Генетические эффекты флавоноидов в бактериальных культурах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Максимов, Александр Юрьевич

• Максимов, Александр Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Максимов, Александр Юрьевич

Введение 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Репарация ДНК, мутагенез и антимутагенез

1.1. ДНК-повреждающие и мутагенные факторы

1.2. Репарация ДНК и мутагенез у бактерий

1.3. Механизмы антимутагенеза

Глава 2. Флавоноиды: структура, классификация, свойства, биологическая активность

2.1. Природные фенольные соединения

2.1. Классификация и общая характеристика флавоноидов

2.2. Биологическая активность флавоноидов 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1. Рабочая коллекция бактериальных культур

3.2. Характеристика использованных флавоноидов

3.3. Питательные среды и растворы

3.4. Условия культивирования и определение количества бактерий

3.5. Методы исследования мутагенного, антимутагенного и ДНК-повреждающего действия

3.6. Полимеразная реакция in vitro с ДНК-полимеразой I

3.7. Анализ активности антиоксидантных ферментов

3.8. Статистическая обработка

Глава 4. Влияние флавоноидов на рост бактерий

4.1. Зависимость роста S. typhimurium от концентрации морина

4.2. Влияние морина на рост и частоту мутаций грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides

4.3. Минимальные ингибирующие концентрации флавоноидов

4.4. Подавление флавоноидами роста штаммов Е. coli, дефектных по репарации ДНК

4.5. Влияние морина на репликацию ДНК in vitro 67 ^

Глава 5. Влияние флавоноидов на частоту мутаций у

S. typhimurium и Е. coli

5.1. Мутагенное действие флавоноидов на S. typhimurium

5.2. Совместное действие флавоноидов и 9-аминоакридина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА

5.3. Совместное действие флавоноидов и бихромата калия на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium

5.4. Совместное действие Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидина и морина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА

5.5. Мутагенное действие флавоноидов и налидиксовой кислоты на штаммы Е. coli WP2, WP2s, WP6 и СМ щ

Глава 6. Модуляция генетических эффектов морина солями двухвалентных металлов

6.1. Минимальные ингибирующие концентрации солей ряда металлов для S. typhimurium ТА

6.2. Модулирующее действие соли магния

6.3. Модулирующее действие соли марганца

6.4. Модулирующее действие соли цинка

6.5. Модулирующее действие соли железа

6.6. Модулирующее действие соли кобальта

6.7. Модулирующее действие соли меди

Глава 7. Обсуждение результатов 103 Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические эффекты флавоноидов в бактериальных культурах»

Актуальность проблемы

В естественной среде генетическая изменчивость и рост микроорганизмов подвержены влиянию различных химических факторов. Достаточно глубоко исследовано влияние некоторых простых ростовых субстратов и необходимых элементов на физиологические процессы модельных ' штаммов бактерий. В то же время, in vivo клетки микроорганизмов подвержены влиянию ряда веществ, не являющихся необходимыми составляющими питательной среды, но проявляющих различную биохимическую и генетическую активность [24, 89]. Некоторые из этих соединений имеют большое значение в стимуляции или ограничении роста бактерий, в формировании, стабилизации и изменении микробных сообществ. Однако экологическая роль подобных компонентов среды мало изучена [11, 18, 20,24].

Растительный мир - огромное по разнообразию, численности и общей биомассе царство автотрофных организмов, продуцирующих и поставляющих в среду подавляющую часть природных органических соединений [18,34]. Растения являются источником разнообразных биологически активных веществ, которые могут быть эффективными экологическими факторами в микроценозах [18, 89].

Флавоноиды — биогенные фенольные вещества, производные флавана или флавона, содержащиеся в тканях высших растений. В настоящее время известно более четырех тысяч индивидуальных флавоноидов и их производных. Разнообразие флавоноидов достигается за счет комбинации заместителей (-ОН, -ОСНз, -СНз и др. групп) в ароматических кольцах, гликозилирования и димеризации [142]. Как и другие фенольные вещества, флавоноиды связывают свободные радикалы, хелатируют катионы металлов. Эти соединения обладают широким спектром физиологического и биохимического действия на живые организмы различных таксономических групп: участвуют в процессах дыхания, онтогенеза, окислительновосстановительных и защитных системах растений [10, 32] влияют на проницаемость мембран [208], являются эффекторами или субстратами ряда ферментов различных организмов [161]. Известны антиоксидантные [74], антирадикальные [73], противоопухолевые [206], антимутагенные [235] и противовирусные [92] свойства флавоноидов, Р-витаминная активность [208].

Ежегодно растительный мир Земли продуцирует миллионы тонн флавоноидов, которые в существенных количествах поступают из растительных тканей в почву и водоемы, во все пищевые цепи, являются постоянными компонентами среды обитания значительной части живых организмов [10, 32, 128]. В отличие от многоклеточных организмов, бактерии имеют максимальный контакт клеточной поверхности с внешней средой, поэтому присутствие флавоноидов должно быть для них особенно значимо [20].

Флавоноиды являются постоянными компонентами продуктов питания человека [4, 21, 22]. Некоторые из них, например кверцетин и его гликозид рутин, используются в медицине. В то же время известно, что кверцетин мутагенен для эукариот [214]. Поэтому исследование генетических эффектов флавоноидов актуально для профилактической медицины [161].

Состояние вопроса

Известны антиоксидантные [201] и антирадикальные свойства флавоноидов [6, 12], цитопротекторное действие на клетки эукариот в различных стрессовых условиях, основанное на связывании свободных радикалов [95, 119, 132].

Активно исследуются медицинские аспекты антирадикальных [167], ангиопротекторных [161,180,189], гепатопротекторных [55,119,165], антибактериальных [89], противовоспалительных и иммуномодулирующих [160, 161] свойств препаратов флавоноидов, их цитостатическое действие в отношении злокачественных клеток [99,170,238]. Сообщается об их мутагенном и антимутагенном действии на эукариоты, а также в микробных тест-системах в условиях метаболической активации ферментами микросомальной фракции печени животных [21,70,170]. Обнаружено антибактериальное действие кверцетина, хризина и катехина [89].

В то же время, влияние флавоноидов на изменчивость и рост бактерий мало изучено. Сведения об их прямом мутагенном действии, антимутагенной активности, антибактериальных свойствах фрагментарны и противоречивы. Опубликованные статьи не дают полного представления о значении флавоноидов как экологического фактора для бактерий. До настоящего времени не проводилось комплексного исследования влияния флавоноидов на рост, жизнеспособность и изменчивость симбиотической и патогенной для человека микрофлоры. Отсутствует оценка баланса мутагенных и антимутагенных свойств этих соединений, их совместного действия с химическими мутагенами и солями металлов [22,44,47].

Цель настоящего исследования - изучение влияния ряда флавоноидов на частоту мутаций и рост штаммов Escherichia coli и Salmonella typhimurium.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние различных концентраций флавоноидов на рост энтеробактерий и грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и Bacillus mycoides.

2. Определить влияние флавоноидов на частоту замен оснований и фреймшифт - мутаций у штаммов S. typhimurium.

3. Оценить зависимость мутагенной активности флавоноидов от структуры их молекул.

4. Изучить совместное действие флавоноидов и стандартных мутагенов (9-аминоакридина, М-метил-К-нитро-К-нитрозогуанидина, бихромата, налидиксовой кислоты) на частоту мутаций у энтеробактерий.

5. Исследовать генетические эффекты флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Научная новизна

Показано цитостатическое действие флавоноидов, относящихся к группам флавонов, флавон-3-олов, катехинов и флаванонов на клетки ^ грамотрицательных бактерий Е. coli и S. typhimurium, а также грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Впервые обнаружено мутагенное действие флавоноидов в культурах грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Установлено, что флавоноиды без метаболической активации индуцируют у бактерий мутации различных типов, наиболее эффективно - мутации типа сдвига рамки считывания генетической информации. Впервые экспериментально показано антимутагенное действие флавоноидов на штаммах S. typhimurium против прямого мутагена акридинового ряда - 9-аминоакридина и оксиданта - бихромата калия. Выявлена модуляция генетического действия флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные, свидетельствующие о мутагенных и антимутагенных эффектах флавоноидов, расширяют представление о воздействии флавоноидов на рост и генетическую стабильность бактерий, и их значении, как экологического фактора в микроценозах. Результаты исследования имеют практическое значение для профилактической медицины. Обнаруженное явление усиления в присутствии флавоноидов эффективности мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, может быть использовано в методах химического мутагенеза и селекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, т> нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ оказывают бактериостатическое действие.

2. Флавоноиды являются мутагенами прямого действия и индуцируют в клетках бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания.

3. Флавоноиды оказывают антимутагенное и цитопротекторное действие в условиях мутагенеза, индуцированного 9-аминоакридином и бихроматом калия.

4. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98», Москва; Областной научно-технической конференции молодых ученых "Химия и экология", Пермь, 1999; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-2001», Волгоград; IX и XI Межвузовских конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Экология: проблемы и перспективы", Пермь, 2001, 2003.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Список принятых сокращений

9-АА - 9-аминоакридин;

АФК активные формы кислорода; днДНК - двунитевая ДНК; он ДНК - однонитевая ДНК;

КОЕ колониеобразующие единицы;

МИК минимальная ингибирующая концентрация;

МННГ - N- метил -N - нитро -N- нитрозогуанидин;

МПА мясо-пептонный агар; сод - супероксиддисмутаза;

LB среда Луриа-Бертани

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Максимов, Александр Юрьевич

выводы

1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ подавляют рост бактерий. Ингибирование роста бактерий обусловлено в большей степени цитостатическим, чем бактерицидным действием флавоноидов.

2. Установлено, что флавоноиды проявляют свойства мутагенов прямого действия. Концентрационная зависимость их мутагенного эффекта имеет нелинейный характер.

3. Показано, что флавоноиды индуцируют у бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания. Генетическая активность структурно различных флавоноидов проявляется в разной степени.

4. Установлено, что флавоноиды в концентрации до 0,5 мМ обладают антимутагенным и цитопротекторным действием при воздействии интеркалирующего мутагена 9-аминоакридина и окислителя бихромата.

5. Обнаружено, что флавоноиды за счет повышения выживаемости клеток увеличивают эффективность мутагенеза, индуцируемого нитрозогуанидином.

6. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа. Ионы двухвалентных металлов, за исключением магния, усиливают антимутагенное действие флавоноидов в отношении 9-аминоакридина. Металлы с переменной валентностью увеличивают частоту мутаций, индуцируемых флавоноидом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Максимов, Александр Юрьевич, 2004 год

1. АбилевС.К. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений. / С.К. Абилев, Г.Г. Порошенко // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Токсикология.- 1986.-Т. 14.- 171 с.

2. Акиньшина Л.П. Генотоксичность фармакопейных производных 5- нитрофурана в бактериальных тест- системах / Л.П. Акиньшина, Т.Б. Танирбергенов, Е.В Бобринев., Г.Н. Золотарева // Генетика. 1992. -Т. 28,№2.-С. 89- 98.

3. Алекперов У.К. Антимутагенез. Теоретические и практические аспекты. -М.: Наука, 1984.- 104 с.

4. Альберт А. Избирательная токсичность. М.: Медицина, 1989. -Т. 1.- 400 с.

5. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. - 464 с.

6. Афанасьев И.Б Свободнорадикальные ингибиторы и промоторы в биологических процессах // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: РМИ. - 1988. - С. 9-25.

7. Бигалиев А.Б. Генетические эффекты ионов металлов. -Алма-Ата: Наука, 1986.- 134 с.

8. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов / Под ред. Ю.А. Ершова. М.: Высш. шк., 2000. - 560 с.

9. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (Ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 10 - С. 18-24.

10. Ботанико фармакогностический словарь / Под ред. К.Ф. Блиновой и Т.П. Яковлева. - М.: Высш. шк, 1990. - 272 с.

11. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М.: Медицина, 1984.- 272с.

12. Бродский А.В. Изучение механизма антиоксидантного действия рутина / А.В. Бродский, А.И. Дорожко, И.Б. Афанасьев // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: РМИ, 1988. - С. 25-28.

13. Васильева С.В. Репарационный эффект генетически активного природного соединения парааминобензойной кислоты в опыте с N-нитрозометилмочевиной / С.В. Васильева, JI.C. Давниченко, Е.В. Луцкова // Докл. АН СССР. 1979. - Т. 247, № 1. - С. 226-230.

14. Васильева С.В. Усиление пара-аминобензойной кислотой процессов репарации ДНК в Escherichia coli К-12 / С.В.Васильева, Л.С. Давниченко, И.А. Рапопорт // Генетика. 1982. - Т. 18. - С. 381 -391.

15. Винклер Г.Н. Генетическая активность катехинов, выделенных из чайного растения / Г.Н. Винклер, М.Н. Запрометов, В.К. Щербаков // Докл. АН СССР. 1967. - Т. 177, № з. с. 699-708.

16. Гауптман 3. Органическая химия/3. Гауптман, Ю. Грефе, X. Ремане. -М.: Химия, 1979. -832 с.

17. Георгиевский В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. -М.: Наука, 1990.-336 с.

18. Гончарова Р.И. Антимутагенез.- Минск: Наука и техника, 1974. 144 с.

19. Громов Б.В. Экология бактерий / Б.В. Громов, Г.В. Павленко Л: ЛГУ, 1989.-248 с.

20. Дурнев А. Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания// Генетика. 1997. - Т. 33, № 2. - С. 165-176.

21. Дурнев А.Д. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий / А.Д. Дурнев, С.Б. Серединин. М.: Медицина, 1998.- 328 с.

22. Жестяников В.Д. Генетика репарационных процессов у микроорганизмов / Генетика микроорганизмов // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Микробиология. 1985. - Т. 15. - С. 5-149.

23. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнера.- М.: Мир, 1981.-520 с.

24. ЗасухинаГ.Д. Рекомбинантный интерферон эффективно защищает клетки от действия мутагенов / Г.Д. Засухина, И.М. Васильева, И.В. Колонина // Докл. АН СССР. 1987. - № 2. - С. 485-487.

25. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот.- М.:Мир, 1987.-584 с.

26. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М.: Высш. шк., 1989.-591 с.

27. КалоусВ. Биофизическая химия / В. Калоус, 3. Павличек. -М.:Мир, 1985.-446 с.

28. Кафиани К.А. ДНК топоизомеразы и механизм действия антинеопластических соединений / К.А. Кафиани., И.Б. Бронштейн // Усп. биол. хим. - М.: Наука, 1988. - Т. 29. - С. 84-112.

29. Колчин Ю.Н. Влияние блокатора 5-липоксигеназы кверцетина на функциональные и морфологические проявления поражения миокарда при ишемии и реперфузии сердца / Ю.Н. Колчин, Л.Ф. Попович, А.Н. Грабовский // Кардиология. 1990. - Т. 30, № 3. - С. 72-75.

30. Костюк В.А. Антиоксидантная активность флавоноидов в различных системах перекисного окисления липидов / В.А. Костюк, А.И.Потапович, С.М.Терещенко, И.Б. Афанасьев // Биохимия. 1988. -Т. 53, №8.-С. 1365-1370.

31. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высш. шк., 1980. - 445 с.33