетерокариозу, клоновой изоляции (Мюллер, Лефлер, 1995; Дьяков и др., 2005). Многие аскомицеты полностью утратили половую стадию (как правило, приуроченную к узким экологическим условиям), что позволило им расширить свою адаптивную зону и, как следствие, расселиться практически по всему земному шару, заселить новые стации, расширить круг используемых хозяев. В настоящее время в связи с активным использованием молекулярно-генетических

методов произошли значительные изменения в систематике данных грибов (Sung et al., 2007). Формальный класс дейтеромицетов ликвидировали, описанные в нем анаморфные виды постепенно сводят в синонимы соответствующих телеоморфных аскомицетов.

1.1.3. Систематическое положение Metarhizium anisopliae и близких

видов грибов

По современной систематике (Sung et al., 2007) М. anisopliae относится к отделу Ascomycota, порядку Hypocreales, семейству Clavicipitaceae, телеоморфному роду Metacordyceps или анаморфному роду Metarhizium В роде известен только 1 вид образующий телеоморфу -Metacordyceps taii. Его анаморфой является Metarhizium guizhouense Q.T. Chen & H.L. Guo. В целом род Metarhizium включает 13 видов, при этом большинство из них до недавнего времени рассматривались в качестве подвидов или патовариантов М. anisopliae (Humber, 1997; Борисов, 2001; Bischoff et al., 2009). Согласно последней ревизии рода (Bischoff et al., 2009) с использованием сопоставления нуклеотидных последовательностей ряда регионов ДНК М. anisopliae относится к PARB кладу, включающему 4 морфологически неразличимых вида: М. pingshaense Q.T. Chen & H.L. Guo, M. anisopliae, M. robertsii J.F. Bisch., Rehner & Humber и M. brunneum Petch. Диагностика вида основана на анализе нуклеотидных последовательностей регионов EFl-a, RPB1, RPB2, ITS, 5-tubulin (Bischoff et al, 2009).

1.1.4. Основные особенности биологии M. anisopliae и близких видов

грибов

М. атзорИае распространен в наземных экосистемах умеренного, торпического и экваториального поясов земного шара. Вид предпочитает

лесные биоценозы и способен развиваться в диапазоне температур от 8 до 38°С с оптимумом между 20-30°С (Fargues et al., 1992; Bidochka et al, 2001). M. anisopliae поражает насекомых разных отрядов (преимущественно Coleóptera, Hemiptera, Orthoptera, Leoidoptera, Hymenoptera, Díptera). Помимо класса насекомых известны случаи поражения грибом клещей (Ment et al., 2010) и нематод (Михайлюков, 1976). Следует отметить, что космополитное распространение и широкая трофическая специализация характерна и для близких к М. anisopliae видов: M. pingshaense, M. robertsii и M. brunneum (Bischoff et al., 2009).

Жизненный цикл M. anisopliae включает 3 основные стадии: патогенную, некротрофную и покоящуюся. Патогенная (или паразитическая) стадия включает прикрепление конидий гриба к покровам насекомого, проникновение в полость его тела и постепенную колонизацию тканей. Данная стадия заканчивается гибелью хозяина и формированием грибом внутри покровов насекомого плотного сплетения гиф - склероция. Некротрофная стадия начинается с обратного роста гиф через кутикулу погибшего хозяина и заканчивается формированием дочернего поколения конидий. Затем конидии попадают во внешнюю среду (опад, почва, различные части растений и др.), где сохраняются до следующего контакта с потенциальным хозяином. Недавно проведенные исследования (Bruck, 2010) показали, что на последней стадии гриб также способен к размножению в ризосфере растений. Являясь факультативным сапротрофом М. anisopliae легко выделяется и культивируется на искусственных питательных средах на основе углеводных (сахароза, глюкоза, декстроза и др.) и белковых (пептон, дрожжевой экстракт) компонентов. Гриб хорошо развивается на простерилизованных растительных субстратах (пшено, рис, картофель и др.) (Евлахова, 1974; Крюков и др., 2011). Однако в нестерильных условиях, как на растительных, так и на синтетических ИПС гриб быстро подавляется и вытесняется сапротрофными микромицетами из родов Aspergillus,

Pénicillium, Mucor и др. Поэтому некоторые авторы (Борисов, 2009) отрицают возможность сапротрофного существования гриба.

1.1.5. Механизм проникновения энтомопатогенных грибов через кутикулу и их развитие в полости тела хозяев

Заражение насекомых энтомопатогенными аскомицетами происходит различными путями. Проникновение грибов возможно через наружные покровы, кишечник, а также через дыхальца или половое отверстие (Вейзер, 1972). Однако наиболее хорошо исследованный и, как принято считать, основной путь проникновения аскомицетов проходит через кутикулу. В целом, при проникновении микопатогена через кутикулу выделяют несколько стадий (рис. 1): 1 - адгезия конидий гриба, 2 -развитие гриба на поверхности кутикулы, 3 - проникновение и развитие гриба в кутикуле, 4 - проникновение в полость тела насекомого и колонизация внутренних органов.

Первая стадия начинается с образования гидрофобных связей между кутикулярными липидами и клеточной оболочкой патогена, при этом наиболее удачное закрепление спор происходит в местах неровностей кутикулы (Ооейе1, 1988). В дальнейшем происходит развитие гриба на поверхности покровов. Прикрепившаяся спора начинает прорастать ростковой трубкой. Затем в месте соприкосновения с кутикулой начинается образование апрессория - булавовиднго утолщения, после чего апрессорий начинает делиться, при этом возможно слияние в единую структуру с апрессориями других клеток.

ГТ1

ГТ2 f^^T

Г с C' --

чгт

vj» А Ж»

Рис. 1. Процесс инфицирования личинок щелкунов энтомопатогенным грибом Metarhizim anisopliae (по Hajek, St. Leger, 1994, цит. по Борисов и др., 2001).

Эп - эпикутикула; Гд - гиподерма; БМ - базальная мембрана; JI -ламеллы прокутикулы; Г - гемолимфа; К - конидия; РТ - ростковая трубка; А - апрессорий; ПП - проникающая плата; ГТ1 и ГТ2 - гифальные тела первого и второго порядка; ЗГТ - звездообразные гифальные тела в гемолимфе.

Для преодоления кутикулярных покровов энтомопатогенные грибы используют ряд гидролитических ферментов. Под действием гидролитических ферментов в эпикутикуле формируются полости, в которые проникает образовавшаяся из апрессория проникающая трубочка. После достижения прокутикулы проникающая трубочка разрастается параллельно ламеллам, образуя в свою очередь, проникающую плату, в дальнейшем из нее ответвляются отростки - гифальные тела. Из гидролитических ферментов в основном описаны липазы, протеазы и хитиназы, участвующие в деградации кутикулы. (Charnley, 2003;

Khachatourians, Qazi, 2008). Предполагают, что на первом этапе происходит деградация кутикулярных белков под воздействием протеаз, в результате высвобождается хитин, «маскируемый» белками экзокутикулы. Параллельно в процессе прорастания споры происходит индукция активности хитобиаз и хитозаназ гриба, которые гидролизуют высвобождающийся хитин до N-ацетил глюкозамина. Далее происходит индуцирование хитиназной активности гриба, что приводит к резкому усилению «гидролитической атаки» со стороны патогена и перфорации экзокутикулы за счет механического воздействия гиф гриба. Далее, уже в эндокутикуле насекомого, богатой липидами, происходит активация липаз гриба (Борисов и др, 2001). Существует множество работ по изучению активности данных ферментов грибов и их связи с вирулентностью (Акулинин, Василенко, 1993; Лукина, 2005; Павлюшин, 1979; Jackson et al, 1985; Lacey et al, 1999; Gillespie et al, 1998). Так, ряд авторов считают, что вирулентность грибов находится в зависимости от активности определенных групп ферментов (Павлюшин, 1979; Castellanos-Moguel et al, 2007). Другие авторы не выявили положительной корреляции между этими факторами (Al-Aidroos, Seifert, 1980; Крюков и др, 2009). В настоящее время большое количество работ посвящено протеазам энтомопатогенных грибов, участвующим в деградации кутикулы (St. Leger, 1995; Gillespie et al, 1998; Castellanos-Moguel et al, 2007; Mohanty et al,2008 ). Данные исследования проводятся с использованием молекулярно-генетических методов. При этом авторами показана прямая связь активности данного фермента и вирулентности микопатогенов (Leal et al, 1997; Wang et al, 2002).

Во время проникновения и латерального роста гриба в насекомых, как правило, на кутикуле наблюдаются темные меланистические пятна, которые образуются в результате запуска в организме хозяина профенолоксидазного каскада. Пройдя кутикулярные слои и гиподерму, гриб попадает в гемоцель насекомого, где происходит его дальнейшее

развитие и колонизация внутренних органов. При этом в гемолимфе образуются гифальные тела, отличающиеся по форме от гифальных тел, формирующихся в кутикуле, и бластоспоры гриба, которые разносятся с током гемолифы по организму насекомого. При дальнейшей колонизации грибом органов насекомого исследователи выявили определенные закономерности. Так, в первую очередь, гриб поражает жировое тело, затем кишечник, мальпигиевы сосуды, гиподерму, нервные волокна, мышцы, трахеи. Через некоторое время гриб начинает обратный рост, к поверхности тела хозяина и, прорывая кутикулярные покровы, выходит на поверхность. При этом сначала мицелий появляется в более тонких межсегментарных складках насекомого (Борисов и др, 2001).

Некоторые авторы отмечают, что именно блокировка тока гемолимфы гифальными телами гриба с последующим разрушением тканей является главным фактором, приводящим к смерти насекомого (Евлахова, 1974). Однако, на наш взгляд, большой вклад в освоение насекомого и его дальнейшую гибель вносят токсины, продуцируемые грибами. Наиболее хорошо изучены и описаны токсины грибов родов Beauveria, Metarhizium, Aspergillus, Penecillium. При этом было показано, что пассирование грибов через насекомого-хозяина способствует повышению уровня токсинообразования штаммов. Среди энтомопатогенных грибов наиболее распространены токсины пептидной природы, но наиболее изучены из этой группы соединений циклопептиды. На клеточном уровне их действие выражается в изменении морфологии клеток, повреждении ядра и цитоплазмы (Сикура и др, 1979). Самые известные и наиболее изучаемые в настоящее время токсины пептидной природы - деструксины, впервые выделенные из грибов рода Metarhizium. В настоящее время насчитывается около 38 деструксинов или их аналогов, разделенных химически на 5 групп (Pedras et al, 2002; Ни et al, 2006). Деструксины по своей химической природе являются гексадепсипептидами, состоящими из альфа-гидрокси кислоты и пяти аминокислотных остатков (Pedras et al.

2002). Деструксины (А, В, Е) обладают выраженным инсектицидным действием (Cavelier et al, 1998; Thomsen и Eilenberg, 2000). Действие на насекомых при инъекциях данных токсинов проявляется в первую очередь в параличе или треморе (Samuels et al, 1988; Bradfisch, Harmer, 1990). Авторы связывают данный эффект с кальций-зависимой деполяризацией мембран клеток мышечных тканей. Также под действием деструксинов отмечено ингибирование секреции жидкости мальпигиевых сосудов (James et al, 1993). Кроме того, деструксины обладают иммуносупрессивным действием через подавление процессов клеточного иммунитета, в частности, гранулообразования (Vilcinskas et al, 1997а). Деструксины приводят к морфологическим изменениям в плазматоцитах, блокируя образование актина, что в свою очередь приводит к невозможности образования филлоподий и запуску процесса фагоцитоза. При этом в клетках наблюдается набухание ядер и образование клампов хроматина, свойственных для апоптозных клеток (Vilcinskas et al, 19976). Рядом авторов показана связь между вирулентностью разных штаммов Metarhizium и количеством продуцируемых ими деструксинов (Kershaw et al, 1997; Sree et al, 2008).

1.2. Механизмы резистентности насекомых к грибам 1.2.1. Внешние барьеры насекомых

На пути проникновения энтомопатогенных аскомицетов в организм хозяина первой преградой является кутикула насекомых. Кутикулярные покровы насекомых состоят из нескольких слоев (рис. 2).

Рис. 2. Строение покровов насекомых

Эп - эпикутикула; Эк - экзокутикула; Эн - эндокутикула; Гд -гиподерма; БМ - базальная мембрана.

Базалъная мембрана. Имеет неклеточное строение. Это аморфный гранулярный слой, состоящий из мукополисахаридов, отделяющий гиподерму от полости тела. Гиподерма представлена непрерывным однослойным рядом одно- или многоядерных клеток. Некоторые специализированные клетки гиподермы образуют волоски, сенсиллы, различные железы (К1о\Ус1еп, 2007). Во многих клетках гиподермы содержатся гранулы пигментов способные перемещаться, при этом изменяется окраска насекомых. Клетки гиподермы выполняют функции, связанные с синтезом различных биологически активных веществ, участвующих в процессах растворения и формирования кутикулярных слоев во время линьки, также заживлении ран (при повреждении гиподермы происходит ее восстановление путем миграции и размножения гиподермальных клеток) (Тыщенко, 1986).

т» «-» ^

В кутикуле выделяют внутренний слои - прокутикулу, содержащую высокомолекулярный полисахарид хитин (полимер 1\Г-ацетил-с1-

глюкозамин). Прокутикула проницаема для воды и выполняет в основном функцию механической защиты тканей насекомого. В свою очередь, прокутикула состоит из эндокутикулы, в которой полимерные молекулы хитиново-протеинового комплекса образуют чередующиеся слои, составленные из пластинок-ламелл и экзокутикулы, в которой хитиново-протеиновые молекулы стабилизируются хинонами и пропитываются пигментами (Тыщенко, 1986; Gullan, Cranston, 2010). В результате процессов склеротизации и пигментации кутикула насекомых становится более прочной и приобретает темный цвет. В течение данного процесса происходит образование поперечных связей между смежными цепями полипептида. Данное поперечное соединение происходит в результате окислительных и нуклеофильных реакций между высокоактивными агентами склеротизации, полученными из катехолов и нуклеофильных групп белков (Hopkins, Kramer, 1992; Kramer et al, 2001). Окисление катехолов катализируется фенолоксидазой. Это важный фермент, участвующий не только в склеротизации, но также в иммунных ответных реакциях насекомых (роль данного фермента в реакциях клеточного и гуморального иммунитета, а также меланогенез подробно рассмотрена в разделе 1.2.3.2.). Через прокутикулу проходят поровые канальца, через которые происходит секреция различных веществ при линьке, а также веществ, участвующих в восстановлении поврежденных покровов и синтезе кутикулярных восков (Gullan, Cranston, 2010). Внешний слой кутикулы называется эпикутикула. Он, в свою очередь, делится на внутренний протеиновый и внешний восковой слой. Верхняя часть протеинового слоя образована задубленым хиноном липопротеиновым комплексом - кутикулином. Этот слой проницаем для воды и восков, но непроницаем для экзувиальной жидкости. В протеиновом слое кроме белков содержатся полифенолы и дифенолы, участвующие в склеротизации, задубливании и окрашивании покровных тканей насекомых. Над этим слоем расположен восковой слой, состоящий из

липидных соединений (жирные кислоты и их эфиры), длинноцепочечных углеводородов и диоловых спиртов (Nelson et al., 1999). Воска формируются на поверхности покровов из жирных кислот и спиртов, поступающих по канальцам из эпидермиса. Данный слой играет важную роль, препятствуя потерям воды из организма (Тыщенко, 1986), а также в защите от патогенов (Bogus et al., 2010).

Уровень резистентности насекомого к грибам нередко зависит от толщины хитинового слоя и степени склеротизации прокутикулы. Известно, что насекомые с мощной и склеротизированной кутикулой менее восприимчивы к энтомопатогенным грибам. Например, при массированном заражении двупятнистого японского сверчка Locustella pryeri (Seebohm) конидиями гифомицетов погибает только 5-10% особей, при тех же условиях у саранчовых (Locusta migratoria L., Calliptamus barbarus (Costa)) наблюдалась 100%-я гибель (Крюков, неопубликованные данные).

Восприимчивость к патогенам зависит от фазы и от возраста насекомых. Известно, что имаго жуков и многих других насекомых гораздо более устойчивы к грибам, чем личинки, а устойчивость личинок к грибам возрастает по мере их роста. Старшие возраста, как правило, менее восприимчивы, чем младшие. Опыты на личинках белокрылки Bemisia argentifolii (Bellows & Perring) показали высокий процент прорастания конидий В. bassiana и Isaria fumosorosea Wize на кутикуле личинок II-III возрастов. Уровень прорастания конидий составил 45-54%. Личинки четвертого возраста имели низкую восприимчивость к этим грибам, и прорастание спор на их кутикуле было очень низкое для В. bassiana (7%) и промежуточное для I. fumosorosea (33%) (James et al., 2003). Кроме того, известно, что заражение насекомых грибами сразу после сбрасывания линочной шкурки, когда новая кутикула не успевает затвердеть, увеличивает восприимчивость к энтомопатогенным грибам. Показано значение толщины хориона яйца в устойчивости к

энтомопатогенным микромицетам. Так, более восприимчивыми к грибным инфекциям, оказались яйца вредной черепашки Eurygaster integriceps Puton на раннем этапе эмбрионального развития (Lappa et al, 1972).

Резистентность насекомых к патогенам в значительной степени определяют свойства верхних слоев кутикулы (эпикутикулы). Это связано с тем, что на первых этапах проникновения гриба необходима адгезия конидий на поверхности насекомых. Споры гриба фиксируются на поверхности кутикулы за счет гидрофобных взаимодействий и начинают прорастать (Ment et al, 2010). При этом микроорганизмы должны быть способны утилизировать скудные питательные вещества, быть невосприимчивыми к ряду метаболитов поверхностной флоры и определенным соединениям, входящих в состав эпикутикулы (фенолы, хиноны, белки, связанные с танинами, токсичные липиды и/или свободные жирные кислоты). Было установлено, что жирные кислоты наружных покровов личинок Е. integriceps способны ингибировать рост и развитие энтомопатогенных грибов В. bassiana (Smith, Gruía, 1982). Установлен ингибирующий эффект сложных эфиров, входящих в состав эпикутикулы белокрылки В. argentifolii на конидии В. bassiana и I. fumosorosea. Также выявлена положительная корреляция между толщиной воскового слоя и устойчивостью насекомых к грибным патогенам (James et al, 2003 ).

В кутикуле при повреждении или при проникновении через нее патогена происходит кутикулярная меланизация, опосредованная деятельностью целого ферментативного каскада, активирующего фенолоксидазу. Меланин и продукты, которые образуются в процессе ферментативных реакций, способны предотвращать дальнейший рост и развитие паразитоидов и некоторых микроорганизмов, в частности, энтомопатогенных грибов (St. Leger et al, 1988; Hajek, St. Leger, 1994). Меланизация также показана при ранении насекомого и кутикулярном инцистировании. Так, у личинок 4 видов пядениц (Geometridae) формируются цисты с отложенными яйцами паразита Banchus flavescents

Cresson (Ewen, Arthur, 1976). Цисты образуются между кутикулой и эпидермисом. Ряд авторов показывают корреляцию устойчивости насекомых к патогенам и интенсивностью меланизации кутикулы насекомых (Wilson et al., 2001). Данные работы проводились в основном на насекомых, которые при большом скоплении (скученности) приобретают более темную окраску в отличие от одиночных особей. Так, личинки Mythimna separate (Wlk.), имеющие темную окраску, были более устойчивыми к энтомопатогенным грибам нежели светлые (Mitsui, Kunimi, 1988). Сходная устойчивость была обнаружена у личинок Tenebrio molitor L. (Barnes et al., 2000) и Galleria mellonella (Dubovskiy et al., unpublished). Интересно, что меланотические формы могут быть менее восприимчивыми не только к энтомопатогенными грибам, но и к другим патогенам. Например, установлена более высокая восприимчивость светлоокрашенных личинок Spodoptera exempta (Wlk.) и М separate к вирусу ядерного полиэдроза, по сравнению с темноокрашенными (Reeson et al., 1998; Kunimi, Yamada, 1990).

Несомненно, основная роль покровов в защите насекомого от патогенов принадлежит механическим свойствам кутикулы. Однако при незначительном механическом повреждении кутикулы, в образовавшиеся раны может попадать сопутствующая микрофлора. Так, ряд авторов выявили антибактериальную (цикропин-подобную) активность эпителиальных клеток (Brey et al., 1993). Кроме того, не исключено, что насекомые могут активно противостоять инфекции, сбрасывая кутикулу с прикрепившимися к ней спорами при линьке.

1.2.2. Детоксицирующая система насекомых

Функция детоксицирующей системы насекомых это преобразование эндогенных и экзогенных токсичных веществ в менее ядовитые (1л, 2007). Реакции биотрансформации разделяют на две фазы. Данная классификация

основана на их способе действия, на токсичные вещества. Реакции фазы 1 включают окислительные, восстановительные и гидролитические реакции. В результате ферментативных реакций фазы 1 образуются водорастворимые соединения. Реакции фазы 2 - это процессы биосинтетической конъюгации, где ферменты этой фазы связываются с продуктами фазы 1, после чего данные вещества подвергаются восстановлению или гидролизу, с последующим выведением из организма (Магшс1а1а, 2011).

У насекомых описаны три основные ферментативные группы, участвующие в детоксикации и инактивации токсичных веществ. Это цитохром Р450 (монооксигеназы), участвующие в окислительных реакциях фазы 1, эстеразы - участвующие в гидролизе (деэтерификация) фазы 1, глутатион-Э-трансферазы (ГСТ) - в гидролизе фазы 2 (Кордюм, 1992; Рославцева, 1994).

1.2.2.1. Монооксигеназы

В состав класса оксидоредуктаз входят монооксигеназы, катализирующие окисление органических соединений, приводящее к включению одного из атомов кислорода в молекулы этих соединений и восстановление второго атома кислорода до воды. В большинстве реакций с оксигеназами, участвуют два донора, один из которых включает в свой атом кислород, а второй является донором водорода при образовании молекулы воды, при этом донорами электронов чаще всего выступают НАДН или НАДФН (Диксон, Уэбб, 1982).

К монооксигеназам относится группа ферментов, которая имеет общее название Цитохром Р450 (цитохром Р450-зависимая монооксигеназа, СУР). Это большая суперсемья белков, найденных во всех живущих организмах (Магшс1а1а, 2011). При этом они являются одновременно гемо-и флавопротеидами. Флавиновые нуклеотиды выступают в качестве

второго донора (Кнорре, Мызина, 1998). Цитохром Р450, связанный с СО, имеет максимум поглощения света при длине волны 450 нм, в связи с чем и получил свое название (Диксон, Уэбб, 1982). Цитохром Р450 разделяют в семьи на основе полного сиквенса аминокислот. При гомологии 40% идентичности аминокислоты формируют семью, при 55% в субсемью, хотя при этом бывают и исключения (Scott, 2001). К настоящему времени приблизительно 59 семей CYP (338 подсемей) были идентифицированы среди 89 видов насекомых. Эти CYPs распределены среди четырех CYP кладов (CYP2, CYP3, CYP4 и митохондриальный CYP) (Mamidala, 2011). Ферменты Р450 найдены фактически во всех тканях насекомых. Они выполняют много важных задач, от синтеза и деградации экдистероидов и ювенильных гормонов, до метаболизма ксенобиотиков естественного или синтетического происхождения. Это разнообразие в функциях достигнуто разнообразием в структуре генов, поскольку геномы насекомого несут приблизительно 100 генов Р450, иногда объединенных в группах. Микросомальные и митохондриальные Р450 присутствуют в насекомых, они лучше всего изучены по гетеролокусной экспрессии их ДНК и восстановлению очищенных ферментов. Гены Р450 находятся под сложным регулированием, играя центральную роль в адаптации и устойчивости к инсектицидам. Полиморфизм генов ответственных за Р450 позволяет насекомым приобретать резистентность к различным инсектицидам (Feyereisen, 1999).

1.2.2.2. Неспецифические эстеразы

Подгруппа эстераз входит в группу гидролаз. В подгруппу эстераз включены ферменты, которые катализируют разрыв эфирных связей, тем самым, гидролизуя эфиры. Данные ферменты обладают широкой субстратной специфичностью (Диксон, Уэбб, 1982а). Реакции с участием эстераз выглядят следующим образом:

RrCOO-R2 + H20 -Ri-COOH + R2-OH,

где Ri-COO-R2 - сложный эфир, RrCOOH - кислота, R2-OH - спирт (Диксон, Уэбб, 1982).

Основа классификации эстераз связана с их субстратной специфичностью. В состав неспецифических эстераз входят карбоксилэстеразы и арилэстеразы. Различные формы эстераз обнаружены практически во всех тканях насекомых (Рославцева и др, 1990). Для характеристики неспецифических эстераз используется ингибиторный анализ, впервые предложенный в 1953 г. (Aldridge, 1953). В организме насекомых эстеразы выполняют ряд сложных функций, например, участвуют в энергетическом обмене, в том числе в летательных мышцах, в контроле количества гормонов, деградации ксенобиотиков (Рославцева и др, 1990, 1993). Эстеразы, вовлечены в деградацию органофосфатов, карбаматов и перитроидов. Внутренние геномные изменения (увеличенное число мутации копий в кодировании последовательностей) среди карбоксилэстераз - один из главных факторов, лежащих в основе развития сопротивления к химическим инсектицидам (Li, 2007; Mamidala, 2011).

1.2.2.3. Глутатион-8-трансферазы

Глутатион-Б-трансферазы (ГСТ) это семейство

многофункциональных белков, использующих восстановленный глутатион для конъюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов. Это ферменты, переносящие серу от донора к акцептору (Диксон, Уэбб, 1982). ГСТ защищает клетки от вредного воздействия различного рода ксенобиотиков. Реакции с участием ГСТ выглядят следующим образом:

ROOH + 2GSH -►ROH + GSSG + Н20,

R + GSH-►HRSG,

RX + GSH -►RSG + HX

ГСТ насекомых, в настоящее время, классифицируют на два класса: I и II. ГСТ класса I, проявляют больше аналогии с классом 9 (Теты) млекопитающих, в то время как GST класса II с я; (Пи) классом. Эти аналогии не связаны с субстратной специфичностью, а основаны на сходстве аминокислотных последовательностей (Snyder, Maddison, 1997). ГСТ играют важную роль в метаболизме ксенобиотиков через катализ окислительно-восстановительных реакций, которые в свою очередь облегчают растворимость веществ и способствуют их выведению из организма (Mamidala, 2011). ГСТ выполняют основную функцию в детоксикации при «окислительных стрессах», связанных с естественными и синтетическими ксенобиотиками, включая инсектициды, аллелохимики, и эндогенно активизированные составляющие, такие как ненасыщенные карбонилы, эпоксиды, органические гидропероксиды и др. (Li, 2007).

1.2.2.4. Роль ферментов детоксицирующей системы насекомых

Роль ферментов детоксицирующей системы наиболее хорошо изучена при действии инсектицидов и развитии устойчивости к ним. Детоксикация синтетических инсектицидов насекомыми, главным образом, связана с цитохромом Р450 и с большими мультигенными семьями: эстераз, оксидаз и трансфераз. Среди этих детоксицирующих систем ферменты цитохром Р450 вовлечены в метаболизм пиретроидов; ГСТ -хлорорганических соединений; эстеразы и оксидазы действуют прежде всего на карбаматы (Mamidala, 2011). Некоторые исследователи применяют ингибиторы детоксицирующих ферментов как синергисты инсектицидов насекомых, к которым развилась устойчивость (Siqueira, 2000). Кроме того, важную роль детоксицирующие феременты играют в деградации ксенобиотиков, полученных фитофагами от кормовых растений. Так, есть исследования показывающие, что полифаги имеют более универсальную детоксицирующую систему, способную к деградации большего

разнообразия аллелохимиков, нежели растительноядные олигофаги и монофаги (Li, 2007). При действии патогенов роль детоксицирующих ферментов изучена намного меньше. Существует ряд работ, показывающих экспрессию детоксицирующих ферментов при микроспоридиозах (Соколова,Сундуков, 1999; Воронцова и др, 2006), а также работы по изучению этих ферментов при вирозах насекомых (Мартемьянов и др, 2009). При этом роль данных ферментов в развитии микозов насекомых рассмотрена в единичных работах, в частности В.В. Серебров с соавторами (Серебров и др, 2003, 2006) и А. Зибаи и А. Бандани (Zibaee, Bandani, 2009), указывают на увеличение активности и количества изоформ детоксицирующих ферментов при развитии грибных заболеваний насекомых.

1.2.3. Иммунитет насекомых

При преодолении патогеном внешних барьеров хозяина, активизируются гуморальная и клеточная иммунные системы насекомых. Гуморальный иммунный ответ включает биосинтез антимикробных белков, производство активированных кислородных метаболитов (АКМ) (Bogdan et al, 2000; Vass, Nappi, 2001; Tsakas et al, 2010), активацию коагуляции и профенолоксидазной системы гемолимфы (Muta, Iwanaga, 1996; Gillespie et al, 1997). Клеточный иммунитет включает фагоцитоз, инкапсуляцию и гранулообразование (Strand, 2008; Tsakas et al, 2010).

1.2.3.1. Клеточный иммунитет

Основные механизмы защиты насекомых от патогенов с участием гемоцитов включают фагоцитоз, гранулообразование и инкапсуляцию (Ьауте, 2002).

Классификация гемоцитов У насекомых имеются несколько типов гемоцитов, при этом их классификация построена на основе морфологических, гистохимических и функциональных характеристиках (Gupta, 1985; Brehelin и Zachary, 1986). Также, для идентификации гемоцитов используют антитела и генетические маркеры (Chain et al., 1992; Strand, Johnson, 1996; Gardiner, 1999; Lebestky et al., 2000). Однако в зависимости от вида насекомого и стадии его развития идентификация гемоцитов может быть несколько затруднительна. При этом разные авторы выделяют разное количество типов гемоцитов, но есть 5 общих типов, описанных в литературе:

прогемоциты - полипотентные клетки гемолимфы; в наибольшем количестве содержатся в гемолимфе личинок младших возрастов, а у имаго они могут либо отсутствовать, либо содержаться в небольшом количестве;

гранулоциты - содержат большое количество включений, участвуют в процессах фагоцитоза и инкапсуляции;

плазмотоциты - клетки, представленные в большом количестве в гемолимфе; имеют небольшое число гранул, также участвуют в процессах фагоцитоза и инкапсуляции;

эноцитоиды - большие сферические или овальные клетки, в цитоплащзме которых содержится фенолоксидаза;

сферулоциты - содержат в плазме сферулы, которые могут содержать разные белки, в частности, у колорадского жука содержится гемолизин (Глупов и др., 2001).

Эти типы гемоцитов были описаны у насекомых из различных отрядов Lepidoptera, Díptera, Orthoptera, Blattoptera, Coleóptera, Hymenoptera, Hemiptera и Collembola (Ahmad, 1988; Luckhart et al., 1992; Fenoglio et al., 1993; Joshi, Lambdin, 1996; Hernández et al., 1999).

36

Фагоцитоз

Фагоцитоз впервые был описан более 130 лет назад И.И. Мечниковым у личинок морской звезды (Kaufmann, 2008; Tan et al, 2009). Это процесс поглощения и переваривания гранулоцитами и плазматоцитами чужеродных объектов, не превышающих размер самих гемоцитов (клеток бактерий и др.). В этом процессе также участвуют перикардиальные клетки и иногда специальные клетки жирового тела. Выделяют несколько стадий фагоцитоза. Первая, наиболее важная стадия - это распознавание чужеродного агента (Глупов и др, 2001). На этом этапе важную роль играют рецепторы гемоцитов, которые находятся на поверхности клеток и способны распознавать не только патогены и другие живые клетки, но и инородные искусственные материалы. Эти рецепторы образуют сигнальные пути, которые, в свою очередь, регулируют фагоцитоз и разрушение чужеродного агента в лизосомальных вакуолях (Jones et al, 1999). При фагоцитировании происходят значительные изменения мембраны и цитоскелета гемоцитов. Мембрана образует псевдоподии вокруг фагоцитируемой частицы, формируя «чашку», которая перемещается в клетку. В течение нескольких минут мембрана закрывается в отдалённом от центра конце (Yeung et al, 2006). Фагоцитоз требует быстрого пополнения плазменной мембраны. В дальнейшем с фагосомой сливаются различные лизосомы, происходит, так называемое, «созревание фагосомы», при котором гидролитические ферменты взаимодействуют непосредственно с поглощенным объектом (Yeung et al, 2006).

Изучение рецепторов гемоцитов при фагоцитозе наиболее хорошо рассмотрено у Drosophila melanogaster Meigen, так как эти работы требуют генетических методов. В насекомых были идентифицированы несколько типов рецепторов: комплемент подобные молекулы, scavenger рецепторы, EGF (эпидермальный фактор роста) - подобные рецепторы, пептидогликан

распознающие молекулы PGRP, DSCAM, интегрины, spatzel и MsToll -рецепторы Toll пути (Rosales, 2011).

В результате фагоцитоза, главным образом, элиминируются проникшие в гемоцель микроорганизмы и измененные клетки самого организма хозяина. Фагоцитирование измененных или аппоптозных клеток особенно важно в момент перестраивания тканей насекомого и в течение эмбриогенеза, когда лишние клетки подвергаются запрограммированной смерти и удалению (Hopkinson-Woolley et al, 1994; Neufeld et al, 2008). Несмотря на важность этого процесса в развитии насекомого, механизмы фагоцитоза апоптозных клеток все еще мало изучены.

Инкапсуляция и гранулообразование В тех случаях когда чужеродный агент из искусственного материала (латекс, гранулы сефадекса, нити нейлона) или же чужеродный организм (бактерии, грибы, простейшие, нематоды, яйца и личинки паразитойдов) имеет большие размеры чем гемоциты, запускаются механизмы капсуло- и гранулообразования. При этом, образование гранул происходит при попадании небольших частиц, не превышающих размеры гемоцитов, но при их большом количестве, в том числе бактерий, латекса и т.п. Образование капсулы происходит, когда чужеродный объект значительно превышает размеры клеток гемолимфы, в основном, это паразитоиды и нематоды (Nappi et al, 2009; Rosales, 2011). Процесс гранулообразования включает формирование многоклеточных слоев гемоцитов, которые вовлекают большое количество бактерий или других чужеродных агентов. Гемоциты вместе с бактериями формируют конгломерат, который увеличивается за счет присоединения других гемоцитов. Как правило образованные гранулы меланизируются, что являестя эффективным способом изоляции бактерий. Процесс формирования гранул до конца не охарактеризован, но есть работы, в которых показана роль эйказаноидов в этом процессе у различных видов насекомых (Miller et al, 1999; Zhao et al, 2009; Shrestha et al, 2009, 2010), а также участие в этом процессе

профенолоксидазы (проФО) и дофадекарбоксилазы (Sideri et al., 2008). Кроме того, при исследовании генов, вовлеченных в иммунный ответ, было идентифицировано два белковых медиатора: Noduler (Gandhe et al., 2007) и Reelerl (Bao et al., 2011), участвующих в гранулообразовании при инъекциях бактерий Escherichia coli Migula (Castellani and Calmers) и Bacillus subtilis Ehrenberg (Cohn).

В процессе инкапсуляции гемоциты связываются с чужеродным агентом и образуют многократные слои клеток. В дальнейшем капсула обычно меланизируется, вследствие чего захваченный организм погибает за счет цитотстатических продуктов, образующихся при профенолоксидазном каскаде, или от асфиксии (Rosales, 2011). Процесс образования капсул условно разделяют на несколько стадий: (1) распознавание чужеродного антигена, (2) формирование слоя, (3) гибель патогена, (4) прекращение формирования слоя. Распознавание чужеродного антигена происходит таким же образом, как и при фагоцитозе. Капсулы могут различаться по количеству клеток и слоев, участвующих в их образовании (Gupta, 2001).

Как инкапсуляция, так и гранулообразование могут происходить в пределах организма одного насекомого в ответ на одни патогены, при этом, иногда трудно различить две эти защитных реакции. Гранула и капсула могут быть описаны как многоклеточные образования. Не исключено, что некоторые из формирующих капсулу гемоцитов, отделяются от гранулы и входят в бактериальную массу фагоцитируя их. Как правило, гранула формируется вокруг ядра меланистического сгустка, образованного дегранулированными гемоцитами (Gupta, 2001). Как было показано некоторыми исследователями, энтомопатогенные аскомицеты, проникшие в гемоцель насекомого и подвергшиеся защитным реакциям клеточного иммунитета, способны выживать внутри образовавшихся меланистических капсул. Так, М. Бидочка с соавторами (Bidochka et al., 2010) предположили, что способность грибов выживать

внутри капсулы связана с их приспособленностью к выживанию в почве. В большинстве исследований зафиксировано снижение показателей клеточного иммунитета при микозах. Ряд авторов пришли к выводу, что подавление процессов фагоцитоза и гранулообразования происходит за счет грибных метаболитов (Huxham et al,1988 a,b; Charnley, 2003), причем как при введении очищенных токсинов грибов (Bandani, 2008) так и непосредственно при развитии грибных инфекциий (Vilcinskas et al, 1997). Однако стоит отметить, что компоненты грибковой клеточной стенки стимулируют фагоцитоз (Gunnarson, 1988).

1.2.3.2. Гуморальный иммунитет

Коагуляция

При нарушении целостности кутикулы в организме насекомых срабатывает процесс коагуляции, который «запечатывает рану», предотвращает дальнейшую потерю гемолимфы, а также ограничивает проникновение микроорганизов (Gupta, 1991; Theopolda et al, 2002). Данный процесс наиболее хорошо изучен среди членистоногих на примере атлантического краба-подковы Limulus polyphemus L. (Iwanaga et al, 1994; Srimal, 1996). В процесс коагуляции у членистоногих вовлечены три сериновые протеазы (проформы) и коагулирущий белок коагулоген, который преобразуется в коагулин, а также клеточные компоненты -гранулоциты (Gupta, 2001). Насекомые имеют два вида коагулогенов: гемоцетин, содержащийся в гранулах гранулоцитов, и плазменный, синтезируемые жировым телом (липофорины) (Bohn, 1986). После индукции процесса коагуляции в гранулоцитах происходят структурные изменения, связанные с формированием вакуолей, радиальным расширением цитоплазматических пузырьков, набуханием ядра, и экссудацией или выбрасыванием цитоплазматического и ядерного материала из клетки. Гемоцитный и плазменный коагулогены формируют

перекрестно связанный сгусток. В свою очередь, для данного процесса необходимо наличие ионов кальция и активного Н-фактора, секретируемого гемоцитами. При этом также, запускается фенолоксидазный каскад, активация которого вызвана действием сериновых протеаз и лизисом клеток (Gupta, 2001). Механизмы коагуляции насекомых могут варьировать в зависимости от видовой принадлежности (Theopolda, 2002).

Антимикробные белки Антимикробные пептиды у насекомых синтезируются клетками жирового тела и определенными клетками гемолимфы, иногда перикардиальными клетками (Bulet et al., 1999; Глупов и др., 2001). Как правило, насекомые производят уникальный набор антимикробных белков, для которых характерна специфичность, направленная на определенную группу микроорганизмов (грамположительные (Г+), грамотрицательные (Г-) бактерии, грибы). Кроме того, одновременное присутствие нескольких, совместно действующих, антимикробных пептидов предоставляет насекомым более полную защиту от патогенных микроорганизмов (Bulet et al., 1999). Наибольшим по молекулярной массе антимикробным белком является лизоцим (муромидаза) около 15 кДа, хотя в основном они представлены низкомолекулярными пептидами (5-10 кДа) (Hancock et al., 2006). В свою очередь, их условно можно разделить на 3 группы. Первая включает пептиды с внутримолекулярными дисульфидными связями, формирующими b-листы, или а -спирали-Ь-листы. Вторая самая важная группа составлена из пептидов, формирующих амфипатические а -спирали. Третья группа включает пептиды с пролиновыми и/или глициновыми остатками. Способ действия антибактериальных пептидов до конца не изучен, однако, некоторые авторы предполагают два способа: первый - через белково-липидное взаимодействие, второй - через рецептор-опосредованное распознавание (Bulet et al., 1999).

Существует множество работ описывающих белки, выделенные из насекомых и обладающие антимикробными свойствами, в основном антибактериальными. Так, ряд работ посвящен антибактериальным пептидам (цекропин, галлеримицин, галиомицин), выделенным из личинок Galleria mellonella (Schuhmann et al., 2003; Kim et al., 2004; Lee et al., 2004; Brown et al., 2008), и некоторым другим пептидам, обладающим также антибактериальными и/или противогрибковыми свойствами (Cytrynska et al., 2007). Большое количество белков/пептидов, обладающих сходным действием выделено из личинок Manduca sexta L.: аттацины, лебоцины, морицины, гловерины, цекропины, а также обладающий бактериолитическим действием лизоцин (Kanost et al., 2004). Из дрозофил были выделены дефензины, мечниковин, активные против Г+ бактерий; аттацины, цекропины, диптерицины и дрозоцины, активные против Г-бактерий. При этом дрозомицин, мечниковин и цикропин были активны по отношению к грибам (Bulet et al., 1999; Meisteret al., 2000). Наиболее изучены из антимикробных пептидов цекропины и дефензины. Цекропины выделены из чешуекрылых и двукрылых и активны против Г+ и Г-бактерий. Дефензины широко распротранены среди насекомых и действуют только на Г+ бактерии (Hoffmann, 1995). Исследований по пептидам, обладающим антигрибковым действием значительно меньше. Некоторые авторы отмечали изменение активности лизоцима при заражении личинок G. mellonella грибом В. bassiana (Wojda et al., 2009). Также были показаны противогрибковые свойства дрозомицина, данный пептид в высокой концентрации подавлял прорастание спор грибов и сдерживал рост гиф при более низкой концентрации (Fehlbaum, 1994).

Профенолоксидазная система

Важную роль в защитных механизмах насекомых играет фенолоксидаза (ФО). Это медьсодержащий фермент из класса оксиредуктаз, окисляющий фенольные соединения. Профенолоксидаза насекомых имеет молекулярную массу около 80 kDa и содержит

приблизительно 685 аминокислот (Hall et al, 1995; Fujimoto et al, 1995). В организме насекомых она локализована в гемолимфе и кутикуле и содержится в виде инактивированных проферментов (Глупов и др, 2001). Активация ФО в организме насекомых происходит при помощи ферментативного каскада, который также называется профенолоксидазный каскад. При этом запуск данного каскада происходит в ответ на определенные факторы, в том числе на проникновение и развитие патогена. Данные факторы могут активировать сериновые протеазы, действующие непосредственно на профенолоксидазу. В большинстве случаев, активация сериновых протеаз насекомых может происходить при контакте гемолимфы с чужеродными объектами, а также может происходить при взаимодействии с компонентами входящих в состав клеточных стенок микроорганизмов. Активированная ФО принимает участие в образовании меланина (Глупов и др, 2001).

Меланин по своей структуре является индолил хиноном. Это сложный полимер, обладающий высокой механической устойчивостью, при этом он может обладать антибактериальными и фунгицидными свойствами. (Soderhall, Ajaxon, 1982). Образование меланина начинается с гидроксилирования тирозина (рис. 3) в дигидрооксифенилаланин (ДОФА) под действием ФО. Затем происходит окисление ДОФА до ДОФА-хинона так же с участием ФО. Дальнейшее образование меланина включает внутримолекулярную циклизацию и индолизацию ДОФА-хинона в формы лейко-ДОФА-хрома, ДОФА-хрома, 5,6 дигидрооксииндола и индолил - 5,6 - хинона, а также эумеланина. Из ДОФА-хрома в присутствие ионов металлов (двухвалентных) образуется 5,6-дигидрооксииндол-2-уксусная кислота. В дальнейшем под действием пероксидаз и ФО индолы окисляются до хинонов с последующей полимеризацией и образованием эумеланина. Также в данном каскаде под действием дофадекарбоксилазы из ДОФА может образовываться дофамин, который является предшественником дигидроксииндола и эумеланина. ДОФА-амин также

может ацетелироваться (ТЧ-ацетилтрансферазой) в результате образуется И-ацетилдофамин, переходящий в 1Ч-ацетилдофаминхинон, который полимеризуется с образованием склеротина (Глупов и др, 2001).

Тирозин ДОФА ДОФА-хинон

^ -соон о^ ^ _

— соон

ДОФА-хинон ДОФА

N СООН I

Н

Рис. 3. Схема катаболизма тирозина и образования меланотической капсулы (гранулы) (Глупов и др, 2001):

ФО - фенолоксидаза; ДДК - ДОФА-декарбоксилаза; NAT - N-ацетилтрансфераза; ДХК - ДОФА-хинонкарбоксилаза.

Одним из важных механизмов участвующих в меланотическом каскаде является регуляторный механизм, который включает выработку ингибиторов профенолоксидазного каскада. Промежуточные звенья профенолоксидазного каскада являются токсичными и могут быть опасны

для самого насекомого. В связи с этим существует необходимость контроля над активацией и деятельностью ФО. Этот контроль частично достигнут, за счет того, что ФО находится в организме насекомых как профермент. Кроме того, необходимо контролировать чрезмерную активацию ФО, при этом важную роль играют ингибиторы протеиназ (Cerenius, S oderhall, 2004). Одними из первых ингибиторов этих ферментов, были описаны белки из пресноводного речного рака Pacifastacus leniusculus (Dana). В этих животных самым эффективным ингибитором был гетеродимерный белок - 155 kDa (Liang et al., 1997). Поскольку ингибиторы, выделенные из речного рака, были первыми из описанных, то они теперь обычно упоминаются как члены «pacifastin» семьи ингибиторов протеиназы (Cerenius, Soderhall, 2004). В насекомых М. sexta (Jiang, Kanost, 1997) и Hyphantria cunea Drury (Park, 2000) были описаны ингибиторы, не принадлежащие к вышеупомянутой семье. В ряде работ проводят изучение ингибиторов на D. melanogaster при помощи молекулярно-генетических методов (Gregorio, 2002). Также на этом объекте проводят генетические исследования регулирования профенолоксидазной системы (Gregorio, 2002).

У беспозвоночных, кроме обеспечения пигментации, меланин также вовлечен в три физиологически важных процесса. Это кутикулярная склеротизация, заживление ран и иммунные реакции.

Процессы меланогенеза сходны с процессами склеротизации, происходящими в кутикуле насекомых при линьке и образовании новых кутикулярных покровов. В реакции склеротизации участвует ФО, которая окисляет N-ацетилдопамин и N-ß-аланилдопамин до хинонов. В дальнейшем, эти и другие реактивные метаболиты, связывают структурные белки и хитин кутикулы, делающие их нерастворимыми (Sugumaran, 1998). Эти хиноны формируют комплексы с аминокислотами в структурных белках. Формирование таких комплексов гарантирует стабилизирующий процесс. Однако, это не единственный химический

процесс, который помогает укреплению. Наиболее важным является то, что окисленные ФО хиноны преобразуются при помощи изомеразы в ДОФА-хинон. ДОФА-хинон, будучи более реактивным, чем большинство хинонов, быстро формирует комплексы не только с аминокислотами структурных белков, но также и с гидроксильными группами хитина, который является главным структурным компонентом кутикулы. В результате твердая кутикула обеспечивает многочисленные функции, такие как формирование физического барьера, водная устойчивость, прикрепление мускулатуры и др. (Sugumaran, 2001).

Важными защитными реакциями на пути развития патогена у насекомых служит инкапсуляция и меланизация. Данные реакции участвуют в репарационных процессах (при внешних и внутренних повреждениях) и элиминации различных организмов, проникших в насекомых. При механических повреждениях также происходит меланизация. На участке повреждения наблюдается быстрая активация ФО и образование меланина. Все это происходит в комбинации с механизмом коагуляции, что позволяет быстро «запечатать» рану (Sugumaran, 2001). Кроме того, промежуточные звенья меланизации в связи со своей цитотоксичностью могут убить болезнетворные микроорганизмы, пытающиеся пройти через поврежденные покровы (Nappi, 1993).

Действие паразитов и патогенов на профенолоксидазный каскад может быть различным. Так, паразитоиды зачастую подавляют иммунитет насекомых, снижая активность ФО (Kryukova et al, 2011). Так же показано действие грибных токсинов (деструксинов), которые предотвращали производство ФО клетками гемолимфы саранчовых (Huxham et al, 1989а), вероятно, разрушая клетки, которые производят профенолоксидазу (Cerenius et al, 1990). В работе Дж. П. Гилеспи соавторами (Gillespie et al, 2000) на саранчовых показано уменьшение уровня ФО в насекомых при микозах, вызванных М. anisopliae. При этом, в других работах было показано увеличение активности ФО в гемолимфе Spodoptera exigua

(Htibner) (Hung, Boucias, 1996) при заражении В. bassiana. Вероятно, влияние микоза на активность ФО зависит от вида патогена, его характеристик, количества инфекционного начала и множества других факторов.

1.3. Факторы, влияющие на течение микозов насекомых

На взаимодействия в системе насекомые - энтомопатогенные грибы влияют различные факторы, которые могут либо ускорить течение микоза и привести к тотальной гибели хозяев, либо замедлить его, что приведет к «выздоровлению» насекомых и элиминации патогенов. К важнейшим факторам, влияющим на течение микозов, можно отнести: дозы инокулуюма, вирулентные свойства штаммов, влияние сопутствующих инфекций, действие абиотических факторов среды, влияние химических инсектицидов.

1.3.1. Дозы конидий и вирулентные свойства штаммов

В природе насекомые сталкиваются с различным количеством инфекционного начала. Чаще всего это небольшие дозы конидий грибов недостаточные для развития заболевания. Однако, в периоды благоприятные для развития эпизоотийного процесса даже незначительные дозы патогена могут вызывать гибель значительной части популяции (Огарков, Огаркова, 2000; Борисов и др., 2001). В зависимости от дозы патогена сценарий микоза может развиваться по-разному: от вялотекущего до быстроразвивающегося заболевания с максимальной гибелью в первые несколько суток после заражения (Огарков, Огаркова, 2000). В последнем случае гибель насекомых происходит преимущественно от токсикоза, при этом прорастание гриба на погибших хозяевах и формирование дочерней инфекции не наблюдается. Таким образом, во многих случаях для грибов

более «выгодным» оказывается длительное, а не быстрое течение микозов (Крюков и др., 2007, 2011).

На исход заболевания значительно влияют вирулентные свойства самого патогена. При этом слабовирулентный штамм не сможет развиваться в организме насекомого и будет сохраняться в популяции за счет ослабленных хозяев, либо элиминироваться. Микопатоген, обладающий высокой вирулентностью, может быть несбалансирован по другим жизненно-важным функциям. Ряд авторов (Борисов, 1990; Воронина, 1997; Kershaw et al, 1999; Charnley, 2003) выделяют различные типы патогенеза или различные стратегии у энтомопатогенных грибов. Так, большинство патогенов используют стратегию «умеренного потребления ресурсов». Они характеризуются средним уровнем вирулентности, обладают высокой продуктивностью и жизнеспособностью. В то же время, в природе встречаются и высоковирулентные штаммы, обладающие обычно повышенным токсинообразованием, но уступающие первым в других свойствах -продуктивности конидиообразования, выживаемости конидий во внешней среде и др. Поэтому вспышки заболеваний от таких форм не бывают длительными. В российской литературе (Борисов, 1990; Воронина, 1997; Яркулов и др, 2006) первую стратегию обозначают как эпизоотийную (обеспечивающую преемственность эпизоотического процесса), вторую -как токсигенную (действие сходно с разовым эффектом после применения химических инсектицидов). В зарубежных работах (Kershaw et al, 1999; Charnley, 2003) первую стратегию называют стратегией роста, что связано с постепенной колонизацией тела насекомого гифальными телами грибов и активным спороношением на трупах. Вторую - стратегией токсина, когда гибель насекомых происходит преимущественно от токсикоза и спороношение на трупах отмечается реже или даже отсутствует. Упомянутые авторы считают, что данные стратегии являются крайними вариантами континуума, и между ними располагается ряд промежуточных

форм. Различия в стратегиях могут выявляться как у разных видов энтомопатогенных грибов, так и у внутривидовых форм (патовариантов, штаммов), и также могут быть связаны с их трофической специализацией (Kershaw et al., 1999; Charnley, Collins, 2007). В чатности, для рода Metarhizium была показана связь данных стратегий с приуроченностью видов и штаммов к определенным группам хозяев. Установлено, что относительно специализированные формы (М. acridum, М. majus, штаммы М. anisopliae, выделенные из саранчовых) обычно проявляют стратегию роста, тогда как генералисты (М. anisopliae) чаще характеризуются токсигенной стратегией (Kershaw et al., 1999). Однако практически не изученными остаются защитные реакции насекомых при инфицировании штаммами с разными стратегиями.

1.3.2. Влияние сопутствующих инфекций

Смешанные инфекции насекомых чрезвычайно широко распространены в природе и находят применение в создании комбинированных биопрепаратов против многих видов филлофагов (Charnley. Collins, 2007). Большинство работ по смешанным инфекциям было направлено на поиск синергистов энтомопатогенных грибов. Рядом авторов было отмечено увеличение гибели насекомых при сочетании разных видов грибов из родов Beauveria и Isaria на колорадском жуке (Bajan, Kmitowa, 1972; Bajan, 1973) и картофельной коровке Henosepilachna vigintioctomaculata (Mötsch.) (Клочко, 1965). Сходный эффект был установлен при совместной обработке энтомопатогенными грибами (Beauveria или Metarhizium) и бактериями В. thuringiensis на личинках кукурузнго мотылька Ostrinia nubilalis (Hbn.) (Lewis, Bing, 1991) и комнатной мухи Musca domestica L. (Mwamburi et al., 2009). Аддитивный эффект в смертности саранчовых зарегистрирован при моделировании смешанных инфекций с использованием аскомицетов

(Metarhizium,, Beauveria) и бактерии Pseudomonas sp. (Леднев и др, 2007; Крюков и др, 2007), а также аскомицетов и микроспоридий (Tokarev et al, 2011). Рядом авторов (Логинов, Павлюшин, 1987; Крюков и др, 2009; Costa et al, 2001; Wraight, Ramos, 2005) предложено совместное применение грибных и бактериальных патогенов против колорадского жука. Отметим, что изменения параметров иммунитета и детоксицирующей системы насекомых при смешанных инфекциях не изучались. Соответственно, вопросы о механизмах синергистических, аддитивных и других эффектов, возникающих при инфицировании насекомых разными энтомопатогенами, во многом остаются открытыми.

1.3.3. Влияние абиотических факторов среды

Влияние абиотических факторов на микозы насекомых изучалось при моделировании различных условий влажности, температуры, солнечного облучения. Многочисленные исследования показывают, что температурный оптимум для энтомопатогенных аскомицетов лежит в пределах 20-3 0°С, а температурные границы роста составляют от 5 до 37°С (Fargues et al, 1992; Ouedraogo et al, 1997; Wraight et al, 2007; Fernandes et al, 2008; De Crecy et al, 2009). При понижении температуры гибель насекомых от энтомопатогенных грибов может, как увеличиваться, так и снижаться (Dimbi et al, 2004; Bugeme et al, 2009). Очевидно, что развитие инфекционного процесса зависит от температурных оптимумов, как гриба, так и хозяина. В литературе описаны факты «выздоровления» насекомых при грибной инфекции в условиях повышенной температуры. Так, инфицированные саранчовые могут повышать температуру тела, перемещаясь на прогреваемые участки растений, при этом часть особей может «выздоравливать» (Blanford et al, 2000; Ouedraogo et al, 2004).

Другим лимитирующим фактором для развития микозов насекомых является влажность. Для прорастания конидий большинства

энтомопатогенных аскомицетов необходима влажность 90% и более (Борисов и др., 2001). Существует ряд работ, в которых показана прямая зависимость между повышением влажности окружающей среды и увеличением инфицирования фитофагов энтомопатогенными грибами (Черепанов, 1957, 1965; Shipp et al., 2003).

На жизнеспособность энтомопатогенных грибов большое влияние оказывает солнечная радиация, в частности ультрафиолетовое облучение (УФО). Наибольшее значение имеет излучение с длинами волн 295-320 нм. Ряд авторов отмечают снижение количества жизнеспособных спор грибов при прямом воздействии УФО (Штерншис и др., 2008; Morley-Davies et al., 1996; Braga et al., 2001). Также известно, что споры грибов, имеющие темные пигменты, являются более устойчивыми к УФО (Cagan, Svercel, 2001). В связи с этим, актуальным является вопрос о применении фотопротекторов для защиты спор энтомопатогенных грибов в условиях повышенной солнечной радиации (Крюков и др., 2010; Edgington et al., 2000; Kassa, 2003; Inglis et al., 2007).

Таким образом, абиотические факторы среды могут значительно влиять на успешность заражения насекомых энтомопатогенами. В условиях пониженной температуры, повышенной влажности, экранирования УФО чаще всего увеличивается возможность реализации грибных эпизоотий. По всей видимости, это связано как с оптимальными условиями для развития грибов, так и физиологическим ослаблением насекомых - хозяев. Однако, не известно, какие именно физиологические и биохимические механизмы у насекомых ответственны за их устойчивость или восприимчивость к микозам при воздействии абиотических факторов среды.

1.3.4. Влияние химических инсектицидов

Известно, что применение грибов в смеси с малыми дозами химических инсектицидов дает значительное повышение биологической активности. Так, многие исследователи начиная еще с 50-60 гг. XX века фиксировали синергистический эффект в смертности насекомых при совместном использовании энтомопатогенных грибов с небольшими концентрациями химических инсектицидов (Теленга, 1956; Бенц, 1976; Серебров и др, 2003, 2005; Delgado et al, 1999; Furlong, Groden, 2001). При этом лишь небольшая часть работ была посвящена изучению механизмов синергистического действия грибов и инсектицидов. Некоторые авторы предполагают, что одной из причин синергизма токсинов Metarhizium, Beauveria и имидаклоприда (неоникотиноиды) может быть подавление поведенческих актов насекомых, направленных на очистку поверхности кутикулы от спор грибов (Quíntela, McCoy, 1998). Другие авторы указывают на иммуносупрессивное действие фосфорорганических соединений и ингибиторов синтеза хитина (Hiromori, Nishigaki, 2001), а также подавление активности ферментов детоксицирующей системы насекомых (Серебров и др, 2003). Однако до конца механизмы данного синергизма до сих пор не изучены.

1.4. Заключение

Аскомицет Ме1агЫг1ит атяорИае - один из наиболее распространенных энтомопатогенных грибов, поражающий насекомых из разных отрядов. Жизненный цикл М. атяорИае включает три основные стадии. Первая стадия - патогенная, характеризуется проникновением микроорганизма в организм хозяина и дальнейшей колонизацией его тканей и органов, приводящей насекомого к гибели. На этом этапе для энтомопатогенных грибов характерно выделение специфических

ферментов и токсинов, необходимых для успешного проникновения и колонизации насекомых. Следующая стадия - некротрофная. Она характеризуется образованием дочернего поколения конидий патогена. После этого конидии гриба попадают в окружающую среду. Грибы М. атзорИае, главным образом, развиваются на насекомых, но не исключено, что они могут расти и размножаться в пределах ризосферы растений. В природе распространенны преимущественно средневирулентные штаммы грибов, так как высоко- и слабовирулентные могут элиминироваться из популяции. Смертность насекомых от грибов Ме1агЫгшт в основном наблюдается на энзоотическом уровне, но применение биопрепаратов на их основе против массовых видов насекомых может значительно сократить численность популяции хозяев, то есть вызвать эпизоотию. Внутри вида М. атзорИае существуют штаммы, характеризующиеся различными стратегиями. В зависимости от особенностей данных стратегий может отличаться и течение микозов, от вялотекущих до острых, с гибелью хозяина от токсикоза и невозможностью гриба перейти в некротрофную фазу развития. В настоящее время большинство работ посвящено биологическому контролю филлофагов и кровосоущих насекомых на основе энтомопатогенных грибов, а также поиску синергистов и протекторов данных агентов, повышению биологической активности с помощью создания трансгенных грибов. При этом защитным механизмам насекомоых-хозяев при микозах уделяется значительно меньше внимания. На пути проникновения грибного патогена в организм насекомого первым барьером являются кутикулярные покровы. Кутикула насекомых является не только механическим барьером. В ней в ответ на проникновение гриба запускается каскад ферментативных реакций с последующим образованием меланина, который может препятствовать развитию гриба, а также образуется ряд активированных кислородных метаболитов, обладающих высокой токсичностью для патогена. После преодоления

грибом кутикулярных барьеров, а возможно и на этапе развития гриба в кутикуле, в гемоцеле запускаются защитные механизмы, направленные на элиминацию патогена (клеточный и гуморальный иммунитет), а также инактивацию и детоксикацию метаболитов гриба (ферменты детоксицирующей системы). При этом на развитие инфекционного процесса может влиять множество факторов. В первую очередь это могут быть факторы, связанные со свойствами самого патогена и его инфекционной нагрузкой. Так, при высокой дозе инфекционного начала гибель может наблюдаться уже в первые сутки после заражения. Сходное течение микоза может происходить и при более низкой дозе, но при инфицировании штаммом гриба, обладающим высокой токсигенностью и, соответственно, вирулентностью. На сценарий развития микоза значительное влияние могут оказывать сопутствующие инфекции. В природе насекомые сталкиваются с патогенами из различных систематических и экологических групп, при этом смешанные инфекции насекомых, по-видимому, не являются редкостью. В свою очередь сопутствующие инфекции могут приводить к более быстрой гибели хозяина. Реакции защитных систем у насекомых при смешанных инфекциях остаются не изученными. Кроме того, на взаимодействие в системе патоген - хозяин значительное влияние оказывают абиотические факторы среды. При этом оптимальные условия для развития патогена и хозяина могут не совпадать, что в свою очередь либо ускоряет, либо замедляет патогенез. Так, некоторые насекомые, зараженные микопатогенами, могут «выздоравливать», повышая температуру тела, например, перемещаясь на прогреваемые участки растений или образуя тесные колони. Однако открытым остается вопрос о механизмах повышения устойчивости насекомых при повышении температуры. Возможно, таким образом, создаются субоптимальные условия для патогена, либо ускоренный метаболизм насекомого-хозяина позволяет ему эффективно противостоять инфекции. Кроме того, в агробиоценозах на

течение микозов оказывает влияние применение химических пестицидов. При этом практически не проводилось изучение влияния совместного действия химических агентов и микопатогенов на защитные системы насекомых.

Для более глубокого понимания взаимодействий в системе патоген -хозяин - среда необходимо изучение ответных механизмов организма насекомого на физиологическом, биохимическом и молекулярном уровне, с учетом различных факторов, влияющих на течение микозов. Данные исследования будут актуальны и в прикладном аспекте для создания высокоэффективных микоинсектицидных препаратов и разработки стратегии их внесения в биоценозы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Насекомые

Исследования проводили на 3-х видах насекомых, колорадском жуке Leptinotarsa decemlineata Say (Coleóptera: Chrysomelidae), большой пчелиной огневке Gallería mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) и перелетной саранче Locusta migratoria L. (Orthoptera: Acrididae).

Личинки колорадского жука были собраны на картофельных полях Новосибирской области (июль-август) в местах свободных от применения инсектицидов. Личинок содержали в лабораторных условиях при 25 °С в вентилируемых пластиковых контейнерах (57x39x42 см), смена корма (листья картофеля Solanum tuberosum L.) проводилась ежесуточно.

Личинок большой пчелиной огневки (лабораторная популяция ИСиЭЖ СО РАН) содержали на искусственной питательной среде (Тамарина, 1987) при 28°С в темноте.

Личинки перелетной саранчи были собраны в тростниковых крепях Брибалхашья (Казахстан) в мае-июне и содержались в садках из металлической сетки при 12 часовом световом дне и температуре 25°С. В качестве корма использовали тростник обыкновенный Phragmites communis Trin, который меняли ежесуточно.

В экспериментах использовались личинки IV возраста колорадского жука, II возраста азиатской саранчи и V возраста большой пчелиной огневки.

2.2. Грибы

Для исследований использовались штаммы энтомопатогенных грибов Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin из коллекции ИСиЭЖ СО РАН (штамм Р-72) и Всероссийского института защиты растений РАСХН

(штамм МАК-1). Штамм Р-72 изолирован в 1972 г. из погибших личинок колорадского жука L. decemlineata в Латвии (Serebrov et al, 2007). Штамм МАК-1 выделен в 2000 г. на юге Новосибирской области из погибших особей итальянского пруса Calliptamus italicus L. (Orthoptera: Acrididae) (Леднев и др., 2004). Видовая идентификация культур проведена на основе световой микроскопии и анализа нуклеотидных последовательностей ITS, IGS, EFla, RPB1 регионов (Bischoff et al, 2009). Идентификация на основе сопоставления нуклеотидных последовательностей с данными Genbank проведена Е.А. Елисафенко (Институт цитологии и генетики СО РАН) и Д. Иствудом (Swansea University, Wales, Great Britain).

Грибы сохраняли на агаризованных искусственных питательных средах (ИПС) Ваксмана, Чапека, Сабуро (Литвинов, 1969) и пересевали 12 раза в год. Для наработки конидиальной массы грибов применяли двухэтапное культивирование. Первый этап — наработка глубинной культуры на жидкой среде Чапека с добавлением пептона (0.4%) в шейкере-инкубаторе при 120 об/мин и 26°С в течение 6 суток. Второй этап - внесение полученного инокулюма (2 мл) в чашки Петри (d=15 см) на дважды автоклавированное пшено и последующее 2-х недельное культивирование в темноте при 25°С с ручным встряхиванием в течение 10-15 секунд 1 раз в сутки. Полученную биомассу высушивали при комнатной температуре (23-25°С) и измельчали в кофемолке. Титр конидий определяли при помощи серийных разведений и рассевов на ИПС, с дальнейшим подсчетом колоний (Литвинов, 1969).

2.3. Бактерии

В работе использовали бактерии Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni (H8 ab) Bonnifoi and de Barjak var. tenebrionis Krieg et al, штамм 2495 из коллекции микроорганизмов ИСиЭЖ СО РАН. Данный штамм изолирован из погибшей личинки большого мучного хрущака Tenebrio mollitor L.

(Coleóptera: Tenebrionidae) лабораторной популяции ИСиЭЖ СО РАН. Бактерии выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 6 суток, затем смывали дистиллированной водой. Титр кристаллов и спор определяли при помощи камеры Горяева.

2.4. Инсектициды

Для обработки насекомых использовали фосфорорганический инсектицид Актеллик, (КЭ 500 г/л; Сингента Кроп Протекши АГ, Австрия) действующее вещество (д.в.) пиримифос-метил.

2.5. Заражение насекомых

Заражение энтомопатогенными грибами Конидии грибов суспендировали в дистиллированной воде (с добавлением Твина-20, 0.03%). Насекомых обрабатывали перкутанно, погружая в водную суспензию на 10 сек. Контрольную группу насекомых обрабатывали дистиллированной водой (с добавлением Твина-20, 0.03%).

Заражение бактериями Для инфицирования насекомых бактериями проводили обработку корма (действие данных бактерий кишечное). Побеги и листья картофеля обрабатывали суспензией содержащей споро-кристаллическую смесь бактерий (1x10бкристаллов/мл) ручным опрыскивателем до появления стекающих капель, с последующим высушиванием в течение 20 минут при 25°С. Насекомые питались на листьях, обработанных бактериями, в течение 2-х суток. Затем корм заменяли. В контрольных вариантах растения обрабатывали дистиллированной водой.

Обработка инсектицидом Обработку инсектицидом проводили с помощью однократного погружения насекомых в водный раствор инсектицида Актеллик КЭ 500

г/л в концентрации 0.0001% д.в. с 10 секундной экспозицией. Насекомых из контрольного варианта погружали в дистиллированную воду.

Учет смертности во всех экспериментах проводился ежедневно. В ряде экспериментов погибших насекомых раскладывали в стерильные чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу для установления количества особей, на которых формируется дочернее спороношение грибов.

2.6. Оценка токсичности культуральной жидкости штаммов

Metarhizium атБорЫае

Для сравнения токсичности культуральной жидкости энтомолпатогенных грибов проводили глубинное культивирование штаммов по вышеописанной методике (см. 2.2.). Через 3 и 6 суток культивирования бластоспоры и мицелий осаждали на центрифуге при 20000 £ в течение 10 минут. Надосадочную жидкость в объеме 5 мкл вводили в гемоцель гусениц У возраста (7. теПопеПа с помощью микроинъектора. Показателем токсичности служил процент парализованных гусениц.

2.7. Измерение активности детоксицирующих ферментов, параметров клеточного и гуморального иммунитета

Измерение интенсивности инкапсуляции

Интенсивность процессов инкапсуляции у насекомых оценивали по степени потемнения нейлоновых имплантантов длиной 2 мм и диаметром 0.5 мм. Имплантанты вводили под кутикулу насекомых с вентральной стороны. Через 4 часа (для личинок Ь. с1есетИпеа1а) и 2 часа (для личинок Ст. теПопеПа) имплантанты извлекали, фотографировали и измеряли

степень потемнения капсулы с помощью программы Image Pro (Dubovskiy et al., 2008; Dubovskiy et al., 2010).

Приготовление образцов тканей и органов насекомых Образцы гемолимфы и жирового тела личинок насекомых отбирали в 0.1 M Na-фосфатный буфер (рН 7.2) (ФБ), для предотвращения меланизации добавляли фенилтиомочевину (ФТМ) (до насыщения - 4 мкг/мл). При отборе гемолимфы колорадского жука и личинок саранчовых соотношение ФБ к образцу составляло 1:1. Образцы жирового тела гомогенезировали в ФБ в соотношении 0.06 г тканей на 1 мл буфера при помощи ультразвукового гомогенизатора. Затем образцы гемолимфы центрифугировали при 4°С в течение 5 минут при 500 g. Образцы жирового тела центрифугировали 10 мин при 10000 g.

Образцы гомогенатов целого тела личинок перлетной саранчи гомогенезировали в ФБ с добавлением ФТМ, при помощи какого? гомогенизатора, затем центрифугировали при 4°С в течение 10 минут при 10000 g.

Образцы кутикулы личинок G. mellonella отбирали в ФБ, предварительно механически очистив от внутренних органов и тканей, отделив головную капсулу. Трижды промывали в 0.5 мл ФБ при помощи шейкера (1500 rpm) в течении 1 мин. В дальнейшим кутикулу механически разрушали в 400 мкл ФБ при помощи гомогенизатора FASTPREP®-24 (MPI) в течении 2 мин при 6.5 М/с. Затем центрифугировали при 4°С в течение 10 минут при 10000 g.

Полученные супернатанты использовали для измерения активности детоксицирующих ферментов и количества белка.

Измерение активности неспецифических эстераз Измерение активности неспецифических эстераз проводили по методу С. К. Прабхакаран (Prabhakaran et al., 1995) с изменениями.

Для измерения активности неспецифических эстераз в гемолимфе колорадского жука к 5 мкл образца плазмы гемолимфы добавляли 200 мкл р-нитрофенилацетата и инкубировали 3 мин при 28°С.

Для измерения активности неспецифических эстераз в жировом теле колорадского жука к 5 мкл образца ткани добавляли 200 мкл р-нитрофенилацетата и инкубировали 10 мин при 28°С.

Для измерения активности неспецифических эстераз в гомогенатах целого тела личинок перелетной саранчи к 20 мкл образца насекомых добавляли 200 мкл р-нитрофенилацетата и инкубировали 15 мин при 28°С.

Активность неспецифических эстераз определяли по образованию нитрофенила спектрофотометрически при длине волны 410 нм.

Измерение активности глутатион-Б-трансфераз

Измерение активности глутатион-8-трансфераз (ГСТ) проводили по методу В. Хабига (НаЫ§ е1 а1, 1974) с изменениями.

Для измерения активности ГСТ к 10 мкл образца плазмы гемолимфы колорадского жука добавляли 200 мкл 1 мМ глутатиона. Реакцию инициировали добавлением 5 мкл ацетонового раствора 1мМ динитрохлорбензола (ДНХБ) и инкубировали 15 мин при 28°С.

Для измерения активности ГСТ в жировом теле колорадского жука к 10 мкл образца ткани добавляли 200 мкл 1 мМ глутатиона. Реакцию инициировали добавлением 5 мкл ацетонового раствора 1мМ ДНХБ и инкубировали 15 мин при 28°С.

Измерение активности ГСТ в гомогенатах целого тела личинок перелетной саранчи проводили с добавлением к 5 мкл образца 200 мкл 1 мМ глутатиона. Реакцию инициировали добавлением 5 мкл ацетонового раствора 1мМ ДНХБ и инкубировали 5 мин при 28°С.

Активность ГСТ определяли спектрофотометрически по образованию5-(2.4-динитрофенил)-глутатиона при длине волны 340 нм.

Измерение активности фенолооксидазы

Фенолоксидазную активность в кутикуле насекомых определяли спектрофотометрически по образованию дофахрома, при длине волны 490 нм, по методу описанному М. Ашида и К. Содерхалл (Ashida, Soderhall, 1984). К 50 мкл образца добавляли 200 мкл раствора 3.4-дигидроокси-Ь-фенилаланина (2 мг/мл ФБ) и инкубировали при 28°С 12 часов.

Активность ферментов выражали в единицах изменения оптической плотности (АА) инкубационной смеси в ходе реакции в расчете на 1 минуту и 1 мг белка.

Определение концентрации белка

Концентрацию белка в образцах насекомых определяли по методу М. Бредфорда (Bradford, 1976). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин.

2.8. Объемы выборок и статистическая обработка данных

Оценку смертности насекомых при заражении грибами, бактериями и обработке инсектицидом проводили не менее чем в 4 повторностях по 10 особей в каждой. Для опытов по измерению активности ФО и детоксицирующих ферментов в тканях и органах насекомых количество особей на вариант (п) составляло не менее 10. В опытах по измерению интенсивности инкапсуляции количество особей на один вариант эксперимента составляло 30—60. В опытах по определению токсичности КЖ энтомопатогенных грибов выборка составляла 40 особей на вариант.

Данные по смертности насекомых представлены в виде накопительных кривых смертности и ошибок средних (SE) в отдельных экспериментальных точках. Данные по активности ферментов и интенсивности инкапсуляции проанализированы с помощью дисперсионного анализа (One-Way ANOVA), достоверность отличий

определена с помощью критерия Фишера. Значения на графиках представлены в виде средних арифметических и их ошибок. Для проверки нормальности распределения данных использовали \¥-критерий Шапиро-Уилка. Расчеты выполнены с использованием программ 8ТАТ18Т1СА 6.0, Sigma-stat УЗ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Активность ферментов детоксицирующей системы личинок Locusta migratoria при микозах, вызванных разными дозами инфекции

Metarhizim anisopliae

К группе детокеицирующих ферментов насекомых относятся монокснгеназы, неспецифические эстеразы и глутатион-Зтрансферазы (ГСТ). Данные ферменты участвуют в преобразовании токсичных метаболитов в менее ядовитые (Li et al, 2007). В дальнейшем происходит выведение продуктов деградации ксенобиотиков из организма насекомых. Первая группа ферментов (неспецифические эстеразы) ускоряет разложение сложных эфиров до спирта и кислоты. ГСТ катализирует конъюгацию органических молекул с глутатионом, который участвует в восстановлении ряда высокореакционных продуктов перекисного окисления липидов (Диксон, Уэбб, 1982). Исходя из предыдущих работ ряда исследователей, можно сказать, что данные группы ферментов ответственны за детоксикацию метаболитов различной природы, и их уровень зачастую определяет устойчивость к химическим инсектицидам, энтомопатогенным грибам, микроспоридиям и другим патогенам (Лозинская, 2002; Серебров, 2003, 2006;).

В данном эксперименте мы регистрировали изменение активности неспецифических эстераз и ГСТ в организме личинок перелетной саранчи L. migratoria. При этом мы моделировали патогенезы с различным изначальным уровнем инфекции, приводящим к высокой либо низкой смертности насекомых. В экспериментах использовали личинок IV возраста перелетной саранчи и штамм Р-72 М. anisopliae.

3.1.1. Динамика смертности насекомых

5 7

Дозы патогена 1x10 и 1x10 конидий/мл, приводили к гибели 40% и 100% особей соответственно (рис.4). Острая (летальная) инфекция характеризовалась быстрым течением грибного заболевания. Достоверные отличия (р<0.05) от контроля регистрировались уже с 4 суток после инфицирования грибом, когда уровень смертности от гриба составил 55%. В случае заражения более низким титром (1хЮ5 конидий/мл) достоверные отличия от контроля в смертности насекомых (р<0.05) зафиксированы начиная с 8 суток после инфицирования. В обоих вариантах особи, погибающие в течение 4 суток после инфицирования, разлагались как при бактериальных инфекциях, тогда как погибшие после 4 суток опыта преимущественно (80%) мумифицировались.

сутки

- - Контроль — ш- М.а. 1*105 —•—М.а.1х107

Рис. 4. Динамика смертности личинок L. migratoria при инфицировании двумя дозами М. anisopliae (М.а.).

3.1.2. Активность ферментов детоксицирующей системы

Под действием низкой дозы гриба у перелетной саранчи происходило достоверное увеличение активности неспецифических эстераз на 3 и 6

сутки эксперимента (рис. 5 А). Изменения активности ГСТ в данном варианте не было зарегистрировано. При летальном заражении в начальный период микоза было зарегистрировано резкое увеличение активности неспецифических эстераз и ГСТ в 2-3 раза по сравнению с заражением низким титром и контролем (рис. 5 А, Б). На 6 сутки после заражения показатели активности в этом варианте снижались до контрольных (рис. 4 А, Б).

сутки □ контроль

6

□ М.а. 1x10'

сутки М.а. 1x10

Рис. 5. Активность неспецифических эстераз (А) и глутатион-S-трансфераз (Б) в гомогенатах целого тела личинок L. migratoria при инфицировании двумя дозами М. anisopliae (М.а) (* - р<0.05 по сравнению с контролем).

3.1.3. Обсуждение результатов

Зарегистрированное увеличение активности ферментов детоксицирующей системы при микозе согласуется с данными других исследователей. Так была выявлена активация эстераз и ГСТ при обработке клопа Eurygaster integriceps (РиШп) спорами и метаболитами В. Ъазя1апа @{Ъаее, 2009), а также при микозе М. ап'торИае на личинках

чешуекрылых (Galleria mellonella L., Aporia crataegi L., Lymantria disparL.) (Серебров, 2000; Серебров и др., 2001, 2003, 2006). При этом зафиксированное нами дозозависимое увеличение активности неспецифических эстераз в начальный период микоза свидетельствует об участии данных ферментов в элиминации грибных метаболитов, образующихся при развитии процессов, обеспечивающих проникновение энтомопатогенного гриба в гемоцель насекомого. Кроме того, В.В. Серебровым с соавторами (2001) было показано, что повышение активности неспецифических эстераз происходит за счет индукции дополнительных изоформ данных ферментов.

Резкое увеличение активности неспецифических эстераз и ГСТ в начальный период развития летальной грибной инфекции свидетельствует о начавшемся токсикозе, вызванном метаболитами гриба. Кроме того, предполагается, что повышение активности данных ферментов связанно с механическим повреждением тканей насекомых гифальными телами грибов при их проникновении в организм хозяина (Xia et al, 2000). При этом последующее снижение активности данных ферментов до уровня контрольных значений в «острый» период заболевания на 6 сутки эксперимента (смертность более 80%) может быть связанно с сильным подавлением защитных систем хозяина энтомопатогенными грибами. Полученные нами данные дополняют исследования Дж. П. Джиллеспи с соавторами (Gillespie et al., 2000), которые зарегистрировали снижение активности фенолокисдаз, антибактериальной активности и общего числа гемоцитов у саранчовых Schistocerca gregaria Forsk при микозе, вызванном М. anisopliae. Вероятно, токсикоз, вызванный грибной инфекцией, приводит к общим нарушениям систем организма насекомого, которые, как правило, сопровождаются снижением активности ключевых звеньев иммунного ответа на фоне увеличения активности детоксицирующих ферментов.

3.2. Активность ферментов детоксицирующей системы и уровень инкапсуляции нейлоновых имплантантов в организме личинок Leptinotarsa decemlineata и Locusta migratoria при микозах, вызванных штаммами с различным уровнем токсинообразования

В природных экосистемах практически всегда присутствуют энтомопатогенные грибы, которые могут влиять на ряд физиологических систем насекомых и при определенных условиях вызывать их смертность, тем самым оказывать влияние на динамику численности хозяев(Борисов и др, 2001; Sierpinska, 1998; Kamata. 1998, 2000). В процессе эволюции у насекомых возник ряд защитных приспособлений, ограничивающих проникновение, дальнейший рост и развитие энтомопатогеннх грибов в организме хозяина, а также системы способствующие выведению токсичных метаболитов патогенов. В свою очередь в процессе коэволюции энтомопатогенные грибы также выработали ряд приспособлений для успешного заражения насекомых и, в тоже время, для сохранения в биоценозе. В результате, у энтомопатогенных грибов возникли разные жизненные стратегии, связанные с уровнем токсинообразования. Стратегия роста (эпизоотийная стратегия) характеризуется низким уровнем токсинообразования, относительно длительными микозами, высоким уровнем специализации к насекомым-хозяевам; стратегия токсина - повышенным токсинообразованием, высокой вирулентностью, более выраженной адаптацией к сапротрофному питанию, широким диапазоном насекомых-хозяев (Борисов, 1990; Гиндина и др, 1990; Воронина, 1997; Воронина и др, 1997; Kershaw et al, 1999). В данной части работы мы провели опыты по влиянию грибов с различным уровнем токсиообразования на патогенезы, а также активность детоксицирующих ферментов и уровень инкапсуляции нейлоновых имплантантов у насекомых. По техническим причинам уровень инкапсуляции мы регистрировали только у личинок L. decemlineata. В исследовании были

использованы два штамма, различающихся по жизненным стратегиям. Штамм Р-72 (стратегия токсина) вызывает скоротечную гибель насекомых из разных отрядов, но при этом не образует дочернего поколения конидий на погибших хозяевах за исключением некоторых видов Ьер1ёор1ега (Крюков и др., 2011). Штамм МАК-1 (стратегия роста), вызывает более длительные микозы у насекомых и обильно продуцирует конидии на трупах хозяев из разных отрядов (Крюков и др., 2011).

3.2.1. Токсигенные и патогенные свойства штаммов

Токсигенностъ

Для характеристики токсигенности выбранных штаммов М. атзорИае, были проведены инъекции культуральной жидкости (КЖ) в гемоцель личинкам С. теИопеИа. При инъекции личинкам 3- и 6-суточной КЖ штамма Р-72 наблюдался паралич 100% гусениц (п=40). Данный паралич продолжался в течение 45-60 мин, после чего гусеницы становились подвижными и возобновляли питание. Однако при инъекции КЖ штамма МАК-1 паралич наблюдался лишь у 6 % гусениц в варианте с 6-суточной культурой, а при инъекции 3-суточной КЖ все насекомые были подвижны. Выявленный паралич насекомых под действием КЖ штамма Р-72, свидетельствует о повышенной продукции деструксинов данным грибом (С1гагп1еу, 2003) и подтверждает факт токсигенной стратегии штамма. Более высокий уровень продукции деструксинов В и Е у штамма Р-72 по сравнению с МАК-1 подтвержден также методом ВЭЖХ (АЬёгаИтап е1 а1., неопубликованные данные).

Патогенез

Изучение динамики смертности при инфицировании штаммами с различными стратегиями проводили на личинках IV возраста колорадского жука и II возраста азиатской саранчи (рис. 6).

£ 80

& 60 о

L 40

ф

о 20 -I

0

1 3

Заключение диссертации по теме «Энтомология», Ярославцева, Ольга Николаевна

104 Выводы

1. Развитие острой грибной инфекции, вызванной Metarhizium anisopliae, приводит к активации неспецифических эстераз и глутатион-s-трансфераз в гомогенате тела личинок Locusta migratoria.

2. Микоз, вызванный токсигенным штаммом М. anisopliae, приводит к увеличению активности неспецифических эстераз и глутатион-s-трансфераз в гомогенатах тела личинок L. migratoria, гемолимфе и жировом теле личинок Leptinotarsa decemlineata, а также к раннему снижению интенсивности инкапсуляции у личинок L. decemlineata. Данных эффектов не наблюдается при инфицировании насекомых штаммом со стратегией роста.

3. Совместное инфицирование грибами М. anisopliae и бактериями Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni var. tenebrionis личинок L. decemlineata приводит к синергистическому эффекту в смертности насекомых. При бактериозе и при смешанной инфекции происходит подавление систем, участвующих в защите насекомых от грибной инфекции: интенсивности инкапсуляции, активности ферментов детоксицирующей системы.

4. Грибная инфекция, вызванная М. anisopliae, протекающая при субоптимальной пониженной температуре для личинок Gallería mellonella (24°С), приводит к более поздней активации фенолоксидазы в кутикуле насекомых, а также снижению интенсивности инкапсуляции по сравнению с оптимальной для насекомых температурой (34°С).

5. При микозе, протекающем на фоне низких доз фосфорорганического инсектицида «Актеллик», у личинок L. decemlineata отмечается снижение активности неспецифических эстераз и глутатион-s-трансфераз и значительное снижение уровня инкапсуляции, по сравнению с монозаражением М. anisopliae.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При проникновении гриба в организм насекомого-хозяина патоген продуцирует ряд метаболитов (ферментов и токсинов), необходимых для успешной колонизации хозяина (Charnley, 2003). При этом в ответ на проникновение патогена в организме насекомого могут запускаться различные защитные механизмы, в том числе и детоксицирующая система, которая направлена на инактивацию и детоксикацию токсичных веществ. Показана активация ферментов детоксицирующей системы, а также изменение количества изоформ данных ферментов при микозах насекомых (Серебров и др, 2001, 2006; Zibae et al, 2009). Однако, полученные нами данные свидетельствуют, что активация данных ферментов при микозах зависит от ряда факторов. В первую очередь, это свойства самого патогена и количество инфекционного начала. Так, установленная нами резкая активация ферментов детоксицирующей системы у L. migratoria при грибной инфекции, вызванной высокой дозой патогена и менее выраженный ответ при низких титрах, свидетельствует о различном дозозависимом ответе данной защитной системы. Кроме того, ферменты детоксицирующей системы по-разному активируются при микозах, вызванных патогенами с различными вирулентными свойствами. Так, при инфицировании штаммом гриба с повышенным уровнем токсинообразования происходит активация неспецифических эстераз и ГСТ, чего не наблюдается при заражении менее токсигенным штаммом. Кроме того, нами показано, что на защитные реакции насекомых при микозе могут оказывать влияние и другие факторы. В частности, при микозе у личинок колорадского жука под действием сопутствующих инфекций (Bacillus thuringiensis) нами показано подавление активности неспецифических эстераз и глутатион-8-трансфераз, что вероятно, не позволяет организму насекомого «справиться» с заболеванием, и приводит к ускоренной гибели. Сходное ингибирующее действие на ферменты детоксицирующей системы могут оказывать и химические инсектициды.

Кроме того, мы показали, что на успешность заражения и дальнейшее развитие микозов влияет температура окружающей среды. Нами впервые показано, что оптимальные для развития личинок (7. теПопеПа температуры позволяют активировать защитные механизмы на самых ранних этапах заражения и «справиться» с грибной инфекцией. Установлена повышенная активация ФО в кутикуле при оптимальных для & теПопеПа температурах (34°С), чего не наблюдалось при субоптимальных (24°С). Повышенные температуры могут отрицательно влиять на рост и развитие микопатогена, что в совокупности с «усиленной» работой защитных систем насекомых приводит к «выздоровлению» хозяев.

Одной из важных защитных систем насекомых является система клеточного иммунитета. Данная система направлена на элиминацию уже проникших пропагул патогена. Рядом исследователей показано подавляющее действие токсических метаболитов энтомопатогенных грибов на клеточный иммунитет насекомых, как при развитии микозов, так и под действием очищенных токсинов (УПстБказ, 1997; Вапёаш, 2008). Нами также в большинстве случаев было зарегистрировано снижение интенсивности процесса инкапсуляции при микозах. При этом под действием штамма с повышенным уровнем токсинообразования происходило более раннее и продолжительное подавление данного процесса. Кроме того, нами установлено, что при развитии микозов под влиянием фонового заражения бактериями, обработке фосфорорганическими инсектицидами или под действием субоптимальных для хозяев температур происходит значительное подавление данного показателя клеточного иммунитета. Это, в свою очередь, приводит к повышению чувствительности насекомых к микопатогену, быстрому развитию грибной инфекции и гибели хозяев в более ранние сроки.

Таким образом, на течение и исход грибного заболевания у насекомых влияет ряд факторов (рис. 20): доза патогена и его вирулентные свойства, наличие сопутствующих инфекций, субоптимальные температурные условия для развития хозяев, воздействие инсектицидов. Все это вызывает подавление активности детоксицирующих ферментов, снижение интенсивности клеточного иммунитета и (или) активности фенолоксидазы, т.е. систем, ответственных за устойчивость насекомых к микопатогену. Это, в свою очередь, может приводить к увеличению количества зараженных особей, ускорению гибели насекомых от микоза, и как следствие, существенно влиять на динамику численности популяций насекомых и их патогенов.

СУБЛЕТАЛЬНЫЕ БАКТЕРИОЗЫ

I 1 I

КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СИСТЕМА

СУБОПТИМАЛЬНЫЕ ТЕМПЕРАТУРЫ

I 1 1

КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ

ФЕНОЛОКСИДАЗА

СУБЛЕТАЛЬНЫЕ ДОЗЫ ИНСЕКТИЦИДОВ

1 I I

КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СИСТЕМА летальный микоз

Рис. 21. Факторы, влияющие на повышение чувствительности насекомых к энтомопатогенным грибам.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ярославцева, Ольга Николаевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Акулинин Т.Е., Василенко O.A. Экспресс - метод оценки вирулентности конидий Beauveria bassiana II Микология и фитопатология. 1993. № 5.С.74-76.

Андреева И.В., Штерншис М.В. Оценка боверина против вредителей защищенного грунта // Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов. Новосибирск, 1997. С. 19-23.

БенцГ. Синергизм микроорганизмов и химических инсектицидов // Микрооганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами / ред. М.С. Гиляров. М.: Колос. 1976. С. 105-123.

Борисов Б. А. Зоопаразитические кордиципитоидные грибы (Ascomycota, Hypocreales): о роли эдафического фактора возникновения и угасания эпизоотий в популяциях членистоногих и нематод // Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск. 2009. С. 36-39.

Борисов Б.А. Проблемы создания и использования микоинсектицидных препаратов // Докл. научного симпозиума СЭВ «Изучение энтомопатогенных микроорганизмов и разработка технологий производства и применения». Румыния, Бухарест: НииЗР, 1990. С. 8-22.

Борисов Б.А., Серебров В.В., Новикова И.И., БойковаИ.В. Энтомопатогенные аскомицеты и дейтеромицеты // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / ред.В.В. Глупов. М.: Круглый год, 2001. С. 352-427.

Вейзер Я. Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми. М.: Колос, 1972. 638 с.

Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю., Васильев C.B., Кочкина Г.А., Озерская С.М. Токсические метаболиты коллекционных культур энтомофторовых грибов и первичный отбор активных моноконидиальных

изолятов Entomophthora thaxteriana Peth (Zygomycetes, Entomophthorales // Микология и фитопатология. 1997. Т. 31. Вып. 3. С. 42-53.

Воронина Э. Г. Перспективы создания нового препарата микоафидина на основе гриба Entomophthora thaxteriana Peth // Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов. М, 1985. С. 61-66.

Воронина Э. Г. Энтомофторовые грибы и биопрепараты эпизоотийного и токсического действия // Защита растений. 1997. № 5. С. 12-13.

Воронцова Я.J1, Ершов Н.И, ГлуповВ.В, Влияние микроспоридии Vairimorpha ephestiae (Microsporidia: Burenellidae) на активность и спектр неспецифических эстераз различных тканей личинок большой пчелиной огневки Gallería mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) // Паразитология. 2006. Т. 40. № 1. С. 74-84.

Гештовт Н.Ю. Энтомопатогенные грибы (биотехнологические аспекты). Алматы, 2002. 288 с.

Гиндина Г.М, Митина Г.В, Павлюшин В.А. Токсигенность природных изолятов Verticillium lecanii (Zimmermann) Viegas // Микология и фитопатология. 1990. Т. 26. Вып. 6. С. 576-582.

Глупов В. В, Бахвалов С. А, Соколова Ю. А, Слепнева И. А. Механизмы резистентности насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / ред. Глупова В.В. М.: Круглый год, 2001. С. 475-557.

Горленко М.В, Соколов Д.В. Жизнь растений. Т. 2 Грибы. М.: Просвещение, 1976. 479 с.

Диксон М, Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. 1120с.

Дьяков Ю.Т, Шнырева А.В, Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов. М.: Академия, 2005. 304 с.

Евлахова А.А. Энтомопатогенные грибы. Систематика, биология, практическое значение. Л.: Наука, 1974. 240 с.

Ильинский А. И., Троиин И. В. Надзор, учёт и прогноз массовых размножений хвое- и листогрызущих насекомых в лесах СССР. М.: Лесная промышленность, 1965. 525 с.

Клочко М.Д. Сравнительное испытание энтомопатогенных микроорганизмов в борьбе с картофельной коровкой // Труды ВИЗР. 1965. Т. 6. №24. С. 187-189.

Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998. 479 с.

Кордюм В.А. Проблема выживания: от кратковременного прибывания к постоянному обитанию в экстремальных условиях // Биополимеры и клетка. 1992. Т. 8 № 2. С.337.

Крюков В.Ю., Ходырев В.П., Ярославцева О.Н., Каменова A.C. Дуйсембеков Б. А., Глупов В.В. Синергетическое действие энтомопатогенных гифомицетов и бактерий Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni при инфицировании личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata //Прик. биохим. и микробиол. 2009. Т. 45. № 5. С. 571-576.

Крюков В.Ю., Дубовский И.М., Ярославцева О.Н., Левченко М.В., СлямоваН.Д., Белгибаева А.Б., Ходырев В.П., ЛедневГ.Р., Глупов В.В. Сравнительный анализ двух штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae с разными жизненными стратегиями // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45. Вып. 2. С. 164-176.

Крюков В.Ю., СеребровВ.В, Малярчук A.A., Копжасаров Б.К., Мухамедиев Н.С., Орынбаева А.К., Ходырев В.П. Перспективы использования энтомопатогенных гифомицетов (Deuteromycota, Hyphomycetes) против колорадского жука в условиях Юго-Восточного Казахстана // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2007. № 4. С. 52-60.

Крюков В.Ю., Ярославцева О.Н., Леднев Г.Р., Борисов Б.А. Локальные эпизоотии, вызванные телеоморфными кордиципитоидными грибами

(Ascomycota: Hypocreales) в популяциях лесных чешуекрылых и пилильщиков летне-осеннего комплекса в Сибири // Микология и фитопатология. 2010. Т. 44. Вып. 4. С. 315-328.

Лапа Н.В, Гораль В.М. Применение боверина для защиты растений в СССР. // Информационный бюллетень ВПС МОББ. 1985. Вып. 12. С. 4751.

Леднев Г. Р, Левченко М. В. Мюскардинозы итальянского пруса в Новосибирской области // Защита растений от вредителей и болезней. Тр. СПбГАУ. 2004. С. 57-62.

Леднев Г.Р, Крюков В.Ю, Ходырев В.П, Левченко М.В, Дуйсембеков Б.А, Сагитов O.A., Глупов В.В. Динамика гибели азиатской саранчи при синхронном заражении энтомопатогенными грибами (Metarhizium anisopliae, Bauveria bassiana) и бактерией Pseudomonas sp. // Сиб. экол. журн. 2007. № 4. С. 527-531.

Литвинов М.А. Методы изучения микроскопических грибов. Л.: Наука, 1969. 124 с.

Логинов Е.В, Павлюшин В.А. Типы синергизма при бактериально -грибной смешанной инфекции личинок большой пчелиной огневки. // Интегрированная защита растений от вредителей. Сб. научн. трудов. Новосибирск: ВАСХНИЛ, 1987. С. 123-133.

Лозинская Я.Л. Изменение активности детоксицирующих ферментов и антиоксидантного статуса личинок Galleria mellonella L. при микроспоридиозе. Автореф. дисс.канд.биол.наук. Новосибирск, 2002. 22 с.

Лукина А. В. Селекция резистентных к фунгицидам штаммов гриба Beauveria bassiana для создания микоинсектицидных препаратов. Автореф. дис. канд.биол.наук. Алматы, 2005. 27 с.

Мартемьянов В.В, Бахвалов С.А, Рантала М.Дж, Дубовский И.М, Шульц Э.Э, Белоусова И.А, Стрельников А.Г, Глупов В.В. Реакция гусениц непарного шелкопряда Lymantria dispar L, инфицированных

вирусом ядерного полиэдроза, на индуцированную резистентность березы Betula pendula Roth // Экология. 2009. № 6. С. 459-464.

Михайлюков B.C. Heterodera humuli Filipjev, 1937 и другие нематоды хмеля на Украине. Автореф. дисс.канд.биол.наук. 1976. 583 с.

Мюллер Э, Леффлер В. Микология М.: Мир, 1995. 343с.

Огарков Б.Н, Огаркова Г.Р. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 2000. 134 с.

Огарков Б.Н. Комплексное применение микробиологических препаратов // Защита и карантин растений. 1999. №7. С. 23-27.

Павлюшин В. А.Биологическая защита растений от колорадского жука. // Защита и карантин растений. 2000. № 10. 48 с.

Павлюшин В. А. Контроль стабильности признака вирулентности у штаммов энтомопатогенных грибов // Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов М, 1985. С. 24-27.

Павлюшин В.А. Факторы вирулентности гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. и патогенез мускардиноза насекомых // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Л.: ВИЗР, 1979. 24 с.

Рославцева С.А, Еремина О.Ю, Костырко И.Н. Исследование эстеразных систем насекомых // Агрохимия. 1990. № 10.С. 117-123.

Рославцева С.А. Современные воззрения на биохимические механизмы резистентности // Агрохимия. 1994. № 10. С. 143-148.

Рославцева С.А, Баканова Е.И, Еремина О.Ю. Эстеразы членистоногих и их роль в механизмах детоксикации инсектоакарицидов // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 3. С. 368-375.

Серебров В.В. Детоксицирующие ферменты насекомых при микозах: Дис. канд. биол. наук. Новосибирск: ИСиЭЖ СО РАН, 2000.123 с.

Серебров В.В, Алексеев A.A., ГлуповВ.В. Изменение активности и спектра эстераз гемолимфы гусениц вощинной моли Galleria mellonella L.

(Lepidoptera; Pyralidae) при микозах // Известия РАН. Сер. биол. 2001. Т. 28. № 5. с. 588-592.

Серебров В.В., Гербер О.Н., Малярчук A.A., Мартемьянов В.В., Алексеев A.A., Глупов В.В. Влияние энтомопатогенных грибов на активность детоксицирующих ферментов гусениц пчелиной огневки, Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae), и роль детоксицирующих ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам // Известия РАН. Сер. биол. 2006. № 6. С.581-586.

Серебров В.В., Гербер О.Н., Ходырев В.П., Цветкова В.П. Перспективы совместного применения энтомопатогенных грибов и химических инсектицидов // Микология и фитопатология. 2005. Т. 39. Вып. 3. С.89-98.

Серебров В.В., Киселев A.A., Глупов В.В. Изучение некоторых факторов синергизма между энтомопатогенными грибами и химическими инсектицидами // Микология и фитопатология. 2003. Т. 1. Вып. 37. С. 7682.

Сикура А.И., Ижевский С.С., Трофимова И.Л. Микробиологические средства борьбы с колорадским жуком. М. 1979. 52 с.

Соколова Ю.Я., Сундуков О.В. Подавление активности эстераз как особенность патогенеза микроспоридиоза сверчков Gryllus bimaculatus II Паразитология. 1999. Т. 33. Вып. 6. С. 527-536.

Тамарина Н.А Техническая энтомология - новая отрасль прикладной энтомологии. Итоги науки и техники. Сер. Энтомол. Т. 7. Тех. Энтомол. М.: ВИНИТИ, 1987. 247 с.

Теленга H.A. Повышение мускардиноза у свекловичного долгоносика при помощи гексахлорана // Докл. АН СССР. 1956. С. 69-80.

Тыщенко В.П. Физиология насекомых. М.: Высшая школа, 1986. 303с.

Черепанов А.И. Жуки-щелкуны Западной Сибири. Новосибирск: Новосиб. книжн. изд-во, 1957. 383 с.

Черепанов А.И. Проволочники Западной Сибири. М.: Наука, 1965. 63

с.

Штейнхаус Э. Патология насекомых. М.: Изд-во иност.лит., 1952. 840 с.

Штерншис М.В. Энтомопатогены - основа биопрепаратов для контроля численности фитофагов. Новосибирск, 2010. 160 с.

Штерншис М.В., Джалилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г. Биологическая защита растений. М.: Колос, 2004. 264 с.

Штерншис М.В., Малярчук А.А., ГулийВ.В. Изучение энтомопатогенного гриба М. anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов/ Вестник ТГУ. 2008. №313. С.232-236.

Юй JL, Тулигуэл, Хайин Б. Cordyceps militaris II Лекарственные грибы Китая в традиционной китайской медицине и современных биотехнологиях / ред. Сысуев В.А. Киров: О-Краткое, 2009. С. 232-240.

Яркулов Ф.Я., Белякова Н.А., Леднев Г.Р., Новикова И.И., Павлюшин В.А. 2006. Экологические основы биологической защиты овощных культур в теплицах Приморского края. СПб-Владивосток. 184 с.

Ahmad A., Khan М.А. Effect of triol and makisterone A on the haemocytes of Hieroglyphus nigrorepletus Bolivar (Orthoptera: Acrididae) // Animal Sci. 1988. V. 97. №3. P. 203-210.

Al-Aidroos K., Seifert A.M. Polysaccharide and protein degradation, germination, and virulence against mosquitoes in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae//]. Invertebr. Pathol. 1980. V. 36. № 1. P. 29-34.

Aldridge W.N. An enzyme hydrolysing diethyl p-nitrophenyl phosphate (E600) and its identity with the A-esterase of mammalian sera // Biochem. J. 1953. V. 53. №62. P. 117-124.

Amiri-Besheli B, KhambayB, Cameron S, DeadmanM.L, ButtT.M. Inter- and intra-specific variation in destruxin production by insect pathogenic Metarhizium spp, and its significance to pathogenesis // Mycol. Res. 2000. V. 104. №4. P. 447-452.

Ashida M, Soderhall K. The prophenoloxidase activating system in crayfish. Comp. Biochem. Physiol. 1984.V. 77. P 21-26.

Bajan C. Changes in the pathogenicity of the entomopathogenic fungi under the influence of the method of culture and infection // Ecologia Polska. 1973. V. 21. №46. P.715-729.

Bajan C, Kmitova K. The effect of entomogenous fungi Paecilomices farinosus (Dicks.) Brown et Smith and Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. on the oviposition by Leptinotarsa decemlineata Say females and the survival of larvae // Ecologia Polska. 1972. V. 20. № 32. P. 423-432.

Bandani A.R. The Effects of entomopathogenic fungus, Tolypocladium cylindrosporum on cellular defence system of Galleria mellonella II J. Agric. Sci. Techn. 2008. V. 10. № 2. P. 135-146.

Bao Y.Y, Xue J, Wu W.J, Wang Y, Lv Z.Y, Zhang C.X. An immune-induced Reeler protein is involved in the Bombyx mori melanization cascade // Insect Biochem. Mol. Biol. 2011. V. 41. № 9. P. 696-706.

Barnes A. I. Siva-Jothy M. T. Density-dependent prophylaxis in the mealworm beetle Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae): cuticular melanization is an indicator of investment in immunity .// Proc. R. Soc. Lond. B. 2000. V. 267. 177-182.

Bidochka M.J, Clark D.C, Lewis M.W, Keyhani N.O. Could insect phagocytic avoidance by entomogenous fungi have evolved via selection against soil amoeboid predators? //Microbiology-Sgm. 2010. V. 156. P. 2164-2171.

Bidochka M.J, Kamp A.M., Lavender T.M, Dekoning J, Amritha De Croos J.N. Habitat association in two genetic groups of the insect-pathogenic

fungus Metarhizium anisopliae: uncovering cryptic species? // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67.№ 3. P. 1335-1342.

Bidochka M.J., Menzies F.V., Kamp A.M. Genetic groups of the insect-pathogenic fungus Beauveria bassiana are associated with habitat and thermal growth preferences // Arch. Microbiol.. 2002. V. 178. № 6. P. 531-537.

Bischoff J.F., Rehner S.A., Humber R.A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anispliae lineage //Mycologia. 2009.V. 101. № 4. P. 512-530.

Blanford S., Thomas M.B. Thermoregulation by two acridid species: effects of habitat and season on thermal behaviour and the potential impact on biocontrol with pathogens // Environ. Entomol. 2000. V. 29. 1060-1069.

Blanford S., Thomas M.B., Langewald J. Thermal ecology of Zonocerus variegatus and its effects on biocontrol using pathogens // Agric. Forest Entomol. 2000. V. 2. № 1. P. 3-10.

Blanford S., Thomas, M.B. Role of thermal biology in disease dynamics // Aspects Appl. Biol. 1999. V. 53, 73-82.

Blumberg D. Seasonal variations in the encapsulation of eggs of the encyrtid parasitoid Metaphycus stanleyi by the pyriform scale, Protopulvinaria pyriformis II Entomol. Exp. Appl. 1991. V. 58. № 3. P. 231-237.

Bogdan C., Rollinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity // Current Opinion in Immunology. 2000. V. 12, № 1. P. 64-76.

Bogus M.I., Czygier M., Golebiowski M., Kedra E., Kucinska J., Mazgajska J., Samborski J., Wieloch W., Wloka E. Effects of insect cuticular fatty acids on in vitro growth and pathogenicity of the entomopathogenic fungus Conidiobolus coronatus II Exp. Parasitol. 2010. V. 125. P. 400-408

Bohn H. Hemolymph clotting in insects // Immunity in invertebrates: cells, molecules, and defense reactions / Ed. M. Brehelin. Berlin: Springer-Verlag. 1986. P. 188-207.

Boyer S, Tilquin M, Ravanel P. Differential sensitivity to Bacillus thuringiensis var. israelensis and temephos in field mosquito populations of Ochlerotatus Cataphylla (Diptera: Culicidae): toward resistance? // Environ. Tox. Chem. 2007. V. 26. № l.P. 157-162.

Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

Braga G.U.L, Flint S.D, Messias C.L, Anderson A.J, Roberts D.W. Effect of UV-B on conidia and germlings of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae II Mycol. Res. 2001. V. 105. № 7. P. 874882.

Brehelin M, Zachary D. Insect haemocytes: a new classification to rule out the controversy // Immunity in invertebrates: cells, molecules, and defense reactions / Ed. Brehelin M. Berlin: Springer-Verlag, 1986. P. 36-48.

Brey P.T.T, Lee W.-J, Yamakawa M, Koizumi Y, Perrot S, Frangois M, Ashida M. Role of the integument in insect immunity: epicuticular abrasionand induction of cecropin synthesis in cuticular epithelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 6275-6279.

Broderick N.A, Raffa K.F, Handelsman J. Chemical modulators of the innate immune response alter gypsy moth larval susceptibility to Bacillus thuringiensis //BMC Microbiology. 2010. V. 10. P. 129.

Broderick N.A, Robinson C.J, McMahon M.D, Holt J, Handelsman J, Raffa K.F. Contributions of gut bacteria to Bacillus thuringiensis-induced mortality vary across a range of Lepidoptera // BMC Biology. 2009. V. 7. P. 11.

Brown S.E, Howard A, Kasprzak A.B, Gordon K.H, East P.D. The discovery and analysis of a diverged family of novel antifungal moricin-like peptides in the wax moth Galleria mellonella II Insect Biochem. Mol. Biol. 2008. V. 38. №2. P. 201-212

Bruck D.J. Fungal entomopathogens in the rhizosphere // The Ecology of fungal entomopathogens. Springer, 2010. P. 103-112.

Bugeme D.M., Knapp M., Boga H.I., Wanjoya A.K., Maniania N.K. Influence of temperature on virulence of fungal isolates of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the two-spotted spider mite Tetranychus urticae II Mycopathologia. 2009. V. 167. № 4. P. 221-227.

Bulet P., Hetru C., Dimarcq J.-L ., Tomann D.A. Antimicrobial peptides in insects; structure and function // Developmental and Comparative Immunology. 1999. V. 23. P. 329-344

Cagan L., Svercel M. The influence of ultraviolet Light on pathogenicity of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin to europian corn borer, Ostrinia nubilalis Hbn. (Lepidoptera: Crambidae) // J. Centr. Europ. Agric. 2001. V. 2. № 3. P. 235-240.

Castellanos-Moguel J., Gonzalez-Barajas M., Mier T., del Rocio-Reyes-Montes M., Aranda E., Toriello C. Virulence testing and extracellular subtilisin-like (Prl) and trypsin-like (Pr2) activity during propagule production of Paecilomyces fumosoroseus isolates from whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae) // Rev. Iberoam Micol. 2007. V. 24. P. 62-68.

Cavelier F., Verducci J., Andre F., Haraux F., Sigalat C., Traris M., Vey A. Natural cyclopeptides as leads for novel pesticides: tentoxin and destruxin' // Pesticide Science. 1998. V. 52. № 1. P. 81-89.

Cerenius L., Soderhall K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates // Immunol. Rev. 2004. V. 198. № 1. P. 116-126.

Cerenius L., Trornqvist P.-O., Vey A., Johansson M.W., Soderhall K. The effect of the fungal toxin destruxin E on isolated crayfish haemocytes // J. Insect Physiol. 1990. V. 36. № 10. P. 785-789.

Chain B.M., Leshon-Sorland K., Siva-Jothy M.T. Hemocyte heterogeneity in the cockroach Periplaneta americana analysed using monoclonal antiboidas 113. Cell Sci. 1992. V. 103. P. 1261-1267.

Charnley A.K. Collins S.A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control // Environmental and microbial relationships. The Mycota: A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research / Eds. C.P. Kubicek, K. Esser and I.S. Druzhinina. V. 4. Springer, 2007. P. 159-187.

Charnley A.K, Fungal pathogens of insects: cuticle degrading enzymes and toxins // Adv. Bot. Res. 2003. V. 40. P. 241-321.

Costa S.D, Barbercheck M.E, Kennedy G.G. Mortality of Colorado potato beetle (.Leptinotarsa decemlineata) after sublethal stress with the CrylllA d-endotoxin of Bacillus thuringiensis and subsequent exposure to Beauveria bassiana //J. Invertebr. Pathol. 2001. V. 77. №3. P. 173-179.

Cytrynska M, Mak P, Zdybicka-Barabas A, Suder P, Jakubowicz T. Purification and characterization of eight peptides from Galleria mellonella immune hemolymph. // Peptides. 2007. V. 28. 533-546

DeCrecyE, Jaronski S, Lyons B, Lyons T.J, Keyhani N.O. Directed evolution of a filamentous fungus for thermotolerance // BMC Biotechnology. 2009. V 9. № l.P. 74.

DelgadoF.X, BrittonJ.H, OnsagerJ.A. et al. Field assessment of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin and potential synergism with diflurbenzuron for control of savanna grasshopper complex (Orthoptera) in Mali // J. Invertebr. Pathol. 1999. V. 73. P. 34-39.

Dimbi S., Maniania N.K, Lux S.A, Mueke J.M. Effect of constant temperatures on germination, radial growth and virulence of Metarhizium anisopliae to three species of African tephritid fruit flies // BioControl. 2004. V. 49. P. 83-94.

Dubovskiy I. M, KryukovaN. A, GlupovV. V. Phagocytic activity and encapsulation rate of Galleria mellonella larvae hemocytes during bacterial infection by Bacillus thuringiensis II J. Invertebr. Pathol. 2008. V. 98. № 3. P. 360-362.

Dubovskiy I.M., Kryukov V.Yu., Benkovskaya G.V., Yaroslavtseva O.N., Surina E.V., Glupov V.V. Activity of detoxificative enzymes system and encapsulation rate in Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata larvae under organophosphorus insecticide treatment and entomopathogenic fungus Metharizium anisopliae infection // Euroasian Entomol. J. 2010. № 4. P. 577582.

Dutt M.S., Balasubramanian R. In vitro bioefficacy of Beauveria bassiana isolate (FB-12) and its combination with chemical insecticides against cabbage diamond back moth, Plutella xylostella on cabbage. // Biotechnology in Ag. Industry & Environ microbiologists Society. / ed. DeshmukhA.M. Karad, 2002.P. 70-72.

EdgingtonS., SeguraH., de La Rosa W., Williams T. Photoprotection of Beauveria bassiana: testing simple formulations for control of the coffee berry borer // Int. J. Pest Manag. 2000. V. 46. № 3. P. 169-176.

Elliot S.L., Blanford S., Thomas M.B. Host-pathogen interactions in a varying environment: temperature, behavioural fever and fitness // Proc. R. Soc. Lond. B. 2002. V. 269. P. 1599-1607.

Ericsson J.D., Janmaat A.F., Lowenberger C., Myers J. H. Is decreased generalized immunity a cost of Bt resistance in cabbage loopers Trichoplusia nil II J. Invertebr. Pathol. 2009. V. 100. № 2. P. 61-67.

Ewen A.L.B., Arthur A.P. Cuticular encystment in three noctuid species (Lepidoptera): induction by acid gland secretion from an ichneumonid parasite (.Banchus flavescens) // Ann. Entomol. Soc. Am. 1976. V. 69. № 6. P. 10871090.

Fan Y, Fang W., Guo S., Pei X., Zhang Y, Xiao Y., Li D., Jin K., Bidochka M.J., Pei Y. Increased insect virulence in Beauveria bassiana strains overexpressing an engineered chitinase'// Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. № l.P. 295-302.

Fargues J, ManianiaN.K, Delmas J.C, SmitsN. Influence of temperature on in vitro growth of entomopathogenic hyphomycetes // Agronomie. 1992. V. 12. № 7. P. 557-564.

Fehlbaum P, Bulet P, Michaut L, Lagueux M, Broekaert W.F, Hetru C, Tomann J.A. Insect immunity: septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant anti-fungal peptides // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 33. P. 159-163.

Fenoglio C, Bernardini P, Gervaso M. V. Cytochemical characterization of the hemocytes of Leucophaea maderae (Dictyoptera: Blaberoidea) // Journal of Morphology. 1993. V. 218. № 2. P. 115-126.

Fernandes E.K.K, Rangel D.E.N, Moraes A.M.L, Bittencourt V.R.E.P, Roberts D. W. Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and thermotolerance of Beauveria II J. Invertebr. Pathol. 2008. V. 98. № 1. P. 69-78.

FeyereisenR. Cytochome P450 enzymes // Annu. Rev. Entomol. 1999. V. 44. P. 507-533.

Fisher C.W, Brady U.E. Increased rate of melanization in hemolymph of american cockroaches (Periplaneta americana) and house crickets {Acheta domesticus) intoxicated by insecticides // Experientia. 1980. V. 36. № 1. P. 9394.

Fujimoto K, Okino N, Kawabata S.-I, Iwanaga S, Ohnishi E. Nucleotide sequence of the cDNA encoding the proenzyme of phenol oxidase Al of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 77697773.

Furlong M J, Groden E, Evaluation of synergistic interactions between the Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) pathogen Beauveria bassiana and the insecticides, imidacloprid, and cyromazine // J. Econ. Entomol. 2001. V. 94. №2. P. 344-356.

Gandhe A.S., John S.H., Nagaraju J., Noduler A. Novel Immune Up-Regulated Protein Mediates Nodulation Response in Insects // Journal of Immunology. 2007. V. 179. P. 6943-6951.

Gardiner E.M.M, Strand M.R. Monoclonal antibodies bind distinct classes of hemocytes in the moth Pseudoplusia includens // J. Insect Physiol. 1999. V. 45. №2. P. 113-126.

Gillespie J.P., Kanost M.R. Biological mediators of insect immunity // Annu. Rev. Entomol. 1997. V. 42. P. 611-643.

Gillespie J.P., Bateman R., Charnley A.K. Role of cuticle-degrading proteases in the virulence of Metarhizium spp. for the desert locust, Schistocerca gregaria II J. Invertebr. Pathol. 1998. V. 71. № 2. P. 128-137.

Gillespie J.P., Burnett C., Charnley A.K. The immune response of the desert locust Schistocerca gregaria during mycosis of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var acridum II J. Insect Physiol. 2000. V. 46. P 429^137.

Goettel M.S. Pathogenesis of the hyphomycete Tolypocladium cylindrosporum in the mosquito Aedes aegypti II J. Inverteb. Pathol. 1988. V. 51. №3. P. 259-274.

Gregorio E.D., Han S.-J., Lee W.-J., Baek M.-J., Osaki T., Kawabata S.-I., Lee B.-L., Iwanaga S., Lemaitre B., Brey P.T. An immune-responsive serpin regulates the melanization cascade in Drosophila II Develop. Cell. 2002. V. 3. №4. P. 581-592.

Grizanova E.V., Dubovskiy I.M., Glupov V.V. Cellular and humoral immune reactions of Galleria mellonella larvae during bacterial infection by Bacillus thuringiensis II BMC Immunology. 2012. (in press)

Gullan P.J., Cranston P.S. The insects: an outline of entomology. Oxford: Wiley-Blakwell, 2010. 567 p.

Gunnarsson S.G.S. Effects in vivo of (3-1,3-glucans from fungal cell walls on the circulating haemocytes of the desert locust Schistocerca gregaria 11 J. Insect Physiol. 1988. V. 34. № 1. P. 47-51.

Gunning R.V, Dang H.T, Kemp F.C, Nicholson I.C, Graham D. M. New resistance mechanism in Helicoverpa armigera threatens transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis CrylAclO toxin // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. № 5. P. 2558-2563.

Gupta A.P. Cellular elements in the hemolymph // Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. V. 3. / eds. Kerkut G.A, Gilbert L.I. Oxford: Pergamon, 1985 P. 401-451.

Gupta A.P. Insect immunocytes and other hemocytes: roles in cellular and humoral immunity // Immunology of Insects and Other Arthropods / ed. Gupta A.P. CRC Press, 1991. P. 19-118.

Gupta A. P Immunology of Invertebrates: Cellular // Encyclopedia Of Life Sciences. Nature Publishing Group, 2001. P. 1-6.

Habig W.H, Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 7130-7139.

Hajek A.E, St. Leger R.J. Interactions between fungal pathogens and insect hosts // Annu. Rev. Entomol. 1994. V. 39. P. 293-322.

Hall M, Scott T, Sugumaran M, Soderhall K,. La J.H. Proenzyme of Manduca sexta phenoloxidase: Purification, activation, substrate specificity of the active enzyme, and molecular cloning // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7764—7768.

Hancock R. E. W, Sahl H.-G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies // Nature Biotechnology. 2006. V. 24. № 12. P. 1551-1557.

Hernandez S, Lanz H, Rodriguez M. H, Torres J.A, Martinez-Palomo A, Tsutsumi V. Morphological and cytochemical characterization of female

Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae) hemocytes // J. Med. Entomol. 1999. V. 36. № 4. P. 426^134.

Hiromori H., Nishigaki J. Factor analysis of synergistic effect between the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and synthetic insecticides // Appl. Entomol. Zool. 2001. V. 36. № 2. P. 231-236.

Hoffmann J.A. Innate immunity of insects // Curr. Opin. Immunol. 1995. V. 7. № 1 P. 4-10.

Holliday H., Cleaver M. Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A review // Int. J. Med. Mushrooms. 2008. V. 10. P. 209-218.

Hopkins T.L., Kramer K.J. Insect Cuticle Sclerotization // Annu. Rev. Entomol. 1992. V. 37. P. 273-302.

Hopkinson-Woolley J., Hughes D., Gordon S., Martin P. Macrophage recruitment during limb development and wound healing in the embryonic and foetal mouse // J. Cell Sci. 1994. V. 107. P. 1159-1167.

Hu Q.B., Ren S.X., Wu J.H., Chang J.M., Musa P.D. Investigation of destruxin A and B from 80 Metarhizium strains in China, and the optimization of cultural conditions for the strain MaQlO // Toxicon. 2006. V. 48. №5. P.491-498

HumberR.A.. Fungi: Identification // Manual of techniques in insect pathology / Ed. Lacey L.A. Academic Press, 1997 P. 153-185.

Hung S.Y., Boucias D.G. Phenoloxidase activity in hemolymph of naive and Beauveria bassiana-mfQctcd Spodoptera exigua Larvae // J. Inverteb. Pathol. 1996. V. 67. № 1. P. 35-40.

Huxham I. M., Lackie A. M., Mccorklnoalet N.J. J. Inhibitory effects of cyclodepsipeptides, Destruxins, from the fungus Metarhizium ankwpliae, on cellular immunity in insects In.wcr Physiol. 1989a. V. 35. № 2. P. 97-105.

Huxham I.M., Samuels K.D.Z., Heale J.B., McCorkindale N.J. In vivo and in vitro assays for pathogenicity of wild-type and mutant strains of Metarhizium

anisopliae for three insect species // J. Invertebr. Pathol. 1989b. V. 53. №2. P. 143-151.

Inglis G.D, Goettel M.S, Erlandson M.A, Weaver D.K. Grasshoppers and locusts // Field manual of techniques in invertebrate pathology. Application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests / eds. Lacey L.A, Kaya H.K. Springer, 2007. P. 627-654.

Iwanaga S, Kawabata S, Miura Y, Seki N, Shigenaga T, Muta T. Clotting cascade in the immuno response of horseshoe crab; Phylogenetic perspectives // Immunity: The Insect Host Defense / eds. Hoffmann J, Natori S. USA: Biomedical Publishers, 1994. P. 79-96.

Jackson C.V, Heale J.B, Hall R.A. Traits associated with viruience to the aphid Macrosiphoniella sanborni ineighteen isolates of Verticillium lecanii II Ann. Appl. Biology. 1985. V. 106. P. 39-48.

James P.J, Kershaw M.J, Reynolds S.E, Charnley A.K. Inhibition of desert locust (Schistocerca gregaria) malpighian tubule fluid secretion by destruxins, cyclic peptide toxins from the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae II J. Insect Physiol. 1993. V. 39. № 9. P. 797-804.

James R.R, Buckner J.S, Freeman T.P. Cuticular lipids and silverleaf whitefly stage affect conidial germination of Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus II J. Invertebr. Pathol.. 2003. V. 84. № 2. P. 67-74.

Jaronski S.T, Goettel M.S, Lomer C.J. Regulatory requirements for ecotoxicological assessments of microbial insecticides - how relevant are they? // Environmental impacts of microbial insecticides / Eds. Hokkanen H.M.T, HajekA.E. The Netherlands, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 237-260.

Jiang H.B, Kanost M.R. Characterization and functional analysis of 12 naturally occurring reactive site variants of serpin-1 from Manduca sexta // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 2. P. 1082-1087.

Jones S.L., Lindberg F.P., Brown E.J. Phagocytosis // Fundamental Immunology // ed. Paul WE., Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1999. 997-1020.

Joshi P.A., Lambdin P.L. The ultrastructure of hemocytes in Dactylopius confusus (Cockerell), and the role of granulocytes in the synthesis of cochineal dye // Protoplasma. 1996. V. 192. P. 199-216.

Kamata N. Periodic outbreaks of the beech caterpillar, Quadricalcarifera punctatella, and its population dynamics: the role of insect pathogens // Population dynamics, impacts, and integrated management of forest defoliating insects (Eds. M. L. McManus, A.M. Liebhold). Gen. Tech. Rep. NE-247, Radnor, PA: USDA Forestry Service, Northeastern Research Station. 1998. P. 34-46.

Kamata N. Population dynamics of the beech caterpillar, Syntypistis punctatella, and biotic and abiotic factors // Popul. Ecol. 2000. V. 42. P 267278.

Kanost M.R., Jiang H., Yu X.-Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta II Immunol. Rev. 2004. V. 198. P. 97-105.

Kassa A. Development and testing of mycoinsecticides based on submerged spores and aerial conidia of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) for control of locusts, grasshoppers and storage pests. Doctoral diss. Gottingen: Georg-August-University, 2003. 170 p.

Kaufmann S.H E. Immunology's foundation: the 100-year anniversary of the Nobel Prize to Paul Ehrlich and Elie Metchnikoff // Nat. Immunol. 2008. V. 9. № 7. P. 705-712.

Kershaw M. J., Moorhouse E. R., Bateman R., Reynolds S. E., Charnley A. K. The role of destruxins in the pathogenicity of Metarhizium anisopliae for three species of insect // J. Invertebr. Pathol. 1999. Vol. 74. № 3. P. 213-223.

Khachatourians G.G, Qazi S.S. Entomopathogenic fungi: biochemistry and molecular biology // Human and Animal Relationships The Mycota V. 6. P. 1. / Eds. Brakhage A.A, Zipfel P.F. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2008 P. 33-61.

Kim T, Kim Y.-J. Overview of innate immunity in Drosophila. Review // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. V. 38. № 2. P. 121-127.

Klowden M.J. Physiological systems in insects. USA: Elsevier, 2007. 688 p.

Kramer K.J, Kanost M.R, HopkinsT.L, Jiang H, Zhu Y.C, Xu R, KerwinJ.L, Turecek F.. Oxidative conjugation of catechols with proteins in insect skeletal systems // Tetrahedron. 2001. V. 57. № 2. P. 385-392

Kryukov V.Yu, Khodyrev V.P, Yaroslavtseva O.N, Kamenova A.S. Duisembekov B.A, Glupov V.V. Synergistic action of entomopathogenic Hyphomycetes and the bacteria Bacillus thuringiensis ssp. morrisoni in the infection of Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata II Appl. Biochem. Microbiol. 2009. V. 45. № 5. P. 511-516.

Kryukova N.A, Dubovskiy I.M, Chertkova E.A, Vorontsova Y.L, Slepneva I.A, Glupov V.V. The effect of Habrobracon hebetor venom on the activity of the prophenoloxidase system, the generation of reactive oxygen species and encapsulation in the haemolymph of Galleria mellonella larvae // J. Insect Physiol. 2011. V. 57. № 6. P. 796-800

Kunimi Y, Yamada E. Relationship of larval phase and susceptibility of the armyworm, Pseudaletia separata Walker (Lepidoptera, Noctuidae) to a nuclear polyhedrosis virus and a granulosis virus // Appl. Entomol. Zool. 1990. V. 25.P. 289-297.

Lacey L.A, Horton D.R, Chauvin R.L, Stocker J.M. Comparative efficacy of Beauveria bassiana, Bacillus thuringiensis, and aldicarb for control of Colorado potato beetle in an irrigated desert agroecosystem and their effects on biodiversity//Entomol. Exp. Appl. 1999. V. 93, P. 189-200.

Lappa N.V, Goral V.M, Markys V.G, Action of Beauverin on eggs of Eurygaster integriceps // Zakh. Rosl. Kiev. 1972. V. 16. P. 23-24.

Lavine M.D, Strand M.R. Insect hemocytes and their role in immunity // Insect Biochem. .Mol. Biol. 2002. V. 32. P. 1295-1309.

Leal S.C.M, Bertioli D.J, Butt T.M, Carder J.H, Burrows P.R, Peberdy J.F. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Prl gene for the detection and characterization of Metarhizium strains // Mycol. Res. 1997. V. 101. №3. P. 257-265.

Lebestky T, Chang T, Hartenstein V, Banerjee U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors // Science. 2000. V. 288, № 5463. P. 146-149.

Lee K. P, Cory J.S, Wilson K, Raubenheimer D, Simpson S.J. Flexible diet choice offsets protein costs of pathogen resistance in a caterpillar // Proc. R. Soc. London. B. 2006. V. 273. P. 823-829.

Lee Y.S, Yun E.K, Jang W.S, Kim I, Lee J.H, Park S.Y, Ryu K.S, Seo S.J,. Kim C.H,. Lee I.H. Purification, cDNA cloning and expression of an insect defensin from the great wax moth, Galleria mellonella II Insect Mol. Biol. 2004. V. 13. № l.P. 65-72.

Lewis L.C, Bing L.A. Bacillus thuringiensis Berliner and Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillimen for European corn borer control - program for immediate and season-long suppression // Can. Entomol. 1991. V. 123. №2. P. 387-393.

Li X, Schuler M.A, Berenbaum M.R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics // Annu. Rev. Entomol. 2007. V. 52. P. 231-253.

Liang Z, Sottrup-Jensen L, Aspan A, Hall M, Soderhall K. Pacifastin, a novel 155-kDa heterodimeric proteinase inhibitor containing a unique transferring chain // PNAS. 1997. V 94. № 13. P. 6682-6687.

Lomer C.J., Bateman R.P., Johnson D.L., Lagewald J., Thomas M. Biological control of locusts and grasshoppers // Annu. Rev. Entomol. 2001. V. 46. P. 667-702.

Luckhart H., Cupp M.S., Cupp E.W. Morphological and functional classification of the hemocytes of adult female Simulium vittatum (Diptera: Simuliidae)//J. Med. Entomol. 1992. V. 29. № 3. P. 457^66.

Mamidala P., Susan C.J., Mittapalli O. Review. Metabolic resistance in bed bugs // Insects. 2011. V. 2. P. 36^18.

Maniania N.K., Sithanantham S., Ekesi S., Ampong-Nyarko K., Baumgartner J., Lohr B., Matoka C.M. A field trial of the entomogenous fungus Metarhizium anisopliae for control of onion thrips, Thrips tabaci II Crop Protection. 2003. V. 22. № 3. p. 553-559.

Meister M., Hetru C., Hoffmann J.A. The antimicrobial host defense of Drosophila //Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. V. 248. P. 17-36.

Ment D., Gindina G., Soroker V., Glazer I., Rot A., Samish M. Metarhizium anisopliae conidial responses to lipids from tick cuticle and tick mammalian host surface // J. Invertebr. Pathol. 2010. V. 103. № 2. P. 132-139.

Meyling N.V., Hajek A.E. Principles from community and metapopulation ecology: application to fungal entomopathogens // BioControl. 2010. V. 55. № 1. P. 39-54.

Miller J.S., Howard R.W., Rana R.L., Tunaz H., Stanley D.W. Eicosanoids mediate nodulation reactions to bacterial infections in adults of the cricket, Gryllus assimilis II J. Insect Physiol. 1999. V. 45. P.75-83.

Milner R.J., Samson P.R., Bullard G.K. FI-1045: A profile of a commercially useful isolate of Metarhizium anisopliae var. anisopliae II Biocontrol Sci. Techn. 2002. V. 12. № 1. P.43-58.

Mitsui J., Kunimi Y. Effect of larval phase on susceptibility of the armyworm, Pseudaletia separate Walker (Lepidoptera: Noctuidae) to an

entomogeneous deuteromycete, Nomuraea rileyi II Jpn. J. Appl. Entomol. Zool. 1988. V. 32. P. 129-134.

Mohanty S. S, Raghavendra K, Dash A.P.Induction of chymoelastase (Prl) of Metarhizium anisopliae and its role in causing mortality to mosquito larvae II World J Microbiol Biotechnol. 2008.V. 24. № 10. P. 2283-2288.

Morley-Davies J, Moore D, Prior C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures //Mycol. Res. 1996. V. 100. № 1. P. 31-38.

Mullen L.M, Goldsworthy G.J. Immune responses of locusts to challenge with the pathogenic fungus Metarhizium or high doses of laminarin // J. Insect Physiol. 2006. V. 52. № 4. P. 389-398.

Muta T, Iwanaga S. The role of hemolymph coagulation in innate immunity// Curr. Opin. Immunol. 1996. V. 8. P. 41-47.

Mwamburi L.A, Laing M.D., Miller R. Interaction between Beauveria bassiana and Bacillus thuringiensis var. israelensis for the control of house fly larvae and adults in poultry houses // Poultry Sci. 2009. V. 88. № 11. P. 23072314.

Nappi A, Poirie M, Carton Y. The Role of melanization and cytotoxic by products in the cellular immune responses of Drosophila against parasitic wasps // Advances in parasitology. V. 70: / Ed. Prevost G. Elsiver, 2009 P. 99-121.

Nappi A.J, Vass E. Melanogenesis and the generation of cytotoxic molecules during insect cellular immune-reactions // Pigment Cell Research. 1993. V. 6. № 3. P. 117-126.

Nelson D.R, Fatland C.L, Buckner J.S, Freeman T.P. External lipids of adults of the giant whitefly, Aleurodicus dugesii // Comp. Biochem. Physiol. B. 1999. V. 123. P. 137-145.

Neufeld T.P, Baehrecke E.H. Eating on the fly: Function and regulation of autophagy during cell growth, survival and death in Drosophila 11 Autophagy. 2008. V. 4. № 5. P. 557-562.

Ouedraogo R.M., Cusson M., Goettel M.S., Brodeur J. Inhibition of fungal growth in thermoregulating locusts, Locusta migratoria, infected by the fungus Metarhizium anisopliae var acridum II J. Invertebr. Pathol. 2003. V. 82 P. 103— 109.

Ouedraogo A., Fargues J., Goettel M.S., Lomer C.J. Effect of temperature on vegetative growth among isolates of Metarhizium anisopliae and M. flavoviride Mycopathologia. 1997.V. 137. P. 37-43.

Ouedraogo R.M., Goettel M. S., Brodeur J. Behavioral thermoregulation in the migratory locust: a therapy to overcome fungal infection // Oecologia. 2004. V. 138. P. 312-319.

Park D.-S., Shin S.W., Hong S.-D., Park H.-Y. Immunological detection of serpin in the fall webworm, Hyphantria cunea and its inhibitory activity on the prophenoloxidase system// Molecules and Cells. 2000. V. 10. № 2. P. 186-192.

Paterson R.R.M. Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory? // Phytochemistry. 2008. V. 69, № 7. P. 14691495.

Pava-Ripoll M., Posada F. J., Momen B., Wang C., St. Leger R. J. Increased pathogenicity against coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae) by Metarhizium anisopliae expressing the scorpion toxin (AalT) gene // J. Invertebr. Pathol. 2008. Vol. 99. № 2. P. 220-226.

Pedras M.S.C., Zaharia L.I., Ward D.E. The destruxins: synthesis, biosynthesis, biotransformation, and biological activity. Review // Phytochemistry. 2002. V. 59. № 6.P. 579-596.

Prabhakaran S.K., Kamble S.T. Purification and characterization of an esterase isozyme from insecticide resistant and susceptible strains of German

cockroach, Blattella germanica (L.) // Insect Biochem. Mol. Biol. 1995. V. 25. №4. P. 519-524.

Purwar J.P, Sachan G.C. Synergistic effect of entomogenous fungi on some insecticides against bihar hairy caterpillar Spilarctia obliqua (Lepidoptera: Arctiidae) // Microbiol. Res. 2006. V. 161 P. 38-42.

Quintela E.D, McCoy C.W. Pathogenicity enhancement of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to first instars of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae) with sublethal doses of imidacloprid // Environ. Entomol. 1997. V. 26. P. 1173-1182.

Quintela E.D, McCoy C.W. Conidial attachment of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the larval cuticle of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae) treated with imidacroprid // J. Invertebr. Pathol. 1998. V. 72. P. 220-230.

Reeson A.F, Wilson K, Gunn A, Hails R.S, Goulson D. Baculovirus resistance in the noctuid Spodoptera exempta is phenotypically plastic and responds to population density // Proc. R. Soc. Lond. B. 1998. V. 265. P. 17871791.

Rehner S.A, Buckley E.A. Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EFl-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs // Mycologia. 2005. V. 97. № 1. P. 84-98.

Riaza M.A, Poupardina R, Reynauda S, Strodeb C, Ransonb H, DavidaJ.P. Impact of glyphosate and benzo[a]pyrene on the tolerance of mosquito larvae to chemical insecticides. Role of detoxication genes in response to xenobiotics // Aquatic Toxicology. 2009. V. 93. P. 61-69.

Roberts D. W, St. Leger R. J. Metarhizium spp, cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects // Adv. Appl. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1-70.

Rosales C. Phagocytosis, a cellular immune response in insects // IS J 2011. V. 8. P. 109-131.

Roy H.E., Steinkraus D.C., Eilenberg J., Hajek A.E., Pell J.K. Bizarre interactions and endgames: Entomopathogenic fungi and their arthropod hosts // Annu. Rev. Entomol. 2006. V. 51. 331-357

Samuels R.I., Charneley A.K., Reynolds S.E. The role of destruxins in the pathogenicity of 3 stains of Metarhizium anisopliae for the tobacco hornworm Manduca sexta // MycopaXhol. 1988. V. 104. P. 51-58.

Schuhmann B., Seitz V., Vilcinskas A., Podsiadlowski L., Cloning and expression of gallerimycin, an antifungal peptide expressed in immune response of greater waxmoth larvae, Galleria melonella II Arch. Insect Biochem. Physiol. 2003. V. 53. P. 125-133.

Scott J.G, We Z. Cytochromes P450 of insects: the tip of the iceberg // PestManag. Sci. 2001. V. 57. № 10. P. 958-967.

Serebrov V.V., Maljarchuk A.A., Shterashis M.V., Spontaneous variability of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. strains as an approach for enhancement of insecticidal activity // Plant sci. (Sofia). 2007. V. 44. № 3. P. 236-239.

Shipp J.L., Zhang Y.,. Hunt D.W.A., Ferguson G. Influence of humidity and greenhouse microclimate on the efficacy of Beauveria bassiana (Balsamo) for control of greenhouse arthropod pests // Environ. Entomol. 2003. V. 32. №5. P. 1154-1163.

Shrestha S., Hong Y.P., Kim Y. Two chemical derivatives of bacterial metabolites suppress cellular immune responses and enhance pathogenicity of Bacillus thuringiensis against the diamondback moth, Plutella xylostella // J. Asia-Pacific Entomol. 2010. V. 13. № 1. P. 55-60.

Shrestha S., Kim Y. Oenocytoid cell lysis to release prophenoloxidase is induced by eicosanoid via protein kinase C // J. Asia-Pacific Entomol. 2009. V. 12. № 4. P. 301-305.

Sideri M., Tsakas S., Markoutsa E., Lampropoulou M., Marmaras V.J. Innate immunity in insects: surface-associated dopa decarboxylase-dependent

pathways regulate phagocytosis, nodulation and melanization in medfly haemocytes // Immunology. 2008. V. 123. № 4. P. 528-537.

Sierpinska A. Towards an integrated management of Dendrolimus pini L. // Population dynamics, impacts, and integrated management of forest defoliating insects (Eds. M. L. McManus, A.M. Liebhold). Gen. Tech. Rep. NE-247, Radnor, PA: USDA Forestry Service, Northeastern Research Station, 1998. P. 129-142.

Siqueira H.A.A, Narciso R, Guedes C, Pican£o M.C. Cartap resistance and synergism in populations of Tuta absoluta (Lep, Gelechiidae) // Agr. Forest Entomol. 2000. V. 2. № 2. P. 147-153.

Smith R.J, Grula E.A. Toxic components on the larval surface of the corn earworm (Heliothis zea) and their effects on germination and growth of Beauveria bassiana II J. Invertebr. Pathol. 1982. V. 39. № 1. P. 15-22.

Snyder M.J, Maddison D.R. Molecular phylogeny of glutathione-S-transferases // DNA and Cell Biology. 1997. V. 16. № 11. P. 1373-1384.

Soderhall K, Ajaxon R. Effect ofquinones and melanin on mycelial growth of Aphanomyces spp, and extracellular protease of Aphanomyces astaci, a parasite on crayfish // J. Invertebr.Pathol. 1982. V. 39. P. 105-109.

Sree K.S, Padmaja V. Destruxin from Metarhizium anisopliae induces oxidative stress effecting larval mortality of the polyphagous pest Spodoptera litura II J. Appl. Entomol. 2008.V. 132. № 1. P. 68-78.

Srimal S, Armstrong P.B. Interaction of immune defense systems of Limulus polyphemus with an extracorporeal protease secreted by the principal ectoparasite of Limulus, the triclad turbellarid worm, Bdelloura Candida II Indian J. Biol. 1996. V. 34. P. 1081-1084.

St. Leger R.J. The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insects // Can. J. Bot. 1995. V. 73. P. 1119-1125.

St. Leger R.J., Cooper R.M., Charnley A.K., The effect of melanization of Manduca sexta cuticle on growth and infection by Metarhizium anisopliae II J. Invertebr. Pathol. 1988. V. 52. P. 459-470.

St. Leger R.J., Joshi L., Bidochka M. J., Roberts D. W. Construction of an improved mycoinsecticide over-expressing a toxic protease // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 93, N 13. P. 6349-6354.

Starks P.T., Blackie C.A., Thomas D. Seeley fever in honeybee colonies // Naturwissenschaften. 2000. V. 87. № 5. P. 229-231.

Strand M.R. Insect hemocytes and their role in immunity // Insect immunology. UK: Elsevier, 2008 P. 25-47.

Strand M.R., Johnson R., Jena A. Characterization of monoclonal antibodies to hemocytes of Pseudoplusia includens II J. Insect Physiol. 1996. V. 42. № l.P. 21-31.

Sugumaran M. Unified mechanism for Sclerotization of Insect Cuticle // Adv. Insect Physiol. 1998. V. 27. P. 229-334.

Sugumaran M., Chemistry of sclerotization // Adv. Insect Physiol. 2010. V. 39. P. 151-200.

Sung G.-H., Hywel-Jones N.L., Sung J.-M., Luangsa-ard J.J., Shrestha B., Spatafora J.W. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi // Stud. Mycol. 2007. Vol. 57. P. 5-59.

Tan S.Y., Dee M.K. Elie Metchnikoff (1845-1916): discoverer of phagocytosis // Singapore Med. J. 2009. V. 50. № 5. P. 456^157

Theopolda U., Lib D., Fabbrib M., Scherfera C., Schmidtb O. Review. The coagulation of insect hemolymph // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 363372.

Thomsen L., Eilenberg J. Time-concentration mortality of Pier is brassicae (Lepidoptera: Pieridae) and Agrotis segetum (Lepidoptera: Noctuidae) larvae from different destruxins // Environ. Entomol. 2000. V. 29. № 5. P. 1041-1047.

Tokarev Y.S, Levchenko M.V, Naumov A.M., Senderskiy I.V, Lednev G.R. Interactions of two insect pathogens, Paranosema locustae (Protista: Microsporidia) and Metarhizium acridum (Fungi: Hypocreales), during a mixed infection of Locusta migratoria (Insecta: Orthoptera) nymphs // J. Inverteb. Pathol. 2011. V. 106. P. 336-338.

Tsakas S, Marmaras V.J. Insect immunity and its signalling: an overview // Invertebr. Survival. J. 2010. V. 7. P. 228-238.

Vass E, Nappi A.J. Fruit fly immunity // Bioscience. 2001. V 51. P. 529535.

Vidal C, Fargues J. Climatic constraints for fungal biopesticides // Use of entomopathogenic fungi in biological pest management / Eds. Ekesi S, Maniana N.K. Kerala, India: Research Signpost. 2007. P. 39-55.

Vilcinskas A, Matha V, Gotz P. Inhibition of phagocytic activity of plasmatocytes isolated from Gallería mellonella by entomogenous fungi and their secondary metabolites J. Insect Physiol. 1997a. V. 43. № 5. P. 475—4-83.

Vilcinskas A, Matha V, Gotz P. Effects of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and its secondary metabolites on morphology and cytoskeleton of plasmatocytes isolated from the greater wax moth, Gallería mellonella //J. Insect Physiol. 1997 b. V. 43. № 12. P. 1149-1159.

Wang C, Typas M.A, Butt T.M. Detection and characterisation of prl virulent gene deficiencies in the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae IIFEMS Microbiology Letters. 2002. V. 213. № 2. P. 251-255.

Wang S, Leclerque A, Pava-Ripoll M, Fang W, St. Leger R. J. Comparative genomics using microarrays reveals divergence and loss of virulence-associated genes in host-specific strains of the insect pathogen Metarhizium anisopliae // Eukaryotic Cell. 2009. Vol. 8. N 6. P. 888-898.

Willoughby L, Chung H, Lumb C, Robin C, Batterham P, Daborn P.J. A comparison of Drosophila melanogaster detoxification gene induction responses

for six insecticides, caffeine and Phenobarbital // Insect Biochem. Mol. Biol. 2006. V. 36. P. 934-942.

Wilson K., Cotter S.C., Reeson A.F., Pell J.K. Melanism and disease resistance in insects // Ecology Letters. 2001. V. 4. P. 637-649.

Wojda I., Kowalski P., Jakubowicz T. Humoral immune response of Galleria mellonella larvae after infection by Beauveria bassiana under optimal and heat-shock conditions // J. Insect Physiol. 2009. V. 55. P. 525-531.

Wraight S.P., Inglis G.D., Goettel M.S. Fungi // Field manual of techniques in invertebrate pathology. Application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests / ed. Lacey L.A., Kaya H.K.. Springer, 2007. P. 223-248.

Wraight S.P., Ramos M.E. Synergistic interaction between Beauveria bassiana - and Bacillus thuringiensis tenebrionis - based biopesticides applied against field populations of Colorado potato beetle larvae // J. Invertebr. Pathol. 2005. V. 90. №3. P. 139-150.

Xia Y., Dean P., Judge A.J., Gillespie J.P., Clarkson J.M., Charnley A.K. Acid phosphatases in the haemolymph of the desert locust, Schistocerca gregaria, infected with the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae II J. Insect Physiol. 2000. V. 46. P. 1249-1257.

Yeung T., Ozdamar B., Paroutis P., Grinstein S. Lipid metabolism and dynamics during phagocytosis // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. V. 18. №4. P. 429-437.

Zare R., Gams W. A revision of the Verticillium fungicola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium // Mycol. Res. 2008. V. 112. № 7. P. 811-824.

Zibaee A., Bandani A.R., Tork M. Effect of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, and its secondary metabolite on detoxifying enzyme activities and acetylcholinesterase (AChE) of the Sunn pest, Eurygaster