Функционирование и структура белков (ферментов) в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, доктор химических наук Кудряшова, Елена Вадимовна

• Кудряшова, Елена Вадимовна
• доктор химических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор химических наук Кудряшова, Елена Вадимовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ С ОСНОВНЫМИ КЛАССАМИ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСОВ.

1.1.1. Углевод-белковые комплексы и конъюгаты.

1.1.2. Липопротеидные комплексы.

1.1.3. Модельные мембраноподобные системы.

1.1.3.1. Липосомы.

1.1.3.2. Обращенные мицеллы.

1.1.3.3. Смешанные обращенные мицеллы.

1.1.4. Субъединичные белки.

1.1.5. Комплексы белков с полиэлектролитами.

1.1.6. Комплексы белков с нуклеиновыми кислотами.

1.1.7. Комплексы белков с олигоэлектролитами, олигоаминами.

1.1.8. Ковалентные конъюгаты ферментов с полиспиртами.

1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ БЕЛОК-СОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСОВ. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ.

1.2.1. Применение методов ATR и КД спектроскопии для исследования структуры белков.

1.2.2. Флуоресцентные методы исследования структуры белков.

1.2.2.1. Метод флуоресцентной спектроскопии.

1.2.2.2. Методы тушения флуоресценции.

1.2.2.3. Флуоресцентная анизотропия.

1.2.2.4. Применение флуоресцентных методов для исследования молекулярной подвижности белков.

1.3. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ АДСОРБИРОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЯХ РАЗДЕЛА ФАЗ ВОДА-ВОЗДУХ И ВОДА-МАСЛО.

1.3.1. Метод мономолекулярных слоев.

1.3.2. Адсорбция белков на гидрофобных «флюидных» поверхностях, вода-воздух и вода-масло

1.3.3. Методы слежения за адсорбцией белков на поверхностях вода-воздух и вода-масло; исследование реологических свойств белковых пленок.

1.3.4. Методы исследования структурных свойств белков на поверхностях вода-воздух

2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. Каталитическая активность ферментов в водных растворах и водно-органических смесях.

3.2.1.1. а-Хилютрипсин (XT).

3.2.1.2. Трипсин (Г).

3.2.1.3. Пероксидазахрена (ПРХ).

3.2.1.4. Лизоцим из куриного яйца.

3.2.1.5. Щелочная протеаза.

3.2.1.5. Целлюлаза.

3.2.2. Сояюбилизация, сворачивание и изучение каталитической активности ферментов в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.2.1. Определение каталитической активности КФ в обращенных мицеллах.

3.2.2.2. Солюбтизация и сворачивание ферментов галактозоксидаз, Fusgalox и Sagalox, в системе обращенных мицелл А ОТ.

3.2.2.3. Сворачивание TcGAL в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.2.4. Определение каталитической активности п-гидроксибензоатгидроксшазы (РНВН) в системе вода-ДМСО и в системе обращенных мицелл ЛОТ.

3.2.3. Приготовление модифицированных препаратов белков и ферментов.

3.2.3.1. Ковалентная модификация ферментов и белков (XT и овалъбумина), приготовление термоденатурированного препарата ОБА.

3.2.3.2. Введение флуоресцентных меток (овальбумип, XT, РНВН, [i-лактоглобулип).

3.2.3.3. Приготовление комплексов ферментов и белков с полиэлектролитами и олигоаминами.

3.2.4. Исследование структурных свойств ферментов и белков в гомогенных и микрогетерогенных системах, в растворах и системах обращенных мицелл ПАВ

3.2.4.1. Флуоресцентная спектроскопия

3.2.4.2. Измерение стационарной флуоресцентной анизотропии. 141.

3.2.4.3. Спектроскопия кругового дихроизма.

3.2.4.4. Седиментационный анализ. 142.

3.2.5. Исследование термодинамических характеристик фермент-полиэлектролитных комплексов.

3.2.5.1. Изучение комплекса XT с ПБ методом флуоресцентной спектроскопии с использованием эозина.

3.2.5.2. Определение стехиометрии и констант диссоциации комплексов XT с олигоаминами в воде и в системе вода-этанол методом равновесного диализа.

3.2.6. Исследование адсорбции и структурных свойств белков на поверхности вода-воздух.

3.2.6.1. Тензиометрия (метод автоматической капельной тензиометрии, ADT).

3.2.6.2. Изучение реологических свойств поверхности вода-воздух при адсорбции белков с использованием Ленгмюровской техники.

3.2.6.3. Измерение Фурье ИК-спектров поглогцения (метод спектроскопии нарушенного полного отражения, FTIR-ATR).

3.2.6.4. Измерение ИК спектров в режиме отражения, IRRAS.

3.2.6.5. Измерение трансляционной диффузии белков методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS).

3.2.6.5.1. Измерение трансляционной диффузии п-гидроксибензоатгидроксилазы, меченной Алекса-488, Алекса-488-РНВН в объемной фазе (в водных растворах и в системе вода-ДМСО методом FFS).

3.2.6.5.2. Измерение трансляционной диффузии и профиля распределения концентрации овальбумина, меченного Bodipy TMR, на поверхности вода-воздух методом FCS.

3.2.6.6. Разрешеино-временная флуоресцентная анизотропия (TRFA).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. БЕЛКИ И БЕЛОК-СО ДЕРЖАЩИЕ КОМПЛЕКСЫ НА ПОВЕРХНОСТИ ВОДА-ВОЗДУХНА ПРИМЕРЕ ОВАЛЬБУМИНА ИЗ КУРИНОГО ЯЙЦА (ОВА) И МОЛОЧНОГО В -ЛАКТОГЛОБУЛИНА (B-LG).

4.1.1. Метод инфракрасной абсорбционно-рефлекционной спектроскопии (IRRAS).,

4.1.2. Молекулярная подвижность белков на поверхности вода-воздух.

4.1.3. Трансляционная диффузия белков на поверхности вода-воздух.

4.1.4. Роль межмолекулярных взаимодействий в формировании и свойствах поверхностного слоя белка при адсорбции на поверхности вода-воздух.

4.1.5. Молекулярные свойства овальбумина в условиях сжатия пленки.

4.1.6. Взаимосвязь поверхностной активности белков с их пенообразующей способности.

4.1.7. Влияние комплексообразования с пектином на адсорбционные свойства белков OBAup-lg.

4.1.8. Вращательная динамика комплексов ОВА-пектин и P-lg-пектин на поверхности вода-воздух.

4.2. РЕГУЛЯЦИЯ ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТОВ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ПАВ.

4.2.1. Рефолдингрекомбинаитных ферментов, образующихся в виде «тел включения» в системе обращенных мицелл ПАВ.

4.2.2. Роль межсубъединичного взаимодействия в функционировании пара-гидроксибензоат-гидроксилазы (РНВН) и Fusgalox.

4.2.3. Влияние природы липидов на каталитическую активность кислой фосфатазы.

4.3. ФЕРМЕНТЫ В СОСТАВЕ ФЕРМЕНТ-ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И КОВАЛЕНТНЫХ КОНЪЮГАТОВ С ПОЛИАЛКИЛЕНОКСИДАМИ В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ.

4.3.1. Ковалентная модификация ферментов гидрофильными и гидрофобными низкомолекуляриыми соединениями

4.3.2. Фермент-полиэлектролитные комплексы в водно-органических средах.

4.3.3. Молекулярные механизмы влияния комплексообразования с ПЭ на функциональную активность и стабильность ферментов.

4.3.4. Регуляция каталитической активности и стабильности ферментов путем образования конъюгатов ферментов с полиспиртами.

4.3.5. Регуляция каталитической активности и стабильности ферментных препаратов щелочной протеазы и целлюлозы при комнлексообразовании схитозаном для применения в составе синтетических моющих средств (CMC).

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функционирование и структура белков (ферментов) в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях»

Как известно, белки в природе не изолированы от остальных компонентов живой материи и, как правило, функционируют в составе тех или иных надмолекулярных ансамблей, которые являются основой молекулярной организации биологических систем. Состав и пространственная структура белок-содержащих комплексов во многом определяет протекание важнейших биохимических процессов, таких как биосинтез и фолдинг белков. Регуляция функциональной активности и стабильности белков in vivo часто осуществляется именно посредством образования надмолекулярных ансамблей, комплексов белков с соединениями различной природы — липидами, олиго- и полисахаридами, ДНК, с другими белками [1-4]. К настоящему времени накоплено большое количество экспериментальных данных о структуре и свойствах белок-содержащих комплексов, в основном в гомогенных системах.

Однако для детального понимания механизмов регуляции и обмена в живых системах требуется проводить исследования свойств ферментов и белков не только в гомогенных, но также в коллоидных, микрогетерогенных системах. Действительно, структурно-функциональное состояние белков на границах раздела фаз в значительной степени определяет протекание многих жизненно важных процессов в клетках. Именно на границах раздела фаз локализованы и функционируют многие биомолекулы, отвечающие за процессы транспорта, метаболизма и сигнальной трансдукции.

Кроме того, переход к коллоидным системам существенно расширяет возможности исследования свойств ферментов и белков в составе надмолекулярных структур: позволяет получать различные формы надмолекулярной организации белков, в том числе, не реализующиеся в водных растворах; проводить как диссоциацию, так и ассоциацию белковых комплексов. Результаты таких исследований могли бы позволить по-новому взглянуть на основные механизмы, регулирующие функционирование белков и ферментов в живой природе.

Однако в арсенале исследователей практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков, адсорбированных на поверхностях раздела фаз. Информация, встречающаяся в литературе, носит, скорее качественный характер.

В настоящее время благодаря интенсивному развитию новых высокочувствительных микроспектроскопических методов, появилась возможность получать детальную информацию о структурных свойствах белков в гомогенных системах. На основе данных методов, в представленной работе впервые были разработаны новые подходы, позволяющие исследовать структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз, вода-воздух.

С применением разработанных подходов впервые получена детальная информация о структурно-динамических свойствах белков и ферментов, как в случае моно-, так и многокомпонентных коллоидных систем: в составе комплексов с соединениями различной природы - полисахаридами, липидами, в составе олигомерных белков и белковых агрегатов.

Таким образом, разработка новых подходов к исследованию структурно-функциональных особенностей белков и ферментов в модельных коллоидных системах представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, исследование на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных коллоидных систем имеет огромное значение для разработки новых лекарственных форм, а также новых технологий для пищевой и косметической промышленности.

I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Настоящий литературный обзор состоит из трех основных частей. Первая часть посвящена классификации комплексов белков и ферментов с основными классами природных и синтетических соединений. Рассмотрены биологические функции природных белок-содержащих комплексов; особенности структуры комплексов; возможные механизмы регуляция каталитической активности и стабильности ферментов посредством образования надмолекулярных ансамблей. Обсуждаются области практического применения белок-содержащих комплексов в биотехнологии и медицине.

Во второй части литературного обзора систематически рассмотрены наиболее широко используемые физико-химические методы исследования структуры и свойств белков и ферментов в гомогенных системах. Особое внимание уделено флуоресцентным методам анализа. Одним из наиболее информативных методов при исследовании структуры надмолекулярных ансамблей представляется релаксационый флуоресцентный метод -разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии (TRFA). Комплементарную информацию дает метод флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS). Благодаря высокой чувствительности и уникальной возможности следить за общими и внутренними динамическими свойствами белок-содержащих комплексов, указанные методы позволяют получать детальную информацию о структурной организации надмолекулярных ансамблей.

В третьей части обзора проанализированы физико-химические методы, позволяющие исследовать функциональные и структурные свойства белков в гетерогенных системах, основное внимание уделяется методам, предназначенным для изучения белков адсорбированных на «флюидных» поверхностях, вода-воздух и вода-масло.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Кудряшова, Елена Вадимовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны подходы, позволяющие исследовать структурно-динамические свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз (вода-воздух) в режиме реального времени. Данные подходы основаны на применении микроспектроскопических методов: разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии и инфракрасной спектроскопии в режиме внешнего отражения, соответственно ER-TRFA и TRRAS. Для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Для интерпретации данных, полученных микроспектроскопическими методами в режиме внешнего отражения (ER-TRFA и IRRAS), разработаны методы спектральной симуляции, позволяющие получать количественную информацию о свойствах адсорбированных на поверхности вода-воздух белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности).

2. Впервые продемонстрировано, что методы ER-TRFA, IRRAS, FCS, являются высокочувствительными и высоко-информативными при изучении свойств белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурно-динамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух на примере овальбумина и лактоглобулина. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.

3. Разработаны подходы для регуляции поверхностно-активных свойств белков и реологических свойств белковых пленок. Установлено, что поверхностную активность белков молено целенаправленно регулировать, изменяя их степень агрегации; включая в комплекс с полиэлектролитами и варьируя физико-химические свойства среды.

4. Предложен новый подход для изучения влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, основанный на применении системы обращенных мицелл ПАВ. Преимуществами данного подхода являются возможность варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на калсдую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. С применением мицеллярного подхода впервые было продемонстрировано на примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы, что химический состав липидной матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов.

5. С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, изучена роль межсубъединичного взаимодействия в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (Fusgalox). Впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах (мономериая и тетрамерная, соответственно), и изучены их каталитические и структурные свойства. На основе анализа полученных данных выдвинута гипотеза, что в системах in vivo олигомерный состав многих ферментов также отличается от водного, а межсубъединичные взаимодействия в таких системах играют ключевую роль в регуляторных процессах.

6. На основе "мицеллярного подхода" разработан принципиально новый эффективный и универсальный метод рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. На примере рекомбинантных белков, галактозооксидазы (Fusgalox) и галактонолактон оксидазы (TcGAL) продемонстрировано, что солюбилизация в системе обращенных мицелл ПАВ позволяет проводить диссоциацию тел включения и восстанавливать каталитическую активность ферментов с выходом порядка 20-30%.

7. Систематически исследованы возможности различных методов регуляции свойств ферментов в водно-органических системах. Установлено, что одним из наиболее эффективных и технологичных методов регуляции каталитических свойств ферментов в неводных средах является образование фермент-полиэлектролитных комплексов. Исследованы молекулярные механизмы влияния ПЭ на функционирование ферментов. Впервые установлена пространственная структура фермент-ПЭ комплексов в водно-органических смесях с применением метода разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии на примере комплексов а-химотрипсина с полиметакриловой кислотой. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию компактной двухуровневой структуры комплекса: внутренней — доменной и общей — глобулоподобной. Показано, что образование компактной регулярной структуры комплексов лежит в основе механизма регуляции свойств ферментов при комплексообразовании с ПЭ: стабилизации вторичной и третичной структуры фермента; активационного эффекта; предотвращения агрегационных процессов.

8. Продемонстрировано, что метод образования белок-полиэлектролитных комплексов применим для решения широкого спектра практических задач, в том числе, для стабилизации ферментов в водно-органических средах или других денатурирующих условиях. Так, на основе образования комплексов с природным поликатионом, хитозаном, разработан новый подход к стабилизации гидролитических ферментов, щелочной протеазы и целлюлазы, при их использовании в составе синтетических моющих средств.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Кудряшова, Елена Вадимовна, 2009 год

1. Курганов Б.И., Федуркнна Н.В., Мицкевич Л.Г., Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Поглазов Б.Ф. Изучение ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы b методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре // 1999. ДАН. Т. 367. С. 122-125.

2. Жан-Мари Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Наука, Новосибирск. 1998.

3. Lyubarev А.Е., Kurganov B.I. II Organization of Biochemical Systems: Structural and regulatory aspects. / Eds. Kurganov B.I. and Lyubarev A.E. 1996. N.Y.: Nova Science, Inc. P. 2-60.

4. Lehninger A. L., Nelson D.L., Cox M.M. // Principles of biochemistry (4th Ed.). W.H. Freeman & Company. 2004.

5. Bewley C.A., Editor, Protein-Carbohydrate Interactions in Infectious Diseases, RSC Publishing, Cambridge, UK .2006.

6. Rini J M., Leffler H.Carbohydrate Recognition and Signaling. Handbook of Cell Signaling, 2003, PP 87-93.

7. Lowe J.B., Glycosylation, immunity, and autoimmunity. // Cell. 2001. 104. 809-812.

8. Sharon N. and Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules, Glycobiology 14 (2004), pp. 53R-62R

9. Bianco, G.A., Toscano, M.A., Ilarregui, J.M., Rabinovich, G.A. Impact of protein-glycan interactions in the regulation of autoimmunity and chronic inflammation. // Autoimmunity Reviews. 2006,5 (5), p. 349-356.

10. Glycoproteins, The New Comprehensive Biochemistry, V.29B, /Eds. J. Montreuil, H. Schachter, J.F.G. Vliegenthart. Amsterdam: Elsevier Science, 1995.

11. Carlsson S.L.R.// Glycobiology: A Practical Approach. /Eds. M. Fukuda, A. Kobata Oxford: Oxford University Press, 1993. P. 1-26.

12. Хыоз P. Гликопротеины: Пер. с англ. М.: Мир, 1985 (Hughes R.C. Glycoproteins. London; New York: Chapman and Hall Inc. 1983).

13. Kisailus E.C., Allen H.J.I I Glycoconjugates: Composition, Structure and Functions/ Eds. E.C. Kisailus, H.J. Allen. N.Y.: Marcel Dekker Inc. 1992. P. 13-32.

14. NC IUPAC-IUB //Eur. J. Biochem. 1986. V.159. P. 1-6.

15. Lis //., Sharon N. Protein glycosylation. Structural and functional aspects. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. P. 1-27.

16. Hart G.W., Haltiwanger R.S., Holt G.D., Kelly W.G. Glycosylation in the nucleus and cytoplasm.// Annu. Rev. Biochem. 1989. V.58. P. 841-874.

17. Montreuil J. II Comprehensive Biochemistry V. 19B. Part II./ Ed. A. Neuberger, Amsterdam: Elsevier. 1982. P. 1-190.

18. Liu Y, Palma AS, Feizi T. Carbohydrate microarrays: key developments in glycobiology. //Biol Chem. 2009;390(7):647-56

19. Dam Т.К., Brewer C.F. //Fundamentals of Lectin-Carbohydrate Interactions. Comprehensive Glycoscience, 2007, Chapter 3.21: 397-452.

20. Datta P.K., Basil P.S., Datta Т.К. Circular dichroism and fluorescence investigations on Vicia faba lectin-saccharide binding// Biochem. J. 1988. Vol. 251. P. 195-199.

21. Wright C.S. New folds of plant lectins II Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7. P. 631-636.

22. Comprehensive Glycoscience From Chemistry to Systems Biology. Editor-in-Chief: Johannis P. Kamerling 2007. Elsevier.

23. Wang J.M., Takeda A., Yang J.T., Wu C.-S. C. Conformation of concanavalin A and its fragments in aqueous solution and organic solvent-water mixtures // J. Prot. Chem. 1992. V.l 1. P. 157-164.

24. Lectins Analytical Technologies. Edited by: Carol L. Nilsson. 2007. Elsevier

25. Stoeva S., Franz M., Wacker R„ Krauspenhaar R., Guthohrlein E., Mikhailov A., Betzel C„ Voelter W. Primary structure, isoforms, and molecular modeling of a chitin-binding mistletoe26.