Генерирование мини-антител для исследования компонентов клеточного ядра тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Вятчанин, Антон Сергеевич

• Вятчанин, Антон Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вятчанин, Антон Сергеевич

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Иммуноглобулины

1.1. Структура и генетика молекул иммуноглобулинов

1.2. Взаимодействия антитела с антигеном

1.3. Использование антител в исследованиях и медицине

1.4. Иммунизация

1.5. Поликлональные антитела

1.6. Моноклональные антитела

1.7. Рекомбинантные технологии получения антител

2. Фаговый дисплей

2.1. Биология бактериофага М

2.2. Библиотеки последовательностей на основе бактеирофага М

2.3. Библиотеки scFv

3. Неканонические антитела представителей сем. Верблюдовые

3.1. Особенности неканонических антител

3.2. Технология фагового дисплея вариабельных доменов неканонических антител

3.3. Синтетические библиотеки неканонических антител

3.4. Свойства мини-антител

3.5. Возможные способы использования мини-антител

3.6. Преимущества мини-антител для детекции антигена in vivo 44 Материалы и методы

1. Оборудование

2. Реактивы

3. Антитела

4. Ферменты

5. Стандартные методы

5.1. Гель-электрофорез в ПААГ

5.2. Вестерн-блот анализ

5.3. Осаждение белков (метанол/хлороформ)

5.4. Иммуно-ферментный анализ

5.5. Очистка белка на №-агарозе

5.6. Определение концентрации белка

5.7. Полимеразная цепная реакция.

5.8. Дефосфорилирование 5'- и З'-концов фрагментов ДНК

5.9. Рестрикция

5.10. Синтез кДНК

5.11. Горизонтальный гель-электрофорез.

5.12. Определение концентрации нуклеиновых кислот

5.13. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций.

5.14. Переосаждение ДНК.

5.15. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

5.16. Препаративное выделение плазмидной ДНК

5.17. Бактериальные среды

5.18. Приготовление компетентных клеток линии Е.соИ.

5.19. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

5.20. Приготовление периплазматического экстракта

6. Работа с фаг-дисплейными библиотеками

6.1. Создание фаг-дисплейных библиотек

6.2. Амплификация фаговых частиц

6.3. Определение концентрации фаговых частиц

6.4. Селекция библиотеки

7. Методы, использованные в работе с ЭгояорИНа melanogaster

7.1. Выделение экстракта ядер эмбрионов D. melanogaster

7.2. Выделение слюнных желез из личинок D. melanogaster

7.3. Клетки D. melanogaster Schneider S

7.4. Фиксация клеток D. melanogaster формальдегидом

7.5. Иммуно-флуоресцентное окрашивание препаратов слюнных желез 63 8. Методы, использованные в работе с двугорбым верблюдом

8.1. Иммунизация верблюда

8.2. Выделение и фракционирование IgG антител

8.3. Выделение В-лимфоцитов

8.4. Выделение РНК из В-лимфоцитов 66 Объекты и задачи исследований 67 Результаты исследований

1. Использование нового модельного животного для создания библиотеки последовательностей вариабельных доменов неканонических антител

2. Исследование свойств новой библиотеки последовательностей мини-антител, полученной иммунизацией бактриана экстрактом ядер D. melanogaster

3. Исследование нового подхода к генерированию мини-антител с использованием библиотек, полученных в результате иммунизации верблюда сшитым in vivo и затем дробленым ультразвуком хроматином

4. «Сэндвич-иммунная» селекция мини-антител

5. Модификация фага-помощника, оптимизация метода фагового дисплея

6. Использование мини-антител к ламину для in vitro и in vivo детекции антигена 95 Обсуждение результатов 99 Выводы 103 Благодарности 104 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Alpha-FP - Alpha-fetoprotein - Альфа-фетопротеин BiP - Binding immunoglobulin protein - шаперон тяжелой цепи иммуноглобулинов

СА125 - Cancer Antigen 125 - раковый антиген 125 (опухолевый маркер) СА199 - Cancer Antigen 199 - раковый антиген 199 (опухолевый маркер)

CDR - Complementarity Determining Region - участок вариабельного домена, определяющий специфичность антитела СН-1 - Constant domain of Heavy chain - первый константый домен тяжелой цепи

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол dsFv - disulfïde-stabilized Fv fragments - Fv, стабилизированный дисульфидной связью

DTT - дитиотриэтол

Fab - fragment antigen binding - антиген связывающий фрагмент

Fv - variable Fragment - вариабельный домен иммуноглобулина

НС - Heavy Chain - тяжелая цепь иммуноглобулина

HCAbs - Heavy Chain-only Antibodies, неканонические антитела Верблюдовых HER-2 - Human Epidermal growth factor Receptor 2 - рецептор эпидермального фактора роста человека 2 LC - Light Chain - легкая цепь иммуноглобулина

MUC-1 - Mucin 1 - муцин 1 (опухолевый маркер)

PSA - prostate specific antigen - антиген, специфичный для рака простаты

PVDF - Поливинилиденфторид

RFP - Red Fluorescent Protein - красный флуоресцентный белок scFv - Single Chain Variable Fragment - слитные вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина

TNF-alpha - Tumor Necrosis Factor - Фактор некроза опухоли-альфа

TRX - Триторакс, продукт гена trithorax

IgG - Immunoglobulin G - иммуноглобулин G

VH - Variable domain of Heavy chain - вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина

VHH - Variable domain of a Heavy chain of a HCAb - вариабельный домен неканонических антител

VL - вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина

VpreB - белок, специфичный для пре-В-клеточной стадии, образующий вместе с

Х5 суррогатный комплекс легкой цепи

X-ChIP - chromatin immunoprecipitation, метод иммуннопреципитации хроматина

БСА - Бычий Сывороточный Альбумин

Да - дальтон

ИФА - иммуноферментный анализ

ОТ-ПЦР - амплификация после обратной транскрипции п.н. - пары нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ФРЭС - Фактор Роста Эндотелия Сосудов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генерирование мини-антител для исследования компонентов клеточного ядра»

Антитела - важнейший инструмент для исследования макромолекул, прежде всего белков. Все большее значение приобретают антитела в связи с их терапевтическим и диагностическим использованием. В настоящее время существует несколько технологий получения новых антител.Получение поликлональных антител из сыворотки иммунизированных животных наиболее простой и доступный метод. Более сложным и, вместе с тем, позволяющим получить более надежные антитела методом (однажды полученные и охарактеризованные гибридомы представляют собой неограниченный источник моноклональных антител) является гибридомная технология. Действительно, за последние десятилетия с помощью гибридомной технологии было получено большое число противораковых антител, однако применение их для лечебных целей наталкивается на серьезные ограничения, связанные с тем, что чужеродные (мышиные) антитела вызывают у человека гуморальный иммунный ответ, элиминирующий экзогенные протеины (а в некоторых случаях приводящей к неблагоприятной анафилактической реакции). Для преодоления этих ограничений необходимо создавать новые рекомбинантные неприродные иммуноглобулины с заменой участков молекулы, не отвечающих за распознавание опухолевой клетки, на соответствующие фрагменты человеческого происхождения (гуманизированные антитела), либо удалять домены, не вовлеченные в связывание антигена (мини-антитела).В последнее время все больше применяются рекомбинантные технологии, основанные на работе с библиотеками последовательностей антител человека. Для построения таких библиотек в экспрессионном векторе соединяют случайным перебором в одной рамке считывания вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, разъединенные линкерной последовательностью. Работа с очень громоздкими библиотеками таких одноцепочечных антител (scFv) весьма трудоемка и имеет ряд узких мест. Результатом такой работы редко бывает высокоаффинное антитело. Само по себе создание репрезентативной библиотеки - трудновыполнимая работа, требующая клонирования всевозможных комбинаций всех последовательностей вариабельных доменов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Определенные сложности связаны со стабильностью полученных генетических конструкций, низким уровнем экспрессии продукта и его растворимостью.Существенный технологический прорыв в этой области связан с обнаружением у представителей сем. Верблюдовые {Camelidae) неканонических антител, лишенных легких цепей и представляющих собой димер укороченных тяжелых цепей. Иммунный ответ с участием этих антител можно вызвать с помощью классической иммунизации.Использование репертуара этих неканонических антител для создания библиотек последовательностей вариабельных доменов (только тяжелой цепи) имеет целый ряд преимуществ. Однодоменная структура узнающего вариабельного домена обуславливает малый размер антиген-связывающего фрагмента (мини-антитела) и его высокую стабильность и растворимость. Благодаря особенностям своего строения, мини-антитела могут использоваться для выявления скрытых для классических иммуноглобулинов эпитопов. Экспрессия с одного гена упрощает генно-инженерные манипуляции и позволяет эффективно и экономично нарабатывать мини-антитело в больших количествах (в Е. coli или дрожжах). Как следствие, существенно упрощаются работы с библиотеками последовательностей вариабельных доменов. Низкая иммуногенность (являющаяся следствием высокой гомологии последовательностей мини-антител с вариабельным доменом тяжелых цепей IgG3 человека) и простота гуманизации открывает широкие возможности для использования мини-антител для создания лекарственных препаратов нового типа.Возможности этой новой технологии мы исследовали и применили в данной работе с целью генерирования новых антител к эндогенным (нативным) эпитопам внутриклеточных белков.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Вятчанин, Антон Сергеевич

выводы

1. Показана принципиальная возможность использования в новой технологии генерирования мини-антител особенностей иммунной системы двугорбого верблюда.

2. Применен новый подход к созданию библиотек последовательностей мини-антител, основанный на иммунизации верблюда сложной белковой смесью. С его использованием получен ряд новых мини-антител к компонентам клеточного ядра.

3. В рамках метода фагового дисплея разработан новый способ селекции мини-антител к компонентам комплекса, содержащего известный белок.

4. На основе модифицированного фага помощника предложены пути оптимизации процедуры отбора мини-антител методом фагового дисплея.

5. Продемонстрирован потенциал использования получаемых мини-антител для детекции антигена, как in vitro, так и in vivo, на примере мини-антитела, специфично связывающегося с ядерным белком ламином.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность коллегам, помогавшим словом и делом: Ряховскому Алексею за ценные советы, Кузнецовой Александре и Арифову Александру за доброе отношение и поддержку, Африкановой Татьяне, Ивановой Татьяне Бурлину Антону за внимание и участие, Воробьевой Надежде за удивительное чувство такта с которым делались замечания. Особую благодарность автор выражает Марине Рутовской и сотрудникам научно-экспериментальной базоы «Черноголовка» ИПЭЭ имени А.Н. Северцова РАН, каждодневный труд которых дал нам возможность работать с верблюдицей Чоней (которой мы тоже безгранично признательны ). Невозможным было бы написание данной работы без советов и внимательного руководства Сергея Владимировича Тиллиба. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы. Благодарен автор и всем людям, помогавшим своим хорошим настроением и добрым отношением.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вятчанин, Антон Сергеевич, 2008 год

1. Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies// FEBS Lett.- 1997.-414(3). P.521-6.

2. Azzazy, H.M. and Highsmith W.E., Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations// Clin Biochem. 2002.- 35(6). P.425-45.

3. Begent, R.H. and Chester K.A. Single-chain Fv antibodies for targeting cancer therapy// Biochem Soc Trans. 1997.- 25(2). P.715-7.

4. Benvenuto, E., Ordas R.J., Tavazza R.s Ancora G., Biocca S., Cattaneo A., Galeffi P. 'Phytoantibodies': a general vector for the expression of immunoglobulin domains in transgenic plants//Plant Mol Biol. 1991.- 17(4). P.865-74.

5. Berry, M.J. and Davies J. Use of antibody fragments in immunoaffinity chromatography. Comparison of FV fragments, VH fragments and paralog peptides// J Chromatogr. 1992.-597(1-2). P.239-45.

6. Bird, R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins// Science. 1988.-242(4877). P.423-6.

7. Boak, J.L., Mitchison N.A., Pattisson P.H. The carrier effect in the secondary response to hapten-protein conjugates. 3. The anatomical distribution of helper cells and antibody-forming-cell-precursors//Eur J Immunol. 1971.- 1(2). P.63-5.

8. Boulianne, G.L., Hozumi N., Shulman M.J. Production of functional chimaeric mouse/human antibody//Nature. 1984.- 312(5995). P.643-6.

9. Chester, K.A., Begent R.H., Robson L., Keep P., Pedley R.B., Boden J.A., Boxer G., Green A., Winter G., Cochet O., et al. Phage libraries for generation of clinically useful antibodies// Lancet. 1994,- 343(8895). P.455-6.

10. Conrath, K.E., Wernery U., Muyldermans S., Nguyen V.K. Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae// Dev Comp Immunol. 2003.- 27(2). P.87-103.

11. Cook, G.P. and Tomlinson I.M. The human immunoglobulin VH repertoire// Immunol Today. 1995.- 16(5). P.237-42.

12. Crissman, J.W. and Smith G.P. Gene-III protein of filamentous phages: evidence for a carboxyl-terminal domain with a role in morphogenesis// Virology. 1984.- 132(2). P.445-55.

13. Cwirla, S.E., Peters E.A., Barrett R.W., Dower W.J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands// Proc Natl Acad Sci USA.- 1990.- 87(16). P.6378-82.

14. Davies, J. and Riechmann L. 'Camelising' human antibody fragments: NMR studies on VH domains//FEBS Lett. 1994.- 339(3). P.285-90.

15. Davies, J. and Riechmann L. Antibody VH domains as small recognition units// Biotechnology (NY). 1995,- 13(5). P.475-9.

16. Davies, J. and Riechmann L. Affinity improvement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariable regions affect antigen binding// Immunotechnology. 1996.- 2(3).1. P. 169-79.

17. Davies, J. and Riechmann L. Single antibody domains as small recognition units: design and in vitro antigen selection of camelized, human VH domains with improved protein stability// Protein Eng. 1996.- 9(6), P.531-7.

18. De Genst, E., Saerens D., Muyldermans S., Conrath K. Antibody repertoire development in camelids// Dev Comp Immunol. 2006.- 30(1-2). P. 187-98.

19. Decanniere, K., Muyldermans S., Wyns L. Canonical antigen-binding loop structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes?//J Mol Biol. 2000.- 300(1). P.83-91.

20. Desmyter, A., Transue T.R., Ghahroudi M.A., Thi M.H., Poortmans F., Hamers R., Muyldermans S., Wyns L. Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme// Nat Struct Biol. 1996,- 3(9). P.803-11.

21. Devlin, J. J., Panganiban L.C., Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules// Science. 1990.- 249(4967). P.404-6.

22. Dumoulin, M., Conrath K., Van Meirhaeghe A., Meersman F,, Heremans K., Frenken L.G., Muyldermans S., Wyns L,, Matagne A. Single-domain antibody fragments with high conformational stability// Protein Sci. 2002.- 11(3). P.500-15.

23. Elkabetz, Y., Argon Y., Bar-Nun S. Cysteines in CHI underlie retention of unassembled Ig heavy chains//J Biol Chem. 2005.- 280(15). P. 14402-12.

24. Els Conrath, K., Lauwereys M., Wyns L., Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs// J Biol Chem. 2001.-276(10). P.7346-50.

25. Ewert, S., Cambillau C., Conrath K., Pluckthun A. Biophysical properties of camelid V(HH) domains compared to those of human V(H)3 domains// Biochemistry. 2002.- 41(11). P.3628-36.

26. Frenken, L.G., Hessing J.G., Van den Hondel C.A., Verrips C.T. Recent advances in the large-scale production of antibody fragments using lower eukaryotic microorganisms// Res Immunol. 1998.- 149(6). P.589-99.

27. Galfre, G. and Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures// Methods Enzymol. 1981.- 73(Pt B). P.3-46.

28. George, A. J., Spooner R.A., Epenetos A. A. Applications of monoclonal antibodies in clinical oncology//Immunol Today. 1994,- 15(12). P.559-61.

29. Gilliland, L.K., Walsh L.A., Frewin M.R., Wise M.P., Tone M., Hale G., Kioussis D., Waldmann H. Elimination of the immunogenicity of therapeutic antibodies// J Immunol. -1999.- 162(6). P.3663-71.

30. Glockshuber, R., Malia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments// Biochemistry. 1990.- 29(6). P. 1362-7.

31. Gorman, S.D. and Clark M.R. Humanisation of monoclonal antibodies for therapy// Semin Immunol. 1990,- 2(6). P.457-66.

32. Greenberg, A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., McKinney E.C., Flajnik M.F. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks// Nature. 1995.- 374(6518). P. 168-73.

33. Hamers-Casterman, C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains// Nature. -1993.-363(6428). P.446-8.

34. Harmsen, M.M., Ruuls R.C., Nijman I.J., Niewold T.A., Frenken L.G., de Geus B. Llama heavy-chain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features// Mol Immunol. 2000,- 37(10). P.579-90.

35. Holliger, P., Prospero T., Winter G. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments// Proc Natl Acad Sci USA.- 1993.- 90(14). P.6444-8.

36. Hoogenboom, H.R. Overview of antibody phage-display technology and its applications// Methods Mol Biol. 2002.- 178 P. 1-37.

37. Hoogenboom, H.R., de Bruine A.P., Hufton S.E., Hoet R.M., Arends J.W., Roovers R.C. Antibody phage display technology and its applications// Immunotechnology. 1998.- 4(1). P. 1-20.

38. Hoogenboom, H.R. and Winter G. By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro// J Mol Biol. 1992.- 227(2). P.381-8.

39. Huse, W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J., Lerner R.A. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda// Science. 1989.- 246(4935). P. 1275-81.

40. Jespers, L., Schon O., Famm K., Winter G. Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation//Nat Bioteehnol. 2004.- 22(9). P. 1161-5.

41. Jones, P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S., Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse//Nature. 1986.-321(6069). P.522-5.

42. Klinman, N.R. The cellular origins of memory B cells// Semin Immunol. 1997.- 9(4). P.241-7.

43. Kohler, G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity//Nature. 1975.- 256(5517). P.495-7.

44. Kuus-Reichel, K., Grauer L.S., Karavodin L.M., Knott C., Krusemeier M., Kay N.E. Will immunogenicity limit the use, efficacy, and future development of therapeutic monoclonal antibodies?// Clin Diagn Lab Immunol. 1994.- 1(4). P.365-72.

45. Kuzin, B.s Tillib S., Sedkov Y., Mizrokhi L., Mazo A. The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head// Genes Dev. 1994.- 8(20). P.2478-90.

46. Laemrnli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970.- 227(5259). P.680-5.

47. Lauwereys, M., Arbabi Ghahroudi M., Desmyter A., Kinne J., Holzer W., De Genst E., Wyns L., Muyldermans S. Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibodies// Embo J. 1998.- 17(13). P.3512-20.

48. Lebedeva, L.A. and Tillib S.V. Trithorax protein, a global factor for maintenance of tissue specific gene activation in Drosophila melanogaster, is associated with the nuclear matrix.// Genetika. 2003,- 39(2). P.250-8.

49. Lipovsek, D. and Pluckthun A. In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display//J Immunol Methods. 2004.- 290(1-2). P.51-67.

50. Maass, D.R., Sepulveda J., Pernthaner A., Shoemaker C.B. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs)// J Immunol Methods. 2007.- 324(1-2). P. 13-25.

51. Marks, J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert T.P., McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage// J Mol Biol. 1991.-222(3). P.581-97.

52. Martensson, I.L., Keenan R.A., Licence S. The pre-B-cell receptor// Curr Opin Immunol. -2007.- 19(2). P. 137-42.

53. Marvin, D.A., Hale R.D., Nave C., Helmer-Citterich M. Molecular models and structural comparisons of native and mutant class I filamentous bacteriophages Ff (fd, fl, M13), Ifl and IKe// J Mol Biol. 1994.- 235(1). P.260-86.

54. McCafferty, J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains//Nature. 1990.- 348(6301). P.552-4.

55. Milstein, C. From the structure of antibodies to the diversification of the immune response// Embo J. 1985.- 4(5). P. 1083-92.

56. Morrison, S.L., Johnson M.J., Herzenberg L.A., Oi V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains// Proc Natl Acad Sci U S A. 1984.- 81(21). P.6851-5.

57. Muyldermans, S., Atarhouch T., Saldanha J., Barbosa J.A., Hamers R. Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains// Protein Eng. 1994.- 7(9). P. 1129-35.

58. Muyldermans, S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains// Trends Biochem Sci. 2001.- 26(4). P.230-5.

59. Muyldermans, S. and Lauwereys M. Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies// J Mol Recognit. 1999.- 12(2). P. 13140.

60. Nguyen, V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae// Adv Immunol. 2001.- 79 P.261-96.

61. Nguyen, V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire C(H)1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies//Mol Immunol. 1999.- 36(8). P.515-24.

62. Nguyen, V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. Camel heavy-chain antibodies: diverse germline V(H)H and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire// Embo J. -2000.- 19(5). P.921-30.

63. Nguyen, V.K., Muyldermans S., Hamers R. The specific variable domain of camel heavy-chain antibodies is encoded in the germline// J Mol Biol. 1998.- 275(3). P.413-8.

64. Nissim, A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D., Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents// Embo J. 1994.- 13(3). P.692-8.

65. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation// Trends Biochem Sci. 2000.- 25(3). P.99-104.

66. Padlan, E.A. A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties// Mol Immunol. 1991.- 28(4-5). P.489-98.

67. Padlan, E.A. Anatomy of the antibody molecule// Mol Immunol. 1994.-31(3). P. 169-217.

68. Parker, D.C. T cell-dependent B cell activation// Annu Rev Immunol. 1993.- 11 P.331-60.

69. Paul, W.E. Fundamental immunology. New York Raven Press 1993. xvii, 1490 p.c.

70. Paul-Murphy, J., Gershwin L.J., Thatcher E.F., Fowler M.E., Habig W.H. Immune response of the llama (Lama glama) to tetanus toxoid vaccination// Am J Vet Res. 1989.- 50(8). P. 127981.

71. Possee, R.D. Baculoviruses as expression vectors// Curr Opin Biotechnol. 1997.- 8(5). P.569-72.

72. Rader, C., Cheresh D.A., Barbas C.F., 3rd A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries// Proc Natl Acad Sci USA.- 1998.-95(15). P.8910-5.

73. Rapoza, M.P. and Webster R.E. The products of gene I and the overlapping in-frame gene XI are required for filamentous phage assembly// J Mol Biol. 1995.- 248(3). P.627-38.

74. Ren, Z. and Black L.W. Phage T4 SOC and HOC display of biologically active, full-length proteins on the viral capsid// Gene. 1998.- 215(2). P.439-44.

75. Renisio, J.G., Perez J., Czisch M., Guenneugues M., Bornet O., Frenken L., Cambillau C., Darbon H. Solution structure and backbone dynamics of an antigen-free heavy chain variable domain (VHH) from Llama// Proteins. 2002.- 47(4). P.546-55.

76. Riechmann, L., Clark M., Waldmann H., Winter G. Reshaping human antibodies for therapy// Nature. 1988.- 332(6162). P.323-7.

77. Rodi, D.J. and Makowski L. Phage-display technology—finding a needle in a vast molecular haystack// Curr Opin Biotechnol. 1999.- 10(1). P.87-93.

78. Rondot, S., Anthony K.G., Dubel S., IdaN., Wiemann S., Beyreuther K., Frost L.S., Little M., Breitling F. Epitopes fused to F-pilin are incorporated into functional recombinant pili// J Mol Biol. 1998.- 279(3). P.589-603.

79. Santini, C., Brennan D., Mennuni C., Hoess R.H., Nicosia A., Cortese R., Luzzago A. Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda//J Mol Biol. 1998,- 282(1). P.125-35.

80. Scott, J.K. and Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library// Science. -1990.- 249(4967). P.386-90.

81. Sidhu, S.S. Engineering M13 for phage display// Biomol Eng. 2001.- 18(2). P.57-63.

82. Skerra, A. and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli// Science. 1988.- 240(4855). P.1038-41.

83. Smith, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface// Science. 1985.- 228(4705). P.1315-7.

84. Smith, G.P. and Petrenko V.A. Phage Display// Chem Rev. 1997,- 97(2). P.391-410.

85. Spinelli, S., Frenken L., Bourgeois D., de Ron L., Bos W., Verrips T., Anguille C., Cambillau C., Tegoni M. The crystal structure of a llama heavy chain variable domain// Nat Struct Biol. 1996,- 3(9). P.752-7.

86. Spinelli, S., Frenken L.G., Hermans P., Verrips T., Brown K., Tegoni M., Cambillau C. Camelid heavy-chain variable domains provide efficient combining sites to haptens// Biochemistry. 2000.- 39(6). P.1217-22.

87. Tanha, J., Xu P., Chen Z., Ni F., Kaplan H., Narang S.A., MacKenzie C.R. Optimal design features of camelized human single-domain antibody libraries// J Biol Chem. 2001.- 276(27). P.24774-80.

88. Tavladoraki, P., Benvenuto E., Trinca S., De Martinis D., Cattaneo A., Galeffi P. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack//Nature. 1993.- 366(6454). P:469-72.

89. Terskikh, A.V., Le Doussal J.M., Crameri R., Fisch I., Mach J.P., Kajava A.V. "Peptabody": a new type of high avidity binding protein// Proc Natl Acad Sci USA.- 1997.-94(5). P. 1663-8.

90. Verhoeyen, M., Milstein C., Winter G. Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity// Science. 1988.- 239(4847). P. 1534-6.

91. Vu, K.B., Ghahroudi M.A., Wyns L., Muyldermans S. Comparison of llama VH sequences from conventional and heavy chain antibodies// Mol Immunol. 1997.- 34(16-17). P.1121-31.

92. Ward, E.S., Gussow D„ Griffiths A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli// Nature. 1989.-341(6242). P.544-6.

93. Wessel, D. and Flugge U.I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids// Anal Biochem. 1984.- 138(1). P.141-3.

94. Winter, G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology// Annu Rev Immunol. 1994,- 12 P.433-55.

95. Woolven, B.P., Frenken L.G., van der Logt P., Nicholls P.J. The structure of the llama heavy chain constant genes reveals a mechanism for heavy-chain antibody formation// Immunogenetics. 1999.- 50(1-2). P.98-101.

96. Zou, X., Smith J.A., Nguyen V.K., Ren L., Luyten K., Muyldermans S., Bruggemann M. Expression of a dromedary heavy chain-only antibody and B cell development in the mouse// J Immunol. 2005,- 175(6). P.3769-79.