Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Герасимова, Софья Викторовна

• Герасимова, Софья Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Герасимова, Софья Викторовна

Содержание

Список сокращений

Введение

Г. Обзор литературы

1.1. Введение в обзор литературы

1.2 Организация и эволюция генов, кодирующих ОАТ

1.3. Функции ОАТ у млекопитающих

1.4. Функции ОАТ у растений

1.4.1 Биохимические свойства орнтинаминотрансферазы

1.4.2. Роль ОАТ в системе взаимопревращений аминокислот

1.4.2.1 Роль ОАТ в метаболизме пролина

1.4.2.2. Участие ОАТ в метаболизме орнитина и аргинина

1.4.2.3. Участие ОАТ в биосинтезе полиаминов

1.4.3. Роль ОАТ в онтогенезе

1.4.4. Структура и транскрипционная регуляция гена ОАТ у Arabidopsis thaliana

1.5 Подходы к исследованию функций генов у растений на примере гена ОАТ

1.5.1. «Прямая» и «обратная» генетика

1.5.2. Выделение растительных генов

1.5.3. Исследование структуры и биохимических свойств белка

1.5.4. Создание растений с модифицированной экспрессией исследуемого гена

1.5.5. Изучение транскрипционной регуляции гена

1.6. Заключение по обзору литературы

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Растительный материал

2.1.2.Реактив ы

2.1.3. Ферменты

2.1.4. Бактериальные штаммы

2.1.5. Плазмиды

2.1.6. Праймеры

2.1.7. Данные публичных информационных ресурсов

2.1.8. Среды и буферные растворы

2.2. Методы

2.2.1. Получение проростков из семян

2.2.2. Трансформация и выращивание трансформантов

2.2.3. Культивирование каллусной ткани

2.2.4. Оценка солеустойчивости

2.2.5. Получение семян трансформантов от самоопыления

2.2.6. Сегрегационный анализ

2.2.7. Приготовление компетентных клеток

2.2.8. Выделение геномной ДНК растений

2.2.9. Выделение суммарной РНК

2.2.10. Обратная транскрипция

2.2.11.ПЦ Р

2.2.12. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.2.13. Электрофорез в агарозном геле

2.2.14. Выделение фрагментов из агарозного геля

2.2.15. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.16. Лигирование

2.2.17. Трансформация клеток плазмидной ДНК

2.2.18. Селекция клонов на среде, содержащей X-Gal

2.2.19. Определение первичной последовательности ДНК (секвенирование)

2.2.20. Компьютерная обработка данных

2.2.21. Анализ геномной ДНК растений методом ПЦР

2.2.22. Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот-гибридизации

2.2.23. Приготовление радиоактивномеченых зондов

2.2.24. Оценка экспрессии ОАТ в тканях трансгенных растений с помощью полуколичественной ПЦР

2.2.25. Определение содержания свободного пролина в тканях растений

2.2.26. Гистохимическое окрашивание

2.2.27. Статистическая обработка данных

3. Результаты

3.1. Исследование фенотипического проявления повышенной и пониженной экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях

3.1.1. Создание генетической конструкции для повышения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях (pBi-OAT)

3.1.2. Создание генетической конструкции для снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях (pBi-OATas)

3.1.3. Получение трансгенных растений N. tabacum

3.1.4. ПЦР-анализ геномной ДНК растений-трансформантов

3.1.5. Саузерн-блот анализ геномной ДНК растений-трансформантов

3.1.6. Оценка уровня транскрипции гена ОАТ в трансгенных растениях

3.1.7. Сегрегационный анализ трансгенных растений в поколении Т1

3.1.8. Оценка числа функционально активных инсерций

3.1.9. Анализ солеустойчивости трансгенных растений

3.1.10. Оценка содержания пролина в листьях трансгенных растений

3.2. Изучение транскрипционной активности промотора гена ОАТ Arabidopsis thaliana

3.2.1. Выделение промоторной области гена ОАТ Arabidopsis thaliana

3.2.2. Создание репортерной генетической конструкции PI844

3.2.3. Получение и первичный генетический анализ трансгенных растений, несущих репортерную конструкцию

3.2.4. Гистохимический анализ трансформантов. Выявление экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы (GUS)

3.2.4.1. Гистохимичекий анализ растений (ТО) выращенных в условиях культуры тканей

3.2.4.2. Гистохимический анализ цветущих взрослых растений ТО из теплицы

3.2.4.3. Гистохимический анализ проростков Т1

3.2.5. Компьютерный анализ последовательности промотора гена ОАТ на наличие цис-регуляторных элементов

3.3. Анализ транскрипции гена ОАТ в различных тканях и органах

4. Обсуждение результатов

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

2-ОГ - альфакетоглутарат,

CaMV - вирус мозаики цветной капусты,

GUS - ß-глюкуронидаза,

NPTII - неомицинфосфотрансфераза II,

N-ацГК - N-ацетилглутаматкиназа,

N-ацГС - N-ацетилглутаматсинтаза,

N-ацГФР - Ы-ацетилглутамат-5-фосфатредуктаза,

N-ацОАТ - N-ацетиламинотрансфераза,

N-ацОГАТ - N-ацетилорнитин.тлутамат ацетилтрансфераза,

N-КПИГ - N-карбомоилпутресциниминогидролаза,

SDS - лаурилсульфат натрия.

S-АМД - S-аденозшшетиониндекарбоксилаза,

АДК - аргининдекарбоксилаза,

АИГ - агматиниминогидролаза,

ACJI - аргиносукцинатлиаза

АСС - аргиносукцинатсинтаза,

БАП - бензиламинопурин,

ГДГ - глутаматдегидрогеназа,

ГОГАТ - глутаматоксоглутаратаминотрансфераза,

ГС - глутаминсинтаза,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК,

МАТ - метионинаденозилтрансфераза

мРНК - матричная РНК,

НУК - нафтилуксусная кислота,

ОАТ - орнитинаминотрансфераза

ОДК - орнитиндекарбоксилаза,

ОТ - обратная транскрипция,

ОТК - орнитинтранскарбомоилаза,

п.н. - пары нуклеотидов,

П5К - пирролин-5-карбоксилат

П5КДГ - пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназа,

П5КР - пирролин-5-карбоксилатредуктаза,

П5КС - пирролин-5-карбоксилатсинтаза

ПДГ - пролиндегидрогеназа

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

РНК - рибонуклеиновая кислота,

РНКаза - рибонуклеаза,

СпдС - спермидинсинтаза,

СпмС - сперминсинтза,

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота,

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений»

Введение

Актуальность проблемы. Адаптация растений к неблагоприятным условиям окружающей среды требует реализации сложных генетических программ, в которых задействована скоординированная экспрессия больших генных ансамблей, исследование которых необходимо для понимания молекулярных механизмов стрессоустойчивости. В частности, в ответ на стресс изменяется уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм некоторых аминокислот (Martinelli et al., 2007). К их числу относится ген дельта-орнитинаминотрансферазы (OAT, ЕС 2.6.1.13), кодирующий фермент, катализирующий перенос дельта-аминогруппы орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием пирролин-5-карбоксилата (П5К) и глутамата (Stranska et al., 2008). Эта реакция является частью системы взаимопревращений таких аминокислот, как аргинин, орнитин, глутамат и пролин. Метаболизм этих аминокислот связан с фиксацией, запасанием и ремобилизацией азота, формированием и прорастанием семян, устойчивостью к различным абиотическим стрессам, регуляцией процессов развития (Funck et al, 2008; Canas et al, 2008; Mattioli et al., 2009). Согласно литературным данным, ген OAT принимает участие в ответе на стресс, однако его конкретная биологическая роль остается неясной и является предметом обсуждения (Stranska et al., 2008). Долгое время считалось, что ОАТ участвует в синтезе пролина при стрессе (Roosens et al, 1998, 2002), однако ряд исследователей опровергают это утверждение и постулируют, что ген ОАТ регулирует деградацию орнитина и связан с системой рециркуляции азота (Funck et al, 2008). Отдельные данные указывают на участие гена ОАТ в ряде других жизненно-важных клеточных процессов (Boon et al., 1999; Slocum, 2005; Page et al, 2010). Потенциально, OAT может являться важным регулятором клеточного метаболизма, поскольку реакция, катализируемая этим ферментом, связывает несколько биохимических систем: цикл мочевины, цикл накопления и деградации пролина и путь биосинтеза полиаминов. Транскрипционная регуляция этого гена не изучена, а его роль в процессах развития и ответе на стресс не определена. Изучение транскрипционной регуляции гена ОАТ и его роли в развитии и стрессоустойчивости необходимо для расширения современных представлений о регуляции клеточного метаболизма, а также для разработки новых способов получения устойчивых форм растений.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование роли гена дельта-орнитинаминотрансферазы (ОАТ) в развитии и стрессоустойчивости растений.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и создание генетических конструкций для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях и получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих эти конструкции.

2. Оценка содержания свободного пролина в тканях трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ в нормальных условиях и в условиях солевого стресса

3. Анализ солеустойчивости трансгенных растений с измененной экспрессией . гена ОАТ.

4. Разработка и создание репортерной генетической конструкции для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Получение Трансгенных растений табака, несущих эту конструкцию. Анализ экспрессии репортерной конструкции в трансгенных растениях Nicotiana tabacum на разных стадиях развития.

5. Оценка уровня экспрессии гена ОАТ Nicotiana tabacum в разных тканях и органах на разных стадиях развития растений.

Научная новизна. Создана новая генетическая модель для изучения функций и транскрипционной регуляции гена ОАТ, которая включает в себя генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, а также репортерную конструкцию для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Впервые показано, что растения с увеличенным уровнем экспрессии гена ОАТ обладают в нормальных условиях большей корневой массой, чем контрольные растения. Впервые показано, что введение антисмыслового супрессора гена ОАТ не влияет на рост растений в нормальных условиях, но существенно снижает формирование корней в условиях солевого стресса. Показано, что изменение уровня экспрессии гена ОАТ не влияет на содержание свободного пролина ни в норме, ни при солевом стрессе. Впервые показано, что активность промотора гена ОАТ и повышенный уровень мРНК ОАТ в норме ассоциированы с зонами инициации роста.

Полученные результаты не подтверждают существующую гипотезу об участии ОАТ в накоплении пролина при стрессе, однако позволяют выдвинуть альтернативную гипотезу о его участии в поддержании ростовых процессов в норме и при стрессе.

Практическая ценность. Показано, что искусственное повышение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях усиливает их ростовые характеристики и повышает солеустойчивость. Создана генетическая конструкция, эффективно повышающая

экспрессию гена OAT в трансгенных растениях, которая может быть использована для трансформации разных видов растений. Создана репортерная генетическая конструкция, которая может быть использована для анализа транскрипционной активности гена ОАТ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Индуцированное трансгенезом увеличение экспрессии гена ОАТ в растениях табака приводит к повышенному формированию корней в норме и позволяет преодолеть ингибирующее действие солевого стресса на рост побегов.

2. Повышенная транскрипционная активность гена ОАТ характерна для зон роста растений.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г.); на отчетной конференции программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (Москва, 2008 г.), на 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009 г.), на Германо -Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.), на международной конференции «Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology» (Новосибирск, 2010 г.), на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 135 источников..

1. Обзор литературы

1.1. Введение в обзор литературы

Дельта-орнитинаминотрансфераза (ОAT, ЕС 2.6.1.13) катализирует реакцию переноса дельта-аминогруппы с орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием полуальдегида глутаминовой кислоты (ПГК) и глутамата (рис. 1). Полуальдегид глутаминовой кислоты находится в равновесии со своей более стабильной циклической формой - пирролин-5-карбоксилатом (П5К). Кофактором в реакции выступает пиридоксаль-фосфат (Stranska et al, 2008). Гены с функцией ОАТ были обнаружены у представителей всех царств живой природы: микроорганизмов, грибов, насекомых, млекопитающих и растений (рис. 2). Несмотря на то, что гены, кодирующие орнитинаминотрансферазу, имеют древнейшее происхождение, их функции и регуляция у высших организмов до сих пор остаются не до конца изученными. Чем выше организация, тем более тонкий и разнообразный паттерн регуляции имеет этот ген. Еще у бактерий было показано, что экспрессия гена ОАТ в значительной мере зависит от различных стимулов (Takechi et al., 1994; Gardan et al, 1995). В регуляции экспрессии ОАТ у дрожжей принимает участие сложный комплекс генов (Messenguy et al., 2000). У млекопитающих экспрессия гена ОАТ регулируется по-разному в зависимости от пола, органа, типа ткани и стадии развития организма (Ventura et al., 2009). Биологическая роль и регуляция этого гена у растений до сих пор остается неясной и в последнее время является предметом активных дискуссий (Stranska et al., 2008).

Ген ОАТ является одним из элементов системы метаболизма аминокислот. Аминокислоты необходимы для синтеза белков, но некоторые из них также участвуют в различных специфических биологических процессах. ОАТ является участником системы взаимопревращений таких аминокислот, как аргинин, орнитин, глутамат и пролин. Все эти аминокислоты в свободных формах участвуют в ряде важных биохимических процессов. Часть исследователей связывает функции ОАТ с метаболизмом пролина, иминокислоты, являющейся совместимым осмолитом, аккумулирующимся в

NH,+

NH3+

L-орнитин

O

альфакетогпутарат

+ E-PLP

П5К

+ E-PMP

NH,+

L-глутамат

+ E-PMP (1)

полуальдегид глутаминовой кислоты

E-PLP (2)

Рисунок 1. Реакция, которую катализирует фермент ОАТ. Цифрами обозначены две полуреакции. Е-РЬР и Е-РМР - комплексы фермента с кофактором. Цит. по Б^апвка е/ а! 2008.

ответ на осмотический стресс (Roosens et al., 2002; Wu et al, 2003; Xue et al., 2009). Другие отвергают эту гипотезу и постулируют, что ОАТ не принимает участия в синтезе пролина, а является ферментом катаболизма других аминокислот -аргинина и орнитина, которые в свою очередь, связаны с такими фундаментальными процессами, как рециркуляция азота (Funck et al, 2008; Canas et al., 2008). Существуют данные, указывающие на специфическую активность ОАТ в онтогенезе (Canas et al, 2008). В данном обзоре сделана попытка систематического анализа существующих на сегодняшний день данных о функциях гена ОАТ, который одновременно является элементом системы ответа на стресс (Stranska et al, 2008), участником регуляции синтеза полиаминов (Ventura et al., 2010) и ферментом азотного метаболизма (Funck et al 2008; Canas et al, 2008), а также возможно, выступает связующим звеном между разными биохимическими системами.

Рисунок 2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена ОАТ разных видов (Gafan et al 2001).

1.2 Организация и эволюция генов, кодирующих ОАТ.

Гены, кодирующие дельта-ОАТ, найдены у всех живых организмов. На рис. 2

представлено филогенетическое древо избранных нуклеотидных последовательностей генов ОАТ. Множественное выравнивание последовательностей генов ОАТ разных видов выявило наличие длинного N-концевого участка в аминокислотной последовательности ОАТ эукариот по сравнению с прокариотами. Для последовательностей ОАТ растений и животных с помощью программы MitoProt II 1.0а4 с высокой вероятностью было предсказано наличие митохондриального транзитного пептида, что указывает на локализацию фермента ОАТ в митохондриях. Для последовательностей ОАТ грибов и бактерий транзитный пептид не был обнаружен. Предполагается, что фермент ОАТ у грибов локализован в цитоплазме (Wagemaker et ai, 2007).

У Bacillus subtillis ген rocD, кодирующий орнитинаминотрансферазу, находится в составе оперона rocDEF. транскрибирующегося с промотора -12 -24. Оперон rocDEF состоит из трех генов (rocD, госЕ и rocF), кодирующих орнитинаминотрансферазу, аргининпермеазу и аргиназу, соответственно. Этот оперон активируется в присутствие аргинина, орнитина и пролина. Мутации в генах rocD и rocF приводили к потере

способности утилизировать аргинин из внешней среды (Gardan et al, 1995). Таким образом, у бактерий орнитинаминотрансфераза специфически задействована в катаболизме аргинина и орнитина.

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae ген, кодирующий ОАТ, называется cargB. Он активируется в ответ на орнитин (Hennaut, 1981), а также на аргинин и аллофанат совместно с геном cargA, кодирующим аргиназу (Hennaut, 1981; Degols, 1987). Ген, кодирующий ОАТ, супрессирован в присутствие азота во внешней среде (Messenguy et al., 2000). И у бактерий, и у дрожжей орнитинаминотрансфераза выполняет только катаболическую фунцию, участвуя в деградации орнитина. У некоторых микроорганизмов эта функция частично дублируется родственным геном ацетилорнитинаминотрансферазы, которая в качестве субстрата способна использовать не только орнитин, но и его ацетилированные производные (Heimberg et al, 1990).

Геном малярийного паразита Plasmodium falciparum имеет одну копию гена ОАТ. Продукт этого гена способен трансаминировать орнитин и ацетилорнитин, перенося аминогруппу на альфакетоглутарат. Однако, в отличие от ферментов бактерий и дрожжей, этот фермент катализирует и обратную реакцию, перенося аминогруппу с глутамата на ПГ'К с образованием орнитина (Gafan et al., 2001). Кроме того, аминокислотная последовательность, кодирующая ОАТ, имеет структурные элементы, ответственные за взаимодействие с тиоредоксином - белком, регулирующим Red-Ox гомеостаз (Jortzik et al, 2010). Таким образом, у малярийного паразита фермент ОАТ демонстрирует различные биохимические функции, находясь в зависимости от окислительно-восстановительного статуса и участвуя как в деградации, так и синтезе орнитина (Gafan et al, 2001; Jortzik et al., 2010).

У млекопитающих, как правило, в геноме присутствует единственная функциональная копия гена ОАТ. Кроме функционального гена также обнаруживаются процессированные псевдогены (Zintz and Inana, 1990; Shull et al., 1991).

1.3. Функции OAT у млекопитающих

Достаточно много работ посвящено изучению функций ОАТ у млекопитающих и в

особенности у человека, поскольку нарушение работы этого гена приводит к рецессивному наследственному заболеванию, - гиратной атрофии (Ramesh et al, 1991). У пациентов, страдающих гиратной атрофией, наблюдается прогрессирующая хориоретинальная дегенерация, начинающаяся с нарушения зрения в детстве и приводящая к слепоте во взрослом возрасте. Описано более 60 мутаций гена ОАТ

человека, приводящих к развитию этого заболевания (Wang et al, 1995). Также обнаружено, что употребление некоторых протвоэпилептических лекарств, в качестве побочного эффекта, приводит к сужению полей зрения предположительно за счет ингибирования ОАТ (Sorri et al, 2010). Как правило, мутации гена ОАТ у людей не имеют выраженного плейотропного эффекта. Кроме нарушения зрения в некоторых случаях наблюдается гипераммониемия в крови новорожденных (Cleary et al, 2005), в редких случаях болезнь сопровождается нарушением нервной деятельности (Valayannopoulos et al, 2009). Развитие заболевания связывают с нарушением метаболизма зрительного аппарата из-за избытка орнитина (Ramesh et al, 1991).

Существует достаточно много данных, согласно которым, у млекопитающих фермент ОАТ экспрессируется во многих тканях и выполняет различные функции в младенчестве и во взрослом возрасте. Мыши с нарушенным геном ОАТ демонстрируют выраженную гипоорнитинемию в неонатальном периоде и гибнут без подкормки аргинином в течение первых двух суток после рождения. В случае, если в диету новорожденных мышей вводится аргинин, они выживают и через короткое время перестают нуждаться в аргинине. Во взрослом возрасте такие мыши имеют выраженные признаки гиратной атрофии и гиперорнитинемию всех тканей организма. Таким образом, после рождения, у этих мышей уровень орнитина и аргинина в крови снижен до летального количества, а потом повышается до ненормально высоких концентраций (Wang et al., 1995). Предполагается, что реакция, катализируемая ферментом ОАТ, обратима, т.е. он может катализировать реакцию в обоих направлениях в зависимости от органа и стадии развития (Alonsol989). Считается, что у новорожденных млекопитающих в тонком кишечнике фермент ОАТ выполняет синтетическую функцию, активно синтезируя орнитин из глутамата (Dekaney et al, 2001). Позднее эта функция или утрачивается или перестает играть важную роль в питании организма и основной функцией ОАТ становится участие не в синтезе, а в деградации орнитина. В то время как ОАТ-дефицитные мыши характеризовались серьезными нарушениями неонатального метаболизма и зрительного аппарата, мыши, обладающие сверхэкспрессией ОАТ, имели абсолютно нормальный фенотип и лишь незначительно измененное соотношение аминокислот в печени. Авторы объясняют это обратимостью катализируемой реакции и наличием регуляции активности ОАТ на посттранскрипционном уровне (Ventura et al, 2009, 2010).

Кристаллическая структура, взаимодействие с субстратами и их аналогами фермента ОАТ человека являются хорошо изучеными (Shen et al, 1998; Storici et al, 1999;

Markova et al, 2005). Было показано, что фермент дикого типа обладает в 450 раз большей специфичностью к орнитину, чем к глутамату. Однако, замена глутамата в 235м положении на серин или аланин приводит к повышению специфичности к глутамату до 650 раз. Специфичность фермента к орнитину обуславливается взаимодействием двух аминокислотных остатков: Glu235 и Arg413 (Markova et al, 2005). Возможно, что блокада этого взаимодействия может сместить направление реакции in vivo.

Неожиданная функция фермента ОАТ обнаружилась в клетках некоторых злокачественных опухолей человека (Wang et al, 2007). Супрессия ОАТ с помощью РНК-интерференции привела к подавлению экспрессии ОАТ и массовой гибели раковых клеток. Клетки, которые утратили экспрессию ОАТ, формировали неправильное многополярное веретено деления, в них нарушалось выстраивание и расхождение хромосом, что в конечном счете приводило к аресту делений и гибели. Восстановление функций ОАТ в этих клетках приводило к восстановлению жизнеспособности. Авторы полагают, что функции ОАТ в формировании веретена деления у раковых клеток не связаны с его известной метаболической ролью. Поскольку млекопитающие с нарушенной функцией ОАТ вполне жизнеспособны, вероятно, ОАТ участвует в формировании веретена деления лишь в очень ограниченных условиях или типах тканей. Механизмы влияния ОАТ на веретено деления также остаются неизвестными, но вероятно, они не связаны с синтезом аминокислот.

Несмотря на то, что фермент ОАТ животных выделен и охарактеризован, весь спектр его функций до сих пор не известен. Он принимает участие в совершенно разных процессах: играет короткую но чрезвычайно важную роль в развитии (синтез орнитина и аргинина в кишечнике новорожденных), важен для функционирования глаз, необходим для формирования веретена деления в некоторых типах раковых клеток. Кроме того, экспрессия и активность ОАТ обнаружена в разных органах млекопитающих, причем для каждого органа показан свой уникальный паттерн регуляции на всех уровнях (Ventura et al, 2009). На настоящий момент наиболее логичным объяснением такого разнообразия функций является то, что фермент ОАТ служит посредником между разными биохимическими контурами, поддерживая необходимый баланс аминокислот в каждом органе. Для организмов млекопитающих важным параметром жизнедеятельности является гомеостаз. Существует предположение, что ОАТ, катализируя обратимые взаимопревращения аргинина и

глутамата, выступает регулятором аминокислотного гомеостаза, а также всего азотного обмена (Alonso and Rubio., 1989; Ventura et al., 2009).

1.4. Функции OAT у растений

1.4.1 Биохимические свойства орнитинаминотрансферазы

На настоящий момент исследованы биохимические свойства ферментов ОАТ лишь нескольких видов растений. Факт трансаминирования орнитина у растений был впервые обнаружен пятьдесят лет назад у шпината (Spinacea oleráceo) и фасоли (Phaseolm aureus). Тогда же впервые была показана связь этого фермента с митохондриями. В последующие годы фермент ОАТ был частично выделен из других видов растений, таких как арахис (Arachis hypogea), тыква (Cucurbita maxima, Cucurbita pepo) и горох (Pisum sativum). Было показано, что ОАТ С. pepo имеет молекулярную массу 48 кДа и оптимум трансаминировния между орнитином и альфа-кетоглутаратом при pH 8.0. Величина констант Михаэлиса (Кт) ОАТ С. pepo составила 4.7 ммоль и 6.3 ммоль для орнитина и альфа-кетоглутарата соответственно (Stranska et al, 2008).

Растительный ген, кодирующий ОАТ, впервые был выделен из библиотеки кДНК Vigna acontifolia (Delauney et al., 1993) с помощью транс-комплементации мутации генов синтеза П5К у Е. coli. Мутанты, трансформированные ОАТ, росли на среде, не содержащей пролина, в то время как исходный штамм самостоятельно не синтезировал пролин и на среде без пролина был нежизнеспособен. Рекомбинантный белок ОАТ V. acontifolia был очищен и охарактеризован. Он представлял собой мономер с молекулярным весом 50 кДа с величиной Кт 2ммоль для орнитина и 0.75 ммоль для альфа-кетоглутарата при оптимальном pH 8.0. Изолейцин, валин и серин ингибировали активность рекомбинантного ОАТ, а пролин не влиял на активность фермента (Delauney et al, 1993).

В настоящее время известны последовательности ОАТ многих видов, в числе которых Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, Vitis vinifera, Oryza sativa, Pinus sylvesteis и др. Недавно вышла работа, в которой был клонирован и охарактеризован фермент ОАТ гороха (Р. sativum). Было показано, что фермент представляет собой мономер с молекулярной массой 50 кДа, оптимумом pH 8.8 и оптимумом температуры 43°С. Основным субстратом ОАТ гороха является L-орнитин (Кт=15 ммоль), но также фермент имеет низкую специфичность к ацетилированной форме орнитина. Единственным акцептором аминогруппы

является альфа-кетоглутарат (Km=2 ммоль). Диамины и полиамины не могут служить субстратом для этого фермента, однако, обладают слабым ингибирующим эффектом (Stranska et al., 2010).

В ряде работ было показано, что активность фермента ОАТ у растений ассоциирована с митохондриями (Bone, 1959; Elthon, Stewart, 1982). Все известные последовательности растительных ОАТ содержат лидерный пептид, с высокой вероятностью указывающий на митохондриальную локализацию. Окончательно митохондриальная локализация растительного ОАТ была подтверждена методом флуоресцентной визуализации с использованием зеленого флуоресцирующего белка в качестве гена-репортера (Funck et al., 2008).

1.4.2. Роль ОАТ в системе взаимопревращений аминокислот

На рисунке 3 представлена сеть биохимических превращений, в которых, как считается, задействован фермент ОАТ. Реакция, которую катализирует ОАТ, соединяет два биохимических контура: цикл мочевины и цикл аккумуляции-деградации пролина (Funck et al., 2008). Метаболическая сеть, контролирующая содержание в клетке свободного пролина, является элементом ответа на стресс у растений (Кузнецов и Шевякова, 1999; Verbruggen, Hermans, 2008). В условиях стресса концентрация свободного пролина в тканях растений возрастает очень быстро за счет синтеза de novo и уменьшения скорости его деградации. В гипоосмотических условиях, напротив, активируется путь деградации пролина и супрессируется его синтез (Verbruggen, Hermans, 2008). Аккумуляция пролина при стрессе связана с синтезом глутамата и с дополнительной активацией путей фиксации азота (Diaz et al., 2010).

Цикл мочевины у растений важен для процессов запасания, рециркуляции и ремобилизации азота (Canas et al., 2008). На рисунке 3 представлены пути синтеза орнитина, аргинина и полиаминов. Аргинин является основным запасающим азот веществом у растений; также, аргинин и аргинин-богатые белки являются важными компонентами питательных веществ в эндосперме семян (Slocum, 2005). Катаболизм аргинина, участником которого является фермент ОАТ, тесно связан с процессами синтеза полиаминов, которые в свою очередь, являются важными регуляторами процессов роста и развития растений (Baron, Stasola, 2008; Jubault et al., 2008). Поскольку каждая из упомянутых систем достаточно сложна сама по себе, в данном обзоре они рассмотрены отдельно.

у

полиамины

Рисунок 3. Роль фермента ОАТ в системе взаимопревращений аминокислот в растительной клетке. Реакция, катализируемая ОАТ, связывает цикл мочевины на этапе деградации агринина и цикл накопления-дегенерации пролина. Деградация аргинина также связана с синтезом полиаминов, а метаболизм пролина зависит от системы фиксации азота и образования глутамата. Названия ферментов выделены курсивом. 2-ОГ - альфакетоглутарат, П5К - пирролин-5-карбоксилат, ACJT - аргиносукцинатлиаза, АСС -аргиносукцинатсинтаза, ГДГ - глутаматдегидрогеназа, ГОГАТ -глутаматоксоглутаратаминотрансфераза, ГС - глутаминсинтаза, ОДК -орнитиндекарбоксилаза, ОТК - орнитинтранскарбомоилаза, П5КДГ - пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназа, П5КР - пирролин-5-карбоксилатредуктаза, П5КС - пирролин-5-карбоксилатсинтаза, ПДГ - пролиндегидрогеназа. Цит. по Funck et al 2008 с изменениями.

1.4.2.1 Роль ОАТ в метаболизме пролина

1.4.2.1.1. Пролин обладает защитным эффектом при многих видах стресса.

Аккумуляция пролина в тканях растений показана при засухе, солевом стрессе, высокой освещенности и повышенном уровне ультрафиолета, воздействии тяжелый металлов, окислительном стрессе и некоторых видах биотического стресса (Szabados, Savoure, 2010). Механизм и регуляция метаболизма пролина у растений считались хорошо изученными, однако, в последние годы появился ряд работ, выявивших новые факты и противоречия и поставивших ряд новых вопросов (Funck et al, 2010; Szabados, Savoure, 2010).

1.4.2.1.2. Синтез пролина. Основным путем синтеза пролина является превращение глутамата в пирролин-5-карбоксилат (П5К), катализируемое пирролин-5-карбоксилатсинтазой (П5КС) (Ни et al., 1992; Savoure et al., 1995) и

последующее восстановление П5К до пролина, катализируемое пирролин-5-карбоксилатредуктазой (П5КР) (Delauney, Verma, 1990). Фермент П5КС считается основным ферментом синтеза пролина, так как его активация строго коррелирует с повышением уровня пролина в клетке (Verbruggen, Hermans, 2008). Большинство растений имеют по две копии гена П5КС в геноме. Показано, что один из генов работает как ген домашнего хозяйства, и имеет специфическую регуляцию в онтогенезе, другой отвечает за накопление пролина при стрессе (Armengaud et al., 2004; Szekely et al., 2008). Синтез пролина из П5К в нормальных условиях осуществляется в цитоплазме. Стресс-индуцируемая изоформа фермента П5КС в условиях осмотического стресса активна в хлоропластах (Szekely et al., 2008).

1.4.2.1.3. Катаболизм пролина. Распад пролина происходит в митохондриях (Szabados, Savoure, 2010) путем окисления пролина до П5К ферментом пролиндегидрогеназой (ПДГ) (Verbruggen et al., 1996) и дальнейшим окислением П5К до глутамата ферментом пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназой (П5КДГ) (Deuschle et al, 2001). Фермент ПДГ имеет две изоформы у Arabidopsis thaliana (Funck et al., 2010). Основная его изоформа супрессируется при стрессе и активируется в период восстановления и в гипоосмотических условиях (Funck et al., 2010; Miller et al., 2005). Для гена, кодирующего фермент П5КДГ, показан сложный и противоречивый паттерн регуляции. В ряде работ показана его активация в условиях осмотического стресса (Deuschle et al., 2001; Sharma, Verslues, 2010). В противоречие этому, описан интересный механизм супрессии П5КДГ при стрессе. Стресс-индуцируемый ген СР05 имеет участок, комплементарный участку 3" - НТП мРНК гена П5КДГ. В условиях стресса участки мРНК СРО и П5КДГ образуют комплементарные пары, что приводит к генерации малых интерферирующих РНК и расщеплению транскриптов П5КДГ (Borsani étal., 2005).

Показано, что нестабильный интермедиат в метаболической цепи пролина - П5К - обладает токсическим эффектом и, возможно, является регуляторной молекулой (Deuschle et al., 2001; Deuschle et al., 2004). Показана роль П5К в индукции клеточной смерти и регуляции ряда генов стрессового ответа (Deuschle et al., 2004). Интересным является тот факт, что П5К не накапливается в тканях растений ни при оверэкспрессии ПДГ, ни при супрессии или отсутствии П5КДГ. Было выдвинуто предположение, что существует механизм быстрого вывода П5К из митохондрий и превращения его в пролин (Miller et al., 2009).

Таким образом, пролин синтезируется из глутамата в цитоплазме и хлоропластах и превращается обратно в глутамат в митохондриях через один и тот же интермедиат - П5К. Это же вещество образуется при катаболизме орнитина в реакции, катализируемой ферментом ОАТ (Stranska et al, 2008). Таким образом, метаболические пути пролина и орнитина конвергируют в митохондриях. Ранее считалось доказанным, что П5К, образующийся в митохондриях из орнитина, может служить предшественником пролина, а фермент ОАТ, катализирующий это превращение, и ген, кодирующий данный фермент, относили к системе ответа на стресс (Kishor et al, 2005). Однако, никому не удавалось однозначно оценить вклад орнитинового пути в аккумуляцию пролина (Stranska et al., 2008).

i.4.2.1.4. Связь между стрессом, накоплением пролина и активностью ОАТ. Существует достаточно много работ, демонстрирующих, что в условиях осмотического стресса возрастает экспрессия гена ОАТ, активность фермента ОАТ и аккумуляция пролина (Sharma, Verslues, 2010; Stranska et al, 2008; Xue et al, 2009). Однако, данные, касающиеся участия ОАТ в ответе на стресс, противоречивы и разрознены. Было показано, что уровень мРНК ОАТ снижался при солевом стрессе и азотном голодании и повышался при избытке азота у Vigna acontifolia (Delauney et al, 1993). У Brassica juncea активность ОАТ и содержание пролина возрастали с нарастанием концентрации соли в среде у растений всех возрастов (Madan et al, 1995). У Brassica napus экспрессия ОАТ активировалась только в случаях тяжелого и продолжительного стресса (Xue et al, 2009). Повышенная экспрессия гена ОАТ в ответ на солевой стресс наблюдалась только у чувствительной к стрессу линии риса, и не менялась у устойчивого варианта (Lutts et al, 1999). У проростков Arabidopsis thaliana, но не у взрослых растений, показано возрастание транскрипции и активности ОАТ в условиях осмотического стресса (Roosens et al, 1998; Sharma, Verslues, 2010). Причем, индукция экспрессии гена ОАТ не наблюдалась у растений, мутантных по гену основного пути биосинтеза пролина, П5КС. Это позволяет выдвинуть предположение, что не активность ОАТ приводит к накоплению пролина, а накопление пролина вызывает индукцию ОАТ (Sharma, Verslues, 2010). Также было показано, что у молодых растений арабидопсиса при стрессе - одновременно с повышением уровня пролина - происходит снижение содержания аргинина и орнитина в тканях (Miller et al, 2009). Была сделана попытка оценить вклад орнитинового пути в накопление пролина при стрессе в листьях Oryza sativa (Yang et al, 1999). Солевой стресс

вызывал повышение уровня пролина в 35-40 раз и активности ОАТ в 4 раза. Добавление габакулина, сильного ингибитора ОАТ, привело к снижению активности ОАТ при стрессе на 75-80% и только к незначительному (около 20%) снижению уровня пролина. Также есть работы, в которых показано, что активность ОАТ не меняется при солевом стрессе (Ruiz et al, 2005).

Растения арабидопсиса, дефицитные по ОАТ, имеют такой же уровень пролина в норме и при стрессе, что и контрольные растения (Funck et al, 2008). Растения риса с повышенной экспрессией гена ОАТ накапливают в норме и при стрессе больше пролина, чем нетрансгенные растения (Wu et al, 2003). При этом растения, характеризующиеся повышенной экспрессией гена ОАТ, обладают повышенной стрессоустойчивостью (Roosens et al, 2002; Wu et al., 2003).

Подобные противоречия относительно роли ОАТ в накоплении пролина не позволяют сделать окончательных выводов. С одной стороны, не показано однозначного вклада орнитинового пути в накопление пролина. С другой стороны, если существует механизм вывода П5К в цитоплазму и превращения его в пролин (Miller et al, 2009), то ничего не противоречит существованию этого пути. Большинство авторов склоняются к тому, что орнитиновый путь вносит вклад в накопление пролина лишь в определенных условиях. Чтобы определить эти условия, необходимо рассмотреть систему метаболизма пролина более широко.

1.4.2.1.5. Глутамат необходим для синтеза пролина при стрессе. Основным предшественником пролина в растительной клетке является глутамат. Помимо этого, в целом глутамат является основным посредником в цепи превращений аминокислот. Несмотря на то, что глутамат участвует во многих реакциях и биохимических циклах, его концентрация в различных условиях поддерживается относительно постоянной (Forde, Lea, 2007). При стрессе недостаточно просто конвертировать имеющийся в клетке глутамат в пролин, необходим активный синтез глутамата, что делает путь биосинтеза пролина при стрессе значительно длиннее и сложнее, чем принято рассматривать. Доступность глутамата для синтеза пролина напрямую зависит от работы системы фиксации азота (Brugiere et al, 1995; Diaz et al, 2010). Глутамат в клетке образуется двумя путями (рис.2). Первый способ - присоединение иона аммония к альфа-кетоглутарату ферментом глутаматдегидрогеназой (Г'ДГ) с образованием молекулы глутамата. Этот фермент катализирует разнонаправленные превращения, в разных условиях он демонстрирует как аминирующую, так и и дезаминирующую активности (Forde,

Lea, 2007). Второй путь считается основным путем фиксации азота и, соответственно, образования глутамата. Он называется путь ГОГАТ-ГС, по названию участвующих в нем ферментов: глутамин-оксоглутарат аминотрансферазы и глутаминсинтазы. Фермент глутамин-оксоглутарат аминотрансфераза (ГОГАТ) переносит аминогруппу с глутамина на альфа-кетоглутарат с образованием двух молекул глутамата. Глутамин производится ферментом глутаминсинтазой: ион аммония присоединяется к глутамату. Таким образом, в одном цикле при участии одной молекулы глутамата из альфа-кетоглутарата и иона аммония образуется еще одна молекула глутамата (Forde, Lea, 2007). Альфа-кетоглутарат, в свою очередь, в основном поступает из цикла трикарбоновых кислот (Foyer et al., 2011).

Для достаточного накопления пролина при стрессе необходима активация биосинтеза глутамата и фиксации азота (Brugiere et al., 1995; Diaz et al., 2010). В ряде работ показана активация аминирующей активности глутаматдегидрогеназы (Lutts et al, 1999; Skopelitis et. al., 2006; Wang et al, 2007) и глутаминсинтазы (Brugiere et al, 1995; Diaz et al, 2010) в ответ на осмотический стресс и прослежена связь интенсивости азотфиксации с аккумуляцией пролина. Также показано, что растения с недостаточным присутствием фермента глутаминсинтазы не способны накапливать пролин при стрессе наравне с контролем. Обнаружено, что такие растения более чувствительны даже к слабому осмотическому стрессу и накапливают в 2-3 раза меньше свободного пролина, чем растения дикого типа (Brugiere étal., 1995, Diaz étal., 2010).

1.4.2.1.6. Роль OAT в обеспечении клеток глутаматом. Считается, что накопление достаточного количества пролина при стрессе является необходимым для выживания растений (Szekely et al, 2008). В случае, если лимитирующим фактором выступает доступность глутамата для синтеза пролина, должны активироваться «альтернативные» источники глутамата или альтернативные пути биосинтеза пролина. Такой альтернативой и является как раз синтез пролина из орнитина. Причем, не обязательно П5К орнитинового происхождения должен непосредственно превращаться в пролин. Возможно, что орнитин вначале конвертируется в глутамат, а затем глутамат орнитинового происхождения вступает в стандартный путь биосинтеза пролина (Sharma, Verslues, 2010). У животных фермент ОАТ принято рассматривать, в частности, как фермент синтеза

глутамата (Boon et al., 1999). Существует работа, также демонстрирующая важность ОАТ для синтеза глутамата у растений (Canas et al., 2008).

В пользу этого предположения свидетельствует ряд экспериментльных данных. У растений Lotus japónica, мутантных по гену глутаминсинтазы и не способных в достаточном количестве синтезировать глутамат через основной путь фиксации азота, в условиях солевого стресса происходила активация ферментов орнитинового пути биоситеза пролина - аргиназы и ОАТ, чего не наблюдалось у растений дикого типа (Diaz et al, 2010). Активация ОАТ при солевом стрессе у проростков (Roosens et al., 1998) также совпадает с недостаточностью фиксации азота. У проростков еще не сформировались полноценные органы, и основным источником азота является аргинин, запасенный в семени (Canas et al., 2008). Глутамат, произведенный из аргинина, может служить основным предшественником пролина. Таким образом, если рассматривать ОАТ как ген дополнительного синтеза глутамата, то в каждом случае вклад орнитинового пути в биостинтез пролина будет значительно варьировать, так как будет зависеть от активности основного пути биосинтеза глутамата и от имеющихся доступных для мобилизации резервов азота, запасенного в виде аргинина.

1.4.2.2. Участие ОАТ в метаболизме орнитина и аргинина

1,4.2.2.1. Роль орнитина и аргинина в метаболизме азота. Процесс

накопления и деградации аргинина является очень важным для жизнедеятельности и выживания растений, поскольку аргинин является основной азот-запасающей структурой. До 40% азота, запасенного в семенах, находится в составе аргинина (Slocum, 2005). На ранних стадиях прорастания аргинин является наиболее представленной свободной аминокислотой. Аргинин несет четыре атома азота и из одной молекулы аргинина образуется четыре молекулы глутамата. Как синтез, так и распад аргинина происходит через образование орнитина (рис. 4).

У животных цикл мочевины выполняет важную роль, способствуя выводу излишков азота: в каждом раунде цикла образуется молекула мочевины. У растений нет механизма вывода азота, напротив, существует система рециркуляции и ретранслокации азота, когда азот выводится из стареющих органов или мобилизуется из резервов и вновь используется для синтеза аминокислот. Предполагается, что цикл мочевины у растений принимает участие именно в этих процессах (Canas et al., 2008; Funck et al., 2008). Все ферменты, катализирующие реакции цикла мочевины у растений, известны, однако, в литературе нет четких

метионин

Рисунок 4. Биосинтез орнитина, аргинина и полиаминов. 1чГ-ацГС - >1-

ацетилглутаматсинтаза, Ы-ацГК - Ы-ацетилглутаматкиназа, Ы-ацГФР - Ы-ацетилглутамат-5-фосфатредуктаза, М-ацОАТ - N-ацетилами нотрансфераза,

ацОГАТ - М-ацетилорнитин:глутамат ацетилтрансфераза, ОДК -

орнитиндекарбоксилаза, ОТК - орнитинтранскарбомоилаза, АСС -

аргиносукцинатсинтаза, АСЛ - аргиносукцинатлиаза, АДК -

аргининдекарбоксилаза, АИГ - агматиниминогидролаза, И-КПИГ - 14-

карбомоилпутресциниминогидролаза, СпдС - спермидинсинтаза, СпмС — сперминсинтза, Б-АМД - Б-аденозилметиониндекарбоксилаза, МАТ метионинаденозилтрансфераза

указаний на функционирование данной системы как цикла. Можно допустить, что

метаболическая часть цикла мочевины у растений отделена от катаболической,

поскольку метаболическая часть связана с накоплением аргинина и запасанием

азота, а катаболическая с высвобождением ресурсов азота из резервов. Возможно,

для растений более правильным будет рассматривать цикл мочевины не как цикл, а

как два разнонаправленных процесса: синтез орнитина и аргинина и катаболизм

этих аминокислот, поскольку данные процессы происходят в разных условиях и на

разных стадиях жизненного цикла.

1.4.2.2.2. Биосинтез орнитина и аргинина. Биосинтез аргинина и орнитина и его регуляция достаточно полно исследованы у прокариот и животных, у растений, напротив, механизм биосинтеза аргинина и орнитина изучен недостаточно

подробно. В последние два десятилетия вышло лишь несколько работ, затрагивающих эту проблему (Slocum, 2005). Орнитин является предшественником аргинина (Slocum, 2005) и полиаминов (Kusano et al., 2008), также давно обсуждается роль орнитина как предшественника пролина (Stranska et al., 2008). Потребность клетки в орнитине связана не только с необходимостью запасать азот, но и с другими жизненными функциями. Поэтому биосинтез аргинина принято делить на два этапа: биосинтез орнитина из глутамата и биосинтез аргинина из орнитина.

1.4.2.2.3. Основной путь биосинтеза орнитина. Орнитин синтезируется из глутамата через серию ацетилированных промежуточных соединений (рис 3). Первый шаг - ацетилирование глутамата ферментом N-ацетилглутаматсинтазой, следующие два фермента фосфорилируют и окисляют ацетилированный глутамат до полуальдегида ацетил-глутаминовой кислоты. На этой стадии ацетилирование предотвращает спонтанную циклизацию полуальдегида до пирролин-5-карбоксилата с последующим превращенем П5К в пролин. Таким образом, неацетилированный полуальдегид глутаминовой кислоты (ПГК) превращается в пролин, а ацетилированный - в орнитин. Следующим шагом в синтезе орнитина является перенос аминогруппы с глутамата на ацетилированный ПГК ферментом N-ацетилорнитинаминотрансферазой с образованием N-ацетилорнитина. Далее ацето-группа переносится с орнитина снова на глутамат ферментом N-ацетилортинитин:1М-ацетилглутамат ацетилтрансферазой с образованием орнитина и ацетилглутамата, который снова вступает в последующие реакции биосинтеза орнитина. Таким образом, путь биосинтеза орнитина является циклическим процессом, в котором сохраняется ацетильная группа. Первичный синтез ацетилглутамата ферментом ацетилглутаматсинтазой необходим только для инициации процесса. При каталитических количествах ацетильной группы в цикле биосинтеза орнитина фермент ацетилглутаматсинтаза в процессе не задействован (Slocum, 2005).

Пока не существует достаточного количества экспериментальных данных о внутриклеточной локализации ферментов пути биосинтеза орнитина. Исходя из оценок различных программ, предсказывающих внутриклеточную локализацию, основываясь на первичной последовательности аминокислот, большая часть ферментов синтеза орнитина локализована в пластидах (Slocum, 2005).

1.4.2.2.4. Участие OAT в биосинтезе орнитина. Пути биосинтеза пролина и орнитина дивергируют на стадии ацетилирования глутамата. Однако, существует гипотеза об альтернативном пути биосинтеза орнитина из неацетилированной формы ПГК ферментом ОАТ (Page et al., 2010; Slocum, 2005). Классически фермент ОАТ у растений рассматривается, как фермент катаболизма орнитина: он переносит аминогруппу с орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием глутамата и ПГК (Funck et al, 2008). В то же время, у животных фермент ОАТ катализирует обратимую реакцию взаимопревращения ПГК и орнитина (Alonso, Rubio, 1989; Markova et al, 2005). В одних органах он выполняет функцию катаболизма орнитина, в других - его синтеза из неацетилированного глутамата (Dekaney et al., 2001; Ventura et al, 2009). Было сделано предположение, что у растений в определенных условиях ОАТ также может выполнять синтетическую функцию, хотя для растительных ферментов ОАТ не было показано синтетической активности (Page et al, 2010). Фермент ОАТ находится в митохондриях, в отличие от ферментов основного пути биосинтеза орнитина, локализовнных предположительно в пластидах. Если он и принимает участие в синтезе орнитина, то этот процесс пространственно и функционально отделен от основного пути. Существуют данные, что экспрессия ОАТ высока в каллусах арабидопсиса (Slocum, 2005), а также повышается в несколько раз в культуре клеток тополя в ответ на добавление свежей питательной среды (Page et al, 2010). Предполагается, что повышение экспрессии ОАТ в этом случае связано с его синтетической активностью. Клетки каллуса и культуры клеток недифференцированы и быстро делятся, в них мало пластид, в которых в норме осуществляется синтез орнитина и аргинина, а потребности в аминокислотах очень высоки. Синтез орнитина в митохондриях ферментом ОАТ компенсирует недостаток пластидного синтеза.

1.4.2.2.5. Биосинтез аргинина. Синтез аргинина из орнитина осуществляется ферментами цикла мочевины. Для синтеза аргинина необходимо достаточное количество карбамоилфосфата. У растений фермент карбамоилфосфатсинтаза производит единый пул карбамоилфосфата для двух процессов: синтеза аргинина и пиримидинов, эти процессы у растений скоординированы. Первой реакцией в пути синтеза аргинина является присоединение карбамоилфосфата к дельта-аминогруппе орнитина ферментом орнитинтранскарбамоилазой с образовнием цитруллина (рис. 3). Далее аргиносукцинатсинтаза и аргиносукцинатлиаза присоединяют к цитруллину аспартат и отщепляют фумарат соответственно.

Ферменты биосинтеза аргинина, как и ферменты синтеза орнитина, локализованы в пластидах (Slocum, 2005).

1.4.2.2.6. Катаболизм аргинина и орнитина. Роль ОАТ. Катаболизм аргинина и орнитина происходит в митохондриях. Фермент аргиназа расщепляет аргинин на орнитин и мочевину. Далее мочевина выводится из митохондрий, а орнитин подвергается дальнейшей конверсии (Funck et al., 2008). Фермент OAT переносит аминогруппу с орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием ПГК и глутамата. ПГК спонтанно циклизуется до П5К. ПГК и П5К окисляются до глутамата ферментом П5КДГ. Мочевина расщепляется в цитоплазме ферментом уреазой с образованием углекислого газа и двух ионов аммония, которые переносятся на глутамат с образованием глутамина (Sirko, Brodzik, 2000). Таким образом, в результате расщепления одной молекулы аргинина происходит образование двух молекул глутамина или четырех молекул глутамата.

Роль ОАТ в распаде аргинина и орнитина у растений была показана на растениях A. thaliana, мутантных по гену ОАТ (Funck et al., 2008). Эти растения не были способны использовать аргинин и орнитин в качестве единственных источников азота. В присутствие экзогенного орнитина и аргинина они накапливали высокие концентрации этих аминокислот в тканях, также возрастала концентрация интермедиатов цикла мочевины.

1.4.2.3. Участие ОАТ в биосинтезе полиаминов

1.4.2.3.1. Полиамины важны для многих биологических процессов. Полиамины - это низкомолекулярные алифатические поликатионные соединения, несущие положительные заряды на атомах азота. Эти соединения обнаружены у представителей всех царств живых существ. Они выполняют множественные функции в живой клетке. Благодаря своим поликатионным свойствам, полиамины могут связываться в отрицательно заряженными макромолекулами, такими как ДНК, фосфолипиды, компоненты клеточной стенки и белки. Также показано, что полиамины могут объединяться в низкомолекулярные комплексы и подвергаться метилированию и ацетилировнию (Baron, Stasola, 2008). Полиамины вовлечены в такие процессы, как транскрипция, процессинг РНК, реорганизация хроматина, трансляция, регуляция активности ферментов, изменения структуры мембран и многое другое (Kusano et al., 2008). Поскольку полиамины участвуют во множестве клеточных процессов, достаточно сложно выявить их конкретную роль в каждом случае. Существуют данные, указывающие на участие полиаминов в росте и

дифференциации клеток, в контроле клеточного цикла, в процессах программируемой клеточной смерти (Baron, Stasola, 2008). У растений полиамины вовлечены в процесс роста и развития, регуляции жизненного цикла, а также принимают участие в ответе на биотический и абиотический стресс. Было показано, что полиамины необходимы для процессов зиготического и соматического эмбриогенеза (Baron, Stasola, 2008). Содержание полиаминов в клетке и соотношение количества разных полиаминов широко варьирует в различных условиях. Нарушение в процессах регуляции уровня и соотношения полиаминов приводит к нарушениям в жизнедеятельности клеток (Mattoo et al., 2010; Page et al., 2010). Регуляция содержания полиаминов в клетке осуществляется координацией их синтеза, взаимопревращений, комплексообразования и деградации (Kusano et al., 2008). В данном обзоре рассмотрен процесс синтеза полиаминов и его связь с метаболизмом аргинина и орнитина.

1.4.2.3.2 Биосинтез полиаминов. Все основные полиамины, наиболее представленные у растений, синтезируются через два альтернативных пути (рис.3) - из аргинина и из орнитина, с образованием диамина путресцина, который, в свою очередь, является предшественником остальных полиаминов (Kusano et al., 2008). Фермент орнитиндекарбоксилаза осуществляет превращение орнитина в путресцин. Этот фермент описан у различных прокариотических и эукариотических организмов, и также найден у высших растений. У растений и некоторых бактерий обнаружен альтернативный путь синтеза полиаминов. Аргинин превращается путресцин последовательным действием трех ферментов: аргининдекарбоксилазы (АДК), агматиниминогидролазы и N-карбамоилпутресцинаминогидролазы (Kusano et al., 2008).

Далее диамин путресцин может служить предшественником триамина спермидина, в который он превращается действием фермента спермидинсинтазы.

Тетрамин спермин образуется— из слермидина присоединением___второй

аминопропильной группы к спермидину ферментом сперминсинтазой. В этих реакциях аминопропильная группа переносится с декарбоксилированного S-аденозилметионина, который синтезируется из метионина двумя последовательными реакциями, катализируемыми ферментами

метионинаденозилтрансферзой и S-аденозинметиониндекарбоксилазой (Kusano et al., 2008).

Поскольку в данном обзоре основное внимание уделяется метаболизму орнитина, который тесно связан с метаболизмом аргинина, рассмотрим более подробно первые стадии синтеза полиаминов, а именно превращение орнитина и аргинина в путресцин.

Орнитиндекарбоксилаза найдена у многих растений, однако, пока не удалось обнаружить фермент ОДК у A. thaliana - основного модельного объекта генетики растений. Фермент аргининдекарбоксилаза, катализирующий первую стадию превращения аргинина в путресцин, также обнаружен у многих видов (Baron, Stasola, 2008). Этот фермент рассматривается как основной фермент пути биосинтеза путресцина из аргинина (Kusano et al., 2008). Биосинтез путресцина происходит во всех клетках растения, однако, для разных типов клеток и стадий жизненного цикла могут быть характерны различные пути биосинтеза полиаминов. Экспрессия гена ОДК характерна для митотически активных клеток. Она совпадает с экспрессией антигена, маркирующего пролиферирующие клетки (Acosta et al., 2005). Существуют данные, демонстрирующие высокую активность ОДК в пролиферирующей культуре клеток, в почках картофеля, в клетках меристем и прокамбиума, а также в самых молодых листьях и кончике корня у томата (Acosta et al., 2005; Cohen et al., 1982; Heimer et al., 1979). На растениях табака также показано, что меристемы являются зонами активного синтеза полиаминов за счет активности ОДК (Paschadilis et al., 2005). В дифференцированных тканях растений ОДК не вносит существенного вклада в общий синтез полиаминов, там основным ферментом синтеза путресцина становится АДК (Acosta et al., 2005; Cohen et al., 1982; Paschadilis et al., 2005). Активность АДК не имеет видимых градиентов (Cohen et al., 1982). Экспрессия АДК обнаружена преимущественно в дифференцированных и растущих клетках побегов и корней (Acosta et al., 2005; Paschadilis et al., 2005). Модуляция синтеза полиаминов в ответ на внешние стимулы также преимущественно происходит за счет изменения активности фермента АДК (Baron, Stasola, 2008). В эмбриогенезе активны оба пути биосинтеза полиаминов (Baron, Stasola, 2008). Предположительно, АДК локализована в пластидах и ядре, а ОДК - в цитоплазме (Baron, Stasola, 2008). Таким образом, можно заключить, что в митотически активных тканях предшественником полиаминов является преимущественно орнитин, а в дифференцированных -аргинин.

1.4.2.3.3. Возможная роль ОАТ в регуляции синтеза полиаминов. Поскольку экспрессия ОАТ ассоциирована с митотически активными тканями (Page et al., 2010; Slocum, 2005; Wang G. et al., 2007), и ОАТ катализирует превращение орнитина, можно предположить, что активности ферментов ОАТ и ОДК взаимосвязаны. Логично предположить, что ОАТ участвует в регуляции уровня орнитина в клетке (Page et al., 2010). Значит, активность ОАТ в делящихся клетках регулирует доступность субстрата для синтеза полиаминов. Если рассматривать ОАТ как ген синтеза орнитина, то коэкспрессия ОАТ и ОДК представляется логичной. В этом случае ОАТ выполняет важную роль по обеспечению делящихся клеток орнитином для синтеза полиаминов (Page et al., 2010). Если рассматривать ген ОАТ как ген катаболизма орнитина, то ОАТ и ОДК конкурируют за субстрат. Одновременная активность этих ферментов требует большого количества орнитина. Следовательно, в митотически активных тканях необходима система доставки или синтеза орнитина. Однако, в настоящее время вопрос об активности транспортеров и генов синтеза орнитина в делящихся клетках пока остается неизученным.

1.4.3. Роль ОАТ в онтогенезе

Данные об участии ОАТ в развитии растений весьма немногочисленны. Однако, поскольку ОАТ принимает участие в метаболизме аргинина и, возможно, задействована в регуляции синтеза полиаминов, необходимо рассмотреть возможное участие этого фермента в процессах роста и развития растений. Процессы запасания-утилизации аргинина очень важны для размножения растений (Slocum, 2005), а полиамины выступают регуляторами различных процессов в числе которых клеточное деление и эмбриогенез (Baron, Stasola, 2008).

Существует достаточно много данных, демонстрирующих высокий уровень экспрессии и активности ОАТ у проростков, но не у взрослых растений (Canas et al., 2008; Roosens et al., 1998), что указывает на специфическую регуляцию ОАТ в онтогенезе. Регуляторные механизмы, определяющие эту специфичность пока не ясны. На момент написания этого обзора существует только одна работа, рассматривающие ген ОАТ с точки зрения процессов роста и развития (Canas et al, 2008).

В работе Canas с соавторами (2008) изучалась роль ОАТ при прорастании семян Pinus silvestris. Во время прорастания зародыш использует запасы питательных веществ из семени. Основная часть азота, как было сказано выше, запасена в виде

аргинина и аргинин-богатых белков. Мобилизация азота при прорастании заключается в его переводе из запасенной формы (аргинин) в мобильные (глутамин и аспарагин). Расщепление аргинина ферментом аргиназой приводит к образованию орнитина и мочевины. Мочевина далее расщепляется уреазой, а освободившиеся два иона аммония ассимилируются двумя молекулами глутамата с образованием двух молекул глутамина в реакции, катализируемой глутаминсинтазой. Было высказано предположение, что орнитин, получившийся в процессе расщепления аргинина, далее подвергается дальнейшей деградации с образованием двух молекул глутамата, которые как раз необходимы для ассимиляции аммония, образовавшегося при расщеплении мочевины. Фермент ОАТ выступает основным поставщиком молекул глутамата в прорастающем семени. Он переносит аминогруппу с орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием ПГК и одной молекулы глутамата. ПГК, находяцийся в равновесии со своей циклической формой, П5К, далее подвергается окислению ферментом П5КДГ. В результате этой реакции образуется вторая молекула глутамата. Две молекулы глутамата ассимилируют два иона аммония мочевины с образованием двух молекул глутамина. Глутамин далее может подвергаться переаминированию, поставляя аммоний для синтеза аспартата и аспарагина (Canovas et al., 2007). Таким образом, при прорастании, азот переводися с одной молекулы аргинина на две молекулы глутамина. Для этого необходимы активности таких ферментов как аргиназа, уреаза, глутаминсинтаза, орнитинаминотрасфераза и изоцитратдегидрогеназа (ИЦДГ, фермент, синтезирующий альфакетоглутрат). Экспрессия ферментов ОАТ, аргиназы и ИЦДГ была супрессирована в сухих семенах и активировалась на ранних стадиях прорастания. Одновременно с активацией этих ферментов менялся аминокислотный состав тканей зародыша. В сухом семени основными аминокислотами были пролин (40,6%) и аргинин (23%), на ранних стадиях прорастания основной аминокислотой становился глутамин (55,3%). Глутаматсинтаза, которая является основным ферментом синтеза глутамата во взрослом растении, неактивна во время прорастания. Было высказано предположение, что ОАТ является основным поставщиком глутамата для дальнейшего синтеза аминокислот при прорастании семян Pinns silvestris. Верно ли это предположение для остальных растений, пока не ясно, так как растения арабидопсиса, мутантные по гену ОАТ, способны к размножению, фенотипически

не отличаются от контроля, а их семена обладают нормальной всхожестью (Funck etal., 2008).

1.4.4. Структура и транскрипционная регуляция гена ОАТ у Arabidopsis thaliana.

Во всем растительном царстве наиболее изученным растением является

Arabidopsis thaliana. Геном этого растения отсеквенирован и хорошо охарактеризован. На настоящий момент A. thaliana является одним из немногих растений, для которых известна детальная структура гена ОАТ.

Ген ОАТ расположен в обратной ориентации на пятой хромосоме арабидопсиса. Он занимает 2,9 т.п.н. и содержит 10 экзонов и 9 интронов (рис. 5). Кодирующая последовательность гена ОАТ арабидопсиса имеет длину 1428 нуклеотидов.

Для A. thaliana существуют обширные базы данных (Омельянчук и др., 2009) и программное обеспечение, позволяющее обрабатывать массивы накопленных данных по профилированию транскриптов (Swarbreck et al, 2008; Winter et al, 2007; Hruz et al, 2008). В частности, есть возможность анализировать паттерн транскрипции отдельных генов, основываясь на всей совокупности экспериментов по исследованию транскриптомов. Паттерн экспрессии гена ОАТ арабидопсиса, восстановленый с использованием разных информационных ресурсов (Swarbreck et al, 2008; Winter et al, 2007; Hruz et al, 2008), значительно варьирует. Однако, можно заключить, что экспрессия гена ОАТ наиболее высока в семенах на разных стадиях (от формирования стручка до прорастания семени), а также в листьях на стадии увядания. Повышенный (относительно среднего) уровень экспрессии наблюдается в элементах цветка (чашелистиках, лепестках и тычинках) на поздних стадиях цветения и в листьях, растущих на стебле цветоносного побега (рис. 6) В корне экспрессия ОАТ мало отличается от среднего уровня.

По данным Arabidopsis eFP Browser (Winter et al, 2007) экспрессия ОАТ индуцируется в условиях осмотического стресса (в присутствии соли и маннитола), несколько повышается в ответ на поранение и снижается при холодовом стрессе (Kilian et al., 2007). Однако, при рассмотрении более широкого поля данных с помощью программы Genevestigator (Hruz et al, 2008), эти результаты подтверждаются менее, чем в половине экспериментов.

В целом по итогам анализа баз данных можно заключить, что все имеющиеся сведения об экспрессии гена ОАТ у арабидопсиса разрозненны, противоречивы и не позволяют составить целостную картину.

ftT5G46180.i (DELTA-OAT) ___

Confidence : m (T2)

Рисунок 5. Экзон-интронная структура гена OAT A. thaliana по данным ресурса TA1R {Swarbreck et al 2008).

AJtSg-^ie 1 ВО 24вв7» lit ПША-ОМ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Герасимова, Софья Викторовна

Выводы

1. Показано, что изменение экспрессии гена ОАТ не оказывает влияние на уровень пролина: трансгенные растения, несущие созданные генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, не отличаются от контрольных растений по содержанию пролина ни в норме, ни при солевом стрессе.

2. Обнаружено, что изменение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях влияет на ростовые характеристики побегов и корней в норме и при солевом стрессе:

• введение в геном растений генетической конструкции, усиливающей экспрессию гена ОАТ, приводит к повышенному формированию корней в норме и повышенной устойчивости к солевому стрессу;

• введение в геном растений антисмыслового супрессора ОАТ приводит к пониженному формированию корней при солевом стрессе.

3. Проведена оценка активности промотора гена ОАТ A.thaliana, с использованием гена-репортера. Показано, что активность промотора наблюдается в меристематических зонах (апикальной и пазушных почках, первом листе, зоне укоренения, кончиках корней). В онтогенезе промотор гена ОАТ индуцируется при прорастании семени во всех тканях проростка с наибольшим уровнем активности в семядолях.

4. Показано, что уровень экспрессии гена ОАТ N. tabacum различен в разных тканях и органах:

• наибольший уровень мРНК ОАТ наблюдается в зонах активного роста (каллус, проростки, апикальная меристема, первый лист);

• минимальный уровень мРНК ОАТ наблюдается в дифференцированных тканях (стебель, лист).

5. Сформулирована новая гипотеза о роли гена ОАТ у растений: изменение ростовых характеристик в ответ на изменение экспрессии гена ОАТ, а также локализация экспрессии этого гена в зонах роста позволяет предположить, что ген ОАТ принимает участие в процессах роста растений и возможно, участвует в защите зон роста в условиях стресса.

В заключение хотелось бы выразить искреннюю благодарность Кочетову Алексею Владимировичу за чуткое руководство во время выполнения диссертационной работы, Першиной Лидии Александровне, Чумакову Михаилу Иосифовичу и Хлесткиной Елене Константиновне за внимательное критическое прочтение диссертации и ценные замечания, Макаровой Елене Николаевне за помощь в оформлении диссертации, Гореловой Вере Васильевне и Романовой Антонине Валерьевне, а также всему коллективу Лаборатории генной инженерии ИЦиГ СО РАН за плодотворную совместную работу.

Заключение

В данной диссертационной работе была создана новая генетическая модель для исследования функций гена ОАТ растений. Она включает генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в растениях, и репортерную конструкцию для анализа транскрипционной активности гена ОАТ. С использованием данной модели впервые был получен ряд результатов, существенно расширяющих современные представления о функциях гена ОАТ у растений. Было показано, что индуцированное трансгенезом изменение экспрессии гена ОАТ приводит к изменению параметров роста растений в норме и при стрессе. Увеличение экспрессии гена ОАТ приводит к достоверному увеличению корневой массы растений и повышению их солеустойчивости за счет преодоления ингибирующего влияния солевого стресса на рост побегов. Введение антисмыслового супрессора гена ОАТ почти полностью ингибирует укоренение в условиях солевого стресса. В то же время, изменение экспрессии гена ОАТ не влияет на уровень пролина. Эти результаты не подтверждают гипотезу об участии гена ОАТ в синтезе пролина, однако позволяют выдвинуть предположение об участии этого гена в ростовых процессах. С использованием репортерной генетической конструкции было обнаружено, что транскрипционная активность промотора гена ОАТ ассоциирована с зонами инициации роста и с процессами прорастания семени. Эти результаты также указывают на связь гена ОАТ с ростовыми процессами. Для того чтобы проверить адекватность созданной генетической модели, была проведена оценка уровня мРНК ОАТ в разных тканях и органах. Было показано, что экспрессия этого гена повышена в митотически-активных тканях и в проростках на ранних стадиях прорастания, что согласуется с предыдущими результатами и подтверждает адекватность созданной генетической модели.

На основании полученных результатов в данной диссертационной работе была сформулирована новая гипотеза: функции гена ОАТ связаны с поддержанием процессов роста, в частности, укоренения в норме и в условиях солевого стресса.

Созданная генетическая модель может быть использована для дальнейших исследований. Перспективным представляется изучение параметров роста растений с измененной экспрессией гена ОАТ в разнообразных условиях. Репортерная конструкция может быть использована для изучения индукции промотора гена ОАТ различными химическими агентами и факторами внешней среды, а мутантные варианты промотора гена ОАТ на основе полученной репортерной конструкции могут быть использованы для исследования структуры промотора и поиска специфических регуляторных сайтов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Герасимова, Софья Викторовна, 2011 год

Список литературы

1. Базилевич Н.И., Титлянова А.А. Биотический круговорот на пяти континентах. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2008. С. 154.

2. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С. Комарова М.Л., Коваль B.C., Макарова Н.Н., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т. 40. № 2. С. 282-285.

3. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 321-336.

4. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ие, 1990. 248 с.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Пер. с англ.; Под ред. Т. Маниатиса. М.: Мир, 1984. 480 с.

6. Медведев С.С. Физиология растений. Санкт-Петербург: Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2004. 336 с.

7. Омельянчук Н.А., Миронова В.В., Колчанов Н.А. Генетика развития растений: интеграция информации из различных наблюдений и экспериментов в базах данных//Генетика. 2009. Т. 45. № 11. С. 1476-1492.

8. Сангаев С.С'., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В. Инактивация гена Nkl в растениях табака Nicotiana tabacum SRI за счет РНК-интерференции // Генетика. 2010. Т. 46. С. 131-134.

9. Abdelhalim Н.М., Nada А.М.К., El-Domyati F.M., Abou- Ali R.M.I., Diab A.A., Bahieldin A. Cloning, sequence analysis and in silico mapping of an ABA-inducible gene coding for ornithine 5-aminotransferase from Vicia villosa II Egyptian J of Genetics and Cytology. 2010. V. 39. P. 143-156.

10. Acosta C., Pérez-Amador M.A., Carbonell J., Granell A. The two ways to produce putrescine in tomato are cell-specific during normal development // Plant Sci. 2005. V. 168. P. 1053-1057.

11. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science, 2002. 1463 p.

12. Alonso E., Rubio V. Participation of ornithine aminotransferase in the synthesis and catabolism of ornithine in mice. Studies using gabaculine and arginine deprivation // Biochem. J. 1989. V. 259. P. 131-138.

13. Alting-Mees M.A. and Short J.M. pBluescript II: gene mapping vectors // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17(22). P. 9494.

14. Armengaud P., Thiery L., Buhot N., March G. G. and Savoure A. Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features // Physiol. Plant. 2004. V. 120. P. 442^150.

15. Balbas P., Lorence A. Recombinant gene expression: reviews and protocols. Totowa, New Jersey: Humana press Inc., 2004. 494 p.

16. Baron K., Stasolla C. The role of polyamines during in vivo and in vitro development // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2008. V. 44. P. 384-395.

17. Bates L.S., Waldren R.P., Teare ID. Rapid determination of free Pro for water-stress studies // Plants and Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

18. Baurle I., Laux T. Apical meristems: the plant's fountain of youth // Bioessays. 2003. V. 25(10). P. 961-970.

19. Bennett T., Leyser O. Something on the side: axillary meristems and plant development // Plant Mol Biol. 2006. V. 60(6). P. 843-854.

20. Benson D.A., Karsch-Mizrachi /., Lipman D.J., Ostell J., Sayers E.W. GenBank // Nucleic Acids Res. 2011. D32-37.

21. Bone D.H. Metabolism of citrulline and ornithine in mung bean mitochondria // Plant Physiol. 1959. V. 34. P. 171-175.

22. Boon L., Geerts W.J.C., Jonker A., Lamers W.H., Van Noorden C.J.F. High protein diet induces pericentral glutamate dehydrogenase and ornithine aminotransferase to provide sufficient glutamate for pericentral detoxification of ammonia in rat liver lobules // Histochem. Cell. Biol. 1999. V. 111. P. 445-452.

23. Borsani O., Zhu J., Versules P.E., Sunkar R., Zhu J.-K. Endogenous siRNA derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis // Cell. 2005. V. 123. P. 1279-1291.

24. Brugiere N., Dubois F., Limami A.M., Lelandais M., Roux Y., Sangwan R.S., Hirel B. Glutamine synthetase in the phloem plays a major role in controlling proline production // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1995-2011.

25. Canas R.A., Villalobos D.P., Diaz-Moreno S.M., Canovas F.M., Canton F.R. Molecular and Functional Analyses Support a Role of Ornithine-d-Aminotransferase in the Provision of Glutamate for Glutamine Biosynthesis during Pine Germination // Plant Physiol. 2008. V. 148. P. 77-88.

26. Canovas F.M., Avila C., Canton, F.R., Canas, R.A., de la Torre F. Ammonium assimilation and amino acid metabolism in conifers // J Exp Bot. 2007. V. 58. - P. 23072318.

27. Carey M., Smale S.T. Transcriptional Regulation in Eukaryotes: Concepts, Strategies, and Techniques. CSHL Press, 2001. 640 p.

28. Chalfie M., Tu Y, Euskirchen G., Ward W., Prasher D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. V. 263 (5148). P. 802-805.

29. Churchill G.A. Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays // Nat Genet. 2002. V. 32. Suppl. P. 490-495.

30. Cleary M.A., Dorland L., de Koning T.J., Poll-The B.T., Duran M., Mandell R., Shih V.E., Berger R., Olpin S.E., Besley G.T. Ornithine aminotransferase deficiency: diagnostic difficulties in neonatal presentation // J Inherit Metab Dis. 2005. V. 28(5). P. 673-679.

31. Cohen E., Heimer Y.M., Mizrahi Y. Ornithine Decarboxylase and Arginine Decarboxylase Activities in Meristematic Tissues of Tomato and Potato Plants // Plant Physiol. 1982. V. 70. P. 544-546.

32. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H. et al Vectors for cloning in plant cells // Meth. Enzymol. 1987. V.153. P.277-292.

33. Degols G. Functional analysis of the regulatory region adjacent to the cargB gene of Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1987. V. 169. P. 193-200.

34. Dekaney C.M, Wu G., Jaeger L.A. Ornithine aminotransferase messenger RNA expression and enzymatic activity in fetal porcine intestine // Pediatr. Res. 2001. V. 50. P. 104-109.

35. Delauney A.J. and Verma D.P.S. A soybean gene encoding Al-pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 221. P. 299-305.

36. Delauney A.J., Hu C.-A.A., Kavi Kishor P.B. and Verma D.P.S. Cloning of ornithine d-aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by transcomplementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 18673-18678.

37. Deuschle K., Funck D., Forlani G., Stansky H., Biehl A., Leister D., van der Graff E., Kunze R., Frommer W.B. The role of delta-l-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase in proline degradation // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 3413-3425

38. Deuschle K., Funck D., Hellman H., Daeschner K., Binder S., Frommer W.B. A nuclear gene encoding mitochondrial Dl-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase and its potential role in protection from proline toxicity // Plant J. 2001 .V. 27. P. 345-355

39. Diaz P., Betti M, Sanchez D.H., Udvardi M.K., Monza J., Marquez A.J. Deficiency in plastidic glutamine synthetase alters proline metabolism and transcriptomic response in Lotus japonicus under drought stress // New Phytologist. 2010. V. 188. P. 10011013.

40. Elthon T.E., Stewart C.R. Proline oxidation in corn mitochondria. Involvement of NAD, relationships to ornithine metabolism, and sidedness on the inner membrane // Plant Physiol. 1982. V. 70. P. 567-572

41. Engelke D. RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of RNAi Technology. Washington: DNA press LLC, 2004. 244 p.

42. Fleming A. Metabolic aspects of organogenesis in the shoot apical meristem // J Exp Bot. 2006. V. 57(9). P. 1863-1870.

43. Forde B.G., Lea P.J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling // J. of Exp. Botany. 2007. V. 58. №9. P. 2339-2358.

44. Forlani G., Mangiagallia A., Pinterb C., Nielsena E. Expression of dl-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase and proline:arginine homeostasis in Solatium tuberosum // Physiol. Plantarum. 2000. V. 110. P. 22-27.

45. Foyer C. H., Noctor G., Hodges M. Respiration and nitrogen assimilation: targeting mitochondria-associated metabolism as a means to enhance nitrogen use efficiency // J. of Exp. Botany. 2011. V. 62 (4). P. 1467-1483.

46. Francis D., Halford N.G. Nutrient sensing in plant meristems // Plant Mol Biol. 2006. V. 60(6). P. 981-993.

47. Frohman M.A. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE // Methods Enzymol. 1993. V. 218. P. 340-356.

48. Funck D., Eckard S., Muller G. Non-redundant functions of two proline dehydrogenase isoforms in Arabidopsis // BMC Plant Biology. 2010. V. 10. P. 70.

49. Funck D., Stadelhofer B., Koch W. Ornithine-delta-aminotransferase is essential for arginine catabolism but not for proline biosynthesis // BMC Plant Biol. 2008. V. 8. P. 40.

50. Gafan C., Wilson J., Berger L.C., Berger B.J. Characterization of the ornithine aminotransferase from Plasmodium falciparum // Mol. Biochem. Parasitol. 2001. V. 118(1). P.l-10.

51. Gardan R., Rapoport G., Debarbouille M. Expression of the roc DEF operon involved in the arginine catabolism in Bacillus subtilis // J Mol Biol. 1995. V. 249. P. 843-856.

52. Gilchrist E, Haughn G. Reverse genetics techniques: engineering loss and gain of gene function in plants // Brief Funct Genomics. 2010. V. 9(2). P. 103-110.

53. Ha C.M., Jun J.H., Fletcher J.C. Shoot apical meristem form and function // Curr Top Dev Biol. 2010. V. 91. P. 103-140.

54. Heimberg H., Boyen A., Crabeel M., Glansdorff N. Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae acetylornithine aminotransferase: evolutionary relationship with ornithine aminotransferase // Gene. 1990. V. 90(1). P. 69-78.

55. Heimer Y.M., Mizrahi Y., Bachrach U. Ornithine-decarboxylase activity in rapidly proliferating plant cells // FEBS Lett. 1979. V. 104. P. 146-148.

56. Helliwell C., Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants // Methods. 2003. V. 30(4). P. 289-295.

57. Hennaut, C. Ornithine transaminase synthesis in Saccharomyces cerevisiae: induction by allophanate, intermediate and inducer of the urea degradative pathway, adds to arginine induction // Curr. Genet. 1981. V. 4. P. 69-72.

58. Higo K., Ugawa Y., Iwamoto M., Korenaga T. Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999 //Nucleic Acids Research. 1999. V.27(l) P. 297-300.

59. Hruz T., Laule ()., Szabo G., Wessendorp F., Bleuler S., Oertle L., Widmayer P., Gruissem W., Zimmermann P. Genevestigator V3: a reference expression database for the meta-analysis of transcriptomes // Adv. Bioinformatics. 2008. 420747.

60. Hu, C-A.A., Delauney A. J., Verma D.P.S. A bifunctional enzyme (Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 9354-9358.

61. Huang H., Tudor M., Su T. et al DNA binding properties of two Arabidopsis MADS domain proteins: binding consensus and dimer formation //Plant Cell. 1996. V. 8. P. 8194.

62. Hull GA., Devic M. The beta-glucuronidase (gus) reporter gene system. Gene fusions; spectrophotometric, fluorometric, and histochemical detection // Methods Mol Biol. 1995. V. 49. P. 125-141.

63. Jefferson RA. The GUS reporter gene system // Nature. 1989. V. 342. P. 837-838.

64. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. beta-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker // PNAS. 1986. V. 83(22). P. 8447-8451.

65. Jefferson RA., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker, in higher plants // EMBO J. 1987. V. 6(13). P.3901-3907.

66. Jortzik E., Fritz-Wolf K., Sturm N., Hipp M., Rahlfs S., Becker K. Redox regulation of Plasmodium falciparum ornithine 5-aminotransferase // J. Mol. Biol. 2010. V. 402(2). P. 445-459.

67. Jubault M., Hamon C., Gravot A., Lariagon C., Delourme R., Bouchereau A., Manzanares-Dauleux M. J. Differential Regulation of Root Arginine Catabolism and

Polyamine Metabolism in Clubroot-Suseeptible and Partially Resistant Arabidopsis Genotypes // Plant Physiol. 2008. V. 146. P. 2008-2019.

68. Kilian J., Whitehead D., Horak J., Wanke D., Weinl S., Batistic O., D'Angelo C., Bornberg-Bauer E., Kudla J., Harter K. The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses // Plant J. 2007. V. 50(2). P. 347-363.

69. Kishor Kavi P.B., Sangam S., Amrutha R.N., Laxmi P., Naidu K.R., Rao K.R.S.S., Rao S., Reddy K.J., Theriappan P. Sreenivasulu N. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance // Current Science. 2005. V. 88. NO. 3. P. 424-438.

70. Kusano T.,-Berberich T., Tateda C., Takahashi Y. Polyamines: essential factors for growth and survival // Planta. 2008. V. 228. P.367-381.

71. Lloyd A. Vector construction for gene overexpression as a tool to elucidate gene function // Methods Mol Biol. 2003. V. 236. P. 329-344.

72. Lu G., Moriyama E.N. Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite // Brief Bioinform. 2004. V. 5(4). P. 378-388.

73. Lutts S, Majerus V, Kinet J-M. NaCl effects on proline metabolism in rice (Oryza sativa) seedlings// Physiologia Plantarum. 1999. V. 105. P. 450^158.

74. Madan S., Nainawatee H.S., Jain R.K., Chowdhury J.B. Proline and proline metabolising enzymes in in-vitro selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under salt stress // Ann. Bot. 1995. V. 76. P. 51 -57.

75. Markova M., Peneff C., Hewlins M.J.E., Schirmer T., John R.A. Determinants of substrate specificity in co-aminotransferases // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 3640936416.

76. Martineiii T, Whittaker A, Bochicchio A, Vazzana C, Suzuki A, Masclaux-Daubresse C. Amino acid pattern and glutamate metabolism during dehydration stress in the 'resurrection' plant Sporobolus stapfianus: a comparison between desiccation-sensitive and desiccation-tolerant leaves // J Exp Bot. 2007. V. 58(11). P. 3037-3046.

77. Mattioli R, Costantino P, Trovato M. Proline accumulation in plants: not only stress // . Plant Signal Behav. 2009 V.4(ll). P. 1016-1018.

78. Mattoo A.K., Minocha S.C., Minocha R., Handa A.K. Polyamines and cellular metabolism in plants: transgenic approaches reveal different responses to diamine putrescine versus higher polyamines spermidine and spermine // Amino Acids. 2010. V. 38. P. 405-413.

79. Melzer R., Theissen G. MADS and more: transcription factors that shape the plant // Methods Mol Biol. 2011. V.754. P. 3-18.

80: Messenguy F., Vierendeels F., Scherens B., Dubois E. In Saccharomyces cerevisiae, expression of arginine catabolic genes CAR1 and CAR2 in response to exogenous nitrogen availability is mediated by the Ume6 (CargRI)-Sin3 (CargRII)-Rpd3 (CargRIII) complex//J. Bacteriol. 2000. V. 182(11). P. 3158-3164.

81. Miller G., Honig A., Stein H., Suzuki N., Mittler R., Zilberstein A. Unraveling deltal-pyrroline-5-carboxylate-proline cycle in plants by uncoupled expression of proline oxidation enzymes // J. Biol. Chem. 2009. V. 284(39). P. 26482-26492.

82. Miller G., Stein H., Honig A., Kapulnik Y., Zilberstein A. Responsive modes of Medicago sativa proline dehydrogenase genes during salt stress and recovery dictate free proline accumulation // Planta. 2005. V. 222. P. 70-79.

83. Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

84. Nada A.M.K., Abd-Elhalim H.M., El-Domyati F.M., Abou-Ali R.M.I., Bahieldin A. Expression, detection of candidate function and homology modeling for Vicia villosa ornithine S-aminotransferase // GM Crops. 2010. V. 1(4). P. 250-256.

85. Nagaraj S.H, Gasser R.B, Ranganathan S. A hitchhiker's guide to expressed sequence tag (EST) analysis // Brief Bioinform. 2007. V. 8(1). P. 6-21.

86. Nakashima K., Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional Regulatory Networks in Response to Abiotic Stresses in Arabidopsis and Grasses // Plant Physiol. 2009. V. 149(1). P. 88 - 95.

87. Page A.F., Minocha R., Minocha S.C. Living with high putrescine: expression of ornithine and arginine biosynthetic pathway genes in high and low putrescine producing poplar cells // Amino Acids. 2010.

88. Paschalidis K.A.; Roubelakis-Angelakis K.A. Spatial and temporal distribution of polyamine levels and polyamine anabolism in different organs/tissues of the tobacco

plant. Correlations with age, cell division/expansion, and differentiation // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 142-152.

89. Ramesh V., Gusella J.F., Shih V.E. Molecular pathology of gyrate atrophy of the choroid and retina due to ornithine aminotransferase deficiency // Mol. Biol. Med. 1991. V. 8(1). P.81-93.

90. Roa-Rodríguez C. Promoters used to regulate gene expression. CAMBIA, 2003. 207 p.

91. Roosens N.H., Bitar F.A., Loenders K., Angenon G. and Jacobs M. Overexpression of ornthine-d-aminotransferase increases proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants // Mol. Breed. 2002. V. 9. P. 73-80.

92. Roosens N. H.C.J., Thu T.T., Iskandar H.M. and Jacobs M. Isolation of ornithine-d-aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression in Arabiodipsis thaliana // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 263-271.

93^ Ruijter N.C.A., Verhees J., Leeuwen W., Krol A.R. Evaluation and comparison of the GUS, LUC and GFP reporter system for gene expression studies in plants // Plant Biology 2003. V. 5(2). P. 103-115.

94. Ruiz J. M., Rivero R. M., Romero L. Relationship between proline metabolism and NAD kinase in green bean plants subjected to short-term salt stress // Journal of Food, Agriculture and Environment. 2005. V. 3. P. 195-198.

95. Rychlik W. OLIGO 7 primer analysis software // Methods Mol Biol. 2007. V. 402. P. 35-60.

96. Satoh R., Nakashima K., Seki M. et al ACTCAT, a novel cis-acting element for proline-and hypoosmolarity- responsive expression of the ProDH gene encoding proline dehydrogenase in Arabidopsis II Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 709-719.

97. Savoure A., Jaoua S., Hua X., Ardiles IV., Montagu M. V. and Verbruggen N. Isolation, characterization, and chromosomal location of a gene encoding the delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase in Arabidopsis thaliana II FEBS Lett. 1995. V. 372. P. 13-19.

98. Sharma S., Ver slues P.E. Mechanisms independent of abscisic acid (ABA) or proline feedback have a predominant role in transcriptional regulation of proline metabolism during low water potential and stress recover // Plant, Cell and Environment. 2010. V. 33. P. 1838-1851.

99. Shen B.W., Hennig M., Hohenester E., Jansonius J.N., Schirmer T. Crystal structure of human recombinant ornithine aminotransferase // J. Mol. Biol. 1998. V. 277(1). P. 81102.

100. Shimizu-Sato S., Mori H. Control of outgrowth and dormancy in axillary buds // Plant Physiol. 2001. V. 127(4). P. 1405-1413.

101. Shull J.D., Pennington K.L., George S.M. and Kilibarda K.A. The ornithine aminotransferase-encoding gene family of rat: cloning, characterization, and evolutionary relationships between a single expressed gene and three pseudogenes // Gene. 1991. V. 104(2), P. 203-209.

102. Sirko A., Brodzik R. Plant ureases: Roles and regulation // Acta Biochimica Polonica. 2000. V. 47. №.4. P. 1189-1195.

103: Skopelitis D.S., Paranychianakis N. V., Paschalidis K.A., Pliakonis E.D., Delis ID., Yakoumakis D.I., Kouvarakis A., Papadakis A.K., Stephanou E.G., Roubelakis-Angelakis K.A. Abiotic Stress Generates ROS That Signal Expression of Anionic Glutamate Dehydrogenases to Form Glutamate for Proline Synthesis in Tobacco and Grapevine //The Plant Cell, 2006. V. 18. P. 2767-2781.

104. Slocum R.D. Genes, enzymes and regulation of arginine biosynthesis in plants // Plant Physiol, and Biochem. 2005. V. 43 P. 729-745.

105. Sorri I., Brigell M.G., Mdlyusz M., Mahlamciki E., de Meynard C., Kdlviciinen R. Is reduced ornithine-5-aminotransferase activity the cause of vigabatrin-associated visual field defects? //.Epilepsy Res. 2010. V. 92(1). P. 48-53.

106. Stafstrom J.P., Sussex I.M. Patterns of protein synthesis in dormant and growing vegetative buds of pea //Planta. 1988. V. 176. P. 497-505.

107. Storici P., Capitani G., Mtiller R., Schirmer 7'., Jansonius J.N. Crystal structure of human ornithine aminotransferase complexed with the highly specific and potent inhibitor 5-fluoromethylornithine // J. Mol. Biol. 1999. V. 285( 1). P. 297-309.

108. Strdnskd J, Kopecny D, Tylichova M. et al Ornithine delta-aminotransferase: An enzyme implicated in salt tolerance in higher plants // Plant Signal Behav. 2008. V. 3(11). P. 929-35.

109. Strânskâ J., Tylichovâ M., Kopecny D., Snégaroff J., Sebela M. Biochemical characterization of pea ornithine-d-aminotransferase: Substrate specificity and inhibition by di- and polyamines // Biochimie. 2010. V. 92. P. 940-948.

110. Su Y.H., Liu Y.B., Zhang X.S. Auxin-cytokinin interaction regulates meristem development // Mol Plant. 2011. V. 4(4). P. 616-625.

111. Swarbreck D., Wilks C., Lamesch P., Berardini T.Z., Garcia-Hernandez M., Foerster H., Li D., Meyer T., Muller R., Ploetz L., Radenbaugh A., Singh S., Swing V., Tissier C., Zhang P., Huala E. The Arabidopsis Information Resource (TAIR): gene structure and function annotation //Nucleic Acids Res. 2008. D1009-1014.

112. Szabados L., Savouré A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in plant science. 2010. V. 15(2). P. 89-97.

113. Székely G., Abraham E., Cséplo A., Rigo G., Zsigmond L., Csiszâr J., Ayaydin F., Strizhov N., JasikJ., Schmelzer E., Koncz C., Szabados L. Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis // Plant J. 2008. V. 53. P. 11-28.

114. Takechi M, Kanda M., Hori K., Kurotsu T., Saito Y. Purification and properties of L-ornithine delta-aminotransferase from gramicidin S-producing Bacillus brevis // J. Biochem. 1994. V. 116(5). P. 955-959.

115. Tatematsu K., Ward S., Leyser ()., Kamiya Y., Nambara E. Identification of cis-elements that regulate gene expression during initiation of axillary bud outgrowth in Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 138. P.757-766.

116. Tierney M.B., Lamour K.H. An Introduction to Reverse Genetic Tools for Investigating Gene Function // The Plant Health Instructor. 2005. DOI: 10.1094/PHI-A-2005-1025-01.

117. Tôpfer R., Matzeit V., Gronenborn B. et al A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // Nucleic Acids Res. 1987. V.15. P.5890.

118. Tovar-Mendez A., Todd C.D., Polacco J.C. The mitochondrial connection: Arginine degradation versus arginine conversion to nitric oxide // Plant Signal Behav. 2008. V. 3(12). P.l 106-1108.

119. Ulmasov T., Liu Z-B., Hagen G., Guilfoyle T.J. Composite structure of auxin response elements // 1995. Plant Cell. V. 7. P. 1611-1623.

120. Valayannopoulos V., Boddaert N., Mention K., Touati G., Barbier V., Chabli A., Sedel F., Kaplan J., Dufier J.L., Seidenwurm D., Rabier D., Saudubray J.M., de Lonlay P. Secondary creatine deficiency in ornithine delta-aminotransferase deficiency // Mol. Genet. Metab. 2009. V. 97(2). P. 109-113.

121. Ventura G, De Bandt J.P., Segaud F., Perret C., Robic D., Levillain ()., Le Plenier S., Godard C., Cynober L., Moinard C. Overexpression of ornithine aminotransferase: consequences on amino acid homeostasis // Br. J. Nutr. 2009. V. 101. P. 843-851.

122. Ventura G., Moinard C., Segaud F., Le Plenier S., Cynober L., De Bandt J.P. Adaptative response of nitrogen metabolism in early endotoxemia: role of ornithine aminotransferase // Amino Acids. 2010. V. 39(5). P. 1417-1426.

123. Verbruggen N., Hermans C. Proline accumulation in plants: a review // Amino Acids. 2008. V. 35. P. 739.

124. Verbruggen N., Hua X.J., May M., Van Montagu M. Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: Evidence for a negative transcriptional regulator// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8787-8791.

125. Vernoux T., Besnard F., Traas J. Auxin at the shoot apical meristem // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010. V. 2(4). a001487.

126. Wagemaker M.J.M., Eastwood D.C., Welagen J., Van Der Drift C., Jetten M.S.M., Burton K., Van Griensven L.J.L.D., Op Den Camp H.J.ML The role of ornithine aminotransferase in fruiting body formation of the mushroom Agaricus bisporus // Mycol. Res. 2007. V.l 11(8). P. 909-918.

127. WangG., Shang L., Burgett A.W.G., Harran P.G., WangX. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division //PNAS. 2007. V. 104. № 7. p. 2068-2073.

128. Wang T„ Lawler A.M., Steel G., Sipila I., Milam A.H., Valle D. Mice lacking ornithine-delta-aminotransferase have paradoxical neonatal hypoornithinaemia and retinal degeneration // Nat. Genet. 1995. V. 11. P. 185-190.

129. Wang Z-Q., Yuan Y-Z., Qu J-Q., Lin Q-H., Zhang C-F. Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase contribute differentially to proline accumulation in leaves of wheat (Triticum aestivum) seedlings exposed to different salinity // J. of Plant Physiology. 2007. V. 164. P. 695-701.

130. Weltmeier F., Ehlert A., Mayer C.S., et al Combinatorial control of proline dehydrogenase transcription by specific heterodimerisation of bZIP transcription factors //EMBO J. 2006. V. 25. P. 3133-3143

131. Winter D., Vinegar B., Nahal H., Ammar R., Wilson G.V., Provart N.J. An "Electronic Fluorescent Pictograph" browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets // PLoS One. 2007. V. 2(l):e718.

132. Wu L., Fan Z., Guo L., Li Y., Zhang W., Qu L-J., Chen Z. Over-expression of an Arabidopsis delta-OAT gene enhances salt and drought tolerance in transgenic rice // Chinese Science Bulletin. 2003. V. 48. №23. P. 2594-2600.

133. Xue X., Liu A., Hua X. Proline accumulation and transcriptional regulation of proline biosynthesis and degradation in Brassica napus // BMB Reports. 2009. V. 42. P. 28-34.

134. Yang C.W., Kao C.H. Importance of ornithine-delta-aminotransferase to proline accumulation caused by water stress in detached rice leaves // Plant Growth Regul. 1999. V. 27. P. 189-192.

135. Zintz C.B., Inana G. Analysis of the human ornithine aminotransferase gene family // Exp. Eye Res. 1990. V. 50(6). P. 759-770.