Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Казакова, Любовь Игоревна

• Казакова, Любовь Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Казакова, Любовь Игоревна

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. методы экспресс-анализа в клинжо-лабораторной диагностике и место в них сенсорных технологий

2.2. применение нано- и микроносителей в создании сенсоров* .1

2.2.1. Типы нано-и микрочастиц, применяемых для создания сенсоров

2.2.2. Способы иммобилизации биологического материала на нано- и микроносителях 15 2.2,5. Оптические сенсоры на основе нано- и микрочастгщ i у

2.3. полиэлектролитные нано- и микрокапсулы

2.3.1. Образование, строение и свойства интерполиэлектролитныхколтлексов

2.3.2. Получение, строение и свойства полиэлектролитных пленок на плоских подложках

2.3.3. Формирование полиэлектролитных капсул

2.3.4. Ядра для формирования полиэлектролитных капсул

2.3.5. Способы включения флуоресцентных красителей в полиэлектролитные капсулы28

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

•••••••••••••••••••••••♦•••••«••«••»♦в»»»»»»»» «JJL

3.1. Материалы и реактивы

3.2. Получение микросферолитов CaC03..Z"'*'"'I*'"

3.3. Получение биоминеральных ядер СаС03/белок

3.4. Формирование полиэлекттолитных микрокапсул'н1'^ошеролит^ СаСоГи

биоминеральных ядрах

3.5. Формирование 1голиэлектр(ъчишькмш<1ч^

ОКСИДА кремния

3.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ШШКОв'в ЮШСУЛАХ^^

3.7. определение ферментативной активности уреазы

3.8. Сканирующая электронная мшо>оскошшполучешь]х'микрок1псул иядер

использованных для их формирования

3.9. Трансмиссионная элгшронная микрос1юпия! Получшше ^ьтратоши^ отвов''

полиэлектролитных микрокапсул

3.10. спектрофотометрическиеисследования

3.11. флуориме1рические исследования

3.12. Конфокальная лазерная сканирующая мивуоскопгш полиэ^

микрокапсул

3.13. Определение параметров взаимодейстогш 1№роци

3.14. Определение константы диссоциацю! с^';'и СаьсюмGreen-1

3.15. Определение константы ассоциации Н+ и SNARF-1

3.16. Измерение интенсивности флуоресценции одиночных пожэлЕк^олиттк

капсул

3.17. Статистические расчеты

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Исследование ультраструктурной организации полиэлектролитных шкрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных

уЦ-Х&Г

4.1.1. Морфология ядер Si02, СаС03 и биоминеральных ядер СаСО^БСА~'''~

4.1.2. Ультраструктурная организщия капсул, сформированных на ядрах Si02

4.1.3. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на микросферолитах СаСОз

4.1.4. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на ядрах СаС03-БСА

4.1.5. Распределение белков внутри полиэлектролитных микрокапсул

4.2. Изучение взаимодействия амфифильного флуоресцентного зонда

мероцианина540 с полиэлек1ролишыми микрокапсулами

4.2.1. Предварительные эксперименты, выбор флуоресцентного зонда

4.2.2. Взаимодействие мероцианина540 с полистиролсульфонатом

4.2.4. Взаимодействие мероцианина540 с полиаллиламином

4.2.5. Взаимодействие мероцианина540 с интерполиэлектролитным комплексом

4.2.6. Взаимодействие мероцианина540 с полиэлектролитными микрокапсулами

4.3. Иммобилизация флуоресцентных красителей в полголектролитные микрокапсулы

4.4. Разработка хемосенсоров на основе полиэлектролишых микрокапсул

4.4.1. Разработка хемосенсора для определения концентрации растворенного кислорода

4.4.2. Разработка хемосенсора для определения ионов кальция

4.5. Разработка биосенсоров на основе полиэлектролитных микрокапсул

4.5.1. Разработка биосенсора для определения глюкозы

4.5.2. Разработка биосенсора для определения лактата

4.5.3. Разработка биосенсора для определения мочевины

5. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАВ- биологически активные вещества

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИПЭК - интерполиэлектролитный комплекс

МФ -частицы — меламинформальдегидные частицы

МЦ540 - мероцианин540

ПАА - поли(аллиламин)гидрохлорид

ПАП - последовательная адсорбция полиэлектролитов

ПДАДМА - поли(диаллилдиметиламмоний)хлорид

ПСС - поли(стиролсульфонат)

ПС-частицы - полистирольные частицы

ПЭ - полиэлектролит, полиэлектролитный

ПЭМК - полиэлектролитные микрокапсулы

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТРИТЦ - Тетраметилродамин изотиоцианат

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров»

1. ВВЕДЕНИЕ

Тема разработки нано- и микроконтейнеров для капсулирования различных веществ широко представлена в научно-исследовательских проектах разных стран и обусловлена общей тенденцией развития наукоемких технологий к универсализации и миниатюризации. Задачи, связанные с созданием, изучением и использованием нано- и микроконтейнеров актуальны для реализации ряда важных разработок в области медицины, косметологии, биотехнологии, тонкой химической технологии и т.д. Существует несколько стратегических направлений их решения, одним из которых является применение полиэлектролитных нано-и микрокапсул, получаемых методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидные частицы нано- и микроразмеров с последующим разрушением этих частиц.

Полиэлектролитная капсула - это система с большими возможностями. Ее функциональность определяется назначением помещенного в нее агента. Возможность включения различных веществ в полиэлектролитные капсулы вызвала в последнее десятилетие нарастающую волну интереса к этим объектам как в нашей стране, так и во всем мире. Их используют в качестве систем доставки биологически активных компонентов к клеткам и тканям [1-4], для создания пролонгированных лекарственных средств [5-7], в качестве сенсорных систем для определения низкомолекулярных веществ в многокомпонентных средах [8-10]. Разработка на основе полиэлектролитных микрокапсул миниатюрных портативных систем для качественного и количественного определения биологически значимых веществ могла бы стать шагом к созданию новых неинвазивных способов определения состава внутренней среды организма и приблизить к воплощению в жизнь идею непрерывного in vivo мониторинга метаболитов, лекарственных препаратов и белков. Поэтому особый интерес представляет одновременное включение в полиэлектролитную капсулу фермента и вещества, выполняющего роль трансдьюсера, способного генерировать аналитический сигнал, величина которого пропорциональна содержанию анализируемого компонента. Такая конструкция капсулы удовлетворяет определению «сенсор» и может бьггь использована для создания новых диагностических средств для определения широкого спектра низкомолекулярных веществ. Настоящая работа направлена на решение проблемы иммобилизации чувствительных компонентов в полиэлектролитные микрокапсулы и демонстрации возможности создания на их основе оптических сенсоров с флуоресцентной системой регистрации.

Цель работы:

изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами и разработка на основе полиэлектролитных микрокапсул флуоресцентных сенсоров для определения биологически значимых ионов и низкомолекулярных метаболитов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурную организацию полиэлектролитных микрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных ядер.

2. Изучить влияние состава полиэлектролитной оболочки капсул и рН среды на внутриобъемное распределение инкапсулированных белков.

3. Изучить взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами на примере амфифильного зонда мероцианина540. Предложить способы включения флуоресцентных индикаторов в полиэлектролитные капсулы.

4. Разработать хемо- и биосенсоры для определения биологически значимых ионов и метаболитов на основе содержащих флуоресцентные красители полиэлектролитных микрокапсул. Продемонстрировать функционирование сенсоров в водной среде.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Методы экспресс-анализа в клинико-лабораторной диагностике и место в них сенсорных технологий

Клинико-лабораторные методы исследования являются одним из основных инструментов в общем комплексе контроля состояния здоровья. Они позволяют судить о течении обменных процессов, правильно оценивать функциональное состояние организма, степень тех или иных отклонений, являются основой для постановки клинического диагноза и назначения адекватного лечения. Проводимые в динамике, они позволяют следить за течением заболевания, за эффективностью проводимых реабилитационных и профилактических мероприятий, изучать направленность обменных процессов путем определения специфических промежуточных продуктов обмена в крови, моче и других средах. Основным источником информации о состоянии организма являются показатели углеводного, азотистого и жирового обменов, сведения о гормонах, витаминах и водно-электролитном составе. В зависимости от характера исследования все методы лабораторной диагностики делятся на качественные - обнаружение искомого вещества в пробе биологической жидкости или ткани, и количественные - определение или измерение его содержания. Среди методов, применяемых в медицинской лабораторной практике, выделяют физико-химические (оптические и электрохимические), биохимические (иммунохимические, молекулярные), методы микроскопии. Их использование, как правило, ограничено условиями клинической лаборатории, что связано с длительностью, сложностью и трудоемкостью операций, соблюдением условий стерильности, необходимостью использования специального оборудования, посуды и измерительных приборов. [11]. В связи с этим особое место в диагностике заняли методы экспересс-анализа, позволяющие пациенту самостоятельно осуществлять контроль состояния своего здоровья и вовремя обращаться к помощи квалифицированных специалистов.

On-site анализы - термин аналитической химии, обозначающий комплекс аналитических методов, позволяющих проводить определение веществ вне стационарных лабораторий [12]. Их целью является быстрая и простая оценка присутствия и/или содержания химических веществ в образце и осуществляется с помощью тест-систем, химических и биохимических сенсоров. Общим принципом создания тест-систем является использование реакций и реагентов в условиях и формах, обеспечивающих получение визуально наблюдаемого или легко регистрируемого эффекта. Разработки в этой области являются одной из основных тенденций развития аналитической химии и обусловлены потребностями не только медицинской направленности, но и в таких сферах деятельности

человека, как контроль технологических процессов, качества пищевых продуктов, криминалистике, космических исследованиях.

Тест-системы представляют собой портативные, легкие и дешевые аналитические средства и соответствующие экспрессные методики для обнаружения и определения веществ [12]. Их отличительными чертами и одновременно достоинствами являются:

- максимальная приближенность выполняемого анализа к пациенту;

- отсутствие сложного аппаратурного оформления;

- невысокие требования к квалификации исполнителя;

- существенное сокращение или отсутствие этапов преаналитической подготовки образцов;

- малый объем жидкости, требуемой для анализа (от нескольких микролитров);

- простота и скорость выполнения анализа (секунды, минуты);

- высокая надежность и специфичность тестов;

- длительная стабильность при правильном хранении.

Среди прочно вошедших в диагностическую практику можно отметить тест-средства на основе «сухой химии». Методы «сухой химии» используют готовые формы реактивов для микроанализа и миниатюрные приборы для качественной и количественной оценки полученных с помощью этих реактивов результатов анализа. Особенностью этой технологии является сочетание в одном аналитическом элементе необходимых реактивов для проведения реакции обнаружения или определения исследуемого компонента с возможностью детекции результата вплоть до создания аналитических систем.

Однако на практике чаще всего реализуется подход построения тест-системы, в котором оценка результата анализа производится визуально. Принципиальная схема «сухих» тест-систем представлена на рис. 1, демонстрирующем, по крайней мере, три ее основных компонента: носитель, реагенты или их последовательность и индикатор, соответствующий конечному продукту реакции. При данном способе анализа все необходимые реактивы химически или физически иммобилизированы на вспомогательном носителе (бумага, нитроцеллюлоза, силикагель, пенополиуретан и т.п.), обеспечивающим беспрепятственное прохождение образца аналита по всем слоям тест-средства. Запуск реакции производится после воздействия образца биологической жидкости и растворения ею сухих реактивов, иммобилизированных на носителе аналитического элемента. Оценка результата производится по интенсивности окраски индикаторной зоны, ее площади или высоты. Классическим примером могут являться индикаторные порошки, таблетки, колонки, тест-полоски, слайды. Основным недостатком методов «сухой химии» можно считать

субъективность визуальной оценки результата, и, соответственно, невысокую надежности анализа и точности измерения.

Рис. 1. Принципиальная схема тест-средства, реализованного в виде слайда, для анализа биологической жидкости на основе технологии «сухой химии».

Однако не всегда тест-системы предполагают визуализацию результата. В настоящее

время в среде поставщиков диагностической продукции термин «тест-системы» часто

употребляется для обозначения диагностических наборов, выработанных в заводских

условиях и готовых для применения в анализе. При этом используют довольно сложные

методы иммуноферментного анализа, иммуноблота, полимеразной цепной реакции и т.д.

Они обладают рядом неоспоримых преимуществ, таких как высокая специфичность,

точность и управляемость реакций, однако возвращают проведение анализа в лабораторные

условия. Компромиссом в решении этой проблемы стало развитие сенсорных технологий анализа.

Сенсор (от англ. sensor - датчик, sensus - восприятие, чувство, ощущение) - термин обозначающий устройство, преобразующее входное воздействие любого физического, химического или биохимического процесса в сигнал, удобный для дальнейшего использования [13]. Эти устройства состоят, как правило, из чувствительного (рецепторного) компонента и физического преобразователя (трансдьюсера), которые находятся в непосредственном прямом контакте (рис. 2).

Рис. 2. Принципиальная схема построения сенсора.

В технической документации IUPAC содержится рекомендация отделять понятие «сенсора» от понятия «аналитической системы», которое включает в себя использование дополнительных стадий пробоподготовки и введение извне специфических реагентов [14]. Таким образом, сенсор должен являться интегрированным аналитическим устройством. К современным сенсорам предъявляются следующие основные требования:

• высокие качественные характеристики: чувствительность, точность, линейность и воспроизводимость показаний, высокая скорость отклика, отсутствие гистерезиса и большое отношение сигнал-шум;

• высокая надежность: длительный срок службы, устойчивость чувствительных элементов к внешней среде, безотказность в работе;

• технологичность: малые габариты и масса, простота конструкции, интегральное исполнение, низкая себестоимость.

Существует большое число сенсоров, успешно применяющихся в лабораторной

диагностике в наши дни. Однако перспективы применения сенсоров, безусловно, связаны

возможностью неинвазивного on-line определения параметров состава внутренней среды и

функционирования организма. К сенсорам такого рода предъявляются дополнительные требования:

• достаточная миниатюрность;

• биосовместимость;

• возможность длительного функционирования в биологическом окружении, и последующее удаление без негативного влияния на организм;

• неинвазивный способ регистрации аналитического сигнала.

Как следует из определения, в основе измерения лежит регистрация некого физического параметра. Однако рецепторная часть сенсора может работать на различных принципах, а ее выбор зависит от характера исследуемого явления. Поэтому в зависимости

11

от природы распознающего элемента сенсоры делят на физические, химические и биохимические (рис. 3).

электрические

полупроводниковые

<- полевые транзисторы

Рис. 3. Классификация сенсоров по принципу регистрации аналитического сигнала*. *по материалам статьи Будникова Г.К., Соросовский образовательный журнал, №3,1998.

Общим элементом для них является наличие трансдьюсера, преобразующего информацию о физическом, химическом или биохимическом процессе в электрический сигнал. Если такие качественные характеристики работы сенсора, как чувствительность и селективность, связаны со свойствами рецепторного материала, то технологические параметры сенсора (габариты, масса) зависят, как правило, от типа трансдьюсера, использованного в его конструкции. Его характеристиками лимитируются размеры датчика.

Трансдьюсер может быть связан с электронно-считывающим устройством физически или дистанционно. Непосредственная физическая связь характерна для сенсоров с электрическим или электрохимическим способами регистрации аналитического сигнала (рис. 3) и широко реализуется на практике в виде электродов и полевых транзисторов. Минимальный размер существующих на сегодняшний день микроэлектродов лежит в интервале 0,1-50 мкм, а минимальная площадь составляет 10"14 м2 [15]. Дистанционное считывание результатов анализа основано на различных вариантах электромагнитного излучения, среди которых наиболее часто применимы инфракрасное, видимое и ультрафиолетовое. На их использовании основаны оптические способы регистрации работы сенсоров.

Таким образом, среди всего многообразия подходов к построению сенсоров, отличающимися возможностью миниатюризации и дистанционного считывания аналитического сигнала на сегодняшний день можно считать только оптические химические и биологические сенсоры. Их преимуществом является отсутствие физического преобразователя в конструкции сенсора. Такие датчики могут иметь минимальный размер всего несколько нанометров, и проявлять размерозависимые свойства, характерные для нанотехнологичных объектов.

2.2. Применение нано- и микроносителей в создании сенсоров

Современной тенденцией в создании миниатюрных сенсоров является использование нано- и микроносителей для закрепления рецепторного материала и отделения его от фазы анализируемого образца. Сенсоры на основе наноматериалов представляют собой любые биологические, химические или другие сенсорные точки, способные передавать информацию о наночастицах на макроуровень [16]. Нано- и микрообъекты обладают потенциалом преодоления биологических барьеров. Они могут проникать в большинство клеток или передвигаться с током крови, взаимодействуя таким образом с биомолекулами на клеточной мембране или внутри клетки. Для конструирования внутриклеточных сенсоров и датчиков для определения параметров внутренней среды организма целесообразно использовать пространственно обособленные структуры: органические, неорганические, или гибридные нано- и микрочастицы, мицеллы, липосомы, микрокапсулы. Все они отличаются крайне малыми размерами (от десятков нанометров до нескольких микрон) и являются объектами коллоидной химии и ее популярного технологического приложения -нанотехнологии.

Типичная конструкция сенсоров на основе нано- и микрочастиц включает в себя инертную или функционально активную матрицу, несущую чувствительный компонент. Чувствительная система микросенсоров может быть основана на разного рода специфических химических и биохимических взаимодействиях таких, как антиген-антитело, фермент-субстрат, или полимеразной цепной реакции. Чтобы избежать потери чувствительности и получить надежный результат измерения, сопряженная система рецептор - трансдьюсер должны находиться в тесной взаимосвязи. На решение этой проблемы направлены исследования по иммобилизации рецепторных веществ на нано- и микроносителях.

2.2.1. Типы нано- и микрочастиц, применяемых для создания сенсоров

Несмотря на свои небольшие размеры, нано- и микрочастицы способны удерживать десятки тысяч малых молекул. Предпосылками для этого является большая площадь поверхности таких частиц и, соответственно, большое число мест для связывания рецепторных молекул.

В зависимости от структурно-функциональных свойств матрицы возможны различные варианты иммобилизации в нее рецепторного материала. Для удобства представления информации о способах иммобилизации рецепторного материала на нано- и микроносителях мы разделили их на две группы в соответствии с положением чувствительных молекул относительно матрицы (рис. 4). Выбор пространственного расположения рецепторных молекул в сенсоре обуславливается структурно-функциональными свойствами матрицы: морфологией используемых частиц, расположением функциональных групп, с помощью которых может быть осуществлено взаимодействие с рецепторным материалом, а также характером предполагаемого анализа.

Рис. 4. Варианты иммобилизации рецепторного материала на нано-и микрочастицах. А-на поверхности нано- или микроносителя; Б - включение в структуру частицы.

Иммобилизация на поверхности частицы используется для модификации неорганических или полимерных частиц, не обладающих внутриструктурной организацией (рис. 4, А). К ним можно отнести металлы (золото, серебро), оксиды железа, цинка, алюминия, кремния, углеродные образования, квантовые точки и полимерные гранулы. Такого рода частицы могут непосредственно генерировать аналитический сигнал в силу собственных свойств (магнитные свойства наночастиц оксидов железа, флуоресценция квантовых точек), или выступать в качестве инертных носителей для рецепторного материала сенсоров. Их использование целесообразно для конструирования сенсоров, главной функцией которых является молекулярное узнавание. Для иммобилизации рецепторных молекул на такого рода частицы используют методы адсорбции [17, 18], ковалентного связывания [19, 20], аффинного взаимодействия [19, 21]. Общим недостатком

14

конструкции подобных сенсоров является отсутствие механизмов защиты рецепторного материала, иммобилизированного на поверхности нано- или микроносителя.

Иммобилизация в матрикс частицы (entrapment) является одним из наиболее распространенных методов физической иммобилизации веществ в инертные пористые образования, в частности, полимерные гранулы. Включение рецепторных молекул в них производится, как правило, на стадии формирования самих частиц, и представляет собой дешевый одностадийный процесс. Главными достоинствами данного метода являются возможность контроля размеров и формы получаемых частиц, а также возможность включения в матрикс частицы практически любых функциональных веществ, независимо от их химической природы и назначения. Кроме того, контроль размера пор полимерной сетки позволяет существенно защитить иммобилизированный материал от проникновения большинства высокомолекулярных веществ, способных его разрушить. С другой стороны, несоответствие размеров пор полимерной сетки размерам молекул включаемого вещества может приводить к вымыванию последних, либо к осложнению диффузии анализируемого вещества [22, 23]. Механизм определения с помощью таких сенсоров включает в себя проникновение аналита в матрикс сенсорной частицы и специфическое взаимодействие с чувствительными молекулами.

Несмотря на ряд преимуществ, технологические свойства таких матриц далеки от идеала: свои ограничения накладывает способ полимеризации. Необходимые условия проведения фотохимических, химических (для альгината, латекса), электрохимических (для полипиррола, полианилина, полииндола) процессов полимеризации могут вызывать необратимые изменения в структуре и свойствах иммобилизуемого материала. Особенно критичным этот момент является для биологического материала.

2.2.2. Способы иммобилизации биологического материала на нано- и микроносителях

Иммобилизация биологического материала является узким местом в создании биосенсоров на основе нано- и микрочастиц. Активность иммобилизованных ферментов критически зависит от свойств матрицы. На эффективность работы чувствительных молекул могут влиять выбор метода иммобилизации, различия в химической природе (металлы, оксиды, органические полимеры), морфологии (пористые, планарные, высокодисперсные), структуре носителей (кристаллические, аморфные). Эти параметры определяют технологические характеристики сенсоров: размер пор матрицы, гидрофобно-гидрофильный баланс, скорость проникновения аналита. Основные требования к нано- и микроносителям для иммобилизации ферментов могут быть сформулированы следующим образом:

- биосовместимость с ферментом,

- наличие реакционно-способных групп, необходимых для включения ферментов,

- стабильность к микроокружению (рН, ионная сила),

- обеспечение стабильности фермента и избежание его утечки,

- обеспечение свободного доступа молекул субстрата к активным центрам фермента и отвода продуктов катализа,

- обеспечение чувствительности и селективности детекции,

- простота приготовления и низкая стоимость, кроме того метод иммобилизации не должен включать использования токсических или денатурирующих реагентов, которые могли бы изменить активность фермента.

Хотя основные принципы создания биокаталитических систем сформулированы давно, уникальных и идеальных материалов для иммобилизации любых ферментов не существует. Иммобилизация чувствительного компонента на наночастице может производиться в ходе синтеза частицы либо после ее формирования путем инкапсулирования, ковалентной сшивки, аффинного взаимодействия, или физической адсорбции посредством электростатического или гидрофобного взаимодействия.

Физическая адсорбция является наиболее безопасным в отношении фермента способом иммобилизации. Она практически не требует подготовки компонент сенсора и использования специальных химических реагентов. Иммобилизация достигается путем самопроизвольной адгезии вещества на поверхности носителя. При этом его удержание обеспечивается за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых, электростатических, гидрофобных взаимодействий с поверхностью носителя, а также водородных связей. Вклад каждого из типов связывания определяется химической природой носителя и функциональных групп молекул иммобилизируемого вещества. Однако, полученные методом адсорбции элементы, обычно характеризуются низкой чувствительностью и существенной зависимостью от рН, температуры, растворителя, ионной силы раствора, что объясняется изменением конформации макромолекул в процессе иммобилизации [15, 22]. Кроме того, материал может десорбироваться, уменьшая чувствительность системы и загрязняя раствор. Методом адсорбции пользуются, в основном, на стадии исследований и для производства дешевых одноразовых элементов. Примерами является иммобилизация на углеродные нанотрубки и золотые частицы [24, 25].

Ковалентное связывание производится путем химического воздействия на структуру иммобилизируемого вещества и носителя с целью создания между ними новых ковалентных связей. Ковалентная сшивка обычно выполняется посредством простых реакций между функциональными амино-, карбокси- или сульфидными группами

наночастицы и прививаемой молекулы. Выбор химических реагентов зависит от природы связываемых молекул и материала носителя и реализуется обычно в три этапа: очистка и модификация поверхности носителя, т.е. формирование на нем слоя из необходимых функциональных групп, затем нанесение прививаемого материала, и, наконец, смывание слабо закрепленных молекул чистыми растворителями. В качестве носителей используют частицы благородных металлов (золота, серебра, платины) и углеродные наночастицы. Достоинства метода ковалентного связывания состоят в том, что, с одной стороны он обеспечивает надежную связь материала с подложкой и предотвращает его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с длительным временем жизни [11]. Недостатками метода является необходимость использования для иммобилизации относительно большого количества фермента, а также невысокая активность иммобилизированных ферментов в силу того, что в связывание могут быть вовлечены группы их активного центра [15, 22].

Этими недостатками не обладают методы аффинной иммобилизации. Они заключаются в создании связей между поверхностью носителя и специфическими группами белка на основе аффинных взаимодействий [26]. Этот метод позволяет исключительно точно контролировать процесс иммобилизации и задавать пространственную ориентацию групп белка [27, 28]. Однако иммобилизация ферментов с помощью этого метода используется сравнительно нечасто, и, возможно, будет развита в будущем.

2.2.3. Оптические сенсоры на основе нано- и микрочастиц

С уменьшением размеров датчиков меняется и идеология их использования: предпочтительной является конструкция сенсора, при которой он связан с регистрирующим макроустройством дистанционно или работает абсолютно автономно. Это обстоятельство накладывает ограничения на выбор способа регистрации аналитического сигнала. Поэтому в разработке нано- и микросенсоров широкое распространение получили оптические способы регистрации информации, поступающей от чувствительного элемента. К ним относятся оптическая, флуоресцентная, рамановская спектроскопия и др. [29-31].

Бесспорно, лидирующую позицию занимают оптические сенсоры, регистрация работы которых основана на люминесцентных свойствах рецепторного вещества. К ним относится использование квантовых точек и различных флуорофоров.

Квантовые точки представляют собой полупроводниковые нанокристаллы СсК, СсШе, С(1Те, ог СсШе/гпБе, обладающие уникальными оптическими свойствами [32]. Фотохимическая стабильность и способность работать в строго определенном интервале длин волн делает квантовые точки очень востребованными для создания сенсоров [33 - 36]. Однако к настоящему моменту накоплено немало сведений о цитотоксическом эффекте

квантовых точек [37-40]. Для повышения биосовместимости их поверхность модифицируют различными полимерами [40 - 42].

Если применение в сенсорных технологиях пока столь экзотических квантовых точек только развивается, то подходы к использованию флуоресцентных красителей постоянно совершенствуются. Именно с их использованием в настоящее время связаны перспективы разработки неинвазивных оптических сенсоров для мониторинга параметров внутренней среды организма или живой клетки. Яркие и разнообразные флуоресцентные красители, способные специфически взаимодействовать с ионами и молекулами, являются пока основными претендентами для реального использования в on-line анализе. Однако и они не лишены недостатков. Некоторые красители могут оказывать токсическое действие на отдельные культуры клеток [43, 44]. Примечательно, что красители, обладающие цитотоксическими свойствами, нашли свое практическое применение в качестве сенсибилизаторов в фотодинамической терапии [45, 46]. Облучение всех флуоресцентных красителей вызывает их фотовыцветание, поэтому основной целью исследователя при работе с красителями являет нахождение оптимального соотношения времени и интенсивности облучения, которое позволит работать с препаратами как можно дольше времени. Кроме того существенной проблемой является взаимодействие индикаторов с нецелевыми ионами и молекулами внутри клетки, которое может приводить к искажению аналитического сигнала [47, 48]. Частично эти проблемы решаются использованием так называемых ратиометрических красителей, позволяющих вести измерение на двух длинах волн возбуждения или эмиссии [49, 50]. Однако существуют сложности, которые трудно решить заменой красителя. Они связаны с «утечкой» индикаторов из клетки или, напротив, их связыванием с белками и органеллами клетки, что осложняет или делает невозможным определение целевых ионов [51, 52]. Здесь на помощь приходят методы иммобилизации красителей. Одним из наиболее распространенных коммерчески доступных вариантом иммобилизированных красителей являются их конъюгаты с высокомолекулярным декстраном. Этот гидрофильный полисахарид используется в качестве переносчика флуорофоров и способствует повышению их растворимости, уменьшению цитотоксического эффекта [53-56]. Однако коммерческая стоимость этих дериватов по сравнению со свободными красителями довольно велика [57]. Кроме того, использование декстрана в качестве переносчика уменьшает общее количество флуоресцентных молекул, включаемых в клетку. Поэтому разработка новых способов иммобилизации флуоресцентных красителей остается актуальным вопросом.

Нано- и микрочастицы для иммобилизации флуоресцентных красителей имеют ряд существенных преимуществ:

1. они защищают иммобилизированный краситель от воздействия внутриклеточных агентов, препятствуя изменению его спектральных характеристик, исключают такие факторы, как связывание с белками, мембранами или органеллами клетки [58, 59].

2. Каждая частица может содержать довольно большое количество красителя, что облегчает использование индикаторов с высокими значениями константы диссоциации [60].

Также увеличение концентрации красителя способствует увеличению параметра сенсора сигнал/шум.

3. В частицу возможно нагружать несколько типов флуорофоров, что позволяет реализовывать ратиометрический подход к анализу, или определять сразу несколько параметров исследуемой системы [61].

4. Поверхность частиц может быть модифицирована биологическими молекулами для специфического взаимодействия с определенными клетками [62].

5. Нано- и микрочастицы имеют высокое соотношение площадь поверхности/объем, обеспечивая высокую доступность аналита красителю [63, 64].

К настоящему времени было предложено большое количество внутриклеточных нано- и микросенсоров, определение ионов и молекул с помощью которых основано на свойствах флуоресцентных молекул. Среди них особого внимания заслуживают нано- и микросенсоры, объединенные под в литературе под общим названием PEBBLE (Photonic Explorer for Biomedical use with Biologically Localized Embedding). Концепция их создания была предложена и развита в последние 15 лет в работах Рауля Копельмана и его коллег [65, 66]. PEBBLE, в общих чертах, представляют собой биологически инертные наноразмерные сферические полимерные частицы, использующиеся в качестве матриц для конструирования оптических сенсоров и предназначенные для анализа in vitro. В качестве матрицы для создания сенсоров авторами используются в основном наноразмерные полимерные частицы из полиакриламида, полидецилметакрилата [67-69, 70-71]. Инкорпорация флуоресцентных и биологических молекул в такие частицы производится на этапе полимеризации частиц или путем создания ковалентных связей между функциональными группами индикатора и полимерной основой [66, 72-75]. Полученные сенсоры обеспечивают все вышеперечисленные преимущества по сравнению со свободными красителями. Главным преимуществом этого типа частиц является отсутствие влияния матрицы на спектральные свойства красителей [72, 73, 76-78].

Однако, обращает на себя внимание тот факт, что большинство из предложенных сенсоров предназначены для измерения концентрации ионов (Н+, Са2+, Mg2+, Zn2', Fe3+ К+ Na , Cu2+) [67, 70, 72, 73, 76] и низкомолекулярных неорганических молекул (ОН-, 02, Н202) [61, 70, 77, 79, 80]. В то время как успехи в разработке нано- и микросенсоров для

количественного определения метаболитов выглядят несколько скромнее [81]. По-видимому, это обусловлено условиями полимеризации, не обеспечивающими в полной мере сохранность имобилизируемого фермента: для формирования сенсорных частиц используют органические растворители, высокие температуры. Поэтому актуальным является вопрос разработки нано- и микроконтейнеров для иммобилизации биологических молекул, формирование которых проходит в мягких условиях, исключающих инактивацию включаемого материал.

Перспективным в этом отношении представляется применение для иммобилизации биологически активных веществ полиэлектролитных микрокапсул (ПЭМК). ПЭМК получают методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидные частицы нано- и микроразмеров (ядра). В качестве ядер для формирования капсул используют полистирольные (ПС) и меламин-формальдегидные (МФ) частицы [82, 83], неорганические карбонатные микрочастицы [84, 85], кристаллы органических красителей [86, 87], белковые агрегаты [88] и др. Биологические макромолекулы могут быть включены в готовые полиэлектролитные микрокапсулы путем изменения проницаемости полиэлектролитной оболочки капсул, или на стадии формирования капсул при использовании в качестве ядер содержащих белки или ферменты биоминеральных частиц (обычно карбонатов двухвалентных металлов) с последующим разрушением этих частиц в мягких условиях (растворение в ЭДТА или небольшом подкислении среды) [86, 87]. Для получения многослойных оболочек микрокапсул могут использоваться как синтетические [82, 83, 89], так и природные [90-92] полиэлектролиты. Однако для использования полиэлектролитных капсул в качестве сенсоров целесообразно использовать различные комбинации синтетических полиэлектролитов.

Полиэлектролитные нано- и микрокапсулы являются относительно новым объектом полимерной нанотехнологии, потенциал практического применения которых велик в связи с возможностью иммобилизации в них различных высокомолекулярных веществ. В связи с этим представляется актуальным оценить современное состояние научных исследований в области полиэлектролитных микрокапсул. В обзоре литературы будут рассмотрены образование, строение и свойства интерполиэлектролитных комплексов, являющихся основой полиэлектролитных микрокапсул, способы получения и загрузки таких капсул биологическими макромолекулами (белками, ферментами), а также флуоресцентными красителями.

2.3. Полиэлектролитные нано- и микрокапсулы

2.3.1. Образование, строение и свойства интерполиэлектролитных комплексов

Полимеры имеют склонность к образованию надмолекулярных структур. Это общее для них свойство обусловлено длинноцепным строением макромолекул, способных кооперативно взаимодействовать друг с другом. Наиболее отчетливо это свойство наблюдается для противоположно заряженных полиэлектролитов. Электростатическое взаимодействие между звеньями противоположно заряженных полиэлектролитов приводит к возникновению ионных связей, каждая из которых сравнительно слаба, но суммарная энергия кооперативной системы всех связей велика, поэтому такие интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) крайне устойчивы. Движущей силой процесса является выигрыш энтропии системы за счет освобождения низкомолекулярных ионов, ранее иммобилизованных в электрическом поле полиионов. Образование ИПЭК с точки зрения свободной энергии электростатических взаимодействий ионных групп полиэлектролитов рассмотрено в работе [93].

Интерполиэлектролитные комплексы представляют собой класс веществ, которые обладают рядом уникальных свойств, связанных с природой составляющих их компонентов, степенью завершенности реакции между ними, составом растворителя и др. Степень превращения (в) полиионов в этой реакции определяют как соотношение равновесного числа образующихся в данных условиях ионных пар к максимально возможному их количеству. На ее величину могут влиять такие условия среды как рН и ионная сила раствора [94, 95]. Интервалы рН, в которых протекают интерполимерные реакции, а также области рН, где поликомплексы устойчивы, определяются константами диссоциации соответствующих поликислот и полиоснований. В реакциях между сильными полиэлекгролитами степень превращения не зависит от величины рН и определяется только структурной комплементарностью реагирующих макромолекул. Такие ИПЭК устойчивы практически при любых значения рН. Для реакций с участием слабых, а также слабых и сильных полиэлектролитов степень превращения 0 зависит от рН среды.

Еще одним важным параметром, влияющим на образование ИПЭК, является ионная сила. В присутствии низкомолекулярного электролита возникает конкуренция меяоду ним и высокомолекулярным полиэлектролитом за образование ионных связей. Это приводит к ослаблению связей, в результате чего цепи полиэлекгролита приобретают большую подвижность, что снимает некоторые стерические затруднения при образовании комплекса. Однако добавление избытка низкомолекулярного электролита может привести к разрушению большого числа ионных связей и даже к полному разрушению ИПЭК. Для каждой пары

полиэлектролитов характерно определенное значение концентрации низкомолекулярного электролита, при которой ИПЭК распадаются [96].

Результаты исследований равновесий реакций образования ИПЭК в водных растворах приводят к представлению о них как о полимерах лестничного строения. В них более или менее упорядоченные участки, представляющие собой двугяжные последовательности пар противоположно заряженных звеньев, образовавших друг с другом солевые связи (рис. 5, А), чередуются с областями (рис. 5 Б, В), содержащими последовательности разобщенных звеньев и представляющих собой дефекты [97]. Среди дефектов различают структуры типа петли (Б) и сетчатые структуры (В). Соотношение между участками А и областями Б и В может варьироваться в широких пределах и зависит как от состава ИПЭК, так и от величины степени превращения 9. Случай, когда структура ИПЭК лишена дефектов, редко реализуется на практике и является идеальным.

Рис. 5. Схематическое строение ИПЭК.

Мембраны из ИПЭК способны пропускать воду и растворенные в ней низкомолекулярные соединения. Это свойство обусловило практический интерес к ним. Исследования показали, что проницаемость по воде таких мембран значительно выше, чем у других гидрофильных мембран [98]. Селективная проницаемость обусловлена наличием определенного количества дефектов в двутяжных структурах мембраны. Их соотношение возможно изменять под действием низкомолекулярных солей. Так, при помещении ИПЭК в раствор, содержащий низкомолекулярный электролит, вследствие экранирования электростатических взаимодействий между функциональными группами полиэлектролитов происходит разрыв некоторого количества межнитевых солевых связей. Это приводит к росту количества дефектов и увеличению степени проницаемости мембраны ИПЭК для воды.

Важно отметить, что усложнение структуры компонентов не приводит к кардинальным изменениям свойств систем, что позволяет прогнозировать поведение вновь синтезируемых ИПЭК и использовать комплексообразование в качестве эффективного

22

средства направленного изменения свойств полимеров с целью придания им качеств, необходимых для практического применения. Полиэлектролитные комплексы обладают двумя, на первый взгляд взаимоисключающими свойствами - высокой устойчивостью и лабильностью. Они легко вступают в конкурентные интерполиэлектролитные реакции, которые сопровождаются переносом полиионов из одних комплексов на другие [99]. Сочетание этих свойств и селективности кооперативного электростатического связывания обеспечивает самосборку интерполиэлектролитных комплексов и создает предпосылки для разработки полиэлектролитных систем, чутко реагирующих на изменение среды в определенных условиях.

2.3.2. Получение, строение и свойства полиэлектролитных пленок на плоских подложках

Получение многослойных ансамблей различного рода молекул применением метода последовательной адсорбции полиэлектролитов (ПАП) было впервые предложено в 1966 году Илером [100], а позднее данный подход был развит Маллоуком [101]. Основной вклад в создание мультислоев был сделан в 1991 г. Дехером и его коллегами, которые разработали метод электростатического самоформирования мультислоев [102-103].

Поочередная адсорбция противоположно заряженных полиэлектролитов на плоские подложки приводит к формированию пленок с чередующимися свойствами поверхности, такими как химический состав, С-потенциал, или угол смачивания [106-108]. Таким образом, было бы обоснованным ожидать ламелярной структуры получаемой пленки с возможной дифференциацией соседних слоев. Однако изучение полиэлектролитных слоев методами отражения рентгеновских лучей и малоуглового отражения нейтронов не подтвердило факт: пики Брэгга, указывающие на определенную структуру мультислоев, зарегистрированы не были [109, 110]. Таким образом, пленки, сформированные путем электростатического взаимодействия, не содержат четко разделенных соседних слоев.

Самый нижний и самый верхний полиэлектролитные слои пленки отличаются от внутренних. Типичным является тот факт, что большинство солей концентрируется во внешнем слое. Результаты экспериментов по изучению диффузии, представленные в работах [Ш-ПЗ], указывают на более рыхлую молекулярную упаковку на поверхности Также авторами была отмечена возможность образования между полиэлектролитами связей с помощью неэлектростатических взаимодействий, сила действия которых различна для разных полиэлектролитов и субстратов. Результирующий избыточный заряд определяет количество полиэлектролита, адсорбирующегося на следующей стадии. Это может привести к различию в структуре пленки в случае, когда для формирования мультислойного покрытия

используются более чем два полиэлектролита, и к различным результатам при изменении порядка адсорбции [114].

2.3.3. Формирование полиэлектролитных капсул

После получения макромолекулярных ансамблей полимеров на плоских поверхностях, полиэлектролитные пленки были успешно получены на коллоидных частицах [105, 106]. Процесс образования полиэлектролитной оболочки на поверхности коллоидных частиц подчиняется тем же принципам, что и на плоских подложках в случае, когда размер коллоидной частицы во много раз больше, чем размер молекул полиэлектролитов. Схема данного процесса представлена на рис. 6. Заряженные коллоидные частицы, выступающие в качестве ядер для формирования пленки, инкубируются в растворе заряженного полиэлектролита (стадия 1, рис. 6), после чего его молекулы адсорбируются на поверхности частицы. Не связавшиеся молекулы полиэлектролита удаляют и затем наносят полимер противоположного заряда (стадия 2, рис. б). Многократное повторение процедур нанесения полиэлектролитов приводит к формированию "многослойной" ПЭ пленки на поверхности коллоидной частицы (стадия 3, рис. б).

ч, щ * €И

Рис. 6. Схема процесса формирования полиэлектролитных оболочек на поверхности коллоидных частиц.

При последовательном нанесении полиэлектролитов на коллоидные частицы могут быть использованы два подхода [105, 106]. В первом случае берутся избыточные концентрации полиэлектролитов, несвязавшиеся молекулы полимера после адсорбции удаляют промывкой. Во втором случае полиэлектролиты добавляют в концентрации, достаточной для насыщения "слоя" мембраны микрокапсулы.

Использование избыточных концентраций ПЭ при покрытии коллоидых частиц более популярно, так как не нужно определять точное количество ПЭ для адсорбции каждого слоя. Однако для реализации данной методики необходимо отделять несвязавшийся полиэлектролит от покрытых коллоидных частиц перед добавлением раствора противоположно заряженного полииона. Для этого проводят многократное промывание

частиц, включающее последовательные центрифугирование, отделение супернатанта и ресуспендирование частиц. Альтернативным способом является применение метода фильтрации для отделения раствора полиэлектролита [115].

Формирование полиэлектролитных микропленок на поверхности коллоидных

частиц послужило началом получения микрокапсул, образующихся при удалении

коллоидной частицы (ядра), покрытой ПЭ оболочкой [105]. Принципиальная схема

процесса получения полых полиэлектролитных микрокапсул (ПЭМК) представлена на рис. 7, стадии а-е.

б)

f»

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Казакова, Любовь Игоревна

5. ВЫВОДЫ

1. Показано, что при использовании пористых сферолитов СаСОз в качестве ядер для формирования полиэлектролитных микрокапсул, внутренняя структура получаемых капсул представляет собой интерполиэлектролитный матрикс, а регулярная оболочка формируется после 8 полиэлектролитных слоев. Применение биоминеральных ядер приводит к формированию содержащих белок капсул с упорядоченной оболочкой уже при 6 полиэлектролитных слоях.

2. Показано, что расположение белка в полости полиэлектролитной микрокапсулы зависит от взаимного влияния зарядов белка и внутреннего полиэлектролитного слоя капсулы и возможно в двух вариантах: равномерное распределение белка в объеме капсулы или концентрирование его агрегатов вблизи оболочки. Установлено, что при значениях pH, близких значениям изоэлектрической точки белка, белок располагается вблизи оболочки микрокапсулы.

3. Установлено, что связывание амфифильного флуоресцентного красителя мероцианина540 с полиэлектролитными капсулами происходит благодаря его электростатическим и гидрофобным взаимодействиям с интерполиэлектролитными структурами оболочки капсулы. Предложено производить включение амфифильных и заряженных гидрофобных флуоресцентных красителей в содержащие и несодержащие белки полиэлектролитные капсулы двумя способами: 1) на стадии формирования капсул, используя комплексы полиэлектролитов с интеркалированным красителем; 2) добавлением раствора красителя к водной суспензии капсул.

4. Разработаны флуоресцентные хемосенсоры на основе полиэлектролитных микрокапсул, содержащих индикаторы Ru(dpp) и Calcium Green-1, для определения кислорода и ионов кальция соответственно. Впервые показана принципиальная возможность определения концентрации аналита с помощью одной сенсорной капсулы.

5. Впервые сформированы полиэлектролитные микрокапсулы, содержащие одновременно ферменты и флуоресцентные индикаторы каталитического разложения метаболитов. Разработаны биосенсоры для определения глюкозы, мочевины и лактата в водной среде. Показана возможность определения концентрации метаболита с помощью одной сенсорной капсулы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Казакова, Любовь Игоревна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бородина Т. Н„ Румш Л. Д., Кунижев С. М., Сухоруков Г. Б., Ворождов Г. Н„ Фельдман Б. М., Марквичева Е. А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ. Биомедицинская химия, 2007, 53 (5), с. 557-565.

2. S. De Koker, B.N. Lambrecht, M.A. Willart, Y. Van Kooyk, J. Grooten, C. Vervaet, J.P. Remon, B.G. De Geest. Designing polymeric particles for antigen delivery. Chemical Society Reviews, 2011, 40 (1), p. 320-329.

3. De Koker, S.; De Cock, L.J.; Auzely-Velty, R.; Gil, P.R.; Parak, W.J.; Grooten, J.; Vervaet, C.; Remon, J.P.; De Geest, B.G. Polyelectrolyte capsules delivering biomacromolecules. Advanced Drug Delivery Reviews, 2011, 63, p. 748-761.

4. L.J. De Cock, S. De Koker, B.G. De Geest, J. Grooten, C. Vervaet, J.P. Remon, G.B. Sukhorukov, M.N. Antipina. Polymeric multilayer capsules in drug delivery. Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49, p. 6954-6973.

5. Xingping Qiu, Stefano Leporatti, Edwin Donath, Helmuth Mohwald. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles. Langmuir, 2001, 17 (17), p. 5375-5380.

6. Bruno G. De Geest, Stefaan De Koker, Gleb B. Sukhorukov, Oliver Kreft, Wolfgang J. Parak, Andrei G. Skirtach, Jo Demeester, Stefaan C. De Smedt and Wim E. Hennink. Polyelectrolyte microcapsules for biomedical applications. Soft Mater, 2009, 5, p. 282-291.

7. S. De Koker, T. Naessens, B.G. DeGeest, P. Bogaert, J. Demeester, S. De Smedt, J. Grooten Biodegradable polyelectrolyte microcapsules: Antigen delivery tools with Thl7 skewing activity after pulmonary delivery. J. Immunol., 2010, 184(1), p. 203-211.

8. Studer D., Palankar R., Bedard M., Winterhalter M., Springer S. Retrieval of a metabolite from cells with polyelectrolyte microcapsules. Small, 2010, 6 (21), p. 2412-2419.

9. Loretta L. del Mercato, Azhar Z. Abbasi, Markus Ochs, Wolfgang J. Parak. Multiplexed sensing of ions with barcoded polyelectrolyte capsules. ACS Nano, 2011; 5(12), p. 9668-9674.

10. Rohit Srivastava, Rahul Dev Jayant, Ayesha Chaudhary, Michael J. McShane. "Smart tattoo" glucose biosensors and effect of coencapsulated anti-inflammatory agents. Journal of diabetes science and technology, 2011, 5 (1), p. 76-85.

11. Т.И. Лукичева и др. Кчинико-лабораторные аналитические технологии и оборудование: учебное пособие для студентов средних проф. учеб. заведений, М.: «Академия», 2007.

12. Золотов Ю. А., Иванов В. М., Амелин В. Г. Химические тест-методы анализа. М.: Едиториал УРСС, 2002.

13. A. Hulanicki, S. Glab and F. Ingman. Chemical sensors definitions and classification. Pure Appl. Chem., 1991, 63 (9), p. 1247-1250.

14. Daniel R. Thevenota, Klara Tothb, Richard A. Durstc, George S. Wilsond. Chemical sensors: definitions and classification Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification (Technical Report). Pure Appl. Chem., 1999, 71 (12), p. 2333-2348.

15. Peter Grundler. Chemical sensors. An introduction for scientists and engineers. SpringerVerlag Berlin Heidelberg, 2007.

16. Foster LE. (2006). Medical nanotechnology: science, innovation, and opportunity.Upper Saddle River: Pearson Education, 2006.

17. C. Bonnet, S. Andreeseu and J.L. Marty. Adsorption: an easy and efficient immobilization of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes. Anal. Chem. Acta., 2003, 481 (2), 209-211.

18. A. F. Collings and F. Caruso. Biosensors: resent advances. Rep. Prog. Phys., 1997, 60 (11), 1397-1445.

19. S. Andreeseu, L. Barthelmebs and J.L. Marty. Immobilization of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes: comparative study between three immobilization methods and applications to the detection of organophosphorus insecticides. Analytica Chimica Acta, 2002, 464 (2), p. 171-180.

20. Sarah E. Baker, Kiu-Yuen Tse, Eve Hindin, Beth M. Nichols, Tami Lasseter Clare, Robert J. Hamers. Covalent Functionalization for Biomolecular Recognition on Vertically Aligned Carbon Nanofibers. Chemistry of Materials, 2005,17 (20), p. 4971-4978.

21. Sigal G.B, Bamdad C., Barberis A., Strominger J., Whitesides G.M. A self-assembled monolayer for the binding and study of histidine-tagged proteins by surface plasmon resonance. Anal Chem., 1996, 68 (3), p. 490-497.

22. William H. Scouten, John H. T. Luong, R. Stephen Brown. Enzyme or protein immobilization techniques for applications in biosensor design. Trends in biotechnology, 1995, 13 (5), p. 178-185.

23. Serge Cosnier, Christine Mousty, Chantal Gondran, Arielle Lepellec. Entrapment of enzyme within organic and inorganic materials for biosensor applications: Comparative study. Materials Science and Engineering: C, 2006,26 (2-3), p. 442-447.

24. Sumant S. Phadtare, V.P. Vinod, Prakash P. Wadgaonkar, Mala M. Rao and Murali M. Sastry. Free-standing nanogold membranes as scaffolds for enzyme immobilization. Langmuir, 2004, 20 (9), p. 3717-3723.

25. Ethan D. Minot, Anne M. Janssens, Iddo Heller, Hendrik A. Heering, Cees Dekker, and Serge G. Lemay. Carbon nanotube biosensors: The critical role of the reference electrode. Appl. Phys. Lett., 2007, 91, p. 093507.

26. S. Andreeseu, B. Bucur, J.-L. Marty. Affinity immobilization of tagged enzymes in immobilization of enzymes and cells, second edition. Ed. by J.M. Guisan, Series: Methods in Biotechnology, Humana Press, 2006.

27. M. Saleemuddin. Bioajfinity based immobilization of enzymes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1999, 64, 203-226.

28. Kumada Y., Tokunaga Y., Imanaka H., Imamura K., Sakiyama T., Katoh S., Nakanishi K. Screening and characterization of affinity peptide tags specific to polystyrene supports for the orientated immobilization of proteins. Biotechnol Prog., 2006, 22 (2), p. 401-405.

29. Xiaosheng Fang, Linfeng Hu, Changhui Ye, and Lide Zhang. One-dimensional inorganic semiconductor nanostructures: A new carrier for nanosensors. Pure Appl. Chem., 2010, 82 (11), p. 2185-2198.

30. V.K. Khanna. Nanoparticle-based Sensors. Defence Science Journal, 2008, 58 (5), p. 608616.

31. Janina Kneipp, Harald Kneipp, Burghardt Wittig, Katrin Kneipp. Novel optical nanosensors for probing and imaging live cells. Nanomedicine, 2010, 6 (2), 214-226.

32. S. Schulz, S. Schumacher, G. Czycholl. Semiconductor nanocrystals and embedded quantum dots: Electronic and optical properties. Physica status solidi (b), 2007, 244 (7), p. 23992406.

33. P. Alivisatos. The use of nanocrystals in biological detection. Nature Biotechnology, 2004, 22, p. 47 - 52.

34. Alivisatos A.P., Gu W., Larabell C. Quantum dots as cellular probes. Annual Review of Biomedical Engineering, 2005, 7, p. 55-76.

35. Smith A.M., Dave S., Nie S., True L., Gao X. Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer. Expert Rev Mol Diagn, 2006; 6, 231-244.

36. Alivisatos P. The use of nanocrystals in biological detection. Nat Biotechnol, 2004, 22, p. 47-52.

37. Sapsford, K.E.; Pons, T.; Medintz, I.L.; & Mattoussi,H. Biosensing with luminescent semiconductor quantum dots. Sensors, 2006, 6, 925-953.

38. Ming-Shu Hsieh, Nion-Heng Shiao and Wen-Hsiung Chan. Cytotoxic effects of cdse quantum dots on maturation of mouse oocytes, fertilization, and fetal development. Int. J. Mol. Sci., 2009, 10(5), 2122-2135.

39. Clift M.J, Varet J., Hanlcin S.M., Brownlee B., Davidson A.M., Brandenberger C., Rothen-Rutishauser B., Brown D.M., Stone V. Quantum dot cytotoxicity in vitro: an investigation into the cytotoxic effects of a series of different surface chemistries and their core/shell materials. Nanotoxicology, 2011, 5(4), p. 664-674.

40. Skaff H, Sill K, Emrick T. Quantum dots tailored with poly (para-phenylenevinylene). J Am Chem Soc, 2004,126, p. 11322-11325.

41. Chan W.C, Nie S. Quantum dot bioconjugates for idtrasensitive nonisotopic detection. Science, 1998, 281, p. 2016-2018.

42. Yuanyuan Su, Yao He, Haoting Lu, Liman Sai, Qingnuan Li, Wenxin Li, Lianhui Wang, Pingping Shen, Qing Huang, Chunhai Fan. The cytotoxicity of cadmium based, aqueous phase -Synthesized, quantum dots and its modulation by surface coating. Biomaterials, 2009, 30, p. 19-25.

43. Summerhayes, I. C., T. Lampidiss, S. D. Bernal, J. J. Nadakavukaren, K. K. Nadakavukaren, E. L. Shepherd, And L. B. Chen. Unusual retention of rhodamine 123 by mitochondria in muscle and carcinoma cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79 (17), p. 52595296.

44. Bernal, S. D., T. J. Lampidis, I. C. Summerhayes, And L. B. Chen. Rhodamine-123 selectively reduces clonal growth of carcinoma cells in vitro. Science, 1982, 218 (4577), p. 11171119.

45. Lampidis, T. J., S. D. Bernal, I. C. Summerhayes, And L. B. Chen. Rhodamine-123 is selectively toxic and preferentially retained in carcinoma cells in vitro. Annals of the New York Academy of Sciences, 1982, 397, p. 299-302.

46. Shea, C. R., N. Chen, J. Wimberly, And T. Hasan. Rhodamine dyes as potential agents for photochemotherapy of cancer in human bladder carcioma cells. Cancer Res., 1989, 49, p. 39613965.

47. Hofer, A. M., And T. E. Machen. Direct measurement offree Ca in organelles of gastric epithelial cells. Am. J. Physiol., 1994,267 (Gastrointest. Liver Physiol. 30), G442-G451.

48. Lattanzio, F. A. J., And D. K. Bartshat. The effects of pH on rate constant, ion selectivity and thermodynamic properties of fluorescent calcium and magnesium indicators. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 177, p. 184-191.

49. Bassnett, S., L. Reinisch, And D. C. Beebe. Intracellular pH measurement using single excitation-dual emission fluorescence ratios. Am. J. Physiol. ), 1990, 258 (Cell Physiol. 27), C171-C178.

50. Scheenen, W. J. J. M„ L. R. Makings, L. R. Gross, T. Pozzan, And R. Y. Tsien. Photodegradation ofindo-1 and its effects on apparent Ca2+ concentrations. Chem. Biol., 1996, 3, p.765-774.

51. Mitsui, M., A. Abe, M. Tajimi, And H. Karaki. Leakage of the fluorescent Ca21 indicator fura-2 in smooth muscle. Jpn. J. Pharmacol, 1993, 61, p. 165-170.

52. Malgaroli, A., D. Milani, J. Meldolesi, And T. Pozzan. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. J. Cell Biol., 1987, 105, p. 2145-2155.

53. Vandenbossche G.M, Van Oostveldt P., Remon J.P. A fluorescence method for the determination of the molecidar weight cut-off of alginate-polylysine microcapsules. J Pharm Pharmacol., 1991,43(4), p. 275-277.

54. Thorball N. FlTC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 1981, 71(2), p. 209-233.

55. Dimitrov D.S, Sowers A.E. Membrane electroporation—fast molecidar exchange by electroosmosis. Biochim Biophys Acta, 1990, 1022 (3), 381-392.

56. Eisen, J. S. Determination of primary> motoneuron identity in developing zebrafish embryos. Science, 1991, 252, p. 569-572.

57. www.invitrogen.com. Molecular Probes®

58. Koo, YEL.; Agayan, R.; Philbert, M.A.; Rehemtulla, A.; Ross, B.D.; Kopelman, R. Photonic explorers based on targeted multifunctional nanoplatforms: in vitro and in vivo biomedical applications. New Approaches in Biomedical Spectroscopy. Chapter 14, p. 200-218. New York: American Chemical Society, 2007.

59. Koo YEL, Reddy G.R, Bhojani M., Schneider R., Philbert M.A, et al. Brain Cancer Diagnosis and therapy with nano-platforms. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58, 1556-1577.

60. Carter, T. D., And D. Ogden. Kinetics of Ca2+ release by InsP3 in pig single aortic endothelial cells: evidence for an inhibitory role of cytosolic Ca21 in regulating hormonally evoked Call spike. J. Physiol. (Lond.), 1997, 504, p. 17-33.

61. M. King and R. Kopelman. Development of a hydroxy} radical ratiometric nanoprobe. Sensors and Actuators B: Chemical, 2003, 90, 76-81.

62. Clark HA, Merritt G, Kopelman R. Novel optical biosensors using a gold colloid monolayer substrate. Proc SPIE (Int Soc Opt Eng), 2000; 3922, p. 138-146.

63. Montalti M, Prodi L, Zaccheroni N. Fluorescence quenching amplication in silica nanosensors for metal ions. J Mater Chem, 2005, 15, p. 2810-2814.

64. Montet X, Funovics M, Montet-Abou K, Weissleder R, Josephson L. Multivalent effects of RGDpeptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem, 2006; 49(20), p. 6087-6093.

65. Clark H.A, Barker S.L.R, Brasuel M., Miller M.T., Monson E., et al. Subcellular optochemical nanobiosensors: probes encapsulated by biologically localised embedding (PEBBLEs). Sens Act B, 1998, 51, p. 12-16.

66. Sasaki K, Shi ZY, Kopelman R, Masuliara H. Three-dimensionalpH microprobing with an optically-manipulated fluorescent particle. Chem Lett, 1996, 25, p. 141-142.

67. M.J. Moreno, E. Monson, R.G. Reddy, A. Rehemtulla, B.D. Ross, M. Philbert, R.J. Schneider and R. Kopelman. Production of Singlet Oxygen by Ru(dpp(SO3)2)3 Incorporated in Polyacrylamide PEBBLEs. Sensors and Actuators B: Chemical, 2003, 90, p. 82- 89.

68. B.A. Moffat, G.R. Reddy, P. McConville, D.E. Hall, T.L. Chenevert, R. Kopelman, M. Philbert, R. Weissleder, A. Rehemtulla and B.D. Ross. A novel polyacrylamide magnetic nanoparticle contrast agent for molecular imaging using MRI. Mol. Imaging, 2003, 2, p. 324-332.

69. Gupta A., Wang S., Pera P., Rao K.V., Patel N„ Ohulchanskyy T.Y., Missert J., Morgan J., Koo-Lee Y.E, Kopelman R., Pandey R.K. Multifunctional nanoplatforms for fluorescence imaging and photodynamic therapy developed by post-loading photosensitize}" and fluorophore to polyacrylamide nanoparticles. Nanomedicine, 2011, [Epub ahead of print],

70. Cao Y., Lee Koo Y.E., Kopelman R. Poly(decyl methacrylate)-based fluorescent PEBBLE swarm nanosensors for measuring dissolved oxygen in biosamples. Analyst, 2004, 129, 745-750.

71. Brasuel M., Kopelman R., Miller T.J., Tjalkens R., Philbert M.A. Fluorescent nanosensors for intracellular chemical analysis: decyl methaaylate liquid polymer matrix and ion-exchange-

based potassium PEBBLE sensors with real-time application to viable rat C6 glioma cells. Anal Chem, 2001, 73, 2221-2228.

72. Park E,J, Brasuel M., Behrend C., Philbert M.A., Kopelman R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem, 2003, 75 (15), 3784-3791.

73. Clark H.A, Hoyer M., Philbert M.A., Kopelman R. Optical nanosensors for chemical analysis inside single living cells. Fabrication, characterization, and methods for intracellular delivery of PEBBLE sensors. Anal Chem, 1999, 71(21), p. 4831-4836.

74. Brasuel M., Kopelman R., Kasman I., Miller T.J., Philbert M.A. Ion Concentrations in Live Cells from Highly Selective Ion Correlations Fluorescent Nano-Sensors for Sodium. Proc IEEE Sensors, 2002,1, 288-292.

75. Almdal K, Sun H.H, Poulsen A.K, Arleth L., Jakobsen I., et al. Fluorescent gel particles in the nanometer range for detection of metabolites in living cells. Polym Adv Technol, 2006, 17, p. 790-793.

76. Sumner J.P, Aylott J.W., Monson E., Kopelman R. Fluorescent PEBBLE Nanosensor for Intracellular Free Zinc. Analyst, 2002, 127, p. 11-16.

77. Sumner J.P, Westerberg N., Stoddard A.K., Fierke C.A., Kopelman R. Cu and Cu2+ sensitive PEBBLE fluorescent nanosensors using Ds Red as the recognition element. Sens Act B, 2005, 113 (2), p. 760-767.

78. Sumner J.P., Kopelman R. Alexa Fluor 488 as an iron sensing molecide and its application in PEBBLE nanosensors. Analyst, 2005, 130 (4), 528-533.

79. Xu H, Aylott JW, Kopelman R, Miller TJ, Philbert MA. A real-time ratiometric method for the determination of molecular oxygen inside living cells using sol-gel-based spherical optical nanosensors with applications to rat C6 glioma. Anal Chem, 2001, 73, 4124-4133.

80. Kim, G. PhD thesis. Univ. Mich; Ann Arbor: 2008. Development of Nanoparticle Based Tools for Reactive Oxygen Species and Related Biomedical Applications; p. 151.

81. Hao Xu, Jonathan W. Aylott and Raoul Kopelman. Fluorescent nano-PEBBLE sensors designedfor intracellidar glucose imaging. Analyst, 2002, 127, 1471-1477.

82. G.B. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld, E. Knippel, M. Knippel, A. Budde, H. Mohwald. Layer-by-layer self-assembly of polyelectrolytes on colloidal particles. Coll. Surf. A., 1998, 137, p.253-266.

83. G.B. Sukhorukov, E. Donath, S. Davis, H. Lichtenfeld, F. Caruso, V.I. Popov, H. Mohwald. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: A novel approach to colloid design Polym. Adv. Technol., 1998, 9 (10-11), p. 759-767.

84. A.A. Antipov, D. Shchukin, Y. Fedutik, A.I. Petrov, G.B. Sukhorukov, H. Mohwald. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Coll. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects., 2003, 224, p. 175-184.

85. G.B. Sukhorukov, D.V. Volodkin, A.M. Gunther, A.I. Petrov, D.B. Shenoy, H. Möhwald. Porous calcium carbonate microparticles as templates for encapsulation of bioactive compounds. J. Mater. Chem., 2004, 14, p. 2073-2081.

86. F. Caruso, W.J. Yang, D. Trau, R. Renneberg. Microencapsulation of uncharged low molecular weight organic materials by polyelectrolyte multilayer self-assembly. Langmuir, 2000, 16 (23), p. 8932-8936.

87. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Möhwald H. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. J. Phys. Chem. B, 2001, 105 (12), p. 2281-2284.

88. Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B., Moroz N.A., Volodkin D.V., Larionova N.I., Donath E., Möhwald H. Encapsulation of proteins by layer-by-layer adsorption of polyelectrolytes onto protein aggregates: Factors regulating the protein release. Biotech. Bioeng., 2001, 76 (3), p. 207-213.

89. E. Donath, G.B. Sukhorukov, F. Caruso, S.A. Davis, H. Möhwald. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 37 (16), p. 2202-2205.

90. G. Berth, A. Voigt, H. Dautzenberg, E. Donath, H. Möhwald. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sidfate. Biomacromolecules, 2002, 3 (3), p. 579590.

91. N.G. Balabushevitch, O.P. Tiourina, D.V. Volodkin, N.I. Larionova, G.B. Sukhorukov. Loading the multilayer dextran sulfate/protamine microsized capsules with peroxidase Biomacromolecules, 2003, 4 (5), p. 1191-1197.

92. D.G. Shchukin, A.A. Patel, G.B. Sukhorukov, Y.M. Lvov. Nanoassembly of biodegradable microcapsides for DNA encasing. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, p. 3374-3375.

93. Biesheuvel P.M., Stuart M. Electrostatic free energy of weakly charge macromolecules in solution and intermacromolecular complexes consisting of oppositely charged polymers. Langmuir, 2004,20, p. 2785-2791.

94. Кабанов B.A. Физико-химические основы и перспективы применениярастворгшых интерполиэлектролитных комплексов. Высокомолекулярные соединения, 1994. Т. 36 (2), с. 183197.

95. Кабанов, В.А. Полиэлектролитные комплексы в растворе и в конденсированной фазе. Успехи химии, 2005. Т. 74, № 1, с. 5-23.

96. Зезин А.Б., Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. М.: Химия, 1973, 27 с.

97. Кабанов В.А., Каргина О.В., Ульянова М.В., Литвинов И.А. Исследование надмолекулярной структуры кристаллизующихся полиэлектролитных комплексов на основе изотактической полиакриловой кислоты. ВМС Б, 1982, т. 24, с. 17-19.

98. Калюжная Р.И., Рудман А.Р., Венгерова H.A., Разводовский Е.Ф., Эльцефон Б.С., Зезин А.Б. Условия образования и свойства мембран из полиэлектролитных комплексов на основе слабых полиэлектрлитов. ВМС А, 1975, т. 17 (12), с. 2786-2792.

99. Tsuchida, E.; Osada, Y.; Sanada, K. Interaction of polystyrene sulfonate) with polycations carrying charges in the chain backbone. J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 1972, 10, 3397-4003.

100. Iler R.K. Multilayers of colloidal particles. J. Colloid Interface Sci., 1966, 21 (6), p. 569575.

101. Lee H., Kepley L.J., Hong H.G., Akhter S. and Mallouk T.E. adsorption of ordered zirconium phosphonate multilayer fdms on silicon and gold surfaces. J. Phis. Chem., 1988, 92 (9), p. 2597-2601.

102. Decher G. and Hong J.D. Buildup of Ultrathin Multilayer Films by a Self-Assembli Process. 1. Consecutive Adsorption of Anionic and Cationic Bipolar Amphiphiles on Charged Surfaces. Makromol. Chem. Macromol. Symp., 1991, 46, p. 321-327.

103. Decher G. and Hong J.D. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembli process. 2. consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles and polyelectrolytes on charged surfaces. Berichte Der Bunsen-Geselschafit-Phisical Chemistry Chemical Physics, 1991, 95 (11), p. 1430-1434.

104. Decher G. and Hong J.D. and Schmitt J. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembli process. 3. alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces. Thin Solid Films, 1992, 210 (1-2), p. 831-835.

105. Sukhorukov, G.B., Donath, E„ Davis, S., Lichtenfeld, H., Caruso, F„ Popov, V.I., and Mohwald, H. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: a novel approach to colloid design. Polymers for Advanced Technologies, 1998, 9 (10-11), p. 759-767

106. Sukhorukov, G.B., Donath, E., Lichtenfeld, H., Knippel, E., Knippel, M., Budde, A., and Mohwald, H. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles. Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 1998, 137(1-3), p. 253-266.

107. Yoo, D„ Shiratori, S.S., and Rubner, M.F. Controlling bilayer composition and surface wettability of sequentially adsorbed multilayers of weak polyelectrolytes. Macromolecules, 1998, 31(13), p'4309-4318.

108. Delcorte, A., Bertrand, P., Arys, X., Jonas, A., Wischerhoff, E„ Mayer, B„ and Laschewsky, A. ToF-SIMS study of alternate polyelectrolyte thin films: Chemical surface characterization and molecular secondary ions sampling depth. Surface Science, 1996, 366 (1), p. 149-165.

109. Losche, M„ Schmitt, J., Decher, G., Bouwman, W.G., and Kjaer, K. Detailed structure of molecularly thin polyelectrolyte multilayer films on solid substrates as revealed by neutron reflectometry. Macromolecules, 1998, 31 (25), p. 8893-8906.

110. Schmitt, J., Grunewald, T„ Decher, G., Pershan, P.S., Kjaer, K„ and Losche, M. Internal structure of layer-by-layer adsorbed polyelectrolyte films - a neutron and x-ray reflectivity study. Macromolecules, 1993,26 (25), p. 7058-7063.

11 1. Okubo, T. and Suda, M. Absorption ofpolyelectrolytes on colloidal surfaces as studied by electrophoretic and dynamic light-scattering techniques. Journal of Colloid and Interface Science, 1999,213 (2), p. 565-571.

112. VonKlitzing, R. and Mohwald, H. A realistic diffusion model for ultrathin polyelectrolyte films. Macromolecules, 1996, 29 (21), p. 6901-6906.

113. VonKlitzing, R. and Mohwald, H. Transport through ultrathin poly electrolyte films. Thin Solid Films, 1996, 285, p. 352-356.

114. Jonas, A.M., Arys, X., Fischer, P., Koetse, M., Laschewsky, A., and Legras, R., Internal structure of ionene-based polyelectrolyte multilayers: General rules and specific examples. Abstracts of Papers of the American Chemical Society, 2000, 219, p. U557-U558.

115. Voigt A., Lichtenfeld R, Sukhorukov G.B., Zastrow H., Donath E., Baumler H. and Mohwald H. Membrane filtration for microencapsulation and microcapsules fabrication by layer-by-layer polyelectrolyte adsorption. Ind. Eng. Chem. Res., 1999, 38 (10), p. 4037-4043.

116. OA Иноземцева, CA Псршов, ТА Колесникова, ДА Горин. Формирование и физико-штяееше свойства пстшентрашттътх ианокомпозит ¡ых л п ¡крокапсул. Российские шнотехнологии, 2007,т. 2, №9-10, с. 68-80.

117. Itoh Y., Matsusaki М., Kida Т. and Akashi М. Preparation of Biodegradable Hollow Nanocapsules by Silica Template Method. Chem. Lett., 2004, 33(12), p. 1552-1553.

118. Shenoy D.B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Layer-by- layer engineering of biocompatible, decomposable core-shell structures. Biomacromolecules, 2003,4(2), p. 265-272.

119. LippmannF. Sedimentary carbonate minerals. Berlin: Springer-Verlag, 1973,146 p.

120.Meldrum F.C. and Hyde S.T. Morphological influence of magnesium and organic additives on the precipitation of calcite. J. Crystal Growth, 2001, 231, p. 544-558.

121. Yang L., Guo Y., Ma X., Hu Z., Zhu S., Zhang X. and Jiang K. Coopejativity between pepsin and crystallization of calcium carbonate in distilled water. J. Inorg. Biochem., 2003, 93, p. 197-203.

122.Naka K., Tanaka Y. and Chujo Y. Effect of anionic starburst dendrimers on the crystallization of CaC03 in aqueous solution: size control of spherical vaterite particles. Langmuir, 2002, 18, p. 3655 -3658.

123. Kitamura M. Crystallization and transformation mechanism of calcium carbonate polymorphs and the effect of magnesium ion. J. Colloid Interface Sci., 2001, 236, p. 318-327.

124. Volodkin, D. V.; Petrov, A. I.; Prevot, M.; Sukhorukov, G. Matrix polyelectrolyte microcapsules - new and high effective system for macromolecule encapsulation. B. Langmuir 2004, 20 (8), 3398-3406.

125. Volodkin, D. V.; Larionova N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaC03 microparticles templating. Biomacromolecules, 2004, 5, 1962-1972.

126. Alexander I. Petrov, Dmitry V. Volodkin, and Gleb B. Sukhorukov. Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation: A Tool for Protein Encapsulation. Biotechnol. Prog. 2005, 21, 918925.

127. Tikhonenko S.A., Saburova E.A., Dubrovsky A.V., Shabarchina L.I., Dybovskaja Ju.N„ Sukhorukov B.I. Methodology of inclusion of enzymes in polyelectrolyte nano- and microcapsules on example of lactate dehydrogenase. Glass Physics and Chemistry, 2007, 33 (3), p. 287-293.

128. Сухорукое Б.И., Тихоненко СЛ., Сабурова Е.А., Дубровский A.B., Дыбовская Ю.Н., Шабарчина Л.И. Инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные нано- и микрокапсулы в связи с проблемой микродиагностикума. Биофизика, 2007, 52 (6), с. 1041-1048.

129. Lvov, Y., A. Antipov, A. Mamedov, Н. Möhwald and G. В. Sukhorukov. Urease Encapsulation in Nanoorganized Microshells. Nano letters, 2001, 1, 125-128.

130. Y. Lvov and F. Caruso. Biocolloids with Ordered Urease Multilayer Shells as Enzymatic Reactors. Anal. Chem., 2001, 73, 4212-4217.

131. Stein, E. W., Volodkin, D. V., McShane, M. J., and Sukhorukov, G. B. Real-time assessment of spatial and temporal coupled catalysis within polyelectrolyte microcapsules containing coimmobilized glucose oxidase and peroxidase. Biomacromolecules, 2006, 7, 710-719.

132. Alexei A Antipov, Gleb В Sukhorukov, Stefano Leporatti, Igor L Radtchenko, Edwin Donath, Helmuth Möhwald. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspect, 198-200, p. 535-541.

133. Alexei A. Antipov, Gleb B. Sukhorukov. Polyelectrolyte midtilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science, 2004, 111, p. 49-61.

134. Alexandra S. Angelatos, Angus P. R. Johnston, Yajun Wang, and Frank Caruso. Probing the permeability of polyelectrolyte multilayer capsules via a molecidar beacon approach. Langmuir, 2007, 23, p. 4554-4562.

135. Qinghe Zhao, Bingyun Li. pH-controlled drug loading and release from biodegradable microcapsules. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2008, 4, p. 302-310.

136. Н.Г. Балабушевич, Г.Б. Сухоруков, Н.И. Ларионова. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и мел амин формальдегида. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2002, т. 43 (6), с. 374-377.

137. К. Köhler, G. В. Sukhorukov. Heat Treatment of Polyelectrolyte Midtilayer Capsules: A Versatile Methodfor Encapsulation. Advanced Functional Materials, 2007, 17 (13), p. 2053-2061.

138. Köhler К., Shchukin D.G., Möhwald H„ Sukhorukov G.B. Thermal behavior of polyelectrolyte multilayer microcapsules. 1. The effect of odd and even layer number. J Phys Chem B, 2005, 109 (39), 18250-18259.

139. Köhler К, Möhwald H, Sukhorukov GB. Thermal behavior of polyelectrolyte multilayer microcapsules: 2. Insight into molecular mechanisms for the PDADMAC/PSS system. J Phys Chem B, 2006,110 (47), 24002-24010.

140. Oliver Kreft, Almudena Muñoz Javier, Gleb B. Sukhorukov and Wolfgang J. Parak. Polymer microcapsules as mobile localpH-sensors. J. Mater. Chem., 2007, 17, 4471-4476.

141. Марченко И.В., Плотников Г.С., Баранов A.H., Салецкий A.M., Букреева T.B. Получение и разрушение полиэлектролитных микрокапсул, модифицированных родамином 6Ж. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2010. № 2, с. 14-18.

142. Парахонский Г.В., Букреева Т.В., Парахонский Б.В., Петров Н.Х. Изучение свойств карбоцианиновых красители внутри полиэлектролитных капсул. Тезисы докладов III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике. Москва, Россия, 2008, с. 58.

143. Парахонский Г.В., Букреева Т.В., Парахонский Б.В., Кошкин А.В., Петров Н.Х. Полиэлектролитные капсулы, наполненные циановыми красителями. Международная школа молодых ученых по твердотельной электронике "Физика и технология микро и наносистем". Санкт- Петербург, с. 56-57.

144. 143. Marchenko I. V., Parakhonsky G. V., Bukreeva Т. V., Plotnikov G. S., Baranov A. N., Saletsky A. M. Embedding of fluorescent dyes into polyelectrolyte capsules for remote destruction of the capsule shell by laser irradiation. Proc. SPIE, 2009, 7547, 754701.

145. Michael J. McShane, J. Quincy Brown, Kyle B. Guice and Yuri M. Lvov. Polyelectrolyte microshells as carriers for fluorescent sensors: loading and sensing properties of a ruthenium-based oxygen indicator. J. Nanosci. Nanotech. 2002, 2 (2), p. 1-6.

146. David A. Chang-Yen, Yuri Lvov, Michael J. McShane, Bruce K. Gale. Electrostatic self-assembly of a ruthenium-based oxygen sensitive dye using polyion-dye interpolyelectrolyte formation. Sensors and Actuators B, 2002, 87, 336-345.

147. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254.

148. Paddeu S., Fanigliulo A., Lanzin M., Dubrovsky Т., Nicolini C. LB-Based PAB immunosystem: Activity of an immobilized urease monolayer. Sens. Actuators., 1995, 25, p. 876882.

149. Мошков Д.А. Адаптаг{ия иулътраструктура нейрона. М.: Наука, 1985.

150. Tsien. R.Y. and Pozzan Т. Measurement of Cytosolic Free Ca2+ with Quin2. Method in Enzymology, 1989, 172, p. 230-244.

151. J. E. Whitaker, R. P. Haugland and F. G. Prendergast. Spectral andphotophysical studies of benzo[c]xanthene dyes: Dual emission pH sensors. Anal. Biochem., 1991, 194(2), 330-344.

152. Dodin, G. & Dupont, J. Thermodynamics and kinetics of the interaction of merocyanine 540 with hydrophobic structures. J. Phys.Chern., 1987, 91, 6322-6326.

153. Verkman, A. S. Mechanism and kinetics of merocyanine 540 binding to phospholipid membranes. Biochemistry, 1987, 26, 4050-4056.

154. Davila H.V., Salzberg B.M., Cohen L.B., Waggoner A.S. A large change in axon fluorescence that provides a promising method for measuring membrane potential.Nature, New Biol., 1973, 241, p. 159.

155. Sikurova L., Haban I., Chorvat D. Dimers of MC540 in aqueous solution. Studia Biophysica., 1988, 125, p. 197-201.

156. Sikurova L. and Cunderlikova В. pH dependence of merocyanine 540 absorption and fluorescence spectra. Spectrochimica Acta, 1997, Part. № 53, p. 293-297.

157. Cunderlikova B. and Sikurova L. Solvent effects on photophyzical properties of merocyanine 540. Chemical Physics, 2001, 263, p. 415 - 422.

158. Peter Kaschny and Felix M. Goni. The components of merocianine-540 absorption spectra in aqueous, micellar and bilayer enviroments. Eur. J. Biochem., 1992, 207, 1085 - 1091.

159. Garcia D.A. and Perillo M.A. Effects of flunitrazepam on the L-alpha-H(lI) phase transition ofphophatidylethanolamine using merocyanine 540 as a fluorescent indicator. Colloids SurfB Biointerfaces, 2004, 37 (1-2), p. 61.

160. V.O. Stern, M. Volmer, Physik. Zeitschr., 1919, 20, p. 183-188.

161. Chusuke Sato, Jim Nakamura, and Yoshiakd Nakamara. A chemometric approach to the estimation of the absorption spectra of dye probe merocyanine 540 in aqueous and phospholipid environments. J. Biochem., 2000, 127, p. 603-610.

162. Frank Caruso, Edwin Donath, Helmuth Mohwald and Radostina Georgieva. Fluorescence studies of the binding of anionic derivatives ofpyrene and fluorescein to cationic polyelectrolytes in aqueous solution. Macromolecules, 1998, 31 (21), p. 7365-7377.

163. A. Mills. Optical oxygen sensors: utilising the luminescence of platinum metals complexes. Platinum Met. Rev., 1997, 41, 115.

164. W. Trettnak. Optical sensors based on fluorescence quenching, in: O.S. Wolfbeis (Ed.), Fluorescence Spectroscopy, Springer, Berlin, 1992, p. 79.

165. Cheng-Shane Chu, Yu-Lung Lo. Optical fiber dissolved oxygen sensor based on Pt(II) complex and core-shell silica nanoparticles incorporated with sol-gel matrix. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 151 (1), p. 83-89.

166. Martin M.F. Choi, Dan Xiao. Single standard calibration for an optical oxygen sensor based on luminescence quenching of a ruthenium complex. Analytica Chimica Acta, 2000, 403, p. 57-65.

167. A. Sheila Holmes-Smith, Alan Hamill, Michael Campbell and Mahesh Uttamlal. Electropolymerised platinum porphyrin polymers for dissolved oxygen sensing. Analyst, 1999,124, 1463-1466.

168. E. R. Carraway and J. N. Demas, B. A. DeGraff, J. R. Bacon. Photophysics and photochemistry of oxygen sensors based on luminescent transition-metal complexes. Anal. Chem., 1991, 63, 337-342.

169. Liebsch, G„ Klimant, I., Frank, B„ Hoist, G„ Wolfbeis, O.S. Luminescence lifetime imaging of oxygen, pH, 'and carbon dioxide distribution using optical sensors. Applied Spectroscopy, 2000, 54 (4), p. 548-559.

170. Hyung Jin Kim, Yong Chae Jeong, Jong II Rhee. Encapsulation of tris(4,7-diphenyl-l,10-phenanthroline)ruthenium(II) complex linked with dendrons in sol-gels: Stable optical sensing membranes for dissolved oxygen.Talanta, 2008, 76, p. 1070-1076.

171 Fenghong Chu, Haiwen Cai, Ronghui Qu, and Zujie Fang. Dissolved oxygen sensor by using Ru-fluorescence indicator and a U-shaped plastic optical fiber. Chinese Optics Letters, 2008,

6 (6), p. 401-404.

172 Toni A Ruda-Eberenz, Amber Nagy, W. James Waldman and Prabir K. Dutta. Entrapment of ionic tris(2,2 '-bipyridyl) ruthenium(ii) in hydrophobic siliceous zeolite: 02 sensing in biological environments. Langmuir, 2008, 24, p. 9140-9147.

173 D Wencel C. Higgins, A. Klukowska, B. D. Maccraith, C. Mcdonagh. Novel sol-gel derived films for luminescence-based oxygen and pH sensing. Materials Science-Poland, 2007, 25

(3), 767-779.

174 S De Koker, B. G. De Geest, C. Cuvelier, L. Ferdinande, W. Deckers, W. E. Hennink, S. C. De Smedt, N. Mertens. In vivo cellular uptake, degradation, and biocompatibility of polyelectrolyte microcapsules. Advanced Functional Materials, 2007, 17 (18), p. 3754-3763.

175 John P Crow. Dichlorodihydrofiuorescein and dihydrorhodamine 123 are sensitive indicators of peroxynitrite in vitro: implications for intracellular measurement of reactive nitrogen and oxygen species. NITRIC OXIDE: Biology and Chemistry, 1997,1 (2), p. 145-157.

176. Lydia M. Henderson and J. Brian Chappell. Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation? Eur. J. Biochem., 1993, 217, p. 973-980.

177 D. Halozan, U. Riebentanz, M. Brumen and E. Donath. Polyelectrolytemicrocapsules and coated CaC03 particles as fluorescence activated sensors in flowmetry. Colloids Surf., A, 2009, 342, p. 115-121.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своим научным руководителям к.б.н. Шабарчиной Людмиле Ивановне и профессору Глебу Борисовичу Сухорукову за руководство, наставления, неоценимую поддержку и помощь в решении научных проблем и подачу идей, положенных в основу представленной работы.

Благодарю за проведение работ по изучению полиэлектролитных микрокапсул методом трансмиссионной электронной микроскопии, помощь в представлении результатов, консультации зав. Лаборатории Ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН, д.б.н., проф. Мошкова Дмитрия Алексеевича, а также к.б.н. Санталову Ирину Михайловну.

Хочу сказать слова благодарности сотруднику Лаборатории культур клеток и клеточной инженерии ИБК РАН д.ф.-м.н., проф. Киму Юрию Александровичу за обучение

и внимательное отношение.

Выражаю особую признательность к.ф.-м.н Лаборатории Новых методов в биологии ИБП РАН Пермякову Сергею Евгеньевичу за неоценимую помощь в проведении флуоресцентных исследований и множество полезных обсуждений. Благодарю также к.ф.-м.н. Емельяненко Виктора Ивановича за обсуждение результатов работы.

Я благодарна д.б.н. Сабуровой Екатерине Андреевне за помощь в освоении методов математической обработки экспериментальных данных и крайне полезные консультации,

внимательность и поддержку.

Хочется поблагодарить весь коллектив Сектора физической химии биополимеров ИТЭБ РАН за помощь в освоении методов, проведении экспериментов, бесчисленные обсуждения, конструктивную критику, создание комфортных рабочих условий, поддержку увлеченность работой: к.б.н. Дубровского Алексея Владимировича, аспиранта Дурденко Екатерину Владимировну, к.б.н. Клягину Веру Павловну, к.б.н. Тихоненко Сергея Алексеевича, к.ф.-м.н. Цееба Вадима Эгоновича и технолога Алейникову Галину

Александровну.

Выражаю глубокую благодарность своим родным, друзьям и близким за моральную поддержку, терпение и всестороннюю помощь.

и