Эпитопный анализ и исследование иммунохимических свойств тропонина I из сердца человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Филатов, Владимир Львович

• Филатов, Владимир Львович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Филатов, Владимир Львович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Белки тропонинового комплекса и их роль в регуляции мышечного сокращения

Tponomml

Общая характеристика

Участки взаимодействия Tul с актином и ТпС

Участки взаимодействия Tnl с ТпТ

Фосфорилирование Tnl

Физиологический эффект фосфоршшрования Tnl

Тропонин Т

Структура и изоформный состав тропонина Т

Взаимодействие тропонина Т с тропомиозином

Взаимодействие тропонина Т с тропонином 1

Взаимодействие тропонина Т с тропонином С

Роль тропонина Т в процессе регуляции мышечного сокращения

Фосфорилирование тропонина Т

Тропонин С

Общая характеристика и изоформный состав

Пространственное строение ТпС

СООН-концевой домен

Центральная Ot-спираль

ИНг-концевой домен

Молекулярный механизм инициации сокращения. Структурные и функциональные различия скелетной и

сердечной изоформ ТпС

Участки взаимодействия ТпС с остальными компонентами тонкого филамента

Молекулярная модель мышечного сокращения

TnI как биохимический маркер инфаркта миокарда

Моноююнальные антитела и способы определения их эпитопной специфичности

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы

Методы

Твердофазный синтез пептидов на целлюлозной основе

Определение участков взаимодействия антител и Тн1

Моделирование некроза сердечной ткани

Иммунофлуориметрия

ДСН-гель-электрофорез по методу Лэммли (Laemmli, 1970)

Вестерн-блоттинг

Иммупохимическая окраска белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активированной сефарозе

Исследование взаимодействия Тн1 с иммобилизованным ТпС

Фосфорилирование Тн1 сАМР-зависимой протеинкиназой

Определение участков взаимодействия Тн1 с ТпС

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез библиотеки пептидов TnI и эпитопное картирование моноклональных антител

Определение участков взаимодействия TnI с TnC

Изучение биохимических факторов, оказывающих влияние на взаимодействие TnI с антителами

Протеолитическая деградация TnI и ее влияние на связывание с моноклональными антителами

Фосфорилирование TnI сАМР-зависимой протеинкиназой и его влияние на взаимодействие с антителами

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список используемых сокращений

Tnl-Tnl ТпС - ТпС ТпТ - ТпТ

ИП - ингибиторный пептид

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

сАМР - цикло -3'-5'-аденозинмонофосфорная кислота

ПКА - сАМР-зависимая протеинкиназа

ПКС — Са2+-фосфолипод-зависимая протеинкиназа

I1KG - cGMP-зависимая протеинкиназа

cGMP - цикло -3'-5'-гуанозинмонофосфорная кислота

ИМ - инфаркт миокарда

СКМВ - изоформа MB креатинфосфокиназы

ФСБТ- фосфатно-солевой буфер, содержащий Твин-20

ДСН - додецилсульфат натрия

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭГТА - (Этилендиокси)диэтилендинитрилотетрауксусная кислота

ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота

ДТТ-дитиотреитол

МАТ - моноклональные антитела

SРОТ-метод - метод одновременного множественного твердофазного синтеза пептидов на целлюлозной основе

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эпитопный анализ и исследование иммунохимических свойств тропонина I из сердца человека»

Введение

Циклический процесс сокращения-расслабления поперечно-полосатой сердечной и скелетной мускулатуры позвоночных регулируется, как и многие другие процессы в клетке, изменением концентрации ионов Са2+ внутри клетки. В том случае, когда мышца расслаблена, концентрация ионов Са2+ понижена и составляет « 10"7 М. При повышении внутриклеточной концентрации Са2+ до 10"5-10"4 М происходит инициация сокращения. Важнейшую роль в осуществлении Са2+-зависимой регуляции сокращения играет белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц - тропонина И (Тп1), тропонина Т (ТпТ) и ТпС (ТпС), объединенных в эквимолярном соотношении. Тп1 ингибирует взаимодействие актина с миозином в условиях пониженной концентрации Са2+ внутри клетки. ТпС - белок, являющийся сенсором ионов Са2+, при связывании он инициирует цепь конформационных превращений в белках тропонинового комплекса и акгинового филамента, приводящих к деблокированию циклического акто-миозинового взаимодействия. Тп1 и ТпС являются «молекулярными переключателями» процесса мышечного сокращения, точный механизм которого остается до конца невыясненным. Тп1 и ТпС находятся в тесном контакте друг с другом, а характер их взаимодействия изменяется в зависимости от фазы сокращения. Хотя изучение молекулярных механизмов сокращения мышцы продолжается в течение более 30 лет, до сих пор точно не определены участки аминокислотной последовательности Тп1, вовлеченные во взаимодействие с ТпС. В данной работе сделана попытка применить для установления участков контакта этих белков нетипичный метод -исследование библиотеки пептидов одного белка с помощью другого, находящегося в конформации, близкой к нативной. Полученные с помощью этого метода данные в целом подтверждают выводы других исследователей, кроме того, мы описали новый участок взаимодействия сердечных изоформ Тп1 и ТпС, расположенный в N1-концевой части Тп1.

Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время являются самой распространенной причиной смерти в развитых странах. Одним из таких заболеваний является инфаркт миокарда (ИМ), особенностью которого является стремительность развития патологического процесса. Для того, чтобы как можно

раньше начать терапию больного, врач должен располагать точной диагностической информацией о заболевании. В последние годы в диагностике ИМ широко используются некоторые белки клеточного метаболизма и сократительной системы кардиомиоцитов - креатинфосфокиназа, лактатдегидрогеназа, легкие и тяжелые цепи миозина (Keffer, 1996). Врач-кардиолог при постановке диагноза больному руководствуется прежде всего данными биохимических тестов. Однако, до недавнего времени использование биохимических маркеров ИМ было сопряжено со многими трудностями, прежде всего с их недостаточной кардиоспецифичностью. Несколько лет назад английские ученые установили, что увеличение концентрации сердечной изоформы Tnl в сыворотке крови человека свидетельствует о некрозе клеток миокарда (Cummins, 1987). Tnl как биохимический маркер острого инфаркта миокарда обладает рядом уникальных свойств, делающих его лучшим из известных в настоящее время маркеров. В частности, его уникальная кардиоспецифичность и некоторые особенности строения, о которых будет сказано далее, превращают его в уникальный инструмент, с помощью которого врач может поставить диагноз больному с почти стопроцентной достоверностью. Чтобы создать высокочувствительную иммунологическую систему для диагностики ИМ, необходимо не только иметь высокоаффинные антитела, специфичные к сердечной форме Tnl, но и знать участки их взаимодействия с антигеном (эпитопы). Несмотря на то, что исследования Tnl проводятся во многих лабораториях по всему миру, до сих пор неясно, в какой форме белок выделяется в кровь больных с ИМ и как возможная гетерогенность Tnl в крови влияет на достоверность диагноза ИМ. Это приводит к существенным затруднениям при работе с диагностическими системами. Как мы постарались показать в данной работе, на взаимодействие Tnl с моноклональными антителами существенное влияние оказывают по крайней мере два фактора: неспецифический протеолиз Tnl, происходящий в ишемизированном участке сердечной ткани и фосфорилирование Tnl сАМР-зависимой протеинкиназой. Данные факты имеют большое практическое значение при создании новых диагностических систем.

Обзор литературы

Белки тропонинового комплекса и их роль в регуляции мышечного сокращения

Циклический процесс сокращения-расслабления поперечно-полосатой мускулатуры позвоночных контролируется белковым комплексом (Ebashi and Kodama, 1966). Этот комплекс получил название "нативного тропомиозина" (Ebashi and Kodama, 1966). Позднее было показано, что "нативный тропомиозин" может быть разделен на два компонента - тропомиозин и тропонин. Хартшорн и Мюллер продемонстрировали, что тропонин, в свою очередь, может быть разделен по крайней мере на два компонента, которые исследователи назвали тропонинами А и В (Hartshorne and Mueller, 1968). Позднее, Гризер и Гергели (Greaser and Gergely, 1971) разделили белок, названный тропонином, на три субъединицы, названные ими тропонинами I, Т, С. Tnl способен ингибировать АТФазную активность актомиозина. ТпС блокирует ингибирующее действие Tnl, но полное восстановление регуляции мышечного сокращения происходило только в присутствии третьего компонента Тн комплекса -тропонина Т, который способен взаимодействовать с тропомиозином и прикреплять Тн комплекс к актиновому филаменту (Greaser and Gergely, 1971).

Тропонин!

Обииая характеристика

Tnl - белок, осуществляющий ингибирование акто-миозиновой АТФазы в присутствии тропомиозина (Greaser and Gergely, 1971). К настоящему времени описаны три изоформы Tnl в поперечно-полосатой мускулатуре позвоночных - две изоформы в скелетных мышцах (из быстрых и медленных скелетных волокон) и одна изоформа в сердечной мышечной ткани (Syska et. al, 1974, Dhoot et. al, 1978). Tnl состоит из 181-211 аминокислотных остатков, при этом изоформы Tnl сердца имеют больший размер, обусловленный наличием дополнительного приблизительно 30-членного пептида, расположенного в N-концевой части

молекулы белка (Wilkinson and Grand, 1975, Grand et. al, 1976, Wilkinson and Grand, 1978). Tnl - полярный белок с преобладанием положительно заряженных остатков, вследствие этого рассчитанная величина pi составляет «9,9.

Изоформы Tnl кодируются тремя различными генами. Известно, что ген Tnl из сердца человека входит в состав 19-ой хромосомы (MacGeogh et. al, 1991, Bhavzar et. al, 1996) и состоит из 8 зкзонов. Экспрессия генов изоформ Tnl регулируется в зависимости от стадии развития ткани, в которой происходит экспрессия (Gorza et. al, 1993). В сердце зародыша человека экспрессируются как сердечная изоформа белка, так и изоформа из медленных скелетных волокон. После рождения экспрессия скелетно-мышечной изоформы Tnl блокируется, а синтез сердечной изоформы наоборот, стимулируется. Это приводит к тому, что спустя 9 месяцев после рождения в сердце человека экспрессируется только сердечная изоформа белка (Sasse et. al, 1993). Регуляция экспрессии изоформ Tnl происходит на уровне транскрипции, так как изменения количества соответствующих мРНК в клетках миокарда соответствует изменениям количества белка. В противоположность сердцу, в скелетной мышце и в эмбриональном, и в зрелом состояниях экспрессируются лишь скелетно-мышечные изоформы Tnl (Amphlett et. al, 1976).

Как уже отмечалось, главной функцией Tnl является ингибирование АТРазной активности актомиозина (Greaser and Gergely, 1971). Это ингибирование усиливается в присутствии тропомиозина, и полностью снимается в присутствии насыщенного ионами Са2+ TnC (Van Eyk and Hodges, 1988). Таким образом, для понимания механизма функционирования Tnl необходимо подробно проанализировать его взаимодействие с актином, тропомиозином и тропонином С.

Участки взаимодействия Tnl с актином и ТпС.

Для того, чтобы картировать участки Tnl, обеспечивающие его взаимодействие с другими компонентами актинового филамента, Tnl подвергали гидролизу под действием бромциана. Среди фрагментов Tnl скелетных мышц был выявлен пептид, ограниченный остатками 96-116, который сохранял способность интактного белка ингибировать АТРазную активность актомиозина (Syska et. al, 1976). Этот ингибиторный пептид (ИП) подавляет сокращение скинированных скелетных и сердечных мышечных волокон, из которых предварительно был удален

интактный Tnl (Ruegg et. al, 1989, Van Eyk et. al, 1993). Помимо этого ИП сохраняет способность интактного белка взаимодействовать с актином и тропонином С (Syska et. al, 1976). Позднее было установлено, что в структуре Tnl есть еще один дополнительный ингибиторный пептид, ограниченный остатками 140-148 (Tripet et. al, 1997), также способный подавлять АТРазную активность актомиозина. По данным ЯМР первый ингибиторный пептид (остатки 96-116) взаимодействует с остатками 1-7 и 19-44 актина (Levine et. al, 1988), т.е. располагается вблизи участков, обеспечивающих взаимодействие миозина с актином. Положение второго ингибиторного пептида Tnl на молекуле актина остается неизвестным. В литературе отмечают сходство первичных структур двух ингибиторных пептидов Tnl (остатки 101-114 и 121-132) (Pearlstone et. al.,1997). В настоящее время подробно проанализирована роль отдельных аминокислотных остатков в структре первого (главного) ингибиторного пептида Tnl.

Минимальная последовательность, сохраняющая ингибиторные свойства, ограничена остатками 104-115 (Van Eyk and Hodges, 1988, Talbot and Hodges, 1979). Ингибиторные пептиды, полученные из Tnl сердца и скелетных мышц имеют довольно консервативную первичную структуру, тем не менее Tnl скелетных мышц более эффективно ингибирует АТРазную активность актомиозина и сократительную активность скинированных волокон (Talbot and Hodges, 1981b; Ruegg et. al, 1989). Высказывается предположение, что указанное различие обусловлено тем, что в ингибиторном пептиде Tnl сердца есть всего лишь одна неконсервативная замена. В ингибиторном пептиде Tnl скелетных мышц положения 109 и 110 заняты Pro, в то время как в ингибиторном пептиде Tnl сердца гомологичные положения заняты остатками Pro и Thr. Считается, что ингибиторный пептид скелетных мышц 96NQKLFDLRGKFKRPPLRRVRMh6 представляет собой две амфифильных а -спирали, жестко соединенных в виде шпильки дипептидом Рго-109-Рго-110. В случае Tnl сердца две а-спирали ингибиторного пептида обладают большей подвижностью и вследствие этого менее эффективно ингибируют АТРазную активность актомиозина. Синтетический ингибиторный пептид Tnl скелетных мышц с заменой P110G обладает повышенной подвижностью двух а-спиральных участков, что приводит к существенному уменьшению его способности ингибировать АТФазу актомиозина (Van Eyk and Hodges, 1988; Campbell et. al, 1992).

Суммируя, можно заключить, что в структуре Tnl есть как минимум два ингибиторных участка. Оба эти участка имеют щелочную природу, при этом первый (основной) ингибиторный пептид (остатки 96-116) имеет форму шпильки, образованной двумя жестко ориентированными друг относительнот друга а-спиралями. Хотя в настоящее время точная ориентация Tnl относительно актина остается не вполне понятной, нет сомнения в том, что в определенных условиях Tnl может располагаться на участках, обеспечивающих взаимодействие актина с миозином и тем самым блокировать АТРазную активность актомиозина.

Ингибирующий эффект Tnl на АТРазную активность актомиозина заметно усиливается в присутствии тропомиозина (Wilkinson et. al., 1972). Этот факт свидетельствует в пользу прямого взаимодействия Tnl с тропомиозином. Это предположение было подтверждено экспериментальными данными ( Мак, et. al., 1983, Pearlstone and Smillie, 1983), хотя участки взаимодействия Tnl с тропомиозином до сих пор не картированы.

Как уже отмечалось, ингибирующий эффект Tnl может быть обращен под действием ТпС. Это становится возможным потому, что Tnl и ТпС образуют прочный комплекс. При этом в отсутствие Са2+ ингибиторные участки Tnl взаимодействуют с актином, а в присутствии Са2+ эти ингибиторные участки диссоциируют от актина и взаимодействуют с тропонином С. Проанализируем более подробно взаимодействие ТпС и Tnl.

Данные последних лет свидетельствуют о том, что Tnl и ТпС ориентированы антипараллельно друг относительно друга (Farah et. al., 1994, Kobayashi et. al., 1995, Krudy et. al., 1994). При таком расположении первый (главный) ингибиторный пептид Tnl (остатки 96-116) может взаимодействовать как с N-, так и С-концевым глобулярными доменами ТпС (Swenson and Fredricksen, 1982, Pearlstone and Smillie, 1995, Kobayashi et. al, 1995, Kobayashi et. al, 1996, Jha et. al,1996) или располагаться поблизости от центральной а-спирали и С-концевого глобулярного домена ТпС (Cachia et. al, 1983, Ngai et. al, 1994, Leszyk et. al, 1987). (см. Табл.1). Как уже отмечалось, замена в ингибирующем пептиде аминокислотного остатка Рго-110 на Thr или Gly приводит к ослаблению влияния на АТРазную активность актомиозина (Van Eyk and Hodges, 1988, Campbell et. al, 1992). Оказалось, что такая мутация сказывается и на взаимодействии ингибиторного пептида с тропонином С. Интактный ИП увеличивает сродство Са-связывающих участков ТпС, в то время как

пептид с заменой Рго-110-И31у не оказывает влияния на Са-связывающие свойства TnC (Van Eyk et. al., 1991). Таким образом, один и тот же ингибиторный пептид Tnl может в зависимости от условий взаимодействовать как с актином (и ингибировать АТРазу актомиозина), так и с тропонином С (при этом ингибирующий эффект Tnl устраняется).

В настоящее время в литературе накоплены обширные сведения об участках взаимодействия Tnl и ТпС (см. Табл.1). N-концевой участок Tnl взаимодействует с С-концевым глобулярным доменом TnC (Tripet et. al., 1997; Pearlstone et. al, 1997). Первый (главный) ингибиторный пептид Tnl может взаимодействовать как с центральной спиралью ТпС, так и с его N- и С-концевыми глобулярными доменами (Swenson and Fredricksen, 1982, Pearlstone and Smillie, 1995, Kobayashi et. al, 1995, Kobayashi et. al, 1996, Jha et. al,1996; Cachia et. al, 1983, Ngai et. al, 1994, Leszyk et. al, 1987). Наконец, С-концевая часть Tnl (остатки 116-148) взаимодействует с N-концевым доменом ТпС (McKay et. al., 1997; Pearlstone et. al., 1997). В отсутствие Ca2+ TnC слабо взаимодействует с тропонином I, который своими ингибиторными и актин-связывающими участками (96-116, а также возможно 140-148) фиксируется на актине и блокирует АТРазную активность актомиозина. Насыщение Са2+ специфических центров, расположенных в N-концевом домене ТпС, приводит к усилению взаимодействия ТпС с С-концевыми ингибиторными участками Tnl и отсоединению основного ингибиторного участка Tnl (остатки 96-116) от актина. Это приводит к деблокированию АТРазной активности актомиозина.

Описанная модель хорошо объясняет взаимодействия Tnl и ТпС в составе тропонинового комплекса скелетных мышц Как уже отмечалось, первичная структура Tnl и ТпС сердца довольно существенно отличаются от первичной структуры соответствующих компонентов ТпСкелетных мышц В этой связи нельзя исключить того, что в сердце имеются определенные различия во взаимодействии С-концевого фрагмента Tnl с тропонином С (Rarick et. al., 1997).

Описанные модели во многом являются умозрительными и построены на основе опытов, проведенных на делеционных мутантах или протеолитических фрагментах компонентов тропонина. До сих пор нет ренптеноструктурных данных о строении полного тропонинового комплекса или бинарного комплекса TnC-Tnl. С помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния установлено, что в бинарном комплексе Tnl как бы оплетает распрямленную гантелеобразную

молекулу ТпС. При этом центры масс двух белков совпадают, и оба белка располагаются симметрично друг относительно друга (Рис. 1) (Sheng et. al 1992; Olah and Trewhella, 1994; Olah et. al., 1994).

Рис. 1. Модель взаимного расположения Tnl и ТпС в бинарном комплексе. Получена с помощью метода малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (Olah and Trewhella, 1994). Показана молекула ТпС (черным цветом) и оплетающая ее молекула Tnl (серыми точками). Буквами N и С обозначены соответствующие области ТпС, а маленькие буквы с, е и g обозначают одноименные спирали в составе ТпС.

Учитывая антипараллельное расположение полипептидных цепей ТпС и Tnl, такая модель не противоречит всем описанным выше результатам. В то же время

недавно опубликованные данные канадских авторов (Peralstone, Smillie, 1997) свидетельстуют в пользу более компактной упаковки компонентов тропонина. Участки взаимодействия Tnl с ТпТ.

Tnl образует прочный комплекс и с третьим компонентом тропонина -тропонином Т. С использованием методов гель-фильтрации, кругового дихроизма и химических «сшивок» было установлено образование прочного бинарного комплекса Tnl-TnT (Horwitz et. al., 1979, Hitchcock-DeGregori, 1982). Константа связывания Tnl и тропонина Т составляет около 8.5X106 М"1 (Ingraham and Swenson, 1984), причем прочность взаимодействия этих компонентов тропонина зависит от степени восстановленности SH групп остатков Cys-48 Cys-64 Tnl (Chong, Hodhges, 1982, Herwitz et. al., 1979). Принимая во внимание тот факт, что удаление первых 57 аминокислотных остатков Tnl приводит к потере способности взаимодействовать с тропонином Т (Sheng et. al., 1992), а также учитывая, что в бинарном комплексе ТпТ изменяет доступность Lys-70 Tnl взаимодействию с модифицирующим реагентом (Hitchcock-De-Gregori, Chong and Hodges, 1982), можно заключить, что N- концевая область Tnl принимает участие во взаимодействии с тропонином Т в бинарном комплексе. С помощью метода химического «сшивания» было установлено, что и в полном тропониновом комплексе Tnl и ТпТ находятся поблизости друг от друга (Hitchcock, 1975, Gusev and Friedrich, 1980), причем в полном тропониновом комплексе прочность взаимодействия Tnl и тропонина Т зависит от концентрации Са2+ . Есть основания предполагать, что взаимодействие Tnl с тропонином Т осуществляется за счет образования двойной (Farah and Reinach, 1995, Stefancsik et. al., 1998) а-суперспирали, в формировании которой принимают участие остатки 53-106 тропонина! и остатки 205-255 тропонина Т (Farah and Reinach, 1995). Таким образом, по всей видимости, участок взаимодействия с тропонином Т располагается между остатками 40-96 Tnl, т.е. оказывается как бы зажатым между участками, ограниченными остатками 1-40 и 96-148 Tnl, и участвующими в его взаимодействии с тропонином С (Farah and Reinach, 1995). Такое расположение участков взаимодействия делает возможной передачу конформационного сигнала, индуцированного связыванием Са2+ с тропонином С через Tnl на ТпТ (Farah and Reinach, 1995) и тропомиозин. Таким образом, Tnl занимает центральное положение в составе тропонинового комплекса и контактирует со всеми компонентами тропонина, тропомиозином и актином.

фосфорилирование Tnl

Белок-белковые взаимодействия в тропонин-тропомиозиновом комплексе не только находятся под контролем ионов Са2+, но могут модулироваться путем фосфорилирования Tnl. При этом фосфорилирование особенно характерно для Tnl сердца.

В условиях in vitro Tnl может фосфорилироваться тремя протеинкиназами -Са-фосфолипид-зависимой протеинкиназой (протеинкиназой С, ПКС), cGMP-зависимой протеинкиназой (протеинкиназой G, nKG) и сАМР-зависимой протеинкиназой (протеинкиназой А, ПКА). Ноланд и Kyo (Noland and Kuo, 1991) установили, что нефракционированный препарат ПКС способен фосфорилировать изолированный Tnl из сердца быка или Tnl в составе полного тропонинового комплекса, при этом фосфорилированию подвергаются остатки Ser-144. Позднее та же группа авторов установила, что ПКС способна фосфорилировать еще остатки Ser-43, Ser-45, а также Ser-23 и Ser-24 (Noland et. al 1995). Более подробное исследование, проведенное в лаборатории Kyo (Jideama et. al.,1996, Noland et. al., 1997), показало, что различные изоформы ПКС фосфорилируют различные участки в структуре Tnl. Так, Х-изоформа ПКС предпочтительно фосфорилирует остатки Ser-43 и Ser-45 (а также Ser-23 и Ser-24). ос и е-изоформы ПКС в основном фосфорилируют остатки Ser-43 и Ser-45 Tnl, а £-изоформа ПКС фосфорилирует Tnl с низкой эффективностью. В литературе нет единого мнения о том, каким образом фосфорилирование Tnl под действием ПКС влияет на регуляторные свойства тропонинового комплекса. По ранним данным лаборатории Kyo (Noland and Kuo, 1991) фосфорилирование Tnl ПКС приводит к уменьшению АТФазной активности актомиозина без существенного изменения зависимости АТФазной активности актомиозина от концентрации Са2+ . Недавняя работа Такеиши с соавторами, исследовавшими влияние повышенной экспрессии гена, кодирующего 02 изоформу РКС, на Са-чувствительность сокращения перфузированных сердец трансгенных мышей, свидетельствует, что фосфорилирование Tnl этой изоформой РКС приводит к уменьшению Са-чувствительности сокращения (Takeishi et. al., 1998). При добавлении форболового эфира или стимуляции а-1 рецепторов кардиомиоцитов крысы (т.е. при воздействиях, стимулирующих ПКС) наблюдается

фосфорилирование Tnl по тем же участкам, которые фосфорилировались ПКС in vitro (Venema and Kuo, 1993). Это может означать, что катализируемое ПКС фосфорилирование Tnl будет уменьшать АТФазную активность миофибрилл. В то же время перфузия сердец морской свинки растворами, содержащими агонисты а1 адренорецепторов или форболовые эфиры, не сопровождалась увеличением фосфорилирования Tnl (Edes, Kranias, 1990, Talosi, Kranias 1992). Таким образом, если обнаруженная in vitro способность ПКС фосфорилировать Tnl реализуется in vivo, то следствием этого процесса будет уменьшение АТФазной активности миофибрилл и, по всей видимости, уменьшением силы сердечных сокращений.

Как уже отмечалось, Tnl может фосфорилироваться cGMP-зависимой и сАМР-зависимой протеинкиназами. В условиях in vitro обе протеинкиназы фосфорилируют одни и те же остатки (Ser-23, Ser-24) в структуре Tnl (Swiderek et. al 1990, Sulakhe and Vo, 1995), при этом сАМР-зависимая протеинкиназа фосфорилирует Tnl как в условиях in vitro (Cole and Perry, 1975), так и в условиях in vivo (England, 1977). Фосфорилирование Tnl ПКА приводит к тому, что сократительный аппарат становится менее чувствительным к ионам Са2+ и полумаксимальная АТФазная активность миофибрилл или полумаксимальное натяжение развиваются при более высоких концентрациях Са2+ (Wattanapermpool et. al., 1995, McConnel et. al., 1997, Malhotra et. al., 1997). Этот эффект, по всей видимости, является следствием того, что фосфорилированный Tnl с меньшим сродством взаимодействует с тропонином С (Al-Hillawi et. al., 1995). Вследствие ослабления взаимодействия Tnl перестает влиять на сродство катион-связывающих центров ТпС к ионам Са2+ и поэтому уменьшается сродство регуляторных центров ТпС к ионам Са2+ (Robertson et. al 1982). В последние годы эти предположения были проверены с помощью методов молекулярной биологии. Установлено, что замена интактного Tnl на мутантный белок, в котором Ser-23 и Ser-24 заменены на остатки Asp, сопровождается уменьшением Са-чувствительности сократительного аппарата (Dohet et. al., 1995). Другими словами, введение отрицательных зарядов (будь то P-Ser или Asp) в положения 23 и 24 Tnl существенно ослабляет связывание Са2+ тропонином С. Такой эффект может быть связан с тем, что фосфорилирование приводит к значительным изменениям структуры Tnl. Действительно, на коротком пептиде (остатки 17-32 Tnl) установлено, что фосфорилирование Ser-23, 24 приводит к крупным конформационным перестройкам (Quirl et al, 1995). Неудивительно, что

фосфорилирование влияет на параметры флуоресценции метки, связанной с пятым остатком Tnl, т.е. влияет на структуру белка вблизи центров фосфорилирования (Dong et. al., 1997b). Значительно больший интерес представляют данные о том, что фосфорилирование Ser23, Ser-24 приводит к глобальным изменениям структуры всей молекулы Tnl. Действительно, фосфорилирование интактного Tnl под действием ПКА сопровождается уменьшением расстояния между флуоресцентной меткой, закрепленной вблизи N-конца Tnl, и остатком Тгр, расположенным на С-конце молекулы белка (Dong et. al., 1997а). Более того, фосфорилирование влияет на флуоресценцию меток, закрепленных в центральной и С-концевой частях Tnl, т.е. в участках, контактирующих с центральной а-спиралью и N-концевым регуляторным доменом TnC (Dong et. al., 1997с). Поэтому неудивительно, что фосфорилирование Ser-23, 24 ослабляет взаимодействие Tnl с тропонином С и влияет на параметры связывания Са2+ N-концевым регуляторным доменом ТпС. Имеются данные о том, что фосфорилирование под действием ПКА влияет не только на взаимодействие Tnl с тропонином С, но и на взаимодействие Tnl с актином (Al-Hillawi et al., 1995). Суммируя представленные данные, можно заключить, что Tnl может фосфорилироваться ПКА и ПКС по остаткам Ser-23, Ser-24 и это фосфорилирование уменьшает чувствительность сократительного аппарата к ионам кальция.

Физиологический эффект Фосфорилирования Tnl.

На протяжении многих лет предпринимались попытки установить причинно-следственные связи между фосфорилированием Tnl и изменением сократительной активности сердца под действием различных гормонов. Хорошо известно, что ß-адренэргическая стимуляция приводит к увеличению силы сердечных сокращений (т.н. положительный инотропный эффект) и увеличению частоты сердечных сокращений (положительный хронотропный эффект) (Kaumann et. al., 1996, Kogler and Ruegg, 1997). Активация ß1 и ß2 адренорецепторов сопровождается увеличением активности аденилатциклазы и, соответственно, увеличением активности ПКА. При этом возрастает степень фосфорилирования Tnl, белка С, а также фосфоламбана (активатора Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума) (Sulakhe and Vo, 1995, Kaumann and Molenaar, 1997). Стимуляция a1-адренорецепторов в присутствии блокаторов ß-рецепторов будет сопровождаться увеличением фосфоинозитидного обмена и активацией ПКС. Высказывается

предположение, что замедление ненагруженных сокращений сердца, вызванное агонистами а1 -адренэргических рецепторов может быть связано с фосфорилированием Tnl ПКС (Strang, Moss, 1995). Аденозиновые А1 рецепторы ингибируют аденилатциклазу. Возможно, вследствие этого стимуляция аденозиновых рецептров сопровождается уменьшением степени фосфорилирования Tnl, белка С, а также фосфоламбана и фосфолеммана (Neuman et al., 1995, Vahlensiek et. al, 1995) и уменьшением силы и частоты сердечных сокращений. Было бы серьезным упрощением связывать изменение характера сердечных сокращений только с фосфорилированием Tnl. Действительно, амплитуда и частота сокращений сердца будут определяться с одной стороны чувствительностью сократительного аппарата к ионам Са2+ (т.е. будут зависеть от фосфорилирования Tnl ПКА и, возможно, ПКС), а с другой стороны будут определяться амплитудой колебаний концентрации Са2+ в миоплазме (т.е. будут зависеть от входа Са2+ через Са-каналы сарколеммы и Са-каналы саркоплазматического ретикулума и скорости удаления Са2+ из миоплазмы). Функционирование Са-транспортирующих систем может регулироваться путем фосфорилирования фосфоламбана и фосфолеммана (Kranias and Solaro, 1983). Таким образом, сократительная активность сердца будет зависеть от координированного фосфорилирования как регуляторных белков миофибрилл (Tnl и белка С), так и мембранных белков (фосфоламбан, фосфолемман, Са-каналы).

В настоящее время нет сомнений, что фосфорилирование Tnl играет важную роль в регуляции сократительной активности сердца. Неудивительно, что при различных патологических состояниях отмечены изменения в степени фосфорилирования этого белка. Увеличение Са-чувствительности сократительного аппарата, наблюдаемое при сердечной недостаточности человека, сопровождается уменьшением степени фосфорилирования Tnl (Bodor et. al, 1997). Изменение сократительной активности сердечной мышцы после инфаркта миокарда также сопровождается уменьшением фосфорилирования Tnl (Li et. al., 1997). При некоторых формах артериальной гипертензии у крыс отмечен повышенный уровень фосфорилировапия Tnl сердца ПКА (McConnel et. al, 1997). Наконец, ухудшение сократительных свойств миокарда, наблюдаемое при инсулин-зависимом диабете у крыс сопровождается уменьшением степени фосфорилирования Tnl (Lui et. al., 1996). К сожалению, в настоящее время трудно установить однозначные причинно-

следственные связи между той или иной патологией и степенью фосфорилирования Тп1. Однако нет сомнения, что фосфорилирование Тп1 под действием различных протеинкиназ может существенным образом отражаться на сократительной активности сердца.

Таблица 1 Участки взаимодействия Тп! и ТпС.

Участки в Участки в Видовая и Источник

структуре Тп1 структуре ТпС тканевая

(остатки (остатки спеиифичность

аминокислот) аминокислот используемых

белков

96-116 89-100 Скелетные мышцы Ьевгуке^ а!., 1988

кролика Ьевгуке^ а!., 1987

92-167 (1_уз- 46-78 Скелетные мышцы Ьеэгуке^ а!., 1990

105, 1_уз-107) кролика

96-145, 58-81, Участок не Скелетные мышцы КоЬауаэЫ е1. а1.,

1-40 определен кролика 1995

96-116 М-и С-концевые Скелетные мышцы КоЬауавЫ е1 а1.,

глобулярные кролика 1995

домены Эу/уепзоп апс!

РгесИскэеп, 1992

ГагаЬ е1 а1., 1994

Реаг^опе апс!

втНПе, 1995

Лпае1 а1., 1996

132-141 Суэ-12 Скелетные мышцы КоЬауаэЫ е1 а1.,

113-121 Суз-57 кролика 1991

108-113 СуБ-89 КоЬауаэЫ е1 а1.,

103-111 СуБ-98 1994

103-182 Участок не Скелетные мышцы РагаИ е1 а1., 1994

определен кролика

96-116 С-концевой глобулярный домен в присутствии Мд2+; М- и С-концевые глобулярные Домена в присутствии Са2+ Скелетные мышцы кролика Тэис^а е! а1., 1992

96-116 С-концевой глобулярный Домен (Суэ-Эв) Скелетные мышцы кролика 1_ап е1 а1., 1992

96-116 Суз-98 Скелетные мышцы Ьевгуке^ а1., 1988

103-110 кролика [.евгуке^ а\., 1987

Су в 133 Суз-98 Скелетные мышцы кролика 0оЬго7оГзку е1 а1., 1984

104-115 СуБ-98 Скелетные мышцы кролика С1юг1д апс! Нос1де8, 1981 Таое1 а1., 1986

104-115 154-159 РИе-102, РИе-151 Скелетные мышцы кролика Ыда! е1 а1., 1994

33-80 МеМ20, 137, Сердечная мышца КгиЬу а1., 1994

32-211 157 С-концевой домен и N1-концевая часть центральной ос- крысы

81-211 спирали М-концевой

домен и центральная а-спираль

1-116 117-148 С-концевой домен N-концевой домен Скелетные мышцы кролика Pearlstone et. al., 1997

116-131 N-концевой домен Скелетные мышцы кролика Tripetet. al., 1997

104-115 84-94 Скелетные мышцы кролика Kobayashi et. al., 1996

Тшпшш.Т.

Структура и изоформный состав тоопонина Т.

ТпТ - компонент тропонинового комплекса, который взаимодействует с тропомиозином и играет важную роль в регуляции мышечного сокращения (Fisher et. al., 1995, Potter et. al., 1995). В настоящее время определена первичная структура тропонина Т из сердца быка (Leszyk et. al., 1987), сердца (Pearlstone et. al., 1986) и скелетных мышц кролика (Pearlstone et. al., 1976), сердца человека (Mesnard et. al., 1993) и других источников. В большинстве мышц ТпТ представлен в виде нескольких изоформ (Pearlstone et. al., 1986, Leszyk et. al., 1987, Tobacman and Lee, 1987, Pan and Potter, 1992, Jin et. al., 1992). Изоформы тропонина T возникают вследствие наличия нескольких генов тропонина Т (Heywood, et. al., 1983) и альтернативного сплайсинга пре-м-РНК (Cooper and Ordahl, 1985, Greig et. al., 1994, Anderson et. al., 1995, Breitbart et. al., 1985). Ген тропонина T имеет в составе несколько экзонов, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу, поэтому для скелетных мышц крысы теоретически возможно существование 128 изоформ тропонина Т, различающихся по аминокислотной последовательности (Breitbart et. al., 1985). Интересно, что схема альтернативного сплайсинга первичного РНК-транскрипта различна для тропонина Т из разных источников

(Townsend et. al., 1995) и зависит от стадии развития. Так Купер и Ордал (Cooper and Ordahl, 1985) установили, что в сердце цыпленка присутствуют 2 изоформы тропонина Т. Во время раннего эмбриогенеза в сердце цыпленка экспрессируется одна изоформа сердечного тропонина Т (назовем ее ради удобства «первой»). Перед вылуплением в сердце цыпленка обнаруживается уже две изоформы тропонина Т(«первая» и «вторая»), а в сердце курицы присутствует только «вторая» изоформа тропонина Т. Любопытно, что «первая» изоформа сердечного тропонина Т обнаруживается не только в сердце, но и в скелетной мышце эмбриона цыпленка.

Переключение экспрессии изоформ сердечного тропонина Т в зависимости от стадии онтогенеза характерно и для человека. В сердце человека обнаружено 4 изоформы тропонина Т, 3 из которых экспрессируются в сердце эмбриона человека, а одна характерна только для сердца взрослого человека (Anderson et. al., 1995). При сердечной недостаточности наблюдается ре-экспрессия эмбриональных изоформ тропонина Т как на уровне информационной РНК (Anderson et. al., 1995), так и на белковом уровне (Anderson et. al., 1991, Anderson et. al., 1995, Solaro et. al., 1993).

Для тропонина T характерно неравномерное распределение аминокислотных остатков вдоль аминокислотной последовательности. При этом N-концевая часть последовательности обогащена кислыми, а С-концевая часть - основными аминокислотными остатками. Подобное распределение заряженных аминокислотных остатков вдоль молекулы тропонина Т обуславливает склонность тропонина Т к агрегации в растворах с физиологическими концентрациями солей (Potter et. al., 1995).

По данным электронной микроскопии молекула тропонина Т в изолированном состоянии и в составе тонкого (актин-тропомиозинового) филамента имеет форму запятой или палочки, лежащей в канавке спирали актина и вытянутой вдоль филамента. Длина молекулы тропонина Т скелетных мышц составляет приблизительно 185 A (Ohtsuki and Nagano, 1982, Flicker et. al., 1982). Из-за наличия дополнительных аминокислотных остатков в N-концевой области сердечная изоформа тропонина Т на 20 А длиннее изоформы из скелетных мышц (Cabral-Lilly et. al., 1991).

Взаимодействие тропонина Т с тропомиозином

Грезер и Гергели в 1971 году впервые показали, что ТпТ способен взаимодействовать с тропомиозином (Тм) (Greaser and Gergely, 1971). В дальнейшем взаимодействие этих двух белков подвергалось всестороннему исследованию. В структуре ТпТ выявлено два тропомиозин-связывающих центра. Один участок ограничен остатками 1-158, а другой находится ближе к С-концу молекулы и ограничен остатками 159-259 (Мак and Smillie, 1981, Pearlstone and Smillie, 1981). Взаимодействие N-концевого химотриптического пептида тропонина Т (т.н. Т1 фрагмент, остатки 1-158) с Тм не зависит от концентрации ионов Са2+ (Pearlstone and Smillie, 1983). Более короткий участок, ограниченный остатками 71151, также взаимодействует с тропомиозином, но это взаимодействие более слабое, чем в случае фрагмента Т1 (Pearlstone and Smillie, 1978, Fisher et. al., 1995). Этот факт свидетельствует в пользу того, что остатки 1-70 тропонина Т играют существенную роль во взаимодействии с тропомиозином. С таким выводом согласуются данные Уайта и соавт. (White et. al., 1987) и Бриссона и соавт. (Brisson et. al., 1986), отводящим остаткам 1-70 тропонина Т важную роль во взаимодействии с тропомиозином. В то же время ТпТ, лишенный первых 45 остатков, взаимодействует с тропомиозином со сродством, сопоставимым со сродством интактного тропонина Т (Pan et. al., 1991), а короткий пептид тропонина Т, ограниченный остатками 1-70, не способен напрямую взаимодействовать с тропомиозином (Pearlstone and Smillie, 1977). Взаимодействие тропонина Т с Тм сильно ослабевает при удалении участка, содержащего остатки 70-150 ТпТ и мало зависит от наличия в структуре тропонина Т фрагментов, ограниченных остатками 1 -69 или 151-158 (Fisher et. al., 1995). Вероятно, основным Са2+-независимым участком взаимодействия тропонина Т с Тм является фрагмент 71-151. Фрагмент тропонина Т1 (остатки 1-151 тропонина Т) взаимодействует с участком, расположенным поблизости от С-конца димера тропомиозина (Мак and Smillie, 1981) и перекрывают область контакта двух димеров тропомиозина, соединенных между собой по принципу «голова-к-хвосту». С этим заключением согласуются данные Бриссона и соавт. (Brisson et. al., 1986), которые методом ЯМР установили, что пептид тропонина Т, ограниченный остатками 1-158, контактирует с остаткми 1-10 тропомиозина.

Взаимодействие участка тропонина Т, ограниченного остатками 159-259, с тропомиозином зависит от концентрации ионов Са2+ (Pearlstone and Smillie, 1983). Тропониновый комплекс, в состав которого вместо интактного тропонина Т включен пептид 159-259 тропонина Т, способен осуществлять Са-зависимую регуляцию мышечного сокращения подобно нативному тропониновому комплексу (Schaertl et. al., 1995). Пептид тропонина Т, ограниченный остатками 159-259, содержит в своем составе как бы два тропомиозин-связывающих центра, оба из которых располагаются вблизи от Cys-190 тропомиозина. Один из этих тропомиозин-связывающих центров, ограниченный остатками 228-259 (или 243-259) тропонина Т взаимодействует только с тропомиозином, а второй участок, ограниченный остатками 159-222 (или 156-227) обеспечивает взаимодействие тропонина Т не только с тропомиозином, но и с тропонином С ( Мак and Smillie, 1981; Chong and Hodges, 1982; Tanokura et. al., 1983). Участок аминокислотной последовательности тропонина Т, ограниченный остатками 159-227, содержит консервативные гептадные повторы гидрофобных аминокислотных остатков (Zot and Potter, 1987). Аналогичные гептадные повторы характерны и для структуры тропомиозина. Высказывается предположение, что ТпТ и димер тропомиозина формируют тройную суперспираль типа coiled-coil, стабилизированную гидрофобными взаимодействиями (Parry, 1981, Мак and Smillie, 1981). Любопытно отметить, что этот участок молекулы тропонина Т может также взаимодействовать с тропонином С (Tanokura et. al., 1983) и может быть химически «пришит» к Cys-190 тропомиозина, при этом вероятность «сшивания» возрастает в присутствии Са2+ (Chong and Hodges., 1982).

Таким образом, в структуре тропонина Т есть три тропомиозин-связывающих центра. N-концевой участок тропонина Т (остатки 1-159) обеспечивает Са-независимое взаимодействие с С-концом одного и N-концом другого димера тропомиозина. Второй участок, ограниченный остатками 156-227, может образовывать тройную суперспираль с тропомиозином и контактировать с тропонином С. Наконец, третий участок, ограниченный остатками 227 (243)-259, так же как второй центр, контактирует с тропомиозином вблизи Cys-190. Взаимодействие второе и третьего центров тропонина Т с тропомиозином зависит от концентрации Са2+.

Взаимодействие тропонина Т с тропонином I.

С-концевая часть тропонина Т, ограниченная остатками 159-259, принимает участие во взаимодействии тропонина Т с двумя другими компонентами тропонинового комплекса (Pearlstone and Smillie, 1978, 1980, 1981). В условиях in vitro вне зависимости от концентрации Са2+ ТпТ взаимодействует с тропонином I с константой связывания 8.5 х 106 М"1 (Ingraham and Swenson, 1984). Вначале предполагалось, что во взаимодействии с тропонином I участвует фрагмент тропонина Т, ограниченный остаткми 1-70 (Pearlstone, Smillie, 1980). Позднее было установлено, что это взаимодействие неспецифично (по всей видимости, имеет электростатическую природу) и не наблюдается при физиологической концентрации соли (Pearlstone, Smillie, 1983). Данные последних лет свидетельствуют о том, что участок связывания с Tnl располагается в С-концевой части тропонина Т и может включать в себя остатки 176-230 (Chong and Hodges, 1982), остатки 152-175 (Pearlstone and Smillie, 1978) или, наконец, остатки 202-259 (Jha et. al., 1996) тропонина Т. Участок, включающий в себя 100 С-концевых аминокислотных остатков тропонина Т, взаимодействует с фрагментом Tnl, ограниченным остатками 41-96, при этом по всей видимости важная роль принадлежит остаткам Cys-48 и Cys-64 Tnl, потому что окисление или модификация этих остатков ослабляют взаимодействие Tnl с тропонином Т (Chong and Hodges, 1982).

Как уже отмечалось, для аминокислотной последовательности тропонина Т, ограниченной остатками 197-250, так же как для фрагмента Tnl, содержащего остатки 57-106, характерна склонность к образованию спирали и наличие гептадных повторов гидрофобных аминокислот. Высказывается предположение, что ТпТ может взаимодействовать со своими белками-партнерами - тропомиозином и тропонином I - путем образования тройных спиралей типа coiled-coil (Pearlstone and Smillie, 1985, Farah and Reinach, 1995, Stefancsik et. al., 1998).

Взаимодействие тропонина T с тропонином С

В литературе нет единого мнения о взаимодействии тропонина Т с тропонином С. В ранних исследованиях, проведенных с помощью метода химического «сшивания», не было обнаружено «сшивок» тропонина Т и ТпС в

составе полного тропонинового комплекса (Sutoh and Matsuzaki, 1980) или доля такого рода комплексов была очень мала (Gusev and Friedrich, 1980). В то же время при очистке компонентов ТпСердца оказалось, что ТпС соочищается с тропонином Т (Gusev et. al., 1983, Katrukha et. al, 1995), в определенных условиях ТпС сорбируется на иммобилизованном тропонине Т (Верин и Гусев, 1988) и ТпТ влияет на реакционную способность определенных групп ТпС (Hitchcock et. al., 1981). Опыты, проведенные на протеолитических фрагментах компонентов тропонина (Grabarek et. al., 1981) и с помощью бифункциональных реагентов (Leszyk et. al., 1988) свидетельствуют о том, что участки взаимодействия ТпС и тропонина Т располагаются вблизи Cys-98 ТпС скелетных мышц и в С-концевой области тропонина Т. Считается, что ТпС взаимодействует с участком, ограниченным остатками 159-259 (Pearlstone and Smillie, 1983) или 176-230 (Chong and Hodges, 1982) тропонина Т. По всей видимости, главная роль во взаимодействии с тропонином Т принадлежит N-концевому глобулярному домену и центральной спирали ТпС (остатки 1-100) (Grabarek et. al., 1981, Farah and Reinach, 1995), поэтому неудивительно, что ТпТ влияет на реакционную способность Lys-37, расположенного в N-концевой части ТпС (Hitchcock et. al., 1981).

Роль тропонина Т в процессе регуляции мышечного сокращения

Суммируя представленные данные, можно заключить, что асимметричная вытянутая молекула тропонина Т, имеющая форму запятой (Flicker et. al., 1982), обеспечивает контакт компонентов ТпС тропомиозином и актином. При этом С-концевая глобулярная часть тропонина Т взаимодействует с тропомиозином (вблизи Cys-190), компонентами тропонина и актином. Вытянутая N-концевая часть тропонина Т формирует «хвостик» запятой, имеет вариабельную первичную структуру из-за альтернативного сплайсинга коротких экзонов, расположенных в этой части молекулы и взаимодействует с С-концом одного димера тропомиозина и N-концом другого (соседнего) димера тропомиозина (Brisson et. al, 1986). Вследствие этого ТпТ может влиять на взаимодействие двух соседних димеров тропомиозина и процессы полимеризации тропомиозина (Tobacman and Lee, 1987), а также на взаимодействие тропомиозина с актином (Fisher et. al., 1995). Установлено, что тропониновый комплекс, в состав которого входит мутантный ТпТ,

лишенный первых 150 остатков, оказывает заметно меньшее влияние на взаимодействие тропомиозина с актином, чем тропониновый комплекс, содержащий интактный TnT (Fisher et. al., 1995). Как уже отмечалось, для N-концевой части тропонина Т (ограниченной остатками 1 -70) характерна повышенная вариабельность, обусловленная альтернативным сплайсингом коротких экзонов, расположенных в этой части молекулы (Breitbart et. al., 1985). В этой связи следует отметить, что в различных типах мышечных волокон имеется четкая корреляция между синтезом определенных изоформ тропомиозина и тропонина Т, которые, по всей видимости, наилучшим образом соответствуют друг другу и обеспечивают правильную упаковку актинового филамента (Schachat et. al., 1985).

TnT не только обеспечивает прикрепление компонентов тропонина к актин-тропомиозиновому филаменту. Данные последних лет свидетельствуют о том, что TnT играет важную роль в регуляции АТРазы актомиозина. Добавление тропонина Т к комплексу Tnl-TnC приводит к более глубокому ингибированию АТРазы актомиозина в отсутствие Са2+ и, наоборот, к повышению АТРазной активности актомиозина в присутствии Са2+ (Farah et. al., 1994). Высказывается предположение о том, что активирующий эффект тропонина Т обусловлен его прямым взаимодействием с тропонином С в составе полного тропонинового комплекса (Potter et. al., 1995).

В литературе довольно долго дискутировался вопрос о прямом взаимодействии тропонина Т с актином (Katayama, 1980, Heeley and Smillie, 1988). Результаты последних лет свидетельствуют в пользу того, что С-концевая часть тропонина Т помимо взаимодействия с другими компонентами тропонина может напрямую контактировать с актином (Dahiya et. al., 1994). При этом, если в отсутствие Са2+ тропонин-тропомиозиновый комплекс закрепляется на актиновом филаменте за счет Tnl, то в присутствии Са2+ , когда контакты Tnl с актином ослабевают, прикрепление тропонин-тропомиозинового комплекса к актину обеспечивается за счет тропонина Т (Dahiya et. al., 1994).

ФосФорилирование тропонина Т

Учитывая важную роль, выполняемую тропонином Т в тропониновом комплекса, можно предположить, что даже незначительные пострансляционные

изменения тропонина Т могут оказать существенное влияние на регуляцию сократительной активности мышц. Установлено, что ТпТ может фосфорилироваться несколькими протеинкиназами как в изолированном состоянии, так и в составе полного тропонинового комплекса.

В скелетных и сердечных мышцах был обнаружен фермент, получивший название ТпТ киназа (Добровольский с соавт., 1976, Гусев с соавт., 1978, Gusev et. al, 1980, Villar-Palasi and Kumon., 1981). Этот фермент с высокой скоростью фосфорилирует как изолированный ТпТ, так и ТпТ в составе полного тропонинового комплекса, перенося остаток фосфата на Ser-1 (Gusev et. al., 1980, Villar-Palasi and Kumon., 1981). TnT-киназа подробно охарактеризована, установлено, что она относится к группе казеин-киназ второго типа (Добровольский и соавт. 1981, Risnik and Gusev, 1984). Важно отметить, что ТпТ, выделенный из скелетных мышц, содержит до 0,8 молей фосфора на моль белка, при этом остаток фосфата в основном связан с Ser-1 (Pearlstone et. al., 1976). В этой связи можно заключить, что тропонинТ киназа, по всей видимости, действительно принимает участие в фосфорилированиии тропонина Т in vivo. К сожалению, до сих остается непонятной физиологическая роль фосфорилирования тропонина Т по Ser-1. Установлено, что фосфорилирование ТпТ киназой не влияет на катион-связывающие свойства тропонинового комплекса (Dobrovol'skij and Gusev, 1982). Можно только предполагать, что фосфорилирование Ser-1 тропонина Т каким-то образом оказывает влияние на его взаимодействие с тропомиозином или сказывается на скорости обмена тропонина Т (Гусев, 1986).

Киназа фосфорилазы фосфорилирует как изолированный ТпТ, так и ТпТ в составе полного тропонинового комплекса (England et. al., 1979). Высокоочищенные препараты киназы фосфорилазы фосфорилируют остатки Ser-149-150 и/или Ser-156-Ser-157 (Moir et. al., 1977) и не способны фосфорилировать Ser-1 тропонина Т (Risnik, et. al., 1980).

Са-фосфолипид-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа С, ПКС) также фосфорилирует ТпТ скелетных и сердечных мышц (Mazzei and Kuo, 1984). В условиях in vitro протеинкиназа С фосфорилирует Thr-171 изолированного тропонина Т скелетных мышц (Risnik, et. al., 1987), а также Thr-190, 199 и 200 в тропонине Т сердца (Noland and Kuo, 1989). Любопытно отметить, что Thr-171 тропонина Т гомологичен Thr-199 тропонина Т сердца, при этом фосфорилирование

Thr-199 ингибируется при встраивании тропонина Т в состав полного тропонинового комплекса (Noland and Kuo, 1989). Этот факт является косвенным подтверждением того, что в С-концевой части тропонина Т располагаются участки взаимодействия с другими компонентами тропонина. Дальнейшие исследования показали, что нефракционированный препарат протеинкиназы С преимущественно фосфорилирует Thr-280, т.е. остаток характерный только для тропонина Т сердца (Noland and Kuo, 1993). Работы последних лет, выполненные на изолированных изоформах протеинкиназы С, показали, что изоформы фермента сильно отличаются по тому, какие участки они фосфорилируют в структуре тропонина Т. Так, а, (3 и s-изоформы РКС модифицируют остатки Thr-190, 199, 280 и Ser-194 в составе аминокислотной последовательности тропонина Т из сердца быка, а ^-изоформа РКС фосфорилирует два пока неиндентифицированных остатка в структуре тропонина Т (Jideama et. al., 1996). Различные изоформы РКС отличаются по внутриклеточной локализации и механизму регуляции ферментативной активности (Nishizuka, 1995). Поэтому можно предположить, что различные изоформы протеинкиназы С, способные фосфорилировать несколько участков в структуре тропонина Т и Tnl избирательно и очень тонко влияют на регуляцию сократительной ативности сердца и скелетных мышц. Фосфорилирование тропонина Т сердца а-изоформой протеинкиназы С приводит к уменьшению максимальной АТРазной активности актомиозина и уменьшению ее чувствительности к ионам Са2+ (Jideama et. al., 1996). Наоборот, фосфорилирование тропонина Т сердца С-изоформой протеинкиназы С приводит к некоторому увеличению чувствительности АТРазной аткивности актомиозина к ионам Са2+ и не влияет на максимальную АТРазную активность актомиозина (Jideama et. al., 1996). Предполагается, что описанный эффект может быть связан с тем, что фосфорилированный ТпТ с меньшим сродством взаимодействует с комплексом актин-тропомиозин (Noland and Kuo, 1992) или с тем, что после фосфорилирования ТпТ каким-то образом замедляет освобождение продуктов реакции из активного центра миозина (Mehegan and Tobacman, 1991).

Степень фосфорилирования тропонина Т по Ser-1 мало меняется при стимуляции скелетных мышц, при этом скорость обмена фосфата, связанного с Ser-1 очень мала. Поэтому можно предположить, что фосфорилирование, катализируемое TnT-киназой играет скорее всего какую-то структурную роль. В

отличие от этого обработка кардиомиоцитов форболовым эфиром сопровождается увеличением степени фосфорилирования тропонина Т (Liu et. al., 1989). В этой связи можно предположить, что фосфорилирование тропонина Т протеинкиназой С может влиять на сократительные свойства сердца, индуцируемые гормонами, влияющими на активность протеинкиназы С (Gwathmey and Hajjar, 1990).

ТропднинС

Общая характеристика и изоформный состав

ТпС (ТпС) - компонент тропонинового комплекса, который осуществляет инициацию мышечного сокращения в ответ на увеличение концентрации ионов Са2+ внутри клетки. Данный белок принадлежит к семейству Са-связывающих белков, некоторые из которых выполняют в основном роль хранилищ Са, а другие, как ТпС и кальмодулин, - регуляторную роль (Ikura, 1996). Большинство регуляторных Са-связывающих белков содержат несколько консервативных участков аминокислотной последовательности, координирующих ионы Са2+. В настоящее время определена первичная структура ТпС из скелетных мыщц кролика (Collins et. al., 1973), курицы (Wilkinson, 1976), из сердечной мышечной ткани быка (Van Eerd and Takahashi, 1975) и из других источников. Существуют тканеспецифичные изоформы ТпС - из быстрых скелетно-мышечных волокон и из медленных/сердечных мышечных волокон (Van Eerd and Takahashi, 1975, Tobacman, 1996). Аминокислотная последовательность ТпС обогащена кислыми аминокислотными остатками и отличается высокой степенью гомологии, особенно в области катион-связывающих участков. Эти участки построены по типу а-спираль-петля-а-спираль (Strynadka and James, 1989, Гусев, 1995). ТпС содержит 4 таких мотива, причем два сайта присоединяют ионы Са2+ с высокой аффинностью и могут присоединять также и ионы Мд2+, а другие два сайта присоединяют лишь ионы Са2+ с низкой аффинностью (Potter and Gergely, 1975).

Пространственное строение ТпС

Исследование кристаллов полностью насыщенного ионами Са2+ ТпС из скелетных мышц кролика методом рентгеноструктурного анализа позволило

установить, что в структуре белка четко выделяются два глобулярных домена, соединенных длинной а-спиралью (Рис 1) (НоибивБе е1. а1., 1997).

Рис 2. Кристаллическая структура 4Са2+-ТпС из скелетных мышц кролика

(Houdusse et. al., 1997). Рисунок получен с помощью программы RasMol (Sayle and

Milner-White, 1995)

Таким образом, ТпС в кристаллическом состоянии имеет гантелевидную форму. Каждый из доменов ТпС содержит по два Са2+-связывающих участка, N-концевой домен содержит низкоаффинные сайты, а С-концевой-высокоаффинные. Исследования структуры ТпС в растворе, проведенные с применением метода трехмерного гетероядерного протонного магнитного резонанса, показали, что в растворе ТпС также имеет гантелевидную форму, однако а-спираль, соединяющая структурно независимые домены ТпС, разупорядочена в центральной своей части. Это означает, что оба домена ТпС соединены весьма гибким линкером и могут принимать почти любые положения друг относительно друга в пространстве (Рис 2) (Slupsky and Sikes, 1995).

Рис 3. Структура 4Са2+-ТпС в растворе (Slupsky and Sikes, 1995). Видна неупорядоченная структура центральной а-спирали. Рисунок получен с помощью программы программы RasMol (Sayle and Milner-White, 1995).

Действительно, недавние данные японских ученых, исследовавших кристаллическую структуру комплекса ТпС с фрагментом Tnl 1-47, говорят о том, что центральная спираль ТпС в таком комплексе согнута под углом 90°, а оба домена ТпС сближены и взаимодействуют между собой (Vassylyev et. al., 1998). Более ранние данные также говорят о существовании функциональной взаимосвязи между глобулярными доменами ТпС (Tsalkova and Privalov, 1985, Swenson and Fredricksen, 1992). Однако, no данным Ола и Трухилла, которые исследовали структуру ТпС в комплексе с Tnl в растворе используя метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, ТпС в таком комплексе находится в вытянутой конформации, похожей на ту, которую этот белок принимает при кристаллизации (Olah and Trewhella, 1994). Очевидная противоречивость экспериментальных данных указывает на то, что ТпС принимает различную конформацию в зависимости от условий эксперимента. Конформация, принимаемая тропонином С в кристаллическом состоянии, достаточно далека от нативной, в то время как исследования структуры белка методом протонного магнитного резонанса позволяют получить наиболее достоверную информацию о нативной структуре ТпС.

В структуре катион-связывающего мотива спираль-петля-спираль непосредственно в координации иона Са2+ участвует 12-членная петля, остатки в положениях 1,3,5,7,9 и 12. Ион Са2+ координируется семью лигандами (12-й

аминокислотный остаток Glu - бидентатный лиганд), его координационная сфера представляет собой пентагональную бипирамиду. В качестве лигандов выступают карбонильные и карбоксильные атомы кислорода аминокислотных остатков, а также атомы кислорода молекул воды. Первичная структура катион-связывающей петли консервативна, особенно консервативны аминокислотные остатки Asp и Glu в положениях 1 и 12 соответственно, так как они участвуют не только в координации иона металла, но и в поддержании целостности структуры петли за счет образования водородных связей (Strynadka and James, 1989, Babu et. al., 1992). Нужно заметить, что ТпС сердца содержит две аминокислотные замены в положениях 1 и 3 первой Са2+-связывающей петли, а также вставку аминокислотного остатка во входящей a-спирали первой катион-связывающей петли. Эти изменения приводят к тому, что первый центр ТпС сердца не способен связывать ионы Са2+, то есть сердечный белок присоединяет 3 моль Са2+ на моль белка, а не 4, как скелетная изоформа ТпС (Van Eerd and Takahashi, 1975). Эта особенность строения возможно отвечает за отличия в механизме регуляции сердечной мускулатуры по сравнению со скелетной. Рассмотрим более подробно структуру ТпС.

СООН-кониевой домен

В этом домене расположены два катион-связывающих домена, которые связывают ионы Са2+ с высоким сродством - 2X107 M"1, а также ионы Мд2+ с более

в <4

низким сродством - 2X10 M (Potter and Gergely, 1975). Когда мышца находится в расслабленном состоянии, концентрация ионов Мд2+ внутри клетки много выше, чем ионов Са2+, поэтому С-концевые катион-связывающие сайты оказываются занятыми ионами Мд2+. Кинетические исследования показали, что константа скорости диссоциации ионов Мд2+ из С-концевых сайтов (Koff=8 с1) мала по сравнению с промежутком времени между нервным импульсом, инициирующим сокращение, и собственно сокращением («15мс), поэтому замены ионов Мд2+ на Са2+ в течение периода сокращения не происходит (Johnson et. al., 1979). Предполагают, что С-концевой домен ТпС играет в основном структурную роль, обеспечивая целостность тропонинового комплекса и участвуя в закреплении его на тонком филаменте (Potter and Gergely, 1975, Szczesna et. al., 1996, Malnic et. al., 1998). Используя метод сайт-направленного мутагенеза, Негеле с соавторами показали, что мутантная форма

скелетного ТпС, в которой С-концевые катион-связывающие сайты были инактивированы путем аминокислотной замены в положении 1 3-го и 4-го сайта, способна при встраивании в скинированные мышечные волокна, из которых предварительно был удален эндогенный ТпС, регулировать мышечное сокращение. Однако мутант ТпС гораздо слабее взаимодействовал с миофибриллами, чем нативный белок (Negele et. al., 1992). Интересно, что тогда как Негеле с соавторами не обнаружили функционального различия между 3 и 4 Са2+-связывающими сайтами сердечной изоформы ТпС, более поздние исследования (Szczesna et. al., 1996) позволили выделить 3-й сайт скелетного ТпС как наиболее важный с точки зрения поддержания структурной целостности Тн комплекса. Различия в функциональной важности С-концевых сайтов сердечного ТпС отмечались также и другими исследователями (Brito et. al., 1993). Присоединение ионов Са2+ к N- и С-концевым катион-связывающим центрам приводит к различным изменениям в структуре соответствующих доменов: насыщение ионами Са2+ С-концевых сайтов ведет к образованию короткой р-складки между катион-связывающими петлями. В N-концевом домене такая р-скпадка существует в ненасыщенном состоянии (Brito et. al., 1993). Вообще говоря, инактивация обоих С-концевых доменов при замене инвариантных аминокислотных остатков приводит к глобальному изменению структуры ТпС, из чего следует, что эти сайты играют ключевую роль в поддержании целостности структуры этого белка (Szczesna et. al., 1996).

Центральная a-спиоаль

В силу того что домены ТпС, выполняющие структурную и функциональную роли, обособлены и соединены лишь длинной а-спиралью, высказывалось предположение, что эта структура может выполнять функции информационного коннектора (Sundaralingam et. al., 1985). С целью проверки этой гипотезы был синтезирован ТпС, в первичной структуре которого аминокислотный остаток Gly, расположенный в середине центральной спирали, был заменен на остаток Pro. Можно было ожидать, что такая замена приведет к сильному изгибу спирали и отрицательно отразится на функциональных свойствах ТпС . Однако, свойства мутантного белка были практически такими же, как и нативного (Reinach and Karlsson, 1988). Дальнейшие исследования функциональных особенностей центральной спирали показали, что удаление 7 аминокислотных остатков из

центральной части спирали приводило лишь к небольшому ослаблению способности ТпС активировать АТРазную активность актомиозина в реконструированной системе (Xu and Hitchcock-DeGregori, 1988). В лаборатории Бабу с соавторами были получены делеционные мутанты ТпС из скелетных мышц кролика, в первичной структуре центральной a-спирали которых были удалены от 3 до 12 аминокислотных остатков. Оказалось , что мутантные белки с делециями 7 и даже 9 остатков были способны регулировать натяжение скинированных волокон. Связывание ионов Са2+ мутантными ТпС, у которых центральная a-спираль была укорочена на 11-12 остатков, не отличалось от соответствующих свойств нативного белка, хотя такие мутанты не были способны регулировать натяжение скинированных мышечных волокон. Интересно, что белок с делецией 12 остатков при встраивании в скинированные волокна в присутствии ионов Са2+ мог образовывать димеры и становиться достаточно эффективным регулятором сократительной активности (Babu et. al., 1993). С одной стороны, центральная а-спираль ТпС может быть укорочена на 2 витка без видимого ухудшения его функциональных свойств, с другой стороны, дальнейшее укорочение линкера между двумя глобулярными доменами ведет к их чрезмерному сближению в пространстве, что делает невозможным регуляцию сократительной активности одной молекулой ТпС. Недавние результаты, полученные в лаборатории Хитчкок-ДеГрегори, свидетельствуют о том, что замена аминокислотного остатка Asp-89 на Ala, а также замена целой a-спирали на последовательность, образующую неупорядоченный клубок, или даже на полипролиновую последовательность не приводила к сильному изменению Са2+-связывающих свойств мутантного белка, хотя его регуляторные свойства были потеряны (Ramakrishnan and Hitchcock-DeGregori, 1996). Если предположить, что ТпС взаимодействует с белком-мишенью подобно калмодулину, то есть область контакта образована обоими доменами белка, а центральная часть оказывается согнутой под углом порядка 90° (Crivici and Ikura, 1995), становится понятным, почему изменение длины центральной спирали до определенного предела не играет роли. Достаточно гибкий линкер, соединяющий два глобулярных домена, может адаптироваться к изменению своей длины путем изгибания. Эта гипотеза недавно получила экспериментальное подтверждение - группа японских ученых, исследуя кристаллическое строение комплекса TnC-фрагмент Tnl, обнаружила, что ТпС в кристалле присутствует в согнутой конформации (Vassylyev

et. al., 1998). Взаимодействие TnC с белком-мишенью, то есть с Tnl, приводит к частичному разрушению вторичной структуры центральной а-спирали на участке аминокислотной последовательности, ограниченном остатками 84-91 (Houdusse et. al., 1997). Таким образом, при образовании комплекса TnC-Tnl по-видимому, происходит сгибание центральной а-спирали, позволяющее обоим доменам ТпС вступать в контакт с белком-мишенью. Сближение двух глобулярных доменов ТпС, происходящее при взаимодействии с Tnl, детектировалось также по изменению флуоресценции пробы, ковалентно присоединенной к аминокислотному остатку Cys-98, расположенному в С-концевом домене. При этом насыщение низкоаффинных N-концевых катион-связывающих сайтов ТпС ионами Са2+ приводило к изменению параметров флуоресценции пробы, расположенной в С-концевом домене ТпС (Grabareket. al., 1986).

NHy-KOHueeod домен

N-концевой домен содержит два катион-связывающих сайта, связывающих только ионы Са2+ с константой аффинности «1X105 М"1 (Potter and Gergely, 1975). Предположение о регуляторной роли этих сайтов в процессе мышечного сокращения высказывалось еще Поттером и Гергели в 1975 году на основании исследования зависимости активности акто-миозиновой АТРазы от концентрации ионов Са2+ при фиксированных концентрациях ионов Mg2+ (Potter and Gergely, 1975). В дальнейшем эта гипотеза получила многочисленные экспериментальные подтверждения и в настоящее время общепринята (Гусев, 1995, Grabarek et. al., 1992, Farah and Reinach, 1995, Tobacman, 1996). Меньшая по сравнению C-концевыми сайтами TnC аффинность N-концевых сайтов к ионам Са2+ может быть объяснена иной первичной структурой Са2+-связывающих петель (Houdusse et. al., 1997). Так, в третьем положении Са2+-связывающих петель 1 и 2 ТпС расположены аминокислотные остатки Gly-31 (петля 1) и Ser-67 (петля 2), тогда как в 3 и 4 Са2+-связывающих петлях в соответствующем положении расположены остатки аспарагиновой кислоты (Houdusse et. al., 1997). Кроме того, N-концевой домен ТпС содержит дополнительный спиральный участок - так называемую N-спираль, которая играет важную роль в стабилизации структуры всего домена, так как ее удаление путем сайт-направленного мутагенеза приводит к уменьшению сродства

катион-связывающих центров к Са2+ и к ослаблению активирующих свойств мутантного ТпС при его включении в состав скинированных мышечных волокон (Smith et. al., 1994, Chandra et. al., 1994). Особенно важным с функциональной точки зрения является аминокислотный остаток Arg-11 в составе N-спирали. Этот остаток образует солевые мостики с остатками Glu-16 и Glu-76, расположенными в составе

I-го и 2-го катион-связывающих сайтов соответственно. Методом сайт-направленного мутагенеза был сконструирован ТпС с аминокислотной заменой Arg-

II->А1а, при этом наблюдалось изменение вторичной структуры центральной а-спирали ТпС и потеря его регуляторных свойств (Gulati et. al., 1995). Различия в первичной структуре являются предпосылкой для появления различий во вторичной и третичной структурах N- и С-концевых доменов ТпС. С-концевой домен гораздо более стабилен в насыщенном ионами состоянии, тогда как N-концевой домен -напротив, в апо-состоянии (Fujisawa et. al., 1989, Houdusse et. al., 1997).

Недавние исследования, посвященные установлению последовательности событий, происходящих при присоединении ионов Са2+ к N-концевым регуляторным катион-связывающим сайтам, позволили установить, что сайты 1 и 2 различаются по сродству к ионам Са2+ (Li et. al., 1995). Эти исследования проводились на полученном методом генной инженерии изолированном N-концевом домене ТпС (остатки 1-90), при этом авторы не смогли определить, какой из сайтов обладает большей аффинностью, и, следовательно, присоединяет ионы Са2+ в первую очередь. Дальнейшие эксперименты, проведенные в этой же лаборатории, привели к выводу о том, что катион-связывающий сайт 2 превосходит по аффинности сайт 1. Недавно полученные данные исследования структуры изолированного N-концевого домена скелетного ТпС в 2Са2+-состоянии объясняют эффект разного сродства 1 -го и 2-го катион-связывающих центров к ионам Са2+. Как оказалось, в составе 1 -го сайта в координации иона металла участвуют две молекулы воды (в положениях 5 и 9 петли), а в составе 2-го сайта - лишь одна - в положении 9. К тому же в составе 1-ой катион-связывающей петли присутствуют три идущих подряд аминокислотных остатка глицина, что уменьшает общий отрицательный заряд петли и придает ее структуре дополнительную гибкость (Strynadka et. al., 1997). При инициации мышечного сокращения ионы Са2+ присоединяются сначала по сайту 2, индуцируя при этом лишь слабые конформационные изменения в структуре N-концевого домена ТпС, в то же время происходит «подготовка» сайта 1 к насыщению Са2+.

Второй ион Са2+, присоединяемый сайтом 1, вызывает крупные конформационные перестройки - движение комплекса спиралей ВС относительно спиралей NAD и экспонирование гидрофобного «кармана», располагавшегося внутри N-концевого домена. Ключевую роль в этом процессе играет аминокислотный остаток Glu-41, находящийся в положении 12 второй катион-связывающей петли. При связывании иона Са2+ по первому сайту происходит движение этого остатка на расстояние порядка 8 А (по другим данным, на «4 А), инициирующее движение спиралей (Gagne et. al., 1997) Отмеченное авторами влияние одного катион-связывающего домена на другой является причиной наблюдаемого другими исследователями кооперативного характера Са2+-зависимой активации мышечного сокращения. Характерно, что эффект кооперативности приписывается именно взаимодействию N-концевых Са2+-связывающих доменов (Negele et. al., 1992).

Молекулярный механизм иниииаиии сокращения. Структурные и функциональные различия скелетной и сердечной изоФорм ТпС

После того как были получены первые данные о кристаллической структуре скелетного ТпС в 2Са2+-состоянии, когда только С-концевые катион-связывающие сайты были насыщены ионами металла, (Herzberg and James, 1985), на основании гомологии первичной структуры и различий в пространственном строении N- и С-концевых доменов ТпС была построена молекулярная модель конформационных перестроек, происходящих при насыщении ТпС ионами Са2+, впоследствии названная моделью Херцберга-Моулта-Джеймса (Herzberg et. al., 1986). Согласно этой модели, строение N-домена идентично строению С-домена, а наблюдаемые различия обусловлены лишь наличием или отсутствием ионов Са2+. При насыщении N-домена ионами Са2+ происходит изменение углов между осями спиралей А, В и C,D, то есть движение комплекса спиралей ВС относительно спиралей NAD. Это движение сопровождается открытием гидрофобного «кармана», образованного соответствующими аминокислотными остатками, расположенными на внутренней стороне спиралей В, С, и D, которые в апо-состоянии укрыты от контакта с внешней средой. Эти гидрофобные аминокислотные остатки, также как полярные остатки, расположенные на внешней стороне спиралей, образуют зону контакта ТпС с фрагментом 116-131 Tnl (McKay et. al., 1997). Данное взаимодействие,

происходящее при увеличении концентрации Са2+ во внутриклеточной среде, приводит к ослаблению связи двух ингибиторных участков Tnl с актином и взаимодействию последнего с миозином (Tripet et. al., 1997).

Модель Херцберга-Моулта-Джеймса получила многочисленные экспериментальные подтверждения, полученные с применением методов генной инженерии. Так, мутации Val-45->Thr, Met-46-»Gln, Met-48->Ala, Leu-49->Thr, Met-82->Gln в первичной структуре TnC из скелетных мышц птиц теоретически должны привести к облегчению перехода конформации N-домена ТпС из закрытого состояния в открытое вследствие того, что такие аминокислотные замены сопровождаются понижением гидрофобности внутреннего «кармана». Действительно, при исследовании свойств такого мутантного белка было установлено, что он обладает повышенным сродством Са2+-специфических центров к ионам Са2+ (da Silva et. al., 1993). В структуре ТпС из скелетных мышц птиц в отсутствие ионов Са2+ остаток Glu-57, локализованный в спирали С, расположен поблизости от остатка Glu-88, который находится в составе спирали D. Согласно модели Херцберга-Моулта-Джеймса расстояние между этими двумя остатками должно увеличиваться при связывании Са2+ N-концевыми катион-связывающими центрами. Мутация Glu-57^Lys или Glu-88->Lys изменяет заряд одного из остатков пары и приводит к тому, что между ними возникает притяжение, вследствие чего затрудняется удаление спирали С от спирали D. В полном согласии с теорией, мутантный белок обладал пониженным сродством к ионам Са2+ и менее эффективно регулировал натяжение скинированных волокон (Fujimori et. al., 1990). Вторым экспериментом, подтвердившим правильность модели Херцберга-Моулта-Джеймса, является опыт по направленному мутированию остатков, расположенных внутри гидрофобного «кармана», в остатки цистеина. В лаборатории Гергели был получен ТпС из скелетных мышц кролика с тройной мутацией Gln-48-^Cys, Gln-82->Cys, Cys-98-»Leu. В последовательности ТпС эндогенный остаток Cys был заменен на лейцин, а остатки в положении 48 (линкер между спиралями В и С) и и 82 (спираль D) были заменены на Cys. Окисление SH-групп белка приводило к образованию дисульфидной связи между остатками 48 и 82 и иммобилизации спиралей В и С относительно спирали D. Согласно модели Херцберга-Моулта-Джеймса, окисление должно было приводить к уменьшению способности связывать Са2+ по

регуляторным центрам мутантного белка и к ослаблению его регуляторных свойств. Действительно, оказалось что мутантный ТпС характеризовался пониженным сродством к ионам Са2+ и не был способен к регуляции АТРазной активности актомиозина (Grabarek et al., 1990). Прямое доказательство изменения положения в пространстве спиралей ВС относительно комплекса NAD было получено с применением метода модификации определенных остатков ТпС из скелетных мышц кролика флуоресцирующими группами и последующего измерения параметров флуоресценции белка при изменении концентрации ионов Са2+. В последовательность ТпС были введены две мутации: остатки Ser-12 (спираль А) и Thr-49 (линкер между спиралями В и С) были заменены на остатки Cys, к которым затем прикреплялась флуоресцентные пиреновые группы. Модифицированный таким образом ТпС был практически неотличим по своим функциональным свойствам от нативного белка. Расстояние между пиреновыми группами увеличивалось на 13 А при насыщении регуляторных сайтов ТпС ионами Са2+. Таким образом бало доказано, что при насыщении регуляторных Са2+-связывающих сайтов ТпС происходит физическое движение спиралей ВС относительно центральной спирали (Wang et. al., 1992).

Хотя первичная структура ТпС из скелетных и сердечных мышечных волокон высокогомологична, существующие отличия сконцентрированы в аминоконцевой области последовательности белка и обуславливают серьезные структурные и функциональные отличия тканеспецифичных изоформ ТпС. Вследствие вставки аминокислотного остатка в N-спирали и замен консервативных остатков в положениях 1 и 3 первой катион-связывающей петли сайт 1 не способен связывать ионы Са2+ (Van Eerd and Takahashi, 1975). Сердечный ТпС эффективно регулирует сократительную активность сердечных мышечных волокон, поэтому наиболее вероятно, что Са2+-зависимая регуляция сердечного сокращения зависит от насыщения ионами металла сайта 2. Для проверки этого предположения был сконструирован мутантный ТпС сердца, в котором остаток Glu-65 был заменен на Ala. Такая аминокислотная замена приводит к полной инактивации сайта 2. Мутантный белок не был способен связывать ионы Са2+ по второму катион-связывающему центру и не мог регулировать натяжения скинированных мышечных волокон (Sweeney et. al., 1990). Таким образом было однозначно показано, что связывание Са2+ по второму катион-связывающему центру необходимо для

проявления тропонином С его регуляторных свойств. Другой мутантный белок с активированным первым Са2+-связывающим центром был способен регулировать натяжение скинированных мышечных волокон и его свойства были подобны свойствам скелетной изоформы TnC (Sweeney et. al., 1990). На основании исследования мутантов скелетного ТпС, в которых либо первый, либо второй Са2+-связывающие участки инакгивировались путем введения аминокислотных замен в критические положения катион-связывающей петли, был сделан вывод, что оба N-концевых Са2+-связывающих сайта необходимы для регуляции сократительной активности. Тот факт, что ТпС сердца был способен функционировать, имея один Са2+-связывающий сайт , объяснялся различием в структуре N-концевых доменов сердечного и скелетного TnC (Sheng et. al., 1990, Liu et. al., 1994). Для проверки данного предположении в лаборатории Гулати с соавторами были получены несколько мутантных форм ТпС: скелетная изоформа белка с заменами консервативных аминокислот, делающими невозможным связывание ионов Са2+ по 1-му катион-связывающему центру, и химерные ТпС, в которых части N-концевого домена сердечной изоформы белка присоединялись к остальной части скелетного ТпС. В первом случае мутант не регулировал натяжение скинированных мышечных волокон, в то время как химерный белок был полностью активен (Gulati et. al., 1992). Работа Гулати с соавторами полностью подтверждает сформулированное выше предположение о том, что скелетная и сердечная изоформы ТпС отличаются друг от друга не только по первичной структуре первого катион-связывающего центра, но и по структуре всего аминоконцевого домена. Различия в процессах функционирования изоформ ТпС подтверждаются также исследованиями Патки с соавторами, изучавших влияние окисления эндогенных SH-групп сердечного ТпС на функциональную активность белка. Известно, что нативный ТпС содержит два остатка цистеина в положениях 35 и 84. Окисление этих остатков приводит к образованию внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. Формирование внутримолекулярной S-S связи приводит к появлению Са2+-независимой регуляторной активности ТпС, хотя катион-связывающие свойства белка остаются неизменными. На основании этих наблюдений авторами был сделан вывод , что образование дисульфидных связей приводит к формированию пространственной структуры ТпС, подобной той, какую этот белок принимает при насыщении регуляторных Са2+-связывающих сайтов ТпС ионами металла (Putkey et. al., 1993).

% X

41 ' ' , ...

Недавние наблюдения исследователей из группы Сайкса, изучавших роль остатка 61и-41 в изменении конформации ТпС при насыщении его ионами Са2+, привели их к заключению, что сайт 1 сердечного ТпС, будучи неспособным к координации иона Са2+, тем не менее взаимодействует с Са2+-насыщенным сайтом 2, то есть активно участвует в регуляторном процессе (□ е1 а1., 1997).

Наибольшее различие в механизме функционирования между сердечным и скелетным ТпС заключается в конформации 1М-концевого домена ТпС сердца в насыщенном ионами Са2+ состоянии. Структура изолированного 1Ч-концевого домена ТпС из сердца человека (БругасороиЬз е1 а1., 1997) и интактного белка из сердца курицы (Эгё е1 а1., 1997) в Са2+-насыщенном состоянии практически не отличается от апо-структуры ТпС. Это достаточно неожиданное наблюдение, так как свидетельствует, что в структуре регуляторного домена сердечного ТпС не происходит изменений, вызванных насыщением его катион-связывающих центров ионами металла. 1Ч-концевой домен сердечного ТпС остается в «закрытой» конформации при присоединении ионов Са2+. Гидрофобные аминокислотные остатки скелетного ТпС, которые экспонируются растворителю при насыщении его Ы-домена Са2+ - это А1а-25, Уа1-45, МеМб, Не-61, Ме*-81 и Ме^82 фгупайка е1 а1., 1997). Увеличения доступности растворителю гомологичных остатков в структуре сердечного ТпС (А1а-23, \/а1-44, МеМ5, Ме^бО, Ме1-80, Ме1-81) не происходит (БругасороиЬб е1 а1., 1997). Отсутствие перехода Ы-концевого домена сердечного ТпС из закрытой конформации в открытую при присоединении ионов Са2+ является прецедентом для регуляторных Са2+-связывающих белков, так как критерием отличия регуляторных от буферных Са2+-связывающих белков как раз и является изменение конформации белка, происходящее при насыщении регуляторных сайтов ионами металла (1кига, 1996). С этой точки зрения сердечный ТпС является уникальным белком, так как его ключевая роль в регуляции сердечного сокращения неоспорима, и в то же время е

Недавние наблюдения исследователей из группы Сайкса, изучавших роль остатка С1и-41 в изменении конформации ТпС при насыщении его ионами Са2+, привели их к заключению, что сайт 1 сердечного ТпС, будучи неспособным к координации иона Са2+, тем не менее взаимодействует с Са2+-насыщенным сайтом 2, то есть активно участвует в регуляторном процессе (Ы е1 а1., 1997).

Наибольшее различие в механизме функционирования между сердечным и скелетным ТпС заключается в конформации 1Ч-концевого домена ТпС сердца в насыщенном ионами Са2+ состоянии. Структура изолированного 1Ч-концевого домена ТпС из сердца человека (вругасороЫоз е1 а\., 1997) и интактного белка из сердца курицы (81а е^ а1., 1997) в Са2+-насыщенном состоянии практически не отличается от апо-структуры ТпС. Это достаточно неожиданное наблюдение, так как свидетельствует, что в структуре регуляторного домена сердечного ТпС не происходит изменений, вызванных насыщением его катион-связывающих центров ионами металла. М-концевой домен сердечного ТпС остается в «закрытой» конформации при присоединении ионов Са2+. Гидрофобные аминокислотные остатки скелетного ТпС, которые экспонируются растворителю при насыщении его 1Ч-домена Са2+ - это А1а-25, \/а1-45, МеМб, Не-61, 1\/И-81 и Ме^82 (в1гупас1ка е1 а1., 1997). Увеличения доступности растворителю гомологичных остатков в структуре сердечного ТпС (А1а-23, \/а1-44, МеМ5, Ме1-60, МеМЗО, Ме1-81) не происходит (БругасороЫоз е1 а1., 1997). Отсутствие перехода !М-концевого домена сердечного ТпС из закрытой конформации в открытую при присоединении ионов Са2+ является прецедентом для регуляторных Са2+-связывающих белков, так как критерием отличия регуляторных от буферных Са2+-связывающих белков как раз и является изменение конформации белка, происходящее при насыщении регуляторных сайтов ионами металла (1кига, 1996). С этой точки зрения сердечный ТпС является уникальным белком, так как его ключевая роль в регуляции сердечного сокращения неоспорима, и в то же время его третичная структура не претерпевает сколько-нибудь заметных изменений при связывании Са2+ по регуляторным сайтам. Вероятным объяснением данного противоречия может служить предположение Сиа с соавторами, которые считают, что «открытие» структуры 1М-концевого домена может происходить после контакта с Тп1 (81а е1 а1., 1997). В пользу этого предположения свидетельствуют данные Круди с соавторами, наблюдавшими изменение окружения остатка Ме1-81 ТпС сердца при контакте последнего с

сердечным Тп1 (Кгис1у е1 а1., 1994). Возможно также, что ведущую роль во взаимодействии ТпС с Тп1 играют не контакты гидрофобных остатков, а электростатические взаимодействия - известно, что заряженные остатки сосредоточены в основном на поверхности 1Ч-концевого домена и для контакта с ними не требуется «открытия» структуры ТпС. Сродство Тп1 и ТпС в скелетных волокнах в 4 раза больше, нежели в сердечных (Ыао е! а1., 1994), поэтому сердечный ТпС может осуществлять более тонкую настройку процесса мышечного сокращения, чем скелетный ТпС.

В заключение нужно сказать, что хотя детали процесса регуляции сердечного сокращения неизвестны, очевидно, что ключевое событие этого процесса -взаимодействие ТпС с Тп1 - осуществляется по-иному нежели в скелетных мышечных волокнах.

Участки взаимодействия ТпС с остальными компонентами тонкого сЬиламента

Участки контакта ТпС с другими компонентами тропонинового комплекса -тропонином И и тропонином Т - уже были описаны выше в соответствующих разделах, но, вероятно, стоит повториться и обрисовать общую картину. Взаимодействие ТпС с ТпТ затрагивает N-концевой домен ТпС, точнее, участок, ограниченный остатками 1-100, (Grabarek et. al., 1981) и играет важную роль как в укреплении Tnl и ТпС на тонком филаменте, так и, возможно, в регуляции мышечного сокращения (Potter et. al., 1995). Взаимодействие ТпС с Tnl является важнейшим с точки зрения инициации мышечного сокращения при возрастании концентрации ионов Са2+ внутри клетки. Участки контакта этих двух белков неидентичны в зависимости от присутствия или отсутствия ионов Са2+. Аминокислотные остатки, со стороны ТпС принимающие участие в таком взаимодействии включают как полярные, так и неполярные аминокислотные остатки, расположенные практически по всей последовательности этого белка (Рис. За, Табл. 1).

151 159 227

■»»ШММ ^^^^^^^ Тм

N С

Cys-190

Рис. За Схема, иллюстрирующая расположение участков контакта белков тонкого филамента друг с другом. Цифрами обозначены аминокислотные остатки, ограничивающие участки взаимодействия.

Мышечного сокращения

Суммируя изложенные выше данные, попытаемся обрисовать гипотетическую молекулярную модель сокращения скелетной мускулатуры. Согласно общепринятой модели сокращения, ингибирование взаимодействия актина с миозином в условиях пониженной концентрации ионов Са2+ («10"7 М) происходит путем стерического блокирования участка актина, с которым взаимодействует глобулярная часть головки миозина. Эту блокировку осуществляет длинная палочковидная молекула тропомиозина (Тм), контактирующая с семью мономерами актина. Удерживание тропомиозина на месте происходит за счет взаимодействия определенных участков молекулы Tnl с актином. Вследствие того, что компоненты тропонинового комплекса тесно взаимодействуют друг с другом и жестко закреплены на акгин-тропомиозиновом филаменте через взаимодействие ТпТ-Тм и ТпТ-актин, молекула тропомиозина удерживается в ингибиторной позиции (Fisher et. al., 1995). При увеличении внутриклеточной концентрации Са2+ до 10"5 - 10"4 М происходит

насыщение катион-связывающих сайтов Ы-концевого регуляторного домена ТпС с последующим открытием гидрофобного «кармана», при этом сродство ингибиторных участков молекулы Тп1 к актину уменьшается, а к М-домену ТпС, напротив, увеличивается. Происходит движение в пространстве части молекулы Тп1, направленное от актина к ТпС (Тао е1 а1., 1989, 1990). Жестко прикрепленная к тропониновому комплексу молекула тропомиозина также передвигается, освобождая участок на молекуле актина для взаимодействия с миозином. Данные недавних исследований вносят некоторые уточнения в вышеописанную схему. В частности, были определены участки Тп1, осуществляющие ингибирующее воздействие на актин-Тм. По данным Трипет с совторами, ингибиторные районы Тп1 ограничены остатками 96-115 и 140-148 (РисЗ) (7пре1 е1 а1., 1997).

В отсутствие ионов Са2+ два участка первичной структуры Тп1 контактируют с ТпС: фрагмент 1-40 (с С-концевым доменом ТпС) и фрагмент 116-131 (с 1Ч-концевым доменом ТпС). Участки аминокислотной последовательности 96-115 и 140-148 контактируют с акгином-тропомиозином, осуществляя ингибиторное воздействие на акто-миозиновую АТРазу. При увеличении концентрации Са2+ внутри клетки происходит насыщение регуляторных сайтов ТпС ионами металла, приводящее, как уже говорилось ранее, к экспонированию гидрофобного участка поверхности 1М-концевого домена ТпС и к изменению его взаимодействия с тропонином I. С С-концевым доменом ТпС при этом контактирует «ингибиторный» пептид 96-115, а с N1-доменом - и участок 115-131, и второй «ингибиторный» пептид 140-148 (Тире! е1 а1., 1997).

Актин

1-40

96-115 140-148

Рис 4. Гипотетическая модель изменений во взаимодействиях белков тонкого филамента, происходящих при увеличении концентрации ионов Са2~ во внутриклеточной среде. (Tripet et. а!., 1997). Красным цветом показан Tni, фиолетовым - ТпТ, синим - ТпС, светло-зеленым - актин и черным - тропомиозин.

Однако, существуют данные, свидетельствующие о том, что в Са2+-зависимой регуляции активности акто-миозиновой АТРазы прямое участие принимает ТпТ, который своим С-концевым участком взаимодействует с ТпС при насыщении регуляторных Са2"-связывающих сайтов последнего ионами металла (Potter et. al., 1995). Авторы также разделяют процессы обращения ингибирования и активации АТРазы, происходящие при инициации сокращения. По их мнению, в присутствии Са2+ изменяется взаимодействие ТпС с Тп! (который диссоциирует от актина) и с ТпТ (приводящее к активации АТРазы акто-миозина. Другие исследователи выдвигают гипотезу о двух видах участков тропонин-зависимого контакта тропомиозина с актином. В отсутствие ионов Са2+ Тн-Тм присоединяется к актиновому филаменту, по-видимому, через Tnl, а при увеличении концентрации Са2+ происходит переключение Тн-Тм на другой участок взаимодействия,

сопровождающееся азимутальным движением молекулы Тм. Сродство Тн-Тм комплекса к актину во время этого процесса меняется достаточно слабо (Dahiya et. al., 1994).

Tnl как биохимический маркер инфаркта миокарда.

Некоторые белки сердечных миофиламентов могут использоваться в диагностике инфаркта миокарда. Как известно, инфаркт миокарда (ИМ) представляет собой некроз (смерть) миоцитов сердца, вызванный прекращением коронарного кровоснабжения. Чаще всего инфаркт миокарда представляет собой локальное поражение в области кровоснабжения одной из крупных ветвей коронарных артерий. Причиной ИМ является тромбоз (развивающийся на фоне коронарного атеросклероза) артерии, снабжающей кровью соответствующий участок миокарда.

Согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения диагноз "инфаркт миокарда" может быть поставлен больному только в том случае, когда выполняются по крайней мере два из трех основных критериев (Julian, 1997):

1. Характерная клиническая картина - наличие сжимающих загрудинных болей, иррадиирующих в челюсть и левую руку и длящихся 20 и более минут

2. Появление характерных изменений в кардиограмме больного - подъем сегмента ST с последующей его нормализацией и формированием инвертированных зубцов Т, а также развитие патологических зубцов Q.

3. Изменение во времени (подъем, а затем, после достижения пиковых значений, снижение) в крови больного концентрации биохимических маркеров ИМ.

В ходе инфаркта миокарда целостность клеточной мембраны кардиомиоцитов нарушается и внутриклеточные белки выходят в межклеточное пространство, а затем- в кровяное русло. Увеличение концентрации белка в крови пациента сигнализирует о начавшемся некротическом процессе в сердце. Биохимические маркеры служат «золотым стандартом» в диагностике ИМ, то есть окончательный вывод о наличии заболевания ставится именно на основании измерения концентрации (или активности) маркера в крови больного. Остальные два критерия диагностики ИМ недостаточно специфичны. Выявление клинической картины

заболевания на основе ощущений больного является чрезвычайно субъективным вопросом и постановка диагноза, конечно же, не может основываться на этом критерии. С другой стороны, от 40% до 75% больных, поступающих в блок интенсивной терапии с подозрением на инфаркт миокарда, могут не иметь характерных изменений в электрокардиограмме (Christenson et. al., 1998)

Камминс с соавторами были первыми, кто установил, что сердечная изоформа Tnl может применяться в качестве детектора некроза сердечной ткани (Cummins et. al., 1987). Ими были получены поликлональные козьи антитела к сердечной изоформе Tnl и создана радиоиммунологическая система, пригодная для диагностики ИМ у больных. Используя данную систему, Камминс с соавторами установили, что:

a) Концентрация Tnl в крови здоровых людей совпадает с пределом обнаружения системы и составляет 10нг\мл,

b) Увеличение концентрации Tnl в крови больных с ИМ начинается спустя 4-6 часов после начала приступа болей в области сердца, концентрация белка достигает пиковых значений через 18 часов после приступа и остается увеличенной в течение последующих 6-7 дней (Рис. 15),

c) Кинетика увеличения концентрации Tnl в крови больных с ИМ совпадает с кинетикой для креатинкиназы ( ее изоформы MB, СКМВ),

d) Повреждения скелетной мускулатуры не приводят к увеличению концентрации Tnl в крови пациентов, тогда как у некоторых из них наблюдалась повышенная концентрация СКМВ,

e) У пациентов с загрудинными болями не сердечной этиологииконцентрация Tnl в крови не была повышенной.

Для того чтобы белок мог применяться в диагностике заболевания в качестве биохимического маркера, увеличение его концентрации в образце должно специфически отражать протекание патологического процесса, а чувствительность измерений должна быть достаточной для точного разделения нормального состояния и заболевания. Кроме того, требованием к идеальному биохимическому маркеру ИМ является также возможность получения диагностических данных в течение длительного промежутка времени, начиная с первых часов после приступа. Это особенно важно, если учесть, что от правильности постановки начального диагноза больному зависит выбор метода его дальнейшей терапии.

Начальные исследования Камминс с соавторами несомненно показали перспективность Tnl как высокоспецифичного и чувствительного маркера ИМ. В последующее годы изучение диагностических свойств Tnl продолжалось во многих лабораториях. Накопленный клинический материал позволяет отнести Tnl к новому поколению биохимических маркеров, которые могут применяться для диагностики не только ИМ, но и более широкого класса патологий сердца, носящих название «острые коронарные синдромы». В эту группу включают повреждения сердечной мышцы в диапазоне от обратимой ишемии (стенокардии) до трансмурального инфаркта миокарда. Предшествующий класс биохимических маркеров, применяемых в течение последних десятилетий, включает изоформу MB креатинкиназы (СК-МВ), ТпТ, а также лактатдегидрогеназу. Насколько оправдано их применение в диагностике ИМ? СК-МВ появляется в крови больного спустя 3-6 часов после приступа, достигает пиковых значений через 16-20 часов и уменьшается до базового уровня через 2-3 дня (Sobel and Shell, 1972). Используя измерение концентрации СК-МВ, достаточно достоверный диагноз можно поставить лишь спустя 8-12 часов после приступа. СК-МВ не обладает достаточной кардиоспецифичностью, эта особенность играет негативную роль в случае диагностирования ИМ у больного с сопутствующим повреждением скелетной мускулатуры (Keffer, 1996). Лактатдегидрогеназа появляется в крови достаточно поздно - через 8-12 часов после начала заболевания, достигает пиковых концентраций через 24 -48 часов и сохраняется в кровотоке в течение 6-10 дней, что позволяет использовать лактатдегидрогеназу для поздней диагностики ИМ (Wolf, 1989). Однако повышение концентрации этого белка в крови больных далеко не всегда связано с поражением клеток сердца (Harff et. al., 1990). ТпТ и Tnl имеют почти одинаковую кинетику появления в крови и сравнимую диагностическую чувствительность. Однако, существуют наблюдения, свидетельствующие о недостаточной специфичности тропонина Т. Высокое содержание этого белка детектировалось в крови больных полимиозитом, с хронической миопатией, с травматическими повреждениями скелетной мускулатуры, у пациентов с хронической почечной болезнью (Braun et. al., 1996, McLaurin et. al., 1997). Сердечная изоформа Tnl не экспрессируется в скелетной мышце при ее повреждении, тогда как другой компонент тропонинового комплекса - ТпТ обнаруживается методами иммуногистохимии и Вестерн-блоттинга в образцах

скелетной мышцы человека, взятых у пациентов с травматическими повреждениями, полимиозитом и мускульной дистрофией Дюшенна (Bodor et. al., 1997b) . При аналогичном анализе тех же образцов скелетной мышцы человека с помощью антител, специфичных к сердечной изоформе Tnl, не было выявлено положительных реакций (Bodor et. al., 1995). Инфаркт миокарда, осложненный травмами скелетной мускулатуры, встречается достаточно часто, поэтому применение ТпТ для диагностики ИМ в такой сложной клинической ситуации неоправданно.

Таким образом, Tnl в настоящее время является наиболее специфичным биохимическим детектором ИМ. Наличие нескольких десятков дополнительных аминокислотных остатков в N-концевой части сердечного Tnl делает возможным получение моноклональных антител, специфичных к сердечной изоформе Tnl. Такие антитела были получены в нескольких лабораториях (Bodor et. al., 1992, Larue et. al., 1992). На их основе были созданы диагностические системы для определения ИМ, которые в дальнейшем были внедрены в рутинную клиническую практику. Основной тенденцией в разработке диагностических систем является стремление уменьшить время анализа и упростить его процедуру.

Время после начала приступа, часы

Рис.5. Изменение концентрации Tnl в крови больных с ИМ.

Появление так называемых Ьес151с1е-систем сделало процедуру анализа доступной для неквалифицированного персонала госпиталя. Лучшие образцы диагностических систем на основе монокпональных антител к Тп1 позволяют получить результат через 10-15 мин после взятия образца крови (СЬ^епвеп е1. а1., 1998). Использование диагностических систем позволило собрать богатый фактический материал. Анализ литературных данных позволяет говорить о тропонине И как о лучшем из известных к настоящему времени биохимических маркеров ИМ.

Несомненным достоинством Тп1 является возможность его применения как в ранней, так и в поздней диагностике инфаркта. Если учесть, что многие пациенты обращаются за медицинской помощью лишь спустя 36-72 часа после приступа, когда диагностическая эффективность другого широко использующегося в клинической практике биохимического маркера ИМ - изоформы МВ креатинкиназы -падает ниже 40% (Вос1ог е1 а1., 1992), становится ясно, что такую особенность Тп1 трудно переоценить. Диагностическая эффективность Тп1 даже спустя 168 часов после начала болевого приступа остается на уровне 70% (Вос1ог е1 а1., 1992). В миоцитах сердца некоторое («4%) количество Тп1 присутствует в свободном виде в цитозоле (Ма1г е1. а1., 1996), поэтому при некрозе, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для белков, Тп1 быстро (через 3-6 часов ) появляется в крови больного. Постепенное разрушение сократительной системы, происходящее в необратимо поврежденной клетке, приводит к выбрасыванию в кровяное русло все новых порций миофиламентных белков. Поэтому повышенная концентрация Тп1 в крови больных с ИМ сохраняется столь длительное время - до 8 дней (Ма1г е1 а1., 1994). Доказательством постепенного разрушения миофиламентной системы и «квантованного» выхода структурных белков во внеклеточное пространство можно считать эксперименты по измерению времени жизни экзогенного Тп1 в кровеносной системе собаки ^а1Те е! а1., 1996) и козы (Катруха А.Г., диссертация, 1997). Уже через 60 минут после введения в организм животного очищенного препарата Тп! в физиологическом растворе концентрация этого белка возвращалась к исходному уровню (Рис. 6).

Для восстановления кровотока в закупоренных коронарных сосудах, окклюзия которых вызвала ИМ, применяют различные тромболитические препараты, при этом очень важно оценить результат применения тромболитической терапии. Тп1, находящийся в свободном виде в цитоплазме кардиомиоцитов, вымывается в

кровяное русло при реперфузии закупоренных сосудов, по увеличению его концентрации в крови пациента судят об эффективности проводимой тромболитической терапии (Ма1ге^ а1., 1994).

10СН

с!

0 8СН х

с бон

Оч

40Н

(0 о.

* \

о 20- \ § -

-1-1-1-1-1-1-1-1

О 50 100 150 200

Время после инъекции, мин

Рис. 6 Кинетика выведения очищенного Тп1 (-И-) из кровотока козы (Катруха

А., диссертация, 1997).

Такое аутоиммунное заболевание, как миокардит, часто сопровождается ишемией миокарда и его повреждениями. Применение диагностической системы на основе сердечного Тп1 позволяет врачу получить информацию об инфаркте в течение первых часов после начала некроза (Bonnefoy е! а\., 1997).

Спектр заболеваний сердца, во время которых происходит повреждение клеток миокарда, включает и нестабильную стенокардию - заболевание с гетерогенной клинической картиной. Опасность этого заболевания в том, что оно часто перерастает в инфаркт миокарда. Для того, чтобы назначить правильное лечение, врачу необходима информация о состоянии сердечной мышцы больного.

Концентрация Tnl в крови здоровых людей чрезвычайно мала (0.1-0.5 нг\мл), поэтому даже небольшое увеличение этого белка в крови людей с нестабильной стенокардией сигнализирует о начавшемся разрушении клеток миокарда. Данные измерений концентрации Tnl в крови таких больных имеет большое прогностическое значение, так как позволяют врачу раньше принять необходимые терапевтические меры и не допустить развития ИМ. Интересно, что иные способы диагностики патологических состояний сердца (электрокардиография, эхокардиография) не дают возможности сделать недвусмысленный вывод о наличии или отсутствии некроза клеток миокарда во время присупа стенокардии (Smith et. al., 1997, Galvani et. al., 1997).

Майр с соавторами установили, что у больных с различными по размеру некротизированными участками миокарда кинетика увеличения концентрации Tnl в крови различна. Используя в качестве стандарта для оценки размера пораженного участка сердца метод компьютерной томографии, Майр с соавторами установили высокий уровень корреляции между площадью под кривой зависимости увеличения концентрации Tnl от времени и размером некротизированного участка миокарда. Авторы утверждают, что Tnl может использоваться в качестве инструмента при оценке величины пораженного участка сердечной мышцы (Mair et. al., 1995). Диагностическая система, основанная на применении анти-Tnl монокпональных антител, может, таким образом, рассматриваться как высокочувствительный прибор, точно определяющий состояние сердечной мышцы пациента при патологии и во время лечения.

Благодаря высокой специфичности и чувствительности Tnl находит применение также и в диагностике повреждений сердца, происходящих во время различных несердечных операций (perioperative myocardial infarction) (Adams et. al., 1994), в мониторинге состояния сердца во время чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики, когда очень важно вовремя заметить начало патологического процесса в сердце пациента (Attali et. al., 1998). Операция аортокоронарного шунтирования (АКШ) также зачастую сопровождается кратковременной ишемией миокарда. Кроме того, во время АКШ возможны также различные патологии электофизиологического характера, поэтому хирургу необходима точная информация об осложнениях, происходящих во время хирургического вмешательства. Установлено, что сердечный Tnl является

высокоспецифичным маркером некротического повреждения миокарда в течение АКШ (Jacquet et. al., 1998).

Для лечения сердечных аритмий широко применяется метод электрической дефибрилляции. Мониторинг состояния сердца в течение операции может проводиться путем серийных измерений концентрации Tnl в сыворотке крови пациента. Концентрация Tnl не увеличивается выше уровня, определяемого как верхний предел допустимых значений, в то время как концентрация других белков -миоглобина и СК-МВ - превышает его иногда в несколько раз. Дефибрилляция вызывает повреждения скелетной мускулатуры и увеличение концентрации миоглобина и СК-МВ. Одновременное применение и Tnl, и СК-МВ в качестве маркеров повреждений мышечной ткани позволяет дифференцировать некроз миокарда и скелетной мышцы (Bonnefoy et. al., 1997).

Моноклональные антитела и способы определения их эпитопной специфичности

Во время иммунного ответа на проникновение чужеродного агента происходит стимуляция индивидуальных B-лимфоцитов (клонов) и их пролиферация, каждая В-клетка при этом синтезирует и секретирует иммуноглобулины определенной специфичности. Поскольку стимуляция антигеном затрагивает огромное количество антитело-продуцирующих клеток, образуется смесь антител различной специфичности и аффинности - так называемая поликлональная антисыворотка. В-кпетка, стимулированная антигеном и производящая антитела определенной специфичности, называется плазматической клеткой. Каждая плазматическая клетка способна синтезировать один вид иммуноглобулинов, взаимодействующих с одним участком на молекуле антигена. Из вышесказанного следует, что взаимодействие поликпональных антител с антигеном неспецифично относительно участка связывания. В середине 70-х годов Келер и Мильштейн (Kohler and Milstein, 1975) разработали методику, позволяющую после иммунизации мышей антигеном получать моноклональные антитела, которые синтезируются клоном клеток, являющихся потомством единственной плазматической клетки. В дальнейшем эта методика получила название гибридомной технологии. Вкратце ее суть такова: продуцирующие антитела мышиные B-лимфоциты гибридизуют путем слияния с

клетками мышиной миеломы. Гибридная клетка - гибридома - секретирует антитела, специфичность которых определяется родительской лимфоидной клеткой, а количество синтезируемых и секретируемых иммуноглобулинов - родительской миеломной клеткой. С помощью процесса, названного «клонированием», единственная гибридомная клетка может быть выделена из клеточной культуры и наращена. Полученная таким образом культура клеток секретирует антитела с уникальной специфичностью - моноклональные антитела (МАТ). Такие антитела обладают способностью взаимодействовать с единственным эпитопом в составе первичной структуры антигена. Вследствие высокой специфичности взаимодействия с антигеном моноклональные антитела находят широкое применение во многих отраслях биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии. Особенно успешно моноклональные антитела применяются в клинической химии, где принцип специфического и прочного взаимодействия с белком-мишенью положен в основу конструкции диагностических тест-систем (Jefferis and Deverill, 1993). При помощи моноклональных антител удается также детектировать конформационные превращения белка-мишени, затрагивающие окрестности эпитопа, так как взаимодействие антител с антигенной детерминантой чувствительно даже к единичным аминокислотным заменам (Sheshberadaran and Payne, 1988). В настоящее время генетика иммуноглобулинов хорошо изучена, поэтому, применяя метод рекомбинантных ДНК, удается создавать антитела заданной специфичности, химерные антитела, отдельные части которых кодируются генами различной видовой принадлежности (Riechmann et. al., 1988), белковые молекулы, в которых антиген-связывающий участок антитела присоединен к молекуле не иммуноглобулинового происхождения (Jefferis and Deverill, 1993). Присоединение каких-либо «репортерских» групп к молекуле антитела, взаимодействующего с интересующим экспериментатора белком, предоставляет возможность контролирования различных внутриклеточных процессов. В качестве «репортерских» могут выступать энзиматические, флуоресцентные и иные метки (Jefferis and Deverill, 1993). Например, моноклональные антитела к очищенному лиганду никотинового ацетилхолинового рецептора имитируют действие нормального рецептора (Merienne et. al., 1997). Таким образом, моноклональные антитела применяются всюду, где необходимо прочное и высокоспецифичное связывание лиганда с белком-мишенью.

На молекулярном уровне взаимодействие антигена с антителом представляет собой контакт пространственной структуры, образованной гипервариабельными участками первичной структуры тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, с участками последовательности антигена. Фрагмент структуры антигена, с которым взаимодействует антитело, называется эпитопом или антигенной детерминантой. Различают конформационные эпитопы, которые построены из нескольких фрагментов первичной структуры белка, сближенных в пространстве, и линейные эпитопы, образованные одним участком последовательности антигена. Полагают, что при индукции иммунного ответа на проникновение чужеродного белка в исследуемый организм большинство антител узнают конформационные эпитопы, так как антиген обладает определенной пространственной структурой (Moudallal et. al., 1985). Рецепторные структуры на поверхности покоящейся В-кпетки, представляющие собой модифицированные молекулы иммуноглобулинов, узнают чаще всего трехмерную структуру антигена (Roitt, 1996). Длина линейного эпитопа определяется различными исследователями по-разному: некоторые исследователи полагают, что его длина составляет 15-20 аминокислотных остатков (Laver et. al., 1990), другие же - что размер эпитопа не превышает 8-10 остатков (Geysen et. al., 1987).

Определение эпитопной специфичности антител проводится по-разному. Стандартным методом является изучение конкурентного связывания меченых и немеченых антител с иммобилизованным антигеном. Таким образом можно определить, направлены антитела к одной или к разным антигенным детерминантам (Jefferis and Deverill, 1993). Если исследователь имеет в своем распоряжении несколько монокпональных антител, он может определить участки первичной структуры антигена, заключающие в себе эпитопы антител одинаковой специфичности.

Одним из наиболее точных методов анализа эпитопной специфичности является рентгеноструктурный анализ комплекса антитела с антигеном. Таким образом была определена трехмерная структура комплекса антитела с нейраминидазой вируса гриппа (Colman et. al., 1987) и пространственное строение Fab фрагмента антитела, связанного с антигеном (лизоцимом) (Amit et. al., 1986). Методом рентгеноструктурного анализа определяется истинное строение эпитопа, но данный подход предполагает кристаллизацию белков как необходимое условие,

что не всегда возможно, кроме того, определение строения одного эпитопного участка требует много времени.

Еще одним методом, позволяющим определить совокупность аминокислотных остатков антигена, участвующих в связывании антитела, является сочетание протеолиза комплекса антиген-антитело и масс-спектрометрии продуктов протеолитического расщепления (Macht et. al., 1996). Однако, недостатком этого способа определения эпитопных участков антигена (как и метода рентгеноструктурного анализа) является то, что в эксперименте определяется всего один эпитоп для определенного вида антител и для скрининга панели моноклональных антител, полученных на один антиген, требуется много времени.

В недавно разработанном методе поверхностного плазменного резонанса (surface plasmori resonance) используется принцип изменения энергетических характеристик световой волны, отраженной от границы раздела фаз с различными преломляющими характеристиками, если на поверхности, являющейся границей, происходит взаимодействие двух объектов. Данный метод успешно используется для определения характеристик связывания двух биологических объектов, например, антигена и антитела (Johne, 1998).

Для картирования эпитопов на поверхности молекулы антигена применяется метод фаговой библиотеки (Cortese et. al., 1995). Исследуемый белок (или пептид) экспрессируется как часть белка оболочки вириона бактериофага. Пептидная библиотека конструируется таким образом, что аминокислотные остатки в составе пептидов определенной длины располагаются случайным образом, то есть получаются все возможные пептиды определенной длины. Число клонов определяется формулой 20х, где х - число остатков в пептиде. Каждый клон бактериофага экспрессирует несколько пептидов. Скрининг библиотеки проводится следующим образом: все клоны бактериофага тестируются на взаимодействие с белком-мишенью (например, антителом), связавшиеся клоны выделяются из смеси и ДНК фагов амплифицируется, после чего определяется последовательность пептидов, вступивших во взаимодействие (Felici et. al., 1991).

Единственным методом, позволяющем скринировать большое количество моноклональных антител, является синтез библиотеки прекрывающихся иммобилизованых пептидов, представляющих первичную структуру исследуемого белка (SPOT-method). Химизм метода изложен в работе Франк (Frank, 1992). При

синтезе используются производные аминокислот, a-NH2-rpynna которых защищена флуоренилметилоксикарбонильной группировкой, а карбоксильная - активирована остатком пентафторфенилового или дигидробензотриазинового эфира. Конденсация аминокислот, то есть удлинение цепи, происходит спонтанно при добавлении раствора очередной аминокислоты в N-метилпирролидоне к растущей цепи. Целлюлозная мембрана в участках присоединения пептидов предварительно обработана - к гидроксильным группам целлюлозы присоединены дипептиды, играющие роль спейсеров. В зависимости от типа спейсера синтезированные пептиды могут быть отщепляемыми и неотщепляемыми. Длина пептидов, синтезированных этим способом, может достигать 20 аминокислотных остатков (Tzioufas et. al., 1997). Достоинством SPOT-метода является также то, что пептидный синтез не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а осуществляется с помощью стандартных лабораторных инструментов. Иммобилизация пептидов производится на различных носителях: целлюлозной мембране (Frank, 1992), полипропиленовых шпильках (Petrakou, 1998), полимерных шариках (Lam, 1996). Исследование взаимодействия подобных библиотек пептидов с монокпональными антителами приводит к определению только линейных эпитопов. Данный метод позволяет быстро и с большой точностью определить антигенные детерминанты для большого количества монокпональных антител. Кроме использования в биотехнологии, множественный пептидный синтез служит инструментом для изучения процессов регуляции иммунной системы (Beck-Sickinger and Jung, 1993).

Таким образом, литературные данные свидетельствуют о том, что Tnl играет важнейшую роль в регуляции сокращения поперечно-полосатой скелетной и сердечной мускулатуры, кроме того, этот белок находит широкое применение в клинике сердечных заболеваний в качестве биохимического маркера инфаркта миокарда. Однако, несмотря на тщательное изучение этих проблем, до сих пор остаются невыясненными до конца некоторые аспекты поведения Tnl как при мышечном сокращении, так и во время некроза кардиомиоцитов. В частности, участки взаимодействия сердечных Tnl и ТпС не определены с достаточной точностью. Кроме того, известно, что Tnl, выделяющийся в кровоток больного с инфарктом миокарда, по-разному ведет себя при взаимодействии с диагностическими антителами. Наша работа является попыткой разрешения этих

проблем.

Материалы и методы исследования. Материалы

Сердечные изоформы Tnl и ТпС, панель моноклональных анти-Tnl и анти-ТпС антител, моноклональные анти-Tnl антитела, модифицированные биотином либо хелатом Еи3+ были получены в нашей лаборатории (Katrukha et al., 1995, 1997).

Набор реактивов и материалов для твердофоазного синтеза пептидов на целлюлозной основе был получен от фирмы Genosys Biotechnologies (Pampisford, Великобритания).

Образцы сывороток крови больных с инфарктом миокарда были любезно предоставлены И.Р. Трифоновым (29-я городская больница, Москва, Россия).

Остальные используемые в работе реактивы были получены от фирмы Sigma (St. Louis, США). В работе использовали радиоактивно меченые реактивы производства АО «Изотоп» (Обнинск, Московская область).

Методы

Твердофазный синтез пептидов на &еш!9Л9.Ш9.йР9Н9$$.

Твердофазный синтез десятичленных пептидов, соответствующих по своей структуре последовательности сердечного тропонина I, осуществляли на целлюлозной мембране к которой производителем в определенных местах уже были ковалентно присоединены дипептиды р-аланина. Все стадии синтеза проводили при комнатной температуре. Первый аминокислотный остаток присоединялся к NH2-rpynne р-аланина, последующие - к NH2-rpynne предыдущего остатка. Наращивание полипептидной цепи производилось одновременно для всех пептидов путем добавления раствора МН2-защищенной и СООН-активированной аминокислоты в N-метилпирролидиноне. В качестве МН2-защитной выступала флуоренилметилоксикарбонильная группа, а активировал карбоксильную группу остаток пентафторфенола, присоединенный к ней эфирной связью. Раствор модифицированной аминокислоты (0,9 мкп) наносили на мембрану в участках

иммобилизации пептидов автоматическим дозатором фирмы Р1ппр1рейе (Финляндия) и инкубировали на воздухе в течение 15 мин. После ацетилирования непрореагировавших свободных амино-групп 4% уксусным ангидридом в диметилформамиде в течение 3 минут при встряхивании проводилось деблокирование а-амино-группы удлиненного на один аминокислотный остаток пептида путем инкубации мембраны в 20% пиперидине/диметилформамиде в течение 5 мин. при встряхивании. Свободные аминогруппы пептидов идентифицировались по синей окраске пятен при инкубации мембраны в растворе, содержащем 0,2 мг/мл бромфенолового синего в диметилформамиде (3 мин. при встряхивании). После каждой стадии непрореагировавшие вещества и побочные продукты реакции удалялись посредством пятикратной отмывки мембраны диметилформамидом. После завершения наращивания цепи проводилось конечное деблокирование всех защитных групп путем инкубации мембраны в 50% трифторуксусной кислоте/дихлорметане (с добавлением небольшого количества триизобутилсилана) в течение 1 часа при комнатной температуре. Синтез завершался последовательной промывкой мембраны последовательно дихлорметаном (4 раза), диметилформамидом (3 раза) и метанолом (3 раза), после чего мембрану высушивали на воздухе и хранили при температуре -20°С вплоть до дальнейшего использования.

О.ПР.вфеление участков взаимодействия антител и Тн(.

Целлюлозную мембрану с иммобилизованными на ее поверхности пептидами инкубировали в ФСБТ, содержащем 10% обезжиренного сухого молока и 3% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин при 37°С и встряхивании с целью блокировки мест неспецифического связывания антител. Затем мембрану последовательно инкубировали в ФСБТ, содержащем 20 мкг/мл анти-Тн1 антител и 5% лошадиной сыворотки крови в течение 30 мин при 37°С и встряхивании, и в ФСБТ, содержащем вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (1/200 от общего объема раствора), 10% лошадиной сыворотки крови и 3% бычьего сывороточного альбумина (30 мин при 37°С и встряхивании). После каждого этапа непрореагировавшие вещества удалялись путем промывки мембраны ФСБТ 10 раз. Конечным этапом эксперимента было использование иммуноферментного метода с

усиленной хемилюминесценцией для визуализации комплексов антител с иммобилизованными пептидами. Для этого мембрану помещали в буферный раствор, содержащий 0,1 М трис, рН 8,0, 68 мкМ транс-3-гидроксициннамовой кислоты, 1,2 мМ люминол, и 0,1% перекиси водорода и экспонировали с рентгеновской пленкой в темноте в течение 15 минут. Пленку после экспозиции проявляли и фиксировали. Регенерация мембраны осуществлялась путем ее инкубации в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, 2% ДСН и 100 мМ р-меркаптоэтанол в течение 1 часа при 95°С.

Моделирование некроза сердечной ткани

■ ■••■■■■«•■■«•■а •«■•■■■■■■■■■■■■■■■■■•■■1ва«ааа*й|а|ай1*|аава11ааа|ц«ав«а>*вааа|ввава|

Фрагменты сердечной ткани человека (5-8 часов после смерти) весом 2-3 гр. инкубировали в буферном растворе (3:1 вес/объем), содержащем 0,15 М №С1 и 0,2% №N3 при 37°С в течение заданных промежутков времени. Образец ткани после инкубации замораживали в жидком азоте и растирали до порошкообразного состояния, затем белки из полученного таким образом препарата экстрагировали в буферном растворе (1:10 веоЪбъем), содержащем 25 мМ трис-НС1, рН 7,5 и ингибиторы протеаз (0,1 мМ ФМСФ, 1 мкМ пепстатин А, 10 мМ бензамидина хлорид) в течение 5 минут. Раствор подвергали центрифугированию при 5000 д в центрифуге Весктап ¿2^ течение 2 минут и осадок экстрагировали повторно в тех же условиях. Супернатанты после центрифугирования объединяли и добавляли к раствору сухую мочевину до конечной концентрации 6 М. Осадок экстрагировали и центрифугировали трижды в тех же условиях буферным раствором, содержащим 50 М трис-НС1, рН 7,5, 6 М мочевину, 5 мМ ЕДТА и 10 мМ р-меПКАптоэтанол и те же ингибиторы протеаз, все полученные супернатанты объединяли и хранили при температуре -70°С.

Иммунофлуориметрия.

• ••••а •••«■•••а авв(а>ваЛ(|а1>|а>1аааа(аааА((|||а|

Иммунологическую активность Тн1 измеряли в экстрактах ткани с помощью двухступенчатой флуориметрической системы, построенной по типу «сэндвич» (Рис.20) (1_оудгеп е1 а1., 1985). Детекторные антитела были модифицированы биотином, а антитела подложки - хелатом европия. Экстракт ткани разбавляли в

3000 раз нормальной человеческой сывороткой, инкубировали со смесью детекторных антител и антител подложки в лунках покрытого стрептавидином планшета (фирма Wallac, Финляндия) в течение 30 мин, затем, после 6-кратной отмывки планшета DELFIA™-pacrBopoM для отмывки добавляли к смеси раствор усиления LAN Fl А™ (0,2 мл/лунку), и инкубировали в течение еще 3 мин, после чего измеряли уровень флуоресценции на приборе DELFIA™ Plate Fluorometer 1234.

¡^СН-г.Ш^^^.РР.Ф.ЯР.^. .(7.9 м§ШодутЛэммли. &аеттПл. l.ß.T.Q).-.

Образцы белковых растворов смешивали в соотношении 3:1 с буферным раствором, содержащим 250 мМ трис-HCI, pH 6,8, 8% (вес/объем) ДСН, 40% глицерин, 1,4 М ß-меркаптоэтанол, 0,1% (вес/объем) бромфеноловый синий и инкубировали при 100°С в течение 5 мин., после чего образцы наносили на градиентный полиакриламидный гель (10-20% акриламида, соотношение акриламид/бисакриламид = 1:37,5) и проводили вертикальный электрофорез, используя прибор для электрофореза SE280 (фирма Hoeffer, США) и источник тока EPS 500/400 (фирма Pharmacia, Швеция) при силе тока 20-25 мА до тех пор, пока фронт не достигал нижнего края кассеты.

Вестерн-блоттинг

шяяяяяатяшш»яяяяяяяттштшяяяяяяи»»яя*яяяяяяя

Вестерн-блоттинг проводили по методу Товбин с соавторами (Towbin et. al., 1992). «Сандвич» состоял из 3 слоев фильтровальной бумаги, вырезанной по форме пластины полиакриламидного геля, нитроцеллюлозной мембраны такой же формы, собственно пластины полиакриламидного геля и дополнительных трех слоев фильтровальной бумаги. «Сандвич» смачивали буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCI, pH 8,3, 150 мМ глицин, 20% (объем/объем) метанола, вставляли в пластиковую кассету, которую помещали между электродами прибора Mini-Protean II™ для электрофоретического переноса фирмы Bio-Rad. Перенос белков осуществляли, используя источник тока EPS 500/400 фирмы Pharmacia при напряжении 2,5 V/cm2 и силе тока 200-250 мА в течение 1 часа. Качество переноса проверяли, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану после проведения Вестерн-

блоттинга 0,3% Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Краску с иммобилизованных белков смывали слабощелочным раствором трис-HCI.

нитроцеллюлозной мембране

»тшвшвшшшШшшлшшшяттшшшттшвяшшшшшвшиишшишишшшшшшшшшшшшшш Яш

Мембрану после Вестерн-блоттинга инкубировали в ФСБТ, содержащем 0,5% казеина в течение 15 мин при 37°С и встряхивании для блокировки мест неспецифического связывания антител, затем мембрану переносили в ФСБТ, содержащий 0,1% казеина и 10мкг/мл антител и инкубировали 1 час в тех же условиях. После инкубации с первичными антителами мембрану переносили в ФСБТ, содержащий 0,1% казеин и вторичные антимышиные антитела (фирма Sigma, США), разведенные в отношении 1:200. Процесс инкубации мембраны со вторичными антителами продолжался в течение 1 часа при 37°С и встряхивании. Визуализация иммуноакгивных белков происходила при инкубации мембраны в растворе хромогенного субстрата, содержавшем 0,5 мг/мл 3,3'-диаминобензидина, 50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 0,2% Н202. После каждой стадии мембрану промывали 5 раз ФСБТ.

Иммобилизация человеческого сердечного ТпС на BrCN-активи сефарозе.

■ Яш шшшшшшшштпфшшш

Активацию сефарозы 4В BrCN-ом проводили по методике, описанной Остерманом (Остерман, 1985). 3 мл BrCN-активированной сефарозы суспендировали в 5 мл раствора, содержащего 6 мг/мл ТпС из сердца человека в 0,1 М NaHC03, рН 8,3, 0,5 М NaCI и инкубировали, встряхивая, при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего носитель отделяли путем фильтрования через стеклянный фильтр и переносили в раствор, содержащий 1,5 М глицина, 3 М NaCI, рН 8,9. Носитель инкубировали в этом растворе в тех же условиях в течение 2 часов, после чего сефарозу промывали на стеклянной воронке 10 объемами того же раствора, 10 объемами раствора, содержащего 0,1 М NaCH3COO, 0,5 М NaCI, рН 4,0, и 10 объемами буфера, содержащего 0,1 М трис-HCI, 0,5 М NaCI, рН 8,0. Полученный таким образом аффинный сорбент хранили в буферной системе, содержащей 7 М мочевины, 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, 15 мМ р-меркаптоэтанол, 2 мМ CaCI2. Степень пришивки составляла 5 мг белка на 1 мл носителя. Исследование взаимодействи ThJ с иммобилизован^

Экстракт сердечной ткани человека (8 мл), полученный как описано выше после инкубации ткани в ишемических условиях в течение 8 часов, наносили на уравновешенную буфером А (7 М мочевины, 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, 15 мМ р-меПКАптоэтанол, 2 мМ CaCI2) TnC-сефарозу, содержащую 2.5 мг иммобилизованного белка, несвязавшийся с носителем материал удаляли путем промывания носителя буферным раствором А после чего связавшийся с ТпС белковый материал элюировали буферным раствором Б, содержащим 7 М мочевины, 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, 15 мМ р-меркаптоэтанол, 10 мМ ЭГТА. Контрольный эксперимент с чистой сефарозой (носитель, на котором не были иммобилизованы белковые лиганды) проводили аналогично. Белки, элюированные с аффинной и контрольной колонок, разделяли методом ДСН-гель-электрофореза в полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом Вестерн-блоттинга. Мембрану с иммобилизованными на ней белками обрабатывали антителами 19С7 для визуализации Tnl и его протеолитических фрагментов.

МЯАМР-змисимдй ПР9Ш?ШШназой

Высокоочищенный лиофильно высушенный препарат Тн1 растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 2 мг/мл. Инкубационная смесь для фосфорилирования содержала 15 мМ MgCI2, 0,5 мМ ДТТ, 0,5 мМ ЭГТА, 50 мкМ АТР, 0,18 мкКи/мл у-[32Р]-АТР и 60 единиц активности сАМР-зависимой протеинкиназы. Реакцию фосфорилирования инициировали добавлением субстрата до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Смесь (50 мкл) инкубировали, встряхивая, при 30°С в течение 2 часов. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл смеси, содержавшей 0,5 М ЭДТА, 10 мМ пирофосфат натрия. Аликвоты по 20 мкл наносили на фильтры размером 18X18 мм из бумаги «ЗММ» фирмы Whatman (Великобритания) и фиксировали в 12% трихлоруксусной кислоте в течение 15 мин. Затем фильтры промывали последовательно 3 раза по 15 мин. в 6% трихлоруксусной кислоте и 2 раза в ацетоне, после чего сушили на воздухе. Радиоактивность фильтров определяли в толуольном сцинтилляторе ЖС-106 в фосфорном канале на сцинтилляционном счетчике Rackbeta фирмы LKB (Швеция). Степень фосфорилирования Тн1 определяли путем сравнения с контрольным образцом, не содержавшим Тн1.

Определение участков взаи^ Тн1 с ТпС

Исследуемую мембрану с иммобилизованными на ней пептидами Тн1 инкубировали в буфере В - 50 мМ трис-HCI, рН 7,0, 150 мМ NaCI, 2 мМ CaCI2, 0,1% Твин-20, содержащем 10 мкг/мл ТпС, затем - в аналогичном буфере, в котором вместо ТпС содержались моноклональные анти-ТпС антитела в концентрации 10мкг/мл, после чего - в буфере В, включавшем вторичные антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:200. После каждой стадии несвязавшиеся реагенты удалялись путем 5-кратной отмывки мембраны буфером В. Образовавшиеся иммунные комплексы проявляли с помощью иммуноферментного метода с усиленной хемилюминесценцией.

Результаты и их обсуждение

Синтез библиотеки пептидов Tnl и эпитопное картирование моноклональных антител.

Метод синтеза библиотеки пептидов на целлюлозной мембране (SPOT-метод) был разработан сравнительно недавно (Frank, 1992), однако является одним из распространенных способов определения эпитопной специфичности моноклональных антител. Суть метода заключается в том, что на целлюлозной основе синтезируются 5-20-членные перекрывающиеся пептиды, представляющие полную последовательность исследуемого белка. Каждый из пептидов отличается от предыдущего сдвигом вдоль последовательности исследуемого белка на определенное количество аминокислотных остатков. Скринирование антител проводится методом дот-блоттинга, с применением в качестве вторичных антител, меченых различными ферментами, например, 3-галактозидазой или пероксидазой хрена, а также иными метками, позволяющими иденифицировать образовавшиеся иммунные комплексы. От выбора ферментной метки зависит способ визуализации пептидов, реагирующих с антителами - это может быть реакция локального окрашивания, когда субстрат превращается в нерастворимый окрашенный продукт в участках расположения комплекса пептид-антитело, иммуноферментный метод с усиленной хемилюминесценцией (Кричка с соавт.,1991) или какой-либо другой. Метод скрининга пептидной библиотеки позволяет определить участки связывания для группы моноклональных антител, полученных при иммунизации лабораторного животного определенным антигеном, так как мембрану с иммобилизованными на её поверхности пептидами можно использовать многократно.

В нашем случае пептидная библиотека сердечной изоформы Tnl человека была синтезирована с целью точного определения эпитопов имеющихся моноклональных антител к этому белку. Нами был применен способ твердофазного синтеза иммобилизованных пептидов с использованием активированных эфиров аминокислот. В качестве активирующей группы выступал остаток пентафторфенола, присоединенный к карбоксильной группе аминокислоты эфирной связью. NH2-rpynna производных аминокислот была защищена флуоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) группировкой, которая, как известно, легко отщепляется от аминокислоты в слабощелочных условиях, создаваемых в растворе пиперидина в диметилформамиде (ДМФ). Боковые группы

некоторых аминокислот (например, Cys, Arg, Glu, Asp, Lys) были также защищены с целью не допустить протекания побочных реакций при наращивании полипептидной цепи. Аминокислоты вводились в реакцию в виде раствора (1-2 М) в N-метипирролидоне. Реакция конденсации протекала спонтанно на воздухе при комнатной температуре (Схема 1). Наращивание цепи происходило с 1МН2-конца цепи. Выход реакции присоединения был весьма высок вследствие того, что наращиваемая пептидная цепь иммобилизована на инертном в условиях реакции носителе, а непрореагировавшие вещества и продукты реакции удалялись при промывке мембраны. Цикл присоединения каждой аминокислоты к растущей цепи состоял из собственно конденсации, ацетилирования непрореагировавших свободных амино-групп путем обработки мембраны раствором уксусного ангидрида в ДМФ, деблокирования Fmoc-защищенной концевой а-амино-группы удлиненного на один остаток пептида, контролирования степени прохождения реакции присоединения, для этой цели мембрану обрабатывали 0,1% раствором бромфенолового синего в ДМФ, после чего цикл повторялся снова (Рис. 1, см. раздел «Материалы и Методы»), Заключительным этапом синтеза пептидов было деблокирование концевой а-амино-группы последней присоединенной аминокислоты и снятие защитных групп с боковых цепей некоторых (лабильных) аминокислотны остатков синтезированных пептидов. Это достигалось путем обработки мембраны с иммобилизованными на ее поверхности пептидами раствором трифтроуксусной кислоты в дихлорметане (50%), к которому

Схема 1. Реакция конденсации Ртос-защищенной аминокислоты, активированной остатком пентафторфенилового эфира, со свободной концевой а-

амино-группой наращиваемой цепи.

F

Снятие защитной группы

Активированная аминокислота

конденсация

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Филатов, Владимир Львович, 1998 год

Список литературы

1. Верин, А.Д., и Гусев, Н.Б. Роль N-концевого фрагмента во взаимодействии с компонентами тропонин-тропомиозинового комплекса сердца W1988, Биохимия, т. 53, с. 1235-1246.

2. Гусев, Н.Б. Исследование структуры и механизма действия ТпС и калмодулина методами белковой инженерии W1995, Биохимия, т.60, с.395-418.

3. Гусев, Н.Б. ТпСердца и скелетных мышц : некоторые особенности строения и свойства. W1986, Биохимия, т.51, с. 1993-2009.

4. Гусев, Н.Б., Добровольский, А.Б., и Северин, С.Е. ТпСкелетных мышц и фосфорилирование: участок тропонина Т, фосфорилированный специфической протеинкиназой W1978, Биохимия, т.43, с.365-371.

5. Добровольский, А.Б., Рисник, В.В., и Гусев, Н.Б. ТпТ - киназа: возможная роль казеин-киназ G-Tnna\\1981, Биохимия, т.46, с. 1006-1014.

6. Добровольский, А.Б., Гусев, Н.Б., Мартынов, А.В., и Северин, С.Е. Поиски протеинкиназы, специфичной к тропонину Т \\1976, Биохимия, т.41, с. 1291-1296.

7. Катруха, А. Г. Получение и исследование свойств тропонина I как маркера инфаркта миокарда W1997, диссертация, с.70.

8. Кричка, Л.Дж., Стотт, Р.А.У., Торп, Г.Х.Г. Иммуноферментный аналаз с усиленной хемилюминесценцией \\в кн.: Новые методы иммуноанализа, 1991, М., «Мир», с. 167-178.

9. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. 1985, М., «Наука», с.348-349.

10.AI-Hillawi, Е., Trayer, I.P., Trayer, H.R., and Bhandari, D.G. The effects of phosphorylation of cardiac troponin-l on its interactions with actin and cardiac troponin-C W1995, Eur. J. Biochem., v.228, p.962-970.

H.Amphlett, G.W., Syska, H., and Perry, S.V. The polymorphic forms of tropomyosin and troponin I in developing rabbit skeletal muscle W1976, FEBS Lett., v.63, p.22-26.

12.Anderson, P.A.W., Greig, A., Mark, T.M., Malouf, N.N., Oakeley, A.E., Underleider, R.M., Allen, P.D., and Kay, B.K. Molecular basis of human cardiac troponin T isoforms

expressed in the developing, adult, and failing heart W1995, Circ. Res., v.76, p.681-686.

13.Anderson, P.A.W., Malouf, N.N., Oakeley, A.E., Pagani, E.D., and Allen, P.D. Troponin T isoform expression in humans. A comparison among normal and failing adult heart, fetal heart, and adult and fetal skeletal muscle W1991, Circ. Res., v.69, p. 1226-1233.

14.Ardelt, P., Dorka, P., Jaquet, K., Heilmeyer, L.M.G.Jr., Kortke, H., Korfer, R. and Notohamiprodjo, G. Microanalysis and distribution of cardiac troponin I phosphospecies in heart areas W1998, Biol.Chem, v.379, p.341-347.

15.Attali, P., Aleil, B., Petitpas, G., DePoli, F., Wiesel, M.L., Wuillermin, A., Cazenave, J.P. and Mossard, J.M. Sensitivity and long-term prognostic value of cardiac troponin-l increase shortly after percutaneous transluminal coronary angioplasty W1998, Clin. Cardiol., v.21, p.353-356.

16.Babu, A., Gulati, J., Su, H., and Rao, V.G. Critical minimum length of the central helix in troponin C for the Ca2+ switch in muscular contraction W1993, J. Biol. Chem., v.268, p. 19232-19238.

17.Babu, A., Su, H., Ryu, Y., and Gulati, J. Determination of residue specificity in the EF-hand of troponin C for Ca2+ coordination, by genetic engineering W1992, J. Biol. Chem., v.267, p. 15469-15474.

18.Beck-Sickinger, A.G. and Jung, G. Epitope mapping: synthetic approaches to the understanding of molecular recognition in the immune system W1993, Pharm.Acta Helv., v.68, p.3-20.

19. Bertinchant, J.P., Larue, C., Pernel, I., Ledermann, B., Fabbro-Peray, P., Beck, L., Calzolari, C., Trinquier, S., Nigond, J. And Pau, B. Release kinetics of serum cardiac troponin I in ischemic myocardial injury \\1996, Clin. Biochem., v.29, p.587-594.

20. Bhaskaran, R. and Ponnuswamy, P.K. The method for assessing protein flexibility W1988, Int. J. Pept. Protein Res, v.32, p.242-255.

21.Bhavzar, P.K, Brand, N.J, Yacoub, M.H, and Barton, P.J.R. Isolation and characterisation of the human cardiac troponin I gene (TNNI3) W1996, Genomics, v.35, p. 11-23.

22.Bodor, G.S, Anderson, P.A, Ladenson, J.H, Crimmins, D.L, Allen, P.D, and Oakeley, A.E. Troponin I phosphorylation in the normal and failing adult human heart \\1997a, Circulation, v.96, p. 1495-1500.

23.Bodor, G.S., Porter, S., Landt, Y. and Ladenson, J.H. Development of monoclonal antibodies for an assay of cardiac troponin-l and preliminary results in suspected cases of myocardial infarction W1992, Clin. Chem., v.38, p.2203-2214.

24. Bodor, G.S., Survant, L., Voss, E.M., Smith, S., Porterfield, D. And Apple, F.S. Cardiac troponin T composition in normal and regenerating human skeletal muscle \\1997b, Clin. Chem., v.43, p.476-484.

25. Bodor, G.S., Porterfield, D., voss, E.M., Smith, S. And Apple, F.S. Cardiac troponin-l is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue W1995, Clin.Chem., v.41, p.1710-1715.

26.Bonnefoy, E., Chevalier, P., Kirkorian, J., Guidolet, J., Marchand, A. and Touboul, P. Cardiac troponin i does not increase after cardioversion W1997, Chest, v.111, p. 15-18.

27.Braun, S.L., Pongratz, D.E., Bialk, P., Liem, S., Schlotter, B. and Vogt, W. Discrepant results for cardiac troponin T and cardiac troponin I in chronic myopathy, depending on instrument and assay generation W1996, Clin. Chem., v.42, p.2039-2041.

28. Breitbart, R.E., Nguyen, H.T., Medford, R.M., Destree, A.T., Mahdavi, V., and Nadal-Ginard, B. Intricate combinatorial patterns of exon splicing generate multiple regulated troponin T isoforms from a single gene U1985, Cell, v.41, p.67-82.

29.Brisson, J.R., Sykes, B.D., Smillie, L.B., and Golosinska, K. Interaction of tropomyosin and troponin T: a proton nuclear magnetic resonance study W1986, Biochemistry, v.25, p.4548-4555.

30. Brito, R.M., Krudy, G.A., Negele, J.C., Putkey, J.A., and Rosevear, P.R. Calcium plays distinctive structural roles in the N- and C-terminal domains of cardiac troponin C W1993, J. Biol. Chem., v.268, p.20966-20973.

31.Cabral-Lilly, D., Tobacman, L.S., Mehegan, J.P., and Cohen, C. Structural studies of tropomyosin by cryoelectron microscopy and x-ray diffraction W1991, Biophys. J., v.59, p.581a.

32.Cachia, P.J., Sykes, B.D., and Hodges, R.S. Calcium-dependent inhibitory region of troponin: a proton nuclear magnetic resonance study on the interaction between troponin C and the synthetic peptide N alpha-acetyl[FPhe106]Tnl-104-115, amide W1983, Biochemistry, v.22, p.4145-4152.

33. Campbell, A.D., Van Eyk, J.E., Hodges, R.S., and Sykes, B.D. Interaction of troponin I and troponin C: use of the two-dimensional transferred nuclear Overhauser effect to

determine the structure of a Gly-110 inhibitory troponin I peptide analog when bound to cardiac troponin C W1992, Biochim. Biophys. Acta, v. 1160, p.25-54.

34. Chandra, M., da Silva, F., Sorensen, M.M., Ferro, J.A., Pearlstone, J.R., Nash, B.E., Bogford, T., Kay, C.M., and Smillie, L.B. The effects of N helix deletion and mutant F29W on the Ca2+ binding and functional properties of chicken skeletal muscle troponin \\1994, J. Biol. Chem., v.269, p. 14988-14994.

35.Chong, P.C., and Hodges, R.S. Photochemical cross-linking between rabbit skeletal troponin subunits. Troponin l-troponin T interactions \\1982,b J. Biol. Chem., v.257, p.11667-11672.

36.Chong, P.C.S., and Hodges, R.S. Photochemical cross-linking between rabbit skeletal troponin and alpha-tropomyosin. Attachment of the photoaffinity probe N-4-azidobenzoyl-[2-3H]glycyl,-S-2-thiopyridyl,-cysteine to cysteine 190 of alpha-tropomyosin \\1982a, J. Biol. Chem., v.257, p.9152-9160.

37. Christenson, R.H., Apple, F.S., Morgan, D.L., Alonsozana, G.L., Mascotti, K., Olson, M., McCormack, R.T., Wians, F.H., Keffer, J.H. and Duh, S.H. Cardiac troponin I measurement with the ACCESS® immunoassay system: analytical and clinical performance characteristics W1998, Clin. Chem., v.44, p.52-60.

38. Cole, H.A., and Perry, S.V, The phosphorylation of troponin I from cardiac muscle W1975, Biochem. J., v.149, p.525-533.

39. Collins, J.H., Potter, J.D., Horn, M.J., Wilshire, G., and Jackman, N. The amono acid sequence of rabbit skeletal muscle troponin C:gene replication and homology with calcium-binding proteins from carp and hake muscle W1973, FEBS Lett., v.36, p.268-272.

40. Cooper, T.A., and Ordahl, C.P. A single cardiac troponin T gene generates embryonic and adult isoforms via developmental^ regulated alternate splicing W1985, J. Biol. Chem., v.260, p.11140-11148.

41.Cortese, R., Monaci, P., Nicosia, A., Luzzago, A., Felici, F., Galfre, G., Pessi, A., Tramontano, A. and Sollazzo, M. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage W1995, Curr. Opin. Biotechnol., v.6, p.73-80.

42. Crivici, A., and Ikura, M. Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin W1995, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., v.24, p.85-116.

43.Cummins, P., Perry, S.V., Troponin I from human skeletal and cardiac muscles W1978, Biochem. J., v.171, p.251-259. .....-

44. Cummins, B., Cummins, P. and Aukland, M.L. Cardiac-specific troponin-l radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction W1987, Am. Heart J., v.113, p. 1333-1344.

45.da Silva, A.C.R., Dearanjo, A.H.B., Herzberg, 0., Moult, J., Sorenson, M., and Reinach, F.C. Troponin-C mutants with increased calcium affinity W1993, Eur. J. Biochem., v.213, p.599-604.

46.Dahiya, R., Butters, C.A., and Tobacman, L.S. Equilibrium linkage analysis of cardiac thin filament assembly. Implications for the regulation of muscle contraction W1994, J. Biol. Chem., v.269, p.29457-29461.

47. Dhoot, G.K., Gell, P.G.H., Perry, S.V., The localization of the different forms of troponin I in skeletal and cardiac muscle cells W1978, Exp. Cell. Res., v.117, p.357-370.

48.Di Lisa, F., De Tullio, R., Salamino, F., Barbato, R., Mellonim E., Siliprandi, N., Schiaffino, S. and Pontremoli, S. Specific degradation of troponin I and T by ^-calpain and its modulation by substrate phosphorylation W1995, Biochem.J., v.308, p.57-61.

49. Dobrovol'skij, A.B., and Gusev, N.B. Phosphorylation of troponin T and cation-binding properties of skeletal muscle troponin \\1982, Biochem.Mol.Biol. Inter., v.5, p.473-480.

50. Dobrovol'sky, A.B., Gusev, N.B., and Friedrich, P. Crosslinking of troponin complex with 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenzene. Identification of the crosslink formed between troponin C and troponin I in the absence of Ca2+ W1984, Biochim. Biophys. Acta, v.789, p. 144-151.

51.Dohet, C., Ruegg, J.C., Trayer, I.P., and al-Hillawi, E. Reconstitute of skinned cardiac fibres with human recombinant cardiac troponin-l mutants and troponin-C W1995, FEBS Lett., v.377, p. 131-134.

52. Dong, W.J., Cheung, H.C., Gordon, A.M., and Wang, C.K. Disparate fluorescence properties of 2-[4'-iodoacetamido,anilino]-naphthalene-6-sulfonic acid attached to Cys-84 and Cys-35 of troponin C in cardiac muscle \\1997a, Biophys. J., v.72, p.850-857.

53. Dong, W.J., Cheung, H.C., Solaro, R.J., She, M., Xinng, J., and Chandra, M. Phosphorylation-induced distance change in a cardiac muscle troponin I mutant \\1997b, Biochemistry, v.36, p.6754-6761.

54.Dong, W.J., Cheung, H.C., Solaro, R.J., Xinng, J., and Chandra, M. Conformation of the N-terminal segment of a monocysteine mutant of troponin I from cardiac muscle \\1997c, Biochemistry, v.36, p.6745-6753.

55.Ebashi, S., and Kodama, A. Interaction of troponin with F-actin in the presence of tropomyosin \\1966, J. Biochem., v.59, p.425-431.

56.Edes, I., and Kranias, E.G. Phospholamban and troponin I are substrates for protein kinase C in vitro but not in intact beating guinea pig hearts W1990, Circ. Res., v.67, p.394-400.

57.Eerd van, J.P., and Kawasaki, J. Effect of calcium II, on the interaction between the subunits of troponin and tropomyosin \\1973, Biochemistry, v. 12, p.4972-4980.

58. England, P. Phosphorylation of the inhibitory subunit of troponin in perfused hearts of mice deficient in phosphorylase kinase. Evidence for the phosphorylation of troponin by adenosine 3':5'-phosphate-dependent protein kinase in vivo W1977, Biochem. J., v.168, p.307-310.

59. England, P. Studies on the phosphorylation of the inhibitory subunit of troponin during modification of contraction in perfused rat heart \\1976, Biochem. J., v.160, p.295-304.

60.England, P.J., Stull, J.T., Huang, T.S., and Krebs, E.G. Phosphorylation and dephosphorylation of skeletal muscle troponin W1979, Metabolic Interconvertions of Enzymes, v.3, p. 175-184.

61.Farah, C.S., Miyamoto, C.A., Ramos, C.H.I., da Silva, A.C.R., Quaggio, R.B., Fujimori, K., Smillie, L.B., and Reinach, F.C. Structural and regulatory functions of the NH2- and COOH-terminal regions of skeletal muscle troponin I W1994, J. Biol. Chem., v.269, p.5230-5240.

62.Farah, C.S., and Reinach, F.C. The troponin complex and regulation of muscle contraction \\1995, FASEB J., v.9, p.755-767.

63. Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. and Cesareni, G. Selection of antibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector \\1991, J. Mol. Biol., v.222, p.301-310.

64. Ferrari, R. Metabolic disturbancies during myocardial ischemia and reperfusion W1995, Am. J. Cardiol., v.76, p.17B-24B.

65.Ferrieres, G., Calzolari, G., Mani, J.C., Laune, D., Trinquier, S., Laprade, M., Larue, C., Pau, B. and Granier, C. Human cardiac troponin I: precise identificayion of antigenic epitopes and prediction of secondary structure W1998, Clin. Chem., v.44, p.487-493.

66. Filatov, V, Katrukha, A, Bereznikova, A, Esakova, T., Bulargina, T, Kolosova, 0, Severin, E, and Gusev, N. Epitope mapping of anti-troponin I monoclonal antibodies W1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 45,1179-1187.

67. Fisher, D, Wang, G, and Tobacman, L.S. NH2-terminal truncation of skeletal muscle troponin T does not alter the Ca2+ sensitivity of thin filament assembly W1995, J. Biol. Chem, v.270, p.25455-25460.

68. Flicker, P.F, Phillips, G.N.Jr., and Cohen, C. Troponin and its interactions with tropomyosin. An electron microscope study W1982, J. Mol. Biol, v.162, p.495-501.

69. Frank, M. SPOT-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support \\1992, Tetrahedron, v.48, p.9217-9232.

70. Fujimori, K, Sorenson, M, Herzberg, O, Moult, J, and Reinach, F.C. Probing the calcium-induced conformational transition of troponin C with site-directed mutants W1990, Nature, v.345, p. 182-184.

71.Fujisawa, T, Ueki, T, and lida, S. Structural change of the troponin C molecule upon Ca2+ binding measured in solution by the X-ray scattering technique W1989, J. Biochem. Tokyo, v. 105, p.377-383.

72.Gagne, S.M, Li, M.X, and Sykes, B.D. Mechanism of direct coupling between binding and induced structural change in regulatory calcium binding proteins W1997, Biochemistry, v.36, p.4386-4392.

73.Galvani, M, Ottani, F, Ferrini, D, Ladenson, J.H, Destro, A, Baccos, D, Rusticali, F. and Jaffe, A.S. Prognostic influence of elevated values of cardiac troponin I in patients with unstable angina \\1997, Circulation, v.95, p.2053-2059.

74. Gao, W.D, Atar, D, Liu, Y, Perez, N.G, Murphy, A.M. and Marban, E. role of Tnl proteolysis in the pathogenesis of stunned myocardium W1997, Circ.Res, v.80, p.393-399.

75.Gamier, J, Gibrat, J.F. and Robson, B. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence W1996, Methods in Enzymology, v.266, p.540-553.

76.Geysen, H.M, Rodda, S.J, Mason, T.G, Tribbick, G. and Schoofs, P.G. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis W1987, J.Immunol.Methods, v. 102, p.259-274.

77. Gomez, B, Zuk, R. and Gibbons, I. Accuracy and specificity of the Alpha Dx™ system cardiac troponinl assay W1998, Clin. Chem, v.44, p.A121.

78. Gorza, L., Ausoni, S., Merciai, N., Hastings, K.E. and Schiaffino, S. Regional différencies in troponin I isoform switching during rat heart development W1993, Dev. Biol., v.156, p.253-264.

79.Grabarek, Z., Drabikowski, W., Leavis, P.C., Rosenfeld, S.S., and Gergely, J. Proteolytic fragments of troponin C. Interactions with the other troponin subunits and biological activity \\1981, J. Biol. Chem., v.256, p. 13121-13127.

80.Grabarek, Z., Leavis, P.C., and Gergely, J. Calcium binding to the low affinity sites in troponin C induces conformational changes in the high affinity domain. A possible route of information transfer in activation of muscle contraction W1986, J. Biol. Chem., v.261, p.608-613.

81.Grabarek, Z., Tan, R.-Y., Wang, J., Tao, T., and Gergely, J. Inhibition of mutant troponin C activity by an intra-domain disulphide bond W1990, Nature, v.345, p. 132135.

82.Grabarek, Z., Tao, T., and Gegely, J. Molecular mechanism of troponin-C function W1992, J. Muscle Res. Cell. Motility, v. 13, p.383-393.

83. Grand, R.J.A., Wilkinson, J.M., and Mole, L.E. The amino acid sequence of rabbit cardiac troponin IW1976, Biochem. J., v. 159, p.633-641.

84. Greaser, M.L., and Gergely, J. Reconstitution of troponin activity from three protein components \\1971, J. Biol. Chem., v.246, p.4226-4232.

85.Greig, A., Hirschberg, Y., Anderson, P.A.W., Hainsworth, C., and Malouf, N.N. Molecular basis of cardiac troponin T isoform heterogeneity in rabbit heart W1994, Circ. Res., v.74, p.41-47.

86.Gulati, J., Akella, A.B., Su, H., Mehler, E.L., and Weinstein, H. Functional role of arginine-11 in the N-terminal helix of skeletal troponin C: combined mutagenesis and molecular dynamics investigation W1995, Biochemistry, v.34, p.7348-7355.

87. Gulati, J., Babu, A., and Su, H. Functional delineation of the Ca2+,-deficient EF-hand in cardiac muscle, with genetically engineered cardiac-skeletal chimeric troponin C W1992, J. Biol. Chem., v.267, p.25073-25077.

88. Guo, X., Martin, A.F. and Solaro, R.J. Modulatory role of N-terminal TC-binding site of cardiac troponin I on activation of cardiac myofilament W1996, Biophys.J., v.70, p.A170.

89.Gusev, N.B., and Friedrich , P Ca2+-induced conformational changes in the troponin complex detected by crosslinking W1980, Biochim. Biophys. Acta, v.626, p. 106-116.

90.Gusev, N.B., Dobrovolskii, A.B., and Severin, S.E., Isolation and some properties of troponin T kinase from rabbit skeletal muscle W1980, Biochem. J., v. 189, p.219-226.

91.Gwathmey, J.K., and Hajjar, R.J. Intracellular calcium related to force development in twitch contraction of mammalian myocardium W1990, Circ. Res., v.67, p.744-752.

92.Harff, G.A., Backer, E.T. Radial immunodiffusion and immunoelectrophoresis compared for identifying autoantibodies to lactate dehydrogenase in human serum W1990, Clin. Chem. Acta., v. 193, p. 157-64.

93-Hartmann, M., Schrader, J., and Stumpe, T. 1-Adrenoceptor stimulation inhibits the isoproterenol-induced effects on myocardial contractility and protein phosphorylation W1995, Eur. J. Pharmacol., v.287, p.57-64.

94. Hartshorne, D.J., and Mueller, H. Fractionation of troponin into two distinct proteins W1968, Biochim. Biophys. Res. Commun., v.31, p.647-653.

95. Hartshorne, D.J., and Mueller, H. Studies on troponin W1969, Biochim. Biophys. Acta, v.175, p.301-308.

96.Hayden, M., Traphagen, L., Wilkins, J., Schmitz, E., Laird, D., Herrmann, and R., Mandecki W. Expression in Escherichia coli and affinity purification of a CKS-troponin I fusion protein W1995, Protein Expr. Purif., v.6, p.256-264.

97. Heeley, D.H., and Smillie, L.B. Interaction of rabbit skeletal muscle troponin T and F-actin at physiological ionic strength W1988, Biochemistry, v.27, p.8227-8232.

98.Horwitz, J., Bullard, B., and Mercola, D. Interaction of troponin subunits. The interaction between inhybitory and tropomyosin-binding subunits W1979, J. Biol. Chem., v.254, p.350-355.

99.Herzberg, O., and James, M.N.G. Structure of the calcium regulatory muscle protein troponin-C at 8 A resolution W1985, Nature, v.313, p.653-659.

100. Herzberg, 0., Moult, J., and James, M.N.G. A model for the Ca2+-induced conformational transition of troponin C. A trigger for muscle contraction W1986, J. Biol. Chem., v.61, p.2638-2644.

101. Heywood, S.M., Thibailt, M.C., and Siegel, E. Control of gene expression in muscle development \\1983, J.Muscle Res.Cell Motility, v.3, p. 157-193.

102. Hitchcock-DeGregory, S.E., Study of the structure of troponin-l by measuring the relative reactivities of lysines with acetic anhydride W1982, J. Biol. Chem., v.257, p.7372-7380.

103. Hitchcock, S.E. Regulation of muscle contraction: bindings of troponin and its components to actin and tropomyosin W1975, Biochemistry, v. 14, p.5162-5167.

104. Hitchcock, S.E. Study of the structure of troponin-C by measuring the relative reactivities of lysines with acetic anhydride W1981, J. Mol. Biol., v. 147, p. 153-173.

105. Hitchcock, S.E., Zimmerman, C.J., and Smalley, C. Study of the structure of troponin-T by measuring the relative reactivities of lysines with acetic anhydride W1981, J. Mol. Biol., v. 147, p. 125-151.

106. Houdusse, A., Love, M.L., Domínguez, R., Grabarek, Z., and Cohen, C. Structures of four Ca2+-bound troponin C at 2.0 A resolution: further insights into the Ca2+-switch in the calmodulin superfamily W1997, Structure, v.5, p. 1695-1711.

107. Ikura, M. Calcium binding and conformational responss in EF-hand proteins W1996, Trends in Biochem. Sci., v.21, p. 14-17.

108. Ingraham, R.H., and Swenson, C.A. Binary interactions of troponin subunits W1984, J. Biol. Chem., v.259, p.9544-9548.

109. Jacquet, L., Noirhomme, P., Khouty, G.E., Goenen, M., Philippe, M., Col, J. And Dion, R. Cardiac troponin I as an early marker of myocardial damage after coronary bypass surgery W1998, Eur. J. Car.-Thor. Surg., v. 13, p.378-384.

110. Jaffe, A.S., Landt, Y., Parvin, C.A., Abendschein, D.R., Geltman, E.M. and Ladenson, J.H. Comparative sensitivity of cardiac troponin I and lactate dehydrogenase isoenzymes for diagnosing acute myocardial infarction W1996, Clin. Chem., v.42, p.1770-1776.

111. Jha P.K., Mao C., and Sarkar S. Photo-cross-linking of rabbit skeletal troponin I deletion mutants with troponin C and its thiol mutants: the inhibitory region enhances binding of troponin I fragments to troponin C W1996, Biochemistry, v.35, p. 1102611035.

112. Jha, P.K., Leavis, P.C., and Sarkar, S. Interaction of deletion mutants of troponins I and T: COOH-terminal truncation of troponin T abolishes troponin I binding and reduces Ca2+ sensitivity of the reconstituted regulatory system W1996, Biochemistry, v.35, p. 16573-16580.

113. Jideama N.M., Kuo J.F., Hannun Y.A., Blumberg P.M., Kazanietz M.G., Fabbro D., Blobe G.C., Raynor R.L., and Noland T.A. Jr. Phosphorylation specificities of protein kinase C isozymes for bovine cardiac troponin I and troponin T and sites within these

proteins and regulation of myofilament properties W1996, J. Biol. Chem., v.271, p.23277-23783.

114. Jin, J.P., Huang, Q.Q., Yeh, H.I., and Lin, J.J.C. Complete nucleotide sequence and structural organization of rat cardiac troponin T gene. A single gene generates embryonic and adult isoforms via developmental^ regulated alternative splicing W1992, J. Mol. Bol., v.227, p. 1269-1276.

115. Johne, B. Epitope mapping by surface plasmon resonance in the BIAcore W1998, Mol.Biotechnol., v.9, p.65-71.

116. Johnson, J.D., Charlton, S.C., and Potter, J.D. A fluorescence stopped flow analysis of Ca2+ exchange with troponin С W1979, J. Biol. Chem., v.254, p.3497-3502.

117. Julian, D.G. Клиника и диагностика. В кн.: Международное руководство по инфаркту миокарда (под. ред. R.W.F.Campbell) W1997, М., р.27-30.

118. Katrukha, A.G., Bereznikova, A.V., Esakova, T.V., Filatov, V.L., Bulargina, T.V., and Gusev, N.B. A new method of human cardiac troponin I and troponin T purification W1995, Biochem. Mol. Biol. Int., v.36, p. 195-202.

119. Katrukha, A.G., Bereznikova, A.V., Esakova, T.V., Pettersson, K., Lovgren, Т., Severina, M.E., Pulkki, K., Vuopio-Pulkki, L.M. and Gusev, N.B. Troponin i is released in bloodsteram of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex \\1997, Clin.Chem., v.43, p.1379-1385.

120. Kaumann, A.J., Krause, E.G., Karczewski, P., Kuschel, M., Bartel, S., Lynham, J.A., and Sanders, L. Beta 2-adrenoceptor activation by zinterol causes protein phosphorylation, contractile effects and relaxant effects through a cAMP pathway in human atrium W1996, Mol. Cell. Biochem., v. 163-164, p. 113-123.

121. Kaumann, A.J., and Molenaar, P. Modulation of human cardiac function through 4 beta-adrenoceptor populations W1997, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., v.355, p.667-681.

122. Keffer, J.H. Myocardial markers of injury: evolutions and insights W1996, Am. J. Clin. Pathol., v.105, p.305-320.

123. Kimura, A., Harada, H., Park, J.E., Nishi, H., Satoh, M., Takahashi, M., Hiroi, S., Sasaoka, Т., Ohbuchi, N., Nakamura, Т., Koyanagi, Т., Hwang, Т.Н., Choo, J.A., Chung, K.S., Hasegawa, A., Nagai, R., Okazaki, 0., Nakamura, H., Matsuzaki, M., Sakamoto, Т., Toshima, H., Кода, Y., Imaizumi, T. and Sasazuki, T. Mutations in the

cardiac troponin I gene associated with hypertrophic cardiomyopathy W1997, Nature, v.14, p.379-382.

124. Kobayashi, T., Grabarek, Z., Gergely, J., and Collins, J.H. Extensive interactions between troponins C and I. Zero-length cross-linking of troponin I and acetylated troponin C W1995, Biochemistry, v.34, p. 10946-10952.

125. Kobayashi, T., Leavis, P.C., and Collins, J.H. Interaction of a troponin I inhibitory peptide with both domains of troponin C W1996, Biochim. Biophys. Acta, v. 1294, p.25-30.

126. Kobayashi, T., Tao, T., Grabarek, Z., and Gergely, J. Cross-linking of residue 57 in the regulatory domain of a mutant rabbit skeletal muscle troponin C to the inhibitory region of troponin I W1991, J. Biol. Chem., v.266, p. 13746-13751.

127. Kogler, H., and Ruegg, J.C. Cardiac contractility: modulation of myofibrillar calcium sensitivity by beta-adrenergic stimulation \\1997, Isr. J. Med. Sci., v.33, p.1-7.

128. Kohler, G. and Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity W1975, Nature, v.256, p.495-497.

129. Kranias, E.G., and Solaro, R.J. Phosphorylation of troponin I and phospholamban during catecholamine stimulation of rabbit heart W1983, Fed. Proc., v.42, p.33-38.

130. Krudy, G.A., Kleerekoper, Q., Guo, X., Howarth, J.M., Solaro, R.J., and Rosevear, P.R. NMR studies delineating spatial relationships within the cardiac troponin I-troponin C complex \\1994, J. Biol. Chem., v.269, p.23731-23735.

131. Kyte, J. and Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein \\1982, v. 157, p. 105-132.

132. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 W1970, Nature, v.227, p.680-685.

133. Lam, K.S. A one-bead one-peptide combinatorial peptide library method for B-cell epitope mapping W1996, Methods, v.9, p.482-493.

134. Lamkin, M., Tao, T., and Lehrer, S.S. Tropomyosin-troponin and tropomyosin-actin interactions: a fluorescence quenching study \\1983, Biochemistry v.22, p.3053-3058.

135. Lan, J.; Albaugh, S., and Steiner, R.F. Interactions of troponin I and its inhibitory fragment residues 104-115, with troponin C and calmodulin W1989, Biochemistry, v.28, p.7380-7385.

136. Larue, C, Defacque-Lacquement, H., Calzolari, C, Nguyen, D.L. and Pau, B. New monoclonal antibodies as probes for human cardiac troponin I: epitopic analysis with synthetic peptides \\1992, Mol. Immunol, v.29, p.271-278.

137. Laver, W.G, Air, G.M, Webster, R.G. and Smith-Gill, S.J. Epitopes on protein antigens: misconceptions and realities \\1990, Cell, v.61, p.553-556.

138. Leszyk, J, Grabarek, Z, Gergely, J, and Collins, J.H. Characterization of zero-length cross-links between rabbit skeletal muscle troponin C and troponin I: evidence for direct interaction between the inhibitory region of troponin I and the NH2-terminal, regulatory domain of troponin C W1990, Biochemistry, v.29, p.299-301.

139. Leszyk, J, Tao, T, Leavis, P.C, and Collins, J.H. Cross-linking of rabbit skeletal muscle troponin subunits: labeling of cysteine-98 of troponin C with 4-maleimidobenzophenone and analysis of products formed in the binary complex with troponin T and the ternary complex with troponins I and T W1987, Biochemistry, v.26, p.7035-7042.

140. Leszyk, J, Dumaswala, R, Potter, J.D, Gusev, N.B, Verin, A.D, Tobacman, L.S, and Collins, J.H. Bovine cardiac troponin T: amino acid sequences of the two isoforms U1987, Biochemistry, v.26, p.7035-7042.

141. Leszyk, J, Collins, J.H, Leavis, P.C, and Tao, T. Cross-linking of rabbit skeletal muscle troponin subunits: labeling of cysteine-98 of troponin C with 4-maleimidobenzophenone and analysis of products formed in the binary complex with troponin T and the ternary complex with troponins I and T W1988, Biochemistry, v.27, p.6983-6987.

142. Levine, B.A, Moir, A.J.R, and Perry, S.V. The interaction of troponin-l with the N-terminal region of actin W1988, Eur. J. Biochem, v.172, p.389-397.

143. Li, P, Anversa, P, Meggs, L.G, Sonnenblick, E.H, Cheng, W, Malhotra, A, and Hoffmann, P.A. Myocardial infarction alters myofilament calcium sensitivity and mechanical behavior of myocytes W1997, Am. J. Physiol, v.272, p.H360-H370.

144. Li, M.X, Sykes, B.D, Smillie, L.B.; Kay, C.M.; Tsuda, S, and Gagne, S.M. Calcium binding to the regulatory N-domain of skeletal muscle troponin C occurs in a stepwise manner \\1997, Biochemistry, v.34, p.8330-8340.

145. Liao, R, Wang, C.K, and Cheung, H.C. Rotational dynamics of skeletal muscle troponin C W1994, Biochemistry, v.33, p. 12729-12734.

146. Lincoln, T.M., and Corbin, J.D. Purified cyclic GMP-dependent protein kinase catalyzes the phosphorylation of cardiac troponin inhibitory subunit TN-1 W1978, J. Biol. Chem., v.253, p.337-339.

147. Liu, X., Dhalla, N.S., and Takeda, N. Troponin I phosphorylation in heart homogenate from diabetic rat \\1996, Biochim. Biophys. Acta, v. 1316, p.78-84.

148. Liu, J.D., Wood, J.G., Raynor, R.L., Wang, Y.C., Noland, T.A.Jr., Ausari, A.A., and Kuo, J.F. Subcellular distribution and immunocytochemical localization of protein kinase C in myocardium, and phosphorylation of troponin in isolated myocytes stimulated by isoproterenol or phorbol ester \\1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., v.162, p.1105-1110.

149. Liu, W., Dotson, D.G., Lin, X., Mullen, J.J., Gouzalez-Garay, M.L., Lu, Q., and Putkey, J.A. The presence but not the sequence of the N-terminal peptide in cardiac TnC is important for function W1994, FEBS Lett., v.347, p.152-156.

150. Lovgren, T., Hemmila, I., Petersson, K. and Halonen, P. Time-resolved fluorometry in immunoassay W1985, in: Alternative Immunoassays, (Ed. by Collins, W.P.), John Wiley and Sons Ltd., p.203-217.

151. MacGeogh, G., Barton, P.J., Vallins, P.J., Bhavzar, P., and Spurr, N.K. The human cardiac troponin I locus: assignment to chromosome 19p1 2-19q1 W1991, Hum. Genet., v.88, p. 101-104.

152. Mair, J., Puschendorf, B and Michel, G. Clinical significance of cardiac contractile proteins for the diagnosis of myocardial injury \\1994, Adv. Clin. Chem., v.31, p.63-98.

153. Mair, J., Wagner, I., Morass, B., Fridrich, B., Lechleitner, P., Ddienstl, F., Calzolari, C., Larue, C. and Puschendorf, B. Cardiac troponin I release correlates with myocardial infarction size\\1995, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., v.33, p.869-872.

154. Mair, J., Genzer, N., Morandell, D., Maier, J., Mair, P., Lechleitner, P., Calzolari, G., Larue, C., Ambach, E., Dienstl, F., Pau, B. And Puschendorf, B. Cardiac troponin I in the diagnosis of myocardial injury and infarction W1996, Clin. Chim. Acta, v.245, p. 1938.

155. Mak, A.S., Golosinska, K., and Smilllie, L.B. Induction of nonpolymerizable tropomyosin binding to F-actin by troponin and its components W1983, J. Biol. Chem., v.258, p. 14330-14334.

156. Mak, A.S., and Smillie, L.B. Structural interpretation of the two-site binding of troponin on the muscle thin filament \\1981, J. Mol. Biol., v. 149, p.541-550.

157. Malhotra, A., Buttrick, P., Bowman, J., and Nakouzi, A. Expression and regulation of mutant forms of cardiac Tnl in a reconstituted actomyosin system: role of kinase dependent phosphorylation \\1997, Mol. Cell. Biochem., v.170, p.99-107.

158. McLaurin, M.D., Apple, f.S., Voss, E.m., Herzog, C.A. and Sharkey, S.W. Cardiac troponin I, cardiac troponin T, and creatine kinase MB in dyalisis patients without ischemic heart disease; evidence of cardiac troponin T expression in skeletal muscle W1997, Clin. Chem., v.43, p.976-982.

159. Malnic, B., Farah, C.S., and Reinach, F.C. Regulatory properties of the NH2- and COOH-terminal domains of troponin T. ATPase activation and binding to troponin I and troponin C W1998, J. Biol. Chem., v.273, p. 10594-10601.

160. Mazzei, G.J., and Kuo, J.F. Phosphorylation of skeletal-muscle troponin I and troponin T by phospholipid-sensitive Ca2+-dependent protein kinase and its inhibition by troponin C and tropomyosin W1984, Biochem. J., v.218, p.361-369.

161. McAuliffe, J.J., Gao, L., and Solaro, R.J. Changes in myofibrillar activation and troponin C Ca2+ binding associated with troponin T isoform switching in developing rabbit \\1990, Circ. Res., v.66, p. 1204-1216.

162. McConnel, B.K., Bond, M., Morano, I., and Moravec, C.S. Troponin I phosphorylation in spontaneously hypertensive rat heart: effect of beta-adrenergic stimulation \\1997, Am. J. Physiol., v.273, p.H1440-H1451.

163. McKay, R.T., Tripet, B.F., Hodges, R.S., and Sykes, B.D. Interaction of the second binding region of troponin I with the regulatory domain of skeletal muscle troponin C as determined by NMR spectroscopy \\1997, J. Biol. Chem., v.272, p.28494-28500.

164. Mehegan, J.P., and Tobacman, L.S. Cooperative interactions between troponin molecules bound to the cardiac thin filament W1991, J. Biol. Chem., v.66, p.966-972.

165. Merienne, K., Germain, N., Zinn-Justin, S., Boulain, J.C., Ducancel, F. and Menez, A. The functional architecture of an acetilcholine receptor mimicking antibody W1997, J.Biol.Chem., v.272, p.23775-23783.

166. Mesnard, L., Samson, F., Espinasse, I., Durand, J., Neveux, J.-Y., and Mercadier, J.J. Molecular cloning and developmental expression of human cardiac troponin T W1993, FEBS Lett., v.328, p.139-144.

167. Moir, A.J.G., Cole, H.A., and Perry, S.V. The phosphorylation sites of troponin T from white skeletal muscle and the effects of interaction with troponin C on their phosphorylation by phosphorylase kinase W1977, Biochem. J., v.161, p.371-382.

168. Moir, A.J.G., Solaro, R.J. and Perry, S.V. The site of phosphorylation of troponin I from perfused rabbit heart \\1980, Biochem. J., v. 185, p.505-513.

169. Moudallal, Z.A., Briand, J.P. and van Regenmortel, M.H.V. Monoclonal antibodies as probes of the antigenic structure of tobacco mosaic virus W1982, EMBO J., v.1, p. 1005-1010.

170. Nassar, R., Malouf, N.N., Kelly, M.B., Oakeley, A.E., Anderson, P.A.W., Force-pCa relation and troponin T isoforms of rabbit myocardium W1991, Circ. Res., v.69, p. 14701475.

171. Negele, J.C., Dotson, J.D., Liu, W., Sweeney, H.L., and Putkey, J.A. Mutation of the high affinity calcium binding sites in cardiac troponin C W1992, J. Biol. Chem., v.267, p.825-831.

172. Neumann, J., Watanabe, A.M., Scholz, H., Schmitz, W., Rask, H.T., Krause, E.G., Bartel, S., Bodor, G.S., Jones, L.R., and Gupta, R.C. Interaction of-adrenoceptor and adenosine receptor agonists on phosphorylation. Identification of target proteins in mammalian ventricles \\1995, J. Mol. Cell. Cardiol., v.27, p.1655-1667.

173. Ngai, S.M., Sonnichsen, M.D., and Hodges, R.S. Photochemical cross-linking between native rabbit skeletal troponin C and benzoylbenzoyl-troponin I inhibitory peptide, residues 104-111 W1994, J. Biol. Chem., v.269, p.2165-2172.

174. Nishizuka, Y. Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses W1995, FASEB J., v.9, p.484-496.

175. Noland, T.A. Jr., and Kuo, J.F. Protein kinase C phosphorylation of cardiac troponin I or troponin T inhibits Ca2+,-stimulated actomyosin MgATPase activity W1991, J. Biol. Chem., v.266, p.4974-4978.

176. Noland, T.A. Jr., Kuo, J.F., Solaro, R.J., Averyhart-Fullard, V., Jideama, N.M., Raynor, R.L., and Guo, X. Cardiac troponin I mutants. Phosphorylation by protein kinases C and A and regulation of Ca2+,-stimulated MgATPase of reconstituted actomyosin S1 W1995, J. Biol. Chem., v.270, p.25445-25454.

177. Noland, T.A. Jr., Kuo, J.F., Solaro, R.J., Blumberg, P.M., Kazanietz, M.G., Guo, X., Jideama, N.M., and Raynor, R.L. Differential regulation of cardiac actomyosin S-1 MgATPase by protein kinase C isozyme-specific phosphorylation of specific sites in cardiac troponin I and its phosphorylation site mutants W1996, Biochemistry, v.35, p. 14923-14931.

178. Noland, T.A.Jr., and Kuo, J.F. Protein kinase C phosphorylation of cardiac troponin I and troponin T inhibits Ca2+,-stimulated MgATPase activity in reconstituted actomyosin and isolated myofibrils, and decreases actin-myosin interactions W1993, J. Mol. Cell. Cardiol., v.25, p.53-65.

179. Noland, T.A.Jr., and Kuo, J.F. Protein kinase C phosphorylation of cardiac troponin T decreases Ca2+,-dependent actomyosin MgATPase activity and troponin T binding to tropomyosin-F-actin complex \\1992, Biochem. J., v.288, p.123-129.

180. Noland, T.A.Jr., Raynor, R.L., and Kuo, J.F. Identification of sites phosphorylated in bovine cardiac troponin I and troponin T by protein kinase C and comparative substrate activity of synthetic peptides containing the phosphorylation sites W1989, J. Biol. Chem., v.264, p.20778-20785.

181. Ohtsuki, I., and Nagano, K. Molecular arrangement of troponin-tropomyosin in the thin filament \\1982, Adv. Biophys., v.15, p.93-130.

182. Olah, G.A., Rokop, S.E., Wang, C.L., Blechner, S.L., and Trewhella, J. Troponin I encompasses an extended troponin C in the Ca2+,-bound complex: a small-angle X-ray and neutron scattering study W1994, Biochemistry, v.33, p.8233-8239.

183. Olah, G.A., and Trewhella, J. A model structure of the muscle protein complex 4Ca2+.troponin C.troponin I derived from small-angle scattering data: implications for regulation W1994, Biochemistry, v.33, p. 12800-12806.

184. Pan, B.S., Gordon, A.M., and Potter, J.D. Deletion of the first 45 NH2-terminal residues of rabbit skeletal troponin T strengthens binding of troponin to immobilized tropomyosin \\1991, J. Biol. Chem., v.266, p. 12432-12438.

185. Pan, B.S., and Potter, J.D. Two genetically expressed troponin T fragments representing alpha and beta isoforms exhibit functional differences W1992, J. Biol. Chem., v.267, p.23052-23056.

186. Parry, D.A.D. Analysis of the amino acid sequence of a tropomyosin-binding fragment from troponin-T\\1981, J. Mol. Biol., v.146, p.259-263.

187. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. Evidence for two-site binding of troponin I inhibitory peptides to the N and C domains of troponin C W1995, Biochemistry, v.34, p.6932-6940.

188. Pearlstone, J.R., Sykes, B.D., and Smillie, L.B. Interactions of structural C and regulatory N domains of troponin C with repeated sequence motifs in troponin I W1997, Biochemistry, v.36, p.7601-7606.

189. Pearlstone, J.R., Carpenter, M.R., Johnon, P., and Smillie, L.B. Amino-acid sequence of tropomyosin-binding component of rabbit skeletal muscle troponin W1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.73, p. 1902-1906.

190. Pearlstone, J.R., Carpenter, M.R., and Smillie, L.B. Amino acid sequence of rabbit cardiac troponin TW1986, J. Biol. Chem., v.261, p. 16795-16810.

191. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. Identification of a second binding region on rabbit skeletal troponin-T for-tropomyosin \\1981, FEBS Lett., v. 128, p. 119-122.

192. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. Troponin T fragments: physical properties and binding to troponin C W1978, Can. J. Biochem., v.56, p.521-527.

193. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. The binding site of skeletal -tropomyosin on troponin-T \\1977, Can. J. Biochem., v.55, p.1032-1038.

194. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. The interaction of rabbit skeletal muscle troponin-T fragments with troponin-l W1985, Can. J. Biochem., v.63, p.212-218.

195. Pearlstone, J.R., and Smillie, L.B. Effects of troponin-l plus-C on the binding of troponin-T and its fragments to alpha-tropomyosin. Ca2+ sensitivity and cooperativity W1983, J. Biol. Chem., v.258, p.2534-2542.

196. Perry, S.V., and Cole, H.A. Phosphorylation of troponin and the effects of interactions between the components of the complex W1974, Biochem. J., v.141, p.733-743.

197. Petrakou, E., Murray, A. and Price, M.R. Epitope mapping of anti-MUC1 mucin protein core monoclonal antibodies \\1998, Tumour Biol., v.19, p.21-29.

198. Potter, J.D., and Gergely, J. The regulatory system of the actin-myosin interaction \\1974, Biochemistry, v. 13, p.2697-2703.

199. Potter, J.D., Sheng, Z., Pan, B.S., and Zhao, J. A direct regulatory role for troponin T and a dual role for troponin C in the Ca2+ regulation of muscle contraction W1995, J. Biol. Chem., v.270, p.2557-2562.

200. Potter, J.D., and Gergely, J. The calcium and magnesium binding sites on troponin and their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase W1975, J. Biol. Chem, v.250, p.4628-4633.

201. Jefferis, R. And Deverill, I., The antigen-antibody reaction W1993 (In: Price, C.P., Newman, D.J. Principles and practice of immunoassay), Stockton Press, p. 1-14.

202. Putkey, J.A, Dotson, D.G, and Mouawad, P. Formation of inter- and intramolecular disulfide bonds can activate cardiac troponin C W1993, J. Biol. Chem, v.268, p.6827-6830.

203. Quirk, P.G, Perry, S.V., Levine, B.A, Gao, Y, and Patchell, V.B. Sequential phosphorylation of adjacent serine residues on the N-terminal region of cardiac troponin-l: structure-activity implications of ordered phosphorylation W1995, FEBS Lett., v.370, p.175-178.

204. Ramakrishnan, S., and Hitchcock-DeGregori, S.E. Structural and functional significance of aspartic acid 89 of the troponin C central helix in Ca2+ signaling W1996, J. Biol. Chem., v.35, p. 15515-15521.

205. Rarick, H.M., Tu, X.-H, Solaro, R.J., and Martin, A.F. The C terminus of cardiac troponin I is essential for full inhibitory activity and Ca2+ sensitivity of rat myofibrils W1997, J. Biol. Chem., v.272, p.26887-26892.

206. Reinach, F.C., and Karlsson, R. Cloning, expression, and site-directed mutagenesis of chicken skeletal muscle troponin C W1988, J. Biol. Chem, v.263, p.2371-2376.

207. Riechmann, L, Clark, M, Waldmann, H. and Winter, G. Reshaping the human antibodies for therapy \\1988, Nature, v.332, p.323-327.

208. Risnik, V.V, Dobrovolskii, A.B, and Gusev, N.B. Phosphorylase kinase phosphorylation of skeletal muscle troponin T \\1980, Biochem. J, v.191, p.851-854.

209. Risnik, V.V, and Gusev, N.B. Some properties of the nucleotide-binding site of troponin T kinase-casein kinase type II from skeletal muscle W1984, Biochim. Biophys. Acta, v.790, p. 108-116.

210. Risnik, V.V, Vorotnikov, A.V, and Gusev, N.B. Phosphorylation of troponin T by Ca-phospholipid-dependent protein kinase W1987, Biomed. Biochim. Acta, v.8/9, p.444-447.

211. Robertson, S.P, Jhonson, J.D, Holroyde, M.J, Kranias, E.G., Potter, J.D, and Solaro, R.J. The effect of troponin I phosphorylation on the Ca2+-binding properties of the Ca2+-regulatory site of bovine cardiac troponin W1982, J. Biol. Chem, v.257, p.260-263.

212. Roitt, I.M, Male, D.K, Brostoff, J. Immunology, 1996, Mosby, UK, p.3-6.

213. Ruegg, J.C., Zengner, C., Van Eyk, J.E., Kay, C.M., and Hodges, R.S. Inhibition of Tnl-TnC interaction and contraction of skinned muscle fibres by the synthetic peptide Tnl [104-115] \\1989, Pflugers Arch., v.414, p.430-436.

214. Sasse, S., Brand, N.J., Kyprianou, P., Dhoot, G.K., Wade, R., Arai, M., Periasamy, M., Yacoub, M., and Barton P.J. Troponin I gene expression during human cardiac development and in end-stage heart failure W1993, Circ. Res., v.72, p.932-938.

215. Sayle, R.A., and Milner-White, E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all U1995, Trends Biochem. Sci., v.20, p.374-376.

216. Schachat, F.H., Bronson, D.D., and McDonald, O.B. Heterogeneity of contractile proteins, A continuum of troponin-tropomysoin expression in mammalian skeletal muscle \\1985, J. Biol. Chem., v.260, p. 1108-1113.

217. Sheng, Z., Pan, B.-S., Miller, T.E., and Potter, J.D. Isolation, expression, and mutation of a rabbit skeletal muscle cDNA clone for troponin I. The role of the NH2 terminus of fast skeletal muscle troponin I in its biological activity W1992, J. Biol. Chem., v.267, p.25407-25413.

218. Sheng, Z., Strauss, W.L., Francois, J.-M., and Potter, J.D. Evidence that both Ca2+,-specific sites of skeletal muscle TnC are required for full activity W1990, J. Biol. Chem., v.265, p.21554-21560.

219. Sheshberadaran, H., and Payne, L.G. Protein antigen-monoclonal antibody contact sites investigated limited proteolysis of monoclonal antibody-bound antigen: protein footprinting \\1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, v.85, p.1-5.

220. Slupsky, C.M., and Sykes, B.D. NMR solution structure of calcium-saturated skeletal muscle troponin C W1995, Biochemistry, v.34, p. 15953-15964.

221. Smith, S.C., Ladenson, J.H., Mason, J.W. and Jaffe, A.S. Elevation of cardiac troponinl associated with myocarditis \\1997, Circulation, v.95, p.163-168.

222. Smith, L., Greenfield, N.J., and Hitchcock-DeGregori, S.E. The effects of deletion of the amino-terminal helix on troponin C function and stability W1994, J. Biol. Chem., v.269, p.9857-9863.

223. Smith-Gill, S.J. Protein epitopes: functional vs. structural definitions W1994, Res. Immunol., v.145, p.67-70.

224. Sobel, B.E. and Shell, W.E. Serum enzyme determination in the diagnosis ans assessment of myocardial infarction \\1972, Circulation, v.45, p.471-482.

225. Solaro, R.J., Moir, A.J., and Perry, S.V. Phosphorylation of troponin I and the inotropic effect of adrenaline in the perfused rabbit heart W1976, Nature, v.262, p.615-617.

226. Solaro, R.J., Powers, F.M., Gao, L., and Gwathmey, J.K. Relationship of abnormal intracellular calcium mobilisation to myocyte hypertrophy in human ventricular myocardium \\1993, Circulation, v. 87, p. 38-43.

227. Stefancsik, R., Jha, P.K., and Sarkar, S. Identification and mutagenesis of a highly conserved domain in troponin T responsible for troponin I binding: potential role for coiled coil interaction W1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.95, p.957-962.

228. Strang, K.T., Moss, P.L., 1-adrenergic receptor stimulation decreases maximum shortening velocity of skinned single ventricular myocytes from rats W1995, Circ. Res., v.77, p. 114-120.

229. Strynadka, N.C.; James, M.N.. Smillie, L.B., Li, M.X., Sielecki, A.R., and Cherney, M. Structural details of a calcium-induced molecular switch: X-ray crystallographic analysis of the calcium-saturated N-terminal domain of troponin C at 1.75 A resolution W1997, J. Mol. Biol., v.273, p.238-255.

230. Strynadka, N.C.J., and James, M.N.J. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins \\1989, Annu. Rev. Biochem., v.58, p.951-998.

231. Sulakhe, P.V., and Vo, X.T. Regulation of phospholamban and troponin-l phosphorylation in the intact rat cardiomyocytes by adrenergic and cholinergic stimuli: roles of cyclic nucleotides, calcium, protein kinases and phosphatases and depolarization \\1995, Mol. Cell. Biochem., v.149-150, p.103-126.

232. Sundaralingam, M., Drendel, W., and Greaser, M. Stabilization of the long central helix of troponin C by intrahelical salt bridges between charged amino acid side chains W1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.82, p.7944-7947.

233. Sutoh, K., and Matsuzaki, F. Millisecond photo-cross-linking of protein components in vertebrate striated muscle thin filaments W1980, Biochemistry, v. 19, p.3878-3882.

234. Swenson, C.A., and Fredricksen, R.S. Interaction of troponin C and troponin C fragments with troponin I and the troponin I inhibitory peptide W1992, Biochemistry, v.31, p.3420-3429.

235. Swiderek, K., Heilmeyer, L.M. Jr., Hoffmann, F., Schachtele, C., Meyer, H.E., and Jaquet, K. Sites phosphorylated in bovine cardiac troponin T and I. Characterization

by 31P-NMR spectroscopy and phosphorylation by protein kinases W1990, Eur. J. Biochem., v.190, p.575-582.

236. Syska, H., Perry, S.V., and Trayer, I.P. A new method of preparation of troponin I inhibitory protein, using affinity chromatography. Evidence for three different forms of troponin I in striated muscle W1974, FEBS Lett., v.40, p.253-257.

237. Syska, H., Wilkinson, J.M., Grand, R.J., and Perry, S.V. The relationship between biological activity and primary structure of troponin I from white skeletal muscle of the rabbit \\1976, Biochem. J., v. 153, p.375-387.

238. Szczesna, D., Guzman, G., Miller, T., Zhao, J., Farokhi, K., Ellemberger, H., and Potter, J.D. The role of the four Ca2+ binding sites of troponin C in the regulation of skeletal muscle contraction W1996, J. Biol. Chem., v.271, p.8381-8386.

239. Takeishi, Y., Chu, G., Kirkpatrick, D.M., Li, Z., Wakasaki, H., Kranias, E.G., King, G.L. and Walsh, R.A. In vivo phosphorylation of cardiac Tnl by protein kinase Cp2 decreases cardiomyocyte calcium responsiveness and contractility in transgenic mousw hearts \\1998, J.Clin.Invest., v.102, p.72-78.

240. Talbot, J.A., and Hodges, R.S. Synthesis and biological activity of an icosapeptide analog of the actomyosin ATPase inhibitory region of troponin I W1979, J. Biol. Chem., v.254, p.3720-3723.

241. Talbot, J.A., and Hodges, R.S. Synthetic studies on the inhibitory region of rabbit skeletal troponin I. Relationship of amino acid sequence to biological activity W1981, J. Biol. Chem., v.256, p.2798-2802.

242. Talbot, J.A., and Hodges, R.S. Comparative studies on the inhibitory region of selected species of troponin-l. The use of synthetic peptide analogs to probe structure-function relationships \\1981, J. Biol. Chem., v.256, p. 12374-12378.

243. Talosi, L., and Kranias, E.G. Effect of -adrenergic stimulation on activation of protein kinase C and phosphorylation of proteins in intact rabbit hearts W1992, Circ. Res., v.70, p.670-678.

244. Tao, T., Gong, B.-J., and Leavis, P.C. Calcium-induced movement of troponin-l relative to actin in skeletal muscle thin filaments W1990, Science, v.247, p. 1339-1341.

245. Tao, T., Gowell, E., Strasburg, G.M., Gergely, J., and Leavis, P.C. Ca2+ dependence of the distance between Cys-98 of troponin C and Cys-133 of troponin I in the ternary troponin complex. Resonance energy transfer measurements W1989, Biochemistry, v.28, p.5902-5908.

246. Tao, T., Scheiner, C., and Lamkin, M. Site-specific photo-cross-linking studies on interactions between troponin and tropomyosin and between subunits of troponin W1986, Biochemistry, v.25, p.7633-7639.

247. Tobacman, L.S. Thin filament-mediated regulation of cardiac contraction W1996, Annu. Rev. Physiol., v.58, p.447-481.

248. Tobacman, L.S., Lee, R., Isolation and functional comparison of bovine cardiac troponin T isoforms W1987, J. Biol. Chem., v.262, p.4059-4064.

249. Townsend, P.J., Barton P.J.R., Yacoub, M.H., and Farza, H. Molecular cloning of human cardiac troponin T isoforms: expression in developing and failing heart W1995, J. Mol. Cell. Cardiol., v.27, p.2223-2236.

250. Tripet B., Van Eyk J.E., Hodges R.S., Mapping of a second actin-tropomyosin and a second troponin C binding site within the C terminus of troponin I, and their importance in the Ca2+-dependent regulation of muscle W1997, J. Mol. Biol., v.271, p.728-750.

251. Tsalkova, T.N., and Privalov, P.L. Thermodynamic study of domain organization in troponin C and calmodulin \\1985, J. Mol. Biol., v. 181, p.533-544.

252. Tsuda, S., Aimoto, S., and Hikichi, K. 1H-NMR study of Ca2+,-and Mg2+,-dependent interaction between troponin C and troponin I inhibitory peptide 96-116 W1992, J. Biochem. Tokyo, v. 112, p.665-70.

253. Tzioufas, A.G., Yiannaki, E., Sakarellos-Daitsiotis, M., Routsias, J.G., Sakarellos, C. And Moutsapoulos, H.M. Fine specificity of autoantibodies to La/SSB epitope mapping, and characterization \\1997, Clin.Exp.lmmunol., v.108, p.191-198.

254. Vahlensieck, U., Schmitz, W., Scheld, H.H., Deng, M.C., Zidek, W., Schluter, H., Herzig, S., Neumann, J., Muller, F.U., Linck, B., Knapp, J., and Boknik, P. Negative chronotropic and inotropic effects exerted by diadenosine hexaphosphate AP6A, via A1-adenosine receptors \\1996, Br. J. Pharmacol., v.19, p.835-844.

255. Van Eerd, J.-P., and Takahashi, K. The amino acid sequence of bovine cardiac tamponin-C. Comparison with rabbit skeletal troponin-C W1975, Biochem. Biophys. Res. Commun., v.64, p. 122-127.

256. Van Eyk, J.E., and Hodges, R.S. The biological importance of each amino acid residue of the troponin I inhibitory sequence 104-115 in the interaction with troponin C and tropomyosin-actin \\1988, J. Biol. Chem., v.263, p.1726-1732.

257. Van Eyk, J.E. and Solaro, R.J. Altered interactions among thin filament proteins modulate cardiac function \\1996, J.Mol.Cell.Cardiol., v.28, p.217-230.

258. Van Eyk, J.E., Strauss, J.D., Hodges, R.S., and Ruegg, J.C. A synthetic peptide mimics troponin I function in the calcium-dependent regulation of muscle contraction W1993, FEBS Lett., v.323, p.223-228.

259. Van Eyk, J.E., Thomas, L.T., Tripet, B., Wiesner, R.J., Pearlstone, J.R., Farah, C.S., Reinach, F.C., and Hodges, R.S. Distinct regions of troponin I regulate Ca2+-dependent activation and Ca2+ sensitivity of the acto-S1-TM ATPase activity of the thin filament \\1997, J. Biol. Chem., v.272, p. 10529-10537.

260. Van Eyk, J.E., Kay, C.M., and Hodges, R.S. A comparative study of the interactions of synthetic peptides of the skeletal and cardiac troponin I inhibitory region with skeletal and cardiac troponin C W1991, Biochemistry, v.30, p.9974-9981.

261. Van Eyk, J.E., Powers, F., Law, W., Larue, C., Hodges, R.S. and Solaro, R.J. Breakdown and release of myofilament proteins during ischemia and ischemia/reperfusion in rat hearts: identification of degragation products and effects on the pCa-force relation \\1998, Circ.Res., v.82, p.261-271.

262. Van Regenmortel, M.H.V. Which structural features determine protein antigenicity W1986, Trends Biochem. Sci. v.23, p.36-39.

263. Vassylyev, D.G., Takeda, S., Wakatsuki, S., Maeda, K., and Maeda, Y. Crystal structure of troponin C in complex with troponin I fragment at 3 A resolution W1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.95, p.4847-4852.

264. Venema, R.C., and Kuo, J.F. Protein kinase C-mediated phosphorylation of troponin I and C-protein in isolated myocardial cells is associated with inhibition of myofibrillar actomyosin MgATPase \\1993, J. Biol. Chem., v.268, p.2705-2711.

265. Villar-Palasi, C., and Kumon, A. Purification and properties of dog cardiac troponin T kinase W1981, J. Biol. Chem., v.256, p.7409-7415.

266. Wang, Z., Gergely, J., and Tao, T. Characterization of the Ca2+,-triggered conformational transition in troponin C W1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.89, p.11814-11817.

267. Wattanapermpool, J., Solaro, R.J., and Guo, X. The unique amino-terminal peptide of cardiac troponin I regulates myofibrillar activity only when it is phosphorylated W1995, J. Mol. Cell. Cardiol., v.27, p.383-391.

268. Westfall, M.V. and Solaro, R.J. Alterations in myofibrillar function and protein profiles after complete global ischemia in rat hearts W1992, Circ.Res, v.70, p.302-313.

269. White, S.P, Cohen, C, and Phillips, G.N. Structure of co-crystals of tropomyosin and troponin W1987, Nature, v.325, p.826-828.

270. Wilkinson, J.M, and Grand, R.J.A. The amino acid sequence of troponin I from rabbit skeletal muscle W1975, Biochem. J., v. 149, p.493-496.

271. Wilkinson, J.M., and Grand, R.J.A. Comparison of amino acid sequence of troponin I from different striated muscles W1978, Nature, v.271, p.31-35.

272. Wilkinson, J.M. The amino acid sequence of troponin C from chicken skeletal muscle \\1976, FEBS Lett, v.70, p.254-256.

273. Wolf, P.L. Lactate dehydrogenese isoenzymes in myocardial disease //1989, Clin. Lab. Med, v.9, p.655-665.

274. Wu, Q.-L, Raychowdhury, M.K, Du, Y, Jha, P.K, Leavis, P.C, and Sarkar, S. Isolation and characterization of human fast skeletal beta troponin T cDNA: comparative sequence analysis of isoforms and insight into the evolution of members of a multigene family W1993, DNA Sequence, v.4, p. 113-121.

275. Xu, G.-Q, and Hitchcock-DeGregori, S.E. Synthesis of a troponin C cDNA and expression of wild-type and mutant proteins in Escherichia coli W1988, J. Biol. Chem, v.263, p. 13962-13969.

276. Zhang, R, Potter, J.D, and Zhao, J. Phosphorylation of both serine residues in cardiac troponin I is required to decrease the Ca2+ affinity of cardiac troponin C W1995, J. Biol. Chem, v.270, p.30773-30780.

277. Zhang, R, Sheng, Z., Jones, M, Parsous, B, and Potter, J.D. Phosphorylation of cardiac Tnl by cAMP-dependent protein kinase W1995, Biophys. J, v.68, p.A165.

278. Zot, A.S, and Potter, J.D. Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction W1987, Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem, v. 16, p.535-559.

Благодарности

Я приношу свою глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору Николаю Борисовичу Гусеву, кандидату биологических наук Алексею Генриховичу Катрухе и коллективу сотрудников проблемной лаборатории «Химия ферментов» за помощь в работе.

Я выражаю искреннюю признательность моим научным руководителям: доктору химических раук профессору Евгению Сергеевичу Северину и кандидату физико-математических наук Тамаре Владимировне Буларгиной за научное руководство.