Исследование физических свойств мышечных белков и характеристик их взаимодействия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Набиев Салават Рафаилович

• Набиев Салават Рафаилович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Набиев Салават Рафаилович

Оглавление

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Поперечно-полосатая мышца: строение и функция

1.2 Сократительные и регуляторные белки

1.3 Функционирование миозинового мотора

1.4 Регуляция актин-миозинового взаимодействия

1.5 Исследование механизма сокращения на ансамбле изолированных молекул мышечных белков

1.6 Исследование взаимодействия мышечных белков на уровне одиночных молекул

1.7 Эксцентрическое сокращение

1.8 Неканонические аминокислотные остатки в молекуле тропомиозина

2 Материалы и методы

2.1 Получение мышечных белков

2.1.1 Скелетно-мышечный миозин

2.1.2 Скелетно-мышечный актин

2.1.3 Тропонин и тропомиозин

2.1.4 Оценка чистоты белков

2.1.5 Определение концентрации белков

2.1.6 Регулируемая тонкая нить

2.1.7 Проточная экспериментальная ячейка

4

26

29

33

34

36

37

39

40

41

2.2 Метод оптической ловушки

2.2.1 Экспериментальная установка оптической ловушки

2.2.2 Измерение характеристик актин-миозинового

взаимодействия в оптической ловушке

2.3 Метод искусственной подвижной системы

2.3.1 Экспериментальная установка

2.3.2 Метод искусственной подвижной системы c

регулируемой тонкой нитью

3 Результаты и обсуждение

3.1 Время жизни актомиозинового комплекса под нагрузкой

3.2 Изгибная жёсткость реконструированной тонкой

нити

3.3 Сравнение характеристик актин-миозинового взаимодействия на уровне одиночных молекул и их ансамбля

Заключение

Выводы

Список используемой литературы

Список сокращений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование физических свойств мышечных белков и характеристик их взаимодействия»

Введение

Мышечное сокращение является результатом циклического взаимодействия двух сократительных белков: актина и миозина. Головки миозина, выступающие из толстых нитей в саркомерах, присоединяясь к актину тонкой нити, образуют так называемые «поперечные мостики» и совершают механическую работу за счёт энергии гидролиза АТФ. В 1971 году в статье A.F. Huxley и R.M. Simmons^ [1] была предложена модель возможного молекулярного механизма мышечного сокращения. Согласно этой модели поперечный мостик, связанный упругим элементом - пружиной - со стволом толстой нити, присоединившись к тонкой нити, поворачивается на ней, смещая нити друг относительно друга, либо, растягивая пружину, запасает в ней упругую энергию. Следует заметить, что эта модель была основана на результатах механических и рентгенодифракционных экспериментов на изолированных мышечных волокнах до расшифровки атомной структуры молекулы миозина.

Позднее в 1985 году была высказана альтернативная идея возможного механизма работы поперечного мостика, в которой предполагалось, что его шаг представляет собой внутримолекулярное движение доменов внутри субфрагмента 1 молекулы миозина [2].

Опубликованная в 1993 году атомная структура кристалла субфрагмента 1 [3] и последующие структуры, показавшие, что угол между его актин-связывающим доменом и доменом лёгких цепей меняется в зависимости от стадии гидролиза нуклеотида [4-7], привели к формулировке «рычажной» (lever arm) гипотезы механизма силогенерации [8-12]. Согласно этой гипотезе элементарный рабочий шаг головки миозина является результатом поворота домена её лёгких цепей, или «рычага», относительно моторного домена,

который взаимодействует с актиновой нитью [12]. Став фактически общепринятой, эта гипотеза объясняет результаты многочисленных механических и рентгенодифракционных исследований мышечного сокращения, выполненных на целых мышцах [2, 13-20] и изолированных мышечных волокнах [21-44], на изолированных молекулах мышечных белков [45-55], а также в растворных экспериментах по изучению взаимодействия сократительных белков [56-58].

Очевидно, что время «рабочего шага» миозина определяется скоростями отдельных стадий биохимического цикла работы миозиновой головки [56]. Механическое напряжение, приложенное к головке, в свою очередь, может влиять на кинетику отдельных стадий биохимического цикла. Ещё в 1923 Фенн [59] обнаружил, что количество выделяемой энергии в мышце, укорачивающейся под нагрузкой, превышает её количество в изометрически сокращающейся мышце. Выяснение того, какие именно стадии биохимического цикла работы одиночной молекулы миозина являются чувствительными к приложенной нагрузке, представляется научной задачей, важной для понимания природы механизма мышечного сокращения.

Присоединение молекул миозина к актиновой нити в поперечнополосатых мышцах определяется концентрацией свободного кальция в клетке и контролируется с помощью двух белков: тропонинового комплекса и тропомиозина. Тропониновый комплекс, связывая свободный кальций, сдвигает тропомиозиновый тяж, что позволяет головкам миозина присоединяться к миозин-связывающим местам на актиновой нити [58].

Было показано, что в структуре молекулы тропомиозина присутствуют неканонические аминокислоты, которые нарушают его стабильность [60]. В центральной части молекулы тропомиозина были обнаружены две

неканонические консервативные аминокислоты в положениях 126 [60] и 137

5

[61]. Оказалось, что стабилизация центральной части молекулы тропомиозина заменами неканонических аминокислот на канонические меняет не только структурные характеристики тропомиозина, но влияет и на функциональные свойства сократительной системы, меняя её кальциевую чувствительность и максимальную скорость циклирования миозинового мотора по тонкой нити

[62]. Один из возможных механизмов влияния таких замен на функциональные свойства сократительной системы - это изменения её кооперативных свойств. Возможно, стабилизация центральной части молекулы тропомиозина путём замены соответствующих аминокислот увеличивает её изгибную жёсткость, что, в свою очередь, может увеличивать длину регуляторной единицы, то есть открывать большее число миозин-связывающих мест на актине. Выяснение роли консервативных неканонических аминокислот в структуре тропомиозина представляется существенным для понимания механизма контроля мышечного сокращения.

Целью работы было исследование механических свойств тонкой нити саркомера и характеристик актин-миозинового взаимодействия.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Построить и откалибровать экспериментальную установку управляемой двухлучевой оптической ловушки для измерения физических характеристик взаимодействия одиночных молекул миозина с актином.

2. Разработать метод измерения изгибной жёсткости актиновой и реконструированной тонкой нити с помощью оптической ловушки.

3. Оценить вклад консервативных неканонических аминокислотных остатков в центральной части молекулы тропомиозина в изгибную жёсткость тонкой нити.

4. Изучить влияние неканонических аминокислотных остатков в центральной части молекулы тропомиозина на характеристики актин-миозинового взаимодействия на молекулярном уровне.

5. Разработать метод задания постоянной нагрузки на одиночную молекулу миозина, присоединённую к актиновой нити, с помощью оптической ловушки и исследовать зависимость времени жизни актомиозинового комплекса от нагрузки.

Научная новизна. В работе использованы впервые разработанные методы задания нагрузки на одиночный актомиозиновый комплекс и измерения изгибной жёсткости актиновой и реконструированной тонкой нити с помощью оптической ловушки. Впервые на уровне одиночного актин-миозинового взаимодействия воспроизведён режим эксцентрического мышечного сокращения, то есть сокращения под нагрузкой, превышающей максимальную изометрическую, и показано, что кинетика распада актомиозинового комплекса в быстрой скелетной мышце является двухфазной, при этом обе фазы являются грузозависимыми. Прямыми измерениями с помощью оптической ловушки показано, что регуляторные белки вносят существенный вклад в изгибную жёсткость тонкой нити. Впервые показано, что стабилизация суперспиральной структуры центральной части молекулы тропомиозина точечными заменами неканонических аминокислотных остатков каноническими увеличивает изгибную жёсткость тонкой нити. Впервые обнаружено, что стабилизирующие аминокислотные остатки в центральной части молекулы тропомиозина влияют на длительность одиночного актин-миозинового взаимодействия под нагрузкой. Впервые продемонстрировано, что максимальная сила, генерируемая ансамблем молекул миозина при взаимодействии с тонкими нитями, содержащими тропомиозин со стабилизирующими заменами в его центральной части, прямо

коррелирует с длительностью одиночного актин-миозинового взаимодействия под нагрузкой.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о работе миозинового мотора при взаимодействии с тонкой нитью саркомера под нагрузкой важны для понимания молекулярного механизма работы мышц и уточняют современные знания о мышечном сокращении. Данные о влиянии стабилизирующих замен в центральной части молекулы тропомиозина на жёсткость тонкой нити, а также на характеристики актин-миозинового взаимодействия расширяют представления о функционировании тропомиозина и его роли в регуляции мышечного сокращения. Результаты дополняют существующие представления о роли нестабильности центральной части молекулы тропомиозина, необходимой для физиологического диапазона кальциевой регуляции сокращения.

Методы исследования. В работе были использованы современные биохимические методы получения и анализа белков, а также методы измерения их физических характеристик. Для измерения изгибной жёсткости филаментарного актина и регулируемых тонких нитей использовали подход теории упругости, в частности, было получено точное решение механической задачи изгиба упругого тонкого стержня, концы которого присоединены к двум сферам. Для обработки результатов и сравнения их с точным решением была разработана программа вычисления в среде Borland C++ Builder. Кроме того, для измерения расстояния между центрами микросфер, необходимого для вычисления изгибной жёсткости, написана программа в среде FreeBasic для анализа изображения по микрофотографиям. Для измерения характеристик одиночных актин-миозиновых взаимодействий использовали двухлучевую оптическую ловушку, характеристики актин-миозинового взаимодействия в ансамбле молекул определяли в экспериментах на искусственной подвижной

системе (in vitro motility assay). Результаты анализировали общепринятыми статистическими методами с помощью программных пакетов Excel и Origin 8.

Степень достоверности полученных результатов. Достоверность представленных в диссертации данных и сделанных выводов определяется использованием множества современных физических и биохимических методов исследования белков и физико-математических методов анализа и интерпретации полученных данных.

Личный вклад автора заключался в конструировании и строительстве установки управляемой двухлучевой оптической ловушки, отработке методик и экспериментальных протоколов, используемых в работе, участии в разработке математической модели изгиба тонкой нити, выделении белков из скелетных мышц кролика, в планировании и выполнении экспериментов с помощью оптической ловушки и искусственной подвижной системы, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке материалов научных публикаций.

Результаты, описанные в первом разделе третьей главы диссертации, опубликованы в статье Nabiev S.R., D.A. Ovsyannikov, A.K. Tsaturyan, S.Y. Bershitsky «The lifetime of the actomyosin complex in vitro under load corresponding to stretch of contracting muscle» в European Biophysics Journal в 2015 г. Соискатель, совместно с А.К. Цатуряном и С.Ю. Бершицким, участвовал в дизайне исследования, анализе результатов и написании статьи; вместе с Д.А. Овсянниковым принимал участие в отладке программного протокола; выполнил все экспериментальные исследования.

Результаты второго раздела третьей главы диссертации опубликованы в статье Nabiev S.R., D.A. Ovsyannikov, G.V. Kopylova, D.V. Shchepkin, A.M. Matyushenko, N.A. Koubassova, D.I. Levitsky, A.K. Tsaturyan, S.Y Bershitsky

«Stabilizing the central part of tropomyosin increases the bending stiffness of the thin filament» в Biophysical Journal в 2015 г. Соискатель, совместно с А.К. Цатуряном и С.Ю Бершицким, принимал участие в дизайне исследования, выполнении экспериментов, анализе результатов и написании статьи. Кроме того, соискатель получал сократительные белки, провёл все эксперименты на установке оптической ловушки, анализировал экспериментальные данные. Совместно с Д.А. Овсянниковым участвовал в написании и отработке экспериментального протокола, а с Г.В. Копыловой и Д.В. Щепкиным получал сократительные и регуляторные белки; А.М. Матюшенко и Д.И. Левицкий предоставили тропомиозин со стабилизирующими аминокислотными заменами. Программное обеспечение для обработки экспериментальных результатов было написано Н.А. Кубасовой и А.К. Цатуряном.

Результаты третьего раздела главы 3 диссертации опубликованы в статье Shchepkin D.V., S.R Nabiev, G.V. Kopylova, A.M. Matyushenko, D.I. Levitsky, S.Y. Bershitsky, A.K. Tsaturyan «Cooperativity of myosin interaction with thin filaments is enhanced by stabilizing substitutions in tropomyosin» в Journal of Muscle Research and Cell Motility в 2017 г. Соискатель, вместе Д.В. Щепкиным, Г.В. Копыловой и С.Ю. Бершицким, участвовал в дизайне исследования; выполнил все эксперименты на оптической ловушке, анализировал данные, полученные на оптической ловушке. Соискатель, вместе с Д.В. Щепкиным и Г.В, Копыловой, получал сократительные и регуляторные белки и участвовал в проведении экспериментов и анализе данных, полученных на искусственной подвижной системе. А.М. Матюшенко и Д.И. Левицкий предоставили препараты тропомиозина с исследуемыми аминокислотными заменами. В написании статьи участвовали соискатель, А. Цатурян, Д.В. Щепкин, Г.В. Копылова и С.Ю. Бершицкий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана экспериментальная установка оптической ловушки, позволяющая измерять физические характеристики одиночных взаимодействий молекул миозина с актином и механические свойства тонких нитей саркомера.

2. Регуляторные белки тонкой нити саркомера вносят измеримый вклад в её изгибную жёсткость.

3. Разработанный нами подход позволяет выявить влияние одиночных аминокислотных замен в молекуле тропомиозина на изгибную жёсткость тонкой нити.

4. Замена неканонических остатков в центральной части молекулы тропомиозина на канонические влияет на кинетические характеристики одиночного актин-миозинового взаимодействия.

5. Время жизни актомиозинового комплекса зависит от приложенной к нему нагрузки.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: на V Съезде биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015), на XI Всероссийском съезде по фундаментальным проблемам теоретической и прикладной механики (Казань, 2015), на Российской конференции с международным участием «Экспериментальная и компьютерная биомедицина» (Екатеринбург, 2016), на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2014 и 2016 гг.), на 44-й, 45-й и 46-й 47 и 48 Европейских мышечных конференциях (Варшава, Польша, 2015; Монпелье, Франция, 2016; Потсдам, Германия, 2017; Будапешт, Венгрия, 2018; Кентербери, Великобритания, 2019).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей (3 из которых являются обзорными) в российских и международных рецензируемых журналах, индексируемых международными базами данных Web of Science и Scopus, и тезисы 9 докладов на отечественных и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 128 страницах, включает 24 рисунка и 4 таблицы. Список литературы содержит 151 источник.

Автор считает своим долгом поблагодарить А.К. Цатуряна за неоценимую помощь в выполнении этой работы. Автор благодарен Б.Ю. Бершицкому за помощь в строительстве и отладке установки оптической ловушки. Автор признателен Д.А. Овсянникову, О.Н. Лукину, Г.И. Машанову, Н.А. Кубасовой и Ф.А. Сёмину за предоставленное программное обеспечение. Автор благодарен А.М. Матюшенко и Д.И. Левицкому за любезно предоставленные препараты тропомиозинов. Автор также благодарит своих коллег: Д.В. Щепкина и Г.В. Копылову за помощь в получении мышечных белков и проведении экспериментов в искусственной подвижной системе.

1 Обзор литературы

1.1 Поперечно-полосатая мышца: строение и функция

Сокращение поперечно-полосатых, то есть скелетных и сердечных, а также гладких мышц обеспечивает молекулярный моторный белок - миозин II класса.

Структурная организация поперечно-полосатой мышцы от тканевого до молекулярного уровня показана на рис. 1.

Рис. 1. Организация поперечно-полосатой мышцы [63].

Скелетная мышца состоит из пучков мышечных волокон, заключённых в общую соединительно-тканую оболочку. Мышечное волокно представляет собой многоядерную клетку. Волокна значительно различаются как по длине -

от нескольких миллиметров до десятков сантиметров, так и по диаметру - от 20 мкм до 100 мкм. В некоторых мышцах они тянутся от одного её конца до другого. Каждое волокно состоит из миофибрилл диаметром около 1 мкм, которые занимают приблизительно 80% объёма волокна. Миофибриллы - это длинные специализированные органеллы мышечной клетки, состоящие из последовательно соединённых саркомеров, которые и реализуют сократительную функцию мышц. Ядра мышечной клетки расположены преимущественно на периферии волокна, а митохондрии, обеспечивающие его энергией, находятся между миофибриллами.

Поперечно-полосатые мышцы позвоночных получили своё название из-за видимой в световой микроскоп поперечной исчерченности - чередования темных и светлых участков, обусловленных упорядоченностью упаковки толстых и тонких нитей в саркомере и тому, что миофибриллы в волокне расположены в регистре, то есть границы саркомеров соседних миофибрилл расположены в плоскостях, перпендикулярных продольной оси волокна.

Поперечно-полосатые мышцы обладают свойством двулучепреломления. При поляризационной микроскопии видно, что полосы, сильнее преломляющие свет, оптически анизотропны, и получили название А-полосы, тогда как менее плотные области между ними относительно изотропны, и называются 1-полосы. В середине 1-полосы располагается сильно преломляющая 7-линия, а в середине А-полосы находится менее плотная область - Н-зона.

На электронных микрофотографиях видно, что А- и 1-полосы формируются двумя типами нитей, или филаментов: толстых и тонких. Тонкие нити идут из 7-линий внутрь саркомера и образуют 1-полосу, а область перекрытия толстых и тонких нитей - А-полосу. Концы тонких нитей расположены в Н-зоне. В середине Н-зоны находится М-линия, которая удерживает в регистре толстые нити. Соседние 7-линии являются границами

саркомера. На поперечных срезах видна гексагональная упаковка нитей: каждая толстая нить окружена шестью тонкими; соотношение толстых и тонких нитей 1:2.

С помощью фазово-контрастной [64] и интерференционной [65] микроскопии было обнаружено, что при сокращении и растяжении мышечных волокон меняются размеры I-полосы, тогда как ширина A-полосы остаётся постоянной. Эти наблюдения привели к формулировке модели скользящих нитей, согласно которой сокращение происходит путём скольжения тонких нитей относительно толстых, что ведёт к изменению перекрытия между ними. При этом меняется длина саркомера, но длина нитей остаётся постоянной.

Позднее было показано, что толстые нити состоят главным образом из белка миозина, а тонкие - из актина. При большом увеличении на электронных микрофотографиях мышц в состоянии ригора (от rigor mortis, трупное окоченение, состояние мышцы в отсутствие АТФ) было обнаружено, что в зоне перекрытия между толстыми и тонкими нитями имеются перемычки -«поперечные мостики» [66, 67]. Эти поперечные мостики располагаются по всей длине толстой нити, за исключением средней, так называемой «голой» зоны. Поперечные мостики на толстой нити располагаются строго упорядоченно с интервалом 14,5 нм. Каждый поперечный мостик - это выступающая из толстой нити глобулярная часть миозиновой молекулы, тот самый молекулярный мотор, который обеспечивает сократительную функцию мышцы.

1.2 Сократительные и регуляторные белки

Сокращение мышц является результатом взаимодействия двух белков: миозина толстых нитей и актина тонких нитей. Механизм их взаимодействия контролируется белками Са2+-регуляторной системы - тропониновым

комплексом и тропомиозином, входящими в состав тонкой нити, основу которой составляет филаментарный актин.

Актин

Актин был открыт Ф.Б. Штраубом в 1942 г. и получил своё название по способности активировать гидролиз АТФ миозином, но при полимеризации актин сам гидролизует АТФ. Актин - высококонсервативный белок, который присутствует во всех эукариотических клетках. Актин может находиться в двух состояниях: в виде мономера (глобулярный, или G- актин) или в виде полимера (фибриллярный, или F-актин). G-актин состоит из полипептидной цепи с молекулярной массой 42 кДа. Филаментарный актин имеет полярную структуру, обусловленную асимметричной структурой G-актиновых субъединиц. Различия в аминокислотном составе разных изоформ актина, как в пределах одного вида, так и межвидовые, крайне незначительны. Они составляют не более 25 замен [68] из 375 аминокислотных остатков полной последовательности белка, т.е. менее 7%.

Тропомиозин

Тропомиозин обнаружен во всех эукариотических клетках. Его основная функция - участие в регуляции актин-миозинового взаимодействия и стабилизации структуры актинового филамента [69].

Молекула тропомиозина имеет стержнеобразную форму. Её длина ~40 нм, диаметр ~1 нм. Тропомиозин представляет собой димер из двух а-спиралей, каждая массой примерно 33 кДа [70], которые формируют левозакрученную суперспираль (^^-соП). Характерной особенностью суперспиралей является периодичность их первичной структуры [71]. Аминокислотная последовательность таких белков организована в виде повторяющегося мотива (гептады), состоящего из 7 аминокислотных остатков

(рис. 2А). В отличие от одиночной а-спирали, в суперспирали на каждый виток приходится 3,5 остатка, и, таким образом, одна гептада включает в себя два витка суперспирали. В гептаде каждая аминокислота обозначается буквой латинского алфавита: а, b, с, d. e, f, g. Arndt с соавторами [72] предложили PV-гипотезу («Peptide Velcro» - «пептид липучка»), которая объединяет полученные до этого данные о свойствах этих остатков, которые необходимы для формирования стабильной структуры суперспирали. Согласно этой гипотезе, в положениях a и d должны находиться неполярные остатки (например, валин, лейцин и тому подобные аминокислотные остатки), которые стабилизируют суперспираль посредством гидрофобных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Кроме того, в положениях e и g должны быть остатки с противоположно заряженными радикалами, которые формируют дополнительно стабилизирующие солевые мостики между спиралями за счёт ионного взаимодействия. В оставшихся b, c и f положениях как правило, располагаются аминокислотные остатки с полярными радикалами, так как они формируют поверхность суперспирали, которая находится в непосредственном контакте с растворителем.

Взаимодействие между остатками a и d происходит таким образом, что каждый остаток в зоне контакта двух спиралей находится в углублении между тремя остатками, принадлежащими соседней спирали (рис. 2Б, В). Благодаря этим взаимодействиям формируется так называемое гидрофобное ядро (core, гидрофобная основа) суперспирали, что равносильно образованию гидрофобного ядра при сворачивании белка в глобулу. Как и в случае глобулярных белков, гидрофобные взаимодействия являются главным фактором стабильности молекулы. Было выявлено, что в положениях a и d наибольшим стабилизирующим влиянием обладают аминокислотные остатки с неполярными радикалами средних размеров (лейцин, изолейцин, валин). За

ними следуют остатки с большими неполярными радикалами (триптофан, тирозин), остатки аланина, незаряженные гидрофильные остатки (глутамин, аспарагин, серин), положительно заряженные остатки (аргинин, лизин), отрицательно заряженные остатки (глутаминовая и аспарагиновая кислота), глицин и пролин [73, 74].

А

a b с d е f д

Y Е Е V A R К

L V I L Е G Е

L Е R S Е Е R

А Е V А Е S К

С G D L Е Е Е

L К I V Т N N LKSLEAQ

A D К Y S Т К

Е D К Y Е Е Е

I К L L Е Е К

L К Е А Е Т R

Рис. 2. Особенности структуры суперспирали. Адаптировано из Protein Engineering Protocols Edited by Arndt and Müller, Humana Press

А - фрагмент последовательности аминокислот суперспиральной (coiled-coil) структуры (в качестве примера приведён участок последовательности ß-изоформы гладкомышечного тропомиозина). Каждая строка из семи букв соответствует одному гептадному повтору. Цветами обозначены разные остатки: синим - стабилизирующие, красным - дестабилизирующие, зелёным -заряженные.

Б - взаимодействие двух a-спиралей в структуре суперспирали (поперечный разрез)

В - взаимодействие двух a-спиралей в структуре суперспирали (вид вдоль молекулы)

Кроме гидрофобных взаимодействий, для плотной структуры суперспирали характерны электростатические взаимодействия в положениях е и g гептадных повторов. Причём правило формирования ионной связи состоит в следующем, остаток в g-положении одной спирали образует связь с остатком в е-положении следующей гептады другой спирали (обычно глутамат с лизином). Такого типа взаимодействия приводят к дополнительной стабилизации структуры суперспирали.

Описанные взаимодействия характеризуют общие принципы организации структуры суперспирали. В случае отдельных белков могут происходить иные взаимодействия, которые влияют на стабильность суперспирали. Многие работы указывают на то, что наличие в структуре неканонических остатков (то есть тех, которые противоречат каноническому гептадному строению суперспиралей), является необходимым фактором для выполнения белками уникальных функций. В структуре молекулы тропомиозина также были обнаружены неканонические остатки. Влияние двух из них, расположенных в центральной части молекулы, исследуется в данной работе.

Тропонин

Тропонин представляет собой комплекс из трёх полипептидых субъединиц: тропонина Т, тропонина I и кальций-связывающего тропонина С. Субъединицы С и часть субъединиц I и Т формируют глобулярную часть комплекса, а другие части субъединиц I и Т - длинные «хвосты», которые тянутся вдоль двойной спирали тропомиозина. Ингибиторный домен тропонина I, выступающий из «хвоста», обратимо связывается с актином. Образование такого комплекса тропонина I с тропомиозином смещает тропомиозин по поверхности актиновой нити в положение, в котором он препятствует взаимодействию актина с миозином даже в присутствии кальция.

19

Если к этому комплексу добавить тропонин С, формирование регуляторного актин-тромиозин-тропонинового комплекса завершится, и взаимодействие сократительных белков становится чувствительным к ионам кальция.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Набиев Салават Рафаилович, 2021 год

Список литературы

1. Huxley A. F. Simmons R. M. Proposed mechanism of force generation in striated muscle // Nature. - 1971. - V. 233, № 5321. - P. 533-538.

2. Huxley H. E., Kress M. Crossbridge behaviour during muscle contraction // J Muscle Res Cell Motil. - 1985. - V. 6, № 2. - P. 153-161.

3. Rayment I., Rypniewski W. R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D. R., Benning M. M., Winkelmann D. A., Wesenberg G., Holden H. M. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor // Science. -1993. - V. 261, № 5117. - P. 50-58.

4. Xie X., Harrison D. H., Schlichting I., Sweet R. M., Kalabokis V. N., Szent-Gyorgyi A. G., Cohen C. Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 A resolution // Nature. - 1994. - V. 368, № 6469. - P. 306-312.

5. Houdusse A., Kalabokis V. N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A. G., Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment S1 complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head // Cell. - 1999. - V. 97, № 4. - P. 459470.

6. Houdusse A., Szent-Gyorgyi A. G., Cohen C. Three conformational states of scallop myosin S1 // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - V. 97, № 21. - P. 11238-11243.

7. Gourinath S., Himmel D. M., Brown J. H., Reshetnikova L., Szent-Gyorgyi A. G., Cohen C. Crystal structure of scallop Myosin S1 in the pre-power stroke state to 2.6 a resolution: flexibility and function in the head // Structure. - 2003. - V. 11, № 12. - P. 1621-1627.

8. Holmes K. C. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction // Curr Biol. - 1997. -. V. 7, № 2. - P. R112-R118.

9. Huxley A. F. Muscle. Support for the lever arm // Nature. - 1998. - V. 396, № 6709. - P. 317-318.

10. Geeves M. A., Holmes K. C. Structural mechanism of muscle contraction // Annu Rev Biochem. - 1999. - V. 68. - P. 687-728.

11. Holmes K. C., Geeves M. A. The structural basis of muscle contraction // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2000. - V. 355, № 1396. - P. 419-431.

12. Geeves M. A., Holmes K. C. The molecular mechanism of muscle contraction // Adv Protein Chem. - 2005. - V. 7. - P. 161-193.

13. Hill A. V. Length of muscle, and the heat and tension developed in an isometric contraction // J Physiol. - 1925. - V. 60, № 4. - P. 237-263.

14. Hill A. V. The fundamental mechanical change in muscle // J Physiol. - 1949. -V. 108, № 3. - Proc. 43.

15. Hill A. V., Weber H. H., Astbury W. T., Dubuisson M., Bailey K., Pryor M. G., Lundsgaard E., Needham D., Elliott A., Barer R., MacArthur I., Edsall J. T. A discussion on muscular contraction and relaxation: their physical and chemical basis // Proc R Soc Lond B Biol Sci. - 1950. - V. 137, №886. - P. 40-87.

16. Huxley H. E., Brown W. The low-angle x-ray diagram of vertebrate striated muscle and its behaviour during contraction and rigor // J Mol Biol. - 1967. -V. 30, № 2. - P. 383-434.

17. Haselgrove, J. C. X-ray evidence for a conformational change in the actin-containing filaments of vertebrate striated muscle. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. - 1972. - V. 37. - P. 341-352.

18. Huxley H. E. Structural changes in the actin and myosin containing filaments during contraction. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. - 1972. - V. 37. - P. 361-376.

19. Huxley H. E., Faruqi A. R., Kress M., Bordas J., Koch M. H. Time-resolved X-ray diffraction studies of the myosin layer-line reflections during muscle contraction // J Mol Biol. - 1982. - V. 158, № 4. - P. 637-684.

20. Huxley H. E., Simmons R. M., Faruqi A. R., Kress M., Bordas J., Koch M. H.

Changes in the X-ray reflections from contracting muscle during rapid

112

mechanical transients and their structural implications // J Mol Biol. - 1983. -V. 169, № 2. - P. 469-506.

21. Gordon A. M., Huxley A. F., Julian F. J. Tension development in highly stretched vertebrate muscle fibres // J Physiol. - 1966. - V. 184, № 1. - P. 143169.

22. Gordon A. M., Huxley A. F., Julian F. J. The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres // J Physiol. - 1966. - V. 184, № 1. - P. 170-192.

23. Cleworth D., Edman K. A. Laser diffraction studies on single skeletal muscle fibers // Science. - 1969. - V. 163, № 3864. - P. 296-298.

24. Ford L. E., Huxley A. F., Simmons R. M. Tension responses to sudden length change in stimulated frog muscle fibres near slack length // J Physiol. - 1977. -V. 269, № 2. - P. 441-515.

25. Ford L. E., Huxley A. F., Simmons R. M. The relation between stiffness and filament overlap in stimulated frog muscle fibres // J Physiol. - 1981. - V. 311. - P. 219-249.

26. Schoenberg M., Brenner B., Chalovich J. M., Greene L. E., Eisenberg E. Cross-bridge attachment in relaxed muscle // Adv Exp Med Biol. - 1984. - V. 170. -P. 269-284.

27. Ford L. E., Huxley A. F., Simmons R. M. Tension transients during steady shortening of frog muscle fibres // J Physiol. - 1985. - V. 361 - P. 131-150.

28. Ford L. E., Huxley A. F., Simmons R. M. Tension transients during the rise of tetanic tension in frog muscle fibres // J Physiol. - 1986. - V. 372 - P. 595-609.

29. Yu L. C., Brenner B. Structures of actomyosin crossbridges in relaxed and rigor muscle fibers // Biophys J. - 1989. - V. 55, № 3. - P. 441-453.

30. Bershitsky, S. Y., Tsaturyan A. K. Effect of Joule temperature jump on tension and stiffness of skinned rabbit muscle fibers // Biophys. J. - 1989. - V. 56. - P. 806-816.

31. Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K. Tension responses to Joule temperature jump in skinned rabbit muscle fibres // J.Physiol. - 1992. - V. 447. - P. 425-448.

32. Irving M., Lombardi V., Piazzesi G., Ferenczi M. A. Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle. // Nature. - 1992. - V. 357, № 6374. - P. 156-158.

33. Piazzesi G., Lombardi V. A cross-bridge model that is able to explain mechanical and energetic properties of shortening muscle // Biophys J. - 1995.

- V. 68, № 5. - P. 1966-1979.

34. Lombardi V., Piazzesi G., Ferenczi M. A., Thirlwell H., Dobbie I., Irving M. Elastic distortion of myosin heads and repriming of the working stroke in muscle. // Nature. - 1995. - V. 374 № 6522. - P. 553-555.

35. Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K., Bershitskaya O. N., Mashanov G. I., Brown P., Burns R. Ferenczi M. A. Muscle force is generated by myosin heads stereospecifically attached to actin // Nature. - 1997. - V. 388. - P. 186-190.

36. Linari M., Lombardi V., Piazzesi G. Cross-bridge kinetics studied with staircase shortening in single fibres from frog skeletal muscle // J Muscle Res Cell Motil. - 1997. - V. 18, № 1. - P. 91-101.

37. Edman K. A., Mansson A., Caputo C. The biphasic force-velocity relationship in frog muscle fibres and its evaluation in terms of cross-bridge function // J Physiol. - 1997. - V. 503 (Pt 1). - P. 141-156.

38. Linari M., Dobbie I., Reconditi M., Koubassova N., Irving M., Piazzesi G., Lombardi V. The stiffness of skeletal muscle in isometric contraction and rigor: the fraction of myosin heads bound to actin // Biophys J. - 1998. - V. 74, № 5.

- P. 2459-2473.

39. Linari M., Piazzesi G., Dobbie I., Koubassova N., Reconditi M., Narayanan T., Diat O., Irving M., Lombardi V. 2000 Interference fine structure and sarcomere length dependence of the axial X-ray pattern from active single muscle fibers // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000.- V. 97, № 13. - P. 7226-7231.

40. Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K. The elementary force generation process probed by temperature and length perturbations in muscle fibres from the rabbit // J. Physiol. - 2002. - V. 540, № 3. - P. 971 -988.

41. Piazzesi G., Reconditi M., Linari M., Lucii L., Sun Y.-B., Narayanan T., Boesecke P., Lombardi V., Irving M. Mechanism of force generation by myosin heads in skeletal muscle // Nature. - 2002. - V. 415, № 6872. - P. 659662.

42. Coupland M. E., Ranatunga K. W. Force generation induced by rapid temperature jumps in intact mammalian (rat) skeletal muscle fibres // J Physiol.

- 2003. - V. 15, № 548 (Pt. 2). - P. 439-449.

43. Ranatunga K.W., Coupland M. E. Molecular step(s) of force generation: temperature-perturbation experiments on muscle fibres // Adv Exp Med Biol. -2003. - V. 538. -P. 441-457.

44. Ferenczi M. A., Bershitsky S. Y., Koubassova N., Siththanandan V., Helsby W. I., Panine P., Roessle M., Narayanan T., Tsaturyan A. K. The 'roll and lock' mechanism of force generation in muscle. // Structure. - 2005. - V. 13, № 1. -P. 131-141.

45. Sheetz M. P., Spudich J. A. Movement of myosin-coated fluorescent beads on actin cables in vitro // Nature. - 1983. - V. 303, № 5912. - P. 31-35.

46. Yanagida T., Nakase M., Nishiyama K., Oosawa F. Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin // Nature. - 1984.

- V. 307, № 5946. - P. 58-60.

47. Kron S. J., Spudich J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1986. - V. 83. - P. 6272-6276.

48. Harada Y., Yanagida T. Direct observation of molecular motility by light microscopy // Cell Motil Cytoskeleton. - 1988. - V. 10, № 1-2. - P. 71-76.

49. Uyeda T. Q. P., Kron S. J., Spudich J. A. Myosin step size: estimation from slow sliding movement of actin over low densities of heavy meromyosin // J. Mol. Biol. - 1990. - V. 214. - P. 699-710.

50. Uyeda T. Q. P., Warrick H. M., Kron S. J., Spudich J. A. Quantized velocities at low myosin densities in an in vitro motility assay // Nature. - 1991. - V. 352. - P. 307-311.

51. Nishizaka T., Yagi T., Tanaka Y., Ishiwata S. Right-handed rotation of an actin filament in an in vitro motile system // Nature. - 1993. - V. 361. - P. 269-271.

52. Finer J. T., Simmons R. M., Spudich J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps // Nature. - 1994. - V. 368, № 6467. -P. 113-119.

53. Molloy J. E., Burns J. E., Kendrick-Jones J., Tregear R. T., White D. C. Movement and force produced by a single myosin head // Nature. - 1995. - V. 378, № 6553. - P. 209-212.

54. Yanagida T., Ishijima A. Forces and steps generated by single myosin molecules // Biophys. J. - 1995. - V. 68. - P. 312s-320s.

55. Takagi Y., Homsher E. E., Goldman Y. E., Shuman H. Force generation in single conventional actomyosin complexes under high dynamic load // Biophys J. - 2006. - V. 90, № 4. - P. 1295-1307.

56. Lymn R. W., Taylor E. W. Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin // Biochemistry. - 1971. - V. 10, №25. - P. 4617-4624.

57. Bagshaw C. R., Eccleston J. F., Eckstein F., Goody R. S., Gutfreund H., Trentham D. R. The magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase of myosin. Two-step processes of adenosine triphosphate association and adenosine diphosphate dissociation. // Biochem J. - 1974. - V. 141, № 2. - P. 351-364.

58. McKillop D. F., Geeves M. A. Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1: evidence for three states of the thin filament // Biophys J. - 1993. - V. 65, № 2. - P. 693-701.

59. Fenn W. O. A quantitative comparison between the energy liberated and the work performed by the isolated sartorius muscle of the frog // J Physiol. - 1923. -V.58, №2-3. - P. 175-203.

60. Невзоров И. А., Левицкий Д. И. Тропомиозин: двойная спираль из мира белков // Успехи биологической химии. - 2011. - C. 283-334.

61. Sumida J. P., Wu E., Lehrer S. S. Conserved Asp-137 imparts flexibility to tropomyosin and affects function // J Biol Chem. - 2008. - V. 283, № 11. - P. 6728-6734.

62. Matyushenko A. M., Artemova N. V., Shchepkin D. V., Kopylova G. V., Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K., Sluchanko N. N., Levitsky D. I. Structural and functional effects of two stabilizing substitutions, D137L and G126R, in the middle part of a-tropomyosin molecule // FEBS J. - 2014. - V. 281, № 8. -P. 2004-2016.

63. Bloom W., Fawcett D. W., A textbook of Histology, 10th edition // 1975. -W.B. Saunders Co. - Philadelphia. - 1033 P.

64. Huxley A. F., Niedergerke R. Structural changes in muscle during contraction; interference microscopy of living muscle fibres // Nature. - 1954. V. 173, № 4412. - P. 971-973.

65. Huxley H., Hanson J. Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation // Nature. - 1954. - V. 173, №4412. - P. 973-976.

66. Huxley H. E., The double array of filaments in cross-striated muscle // J Biophys Biochem Cytol. - 1957. - V. 3, № 5. - P. 631-648.

67. Reedy M. K., Holmes K. C., Tregear R. T. Induced changes in orientation of the cross-bridges of glycerinated insect flight muscle // Nature. - 1965. - V. 207, № 5003. - P. 1276-1280.

68. Gordon A. M., Homsher E., Regnier M. Regulation of contraction in striated muscle // Physiol Rev. - 2000. - V. 80, № 2. - P. 853-924.

69. Lehman W., Hatch V., Korman V., Rosol M., Thomas L., Maytum R., Geeves M. A., Van Eyk J. E., Tobacman L. S., Craig R. Tropomyosin and actin isoforms modulate the localization of tropomyosin strands on actin filaments // J Mol Biol. - 2000. - V. 302, № 3. - P.593-606.

70. Perry S. V. Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function // J Muscle Res Cell Motil. - 2001. - V. 22, № 1. - P. 5-49.

71. Mason J. M., Arndt K. M. Coiled coil domains: stability, specificity, and biological implications // Chembiochem. - 2004. - V. 5. - P. 170-176.

72. Arndt K. M., Pelletier J. N., Müller K. M., Plückthun A., Alber T. Comparison of in vivo selection and rational design of heterodimeric coiled coils // Structure. - 2002. - V. 10 № 9. - P. 1235-1248.

73. Wagschal K., Tripet B., Lavigne P., Mant C., Hodges R. S. The role of position a in determining the stability and oligomerization state of alpha-helical coiled coils: 20 amino acid stability coefficients in the hydrophobic core of proteins // Protein Sci. - 1999. - V. 8, № 11. - P. 2312-2329.

74. Tripet B., Wagschal K., Lavigne P., Mant C. T., Hodges R. S. Effects of side-chain characteristics on stability and oligomerization state of a de novo-designed model coiled-coil: 20 amino acid substitutions in position „d' // J Mol Biol. - 2000. - V. 300, № 2. - P. 377-402.

75. Cooke R., Franks K. All myosin heads form bonds with actin in rigor rabbit skeletal muscle // Biochemistry. - 1980. - V. 19, № 10. - P. 2265-2269.

76. Воротников А. В., Кубасова Н. А., Цатурян А.К. Молекулярный мотор мышц // Природа. - 2010. - №4. - C. 29-36.

77. Kawai M., Brandt P. W. Two rigor states in skinned crayfish single muscle fibers // J Gen Physiol. - 1976. - V. 68, № 3. - P. 267-280.

78. Малинчик С. Б., Леднев В. В. Интерпретация рентгеновской дифракционной картины от скелетной мышцы в состоянии покоя. Трехмерная модель миозиновой нити. // Докл. Акад. наук СССР. - 1987. -T. 293, №1. - C. 238-242.

79. Bordas J., Lowy J., Svensson A., Harries J. E., Diakun G. P., Gandy J., Miles C., Mant G. R., Towns-Andrews E. X-ray evidence that in contracting live frog muscles there exist two distinct populations of myosin heads // Biophys J. -1995. - V. 68. - P. 99S-104S.

80. Zhao L., Naber N., Cooke R. Muscle cross-bridges bound to actin are disordered in the presence of 2,3-butanedione monoxime // Biophys. J. - 1995. - V. 68. - P. 1980-1990.

81. Margosian S. S., Lowey S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle // Methods in Enzymology. - 1982. - V. 85. - P. 55-71.

82. Pardee J. D., Spudich J. A. Purification of muscle actin // Methods in Cell Biology. - 1982. - V. 24. - P. 271-289.

83. Meeusen R. Z., Cande W. Z. N-ethylmaleimide-modified heavy meromyosin (A probe for actomyosin interaction) // J. Cell Biology. - 1979. - V. 82. - P. 57-65.

84. Sekine T., Kielley W. W. The enzimic properties of N-ethylmaleimide (NEM) modified myosin // Biochem. Biophys. Acta. - 1964. - V. 81. - P. 336-345.

85. Crowder M. S., Cooke R. The effect of myosin sulphydryl modification on the mechanics of fibre contraction // J Muscle Res Cell Motil. - 1984. V. 5, № 2. -P. 131-146.

86. Tawada K., Sekimoto K. A physical model of ATP induced actin-myosin movement in vitro // Biophys. J. - 1991. - V. 59. - P. 343-356.

87. Toyoshima Y. Y., Kron S. J., McNally E. M., Niebling K. P., Toyoshima C., Spudich J. A. Myosin subfragment-1 is sufficient to move actin filaments in vitro // Nature. - 1987. - V. 328. - P. 536-539.

88. Цатурян А. К., Якимова Ю. Г. Оценка числа миозиновых головок, взаимодействующих с актиновой нитью в искусственной подвижной системе // Биофизика. - 1995. - Т. 40, Вып. 3. - С. 589-595.

89. Бершицкая О. Н., Цатурян А. К. Актин-миозиновые искусственные подвижные системы in vitro // Биофизика. - 1995. - Т.40, Вып. 3. - С. 578588.

90. Homsher E., Wang F., Sellers J. R. Factor affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin // Am. J. Physiol. -1992. - V. 262. - P. 714-723.

91. Sata M., Yamashita H., Sugiura S., Fujita H., Momomura S., Serizawa T. A new in vitro motility assay technique to evaluate calcium sensitivity of the cardiac contractile proteins // Pflugers Arch. - 1995. - V. 429, № 3. - P. 443-5.

92. Homsher E., Kim B., Bobkova A., Tobacman L. S. Calcium regulation of thin filament movement in an in vitro motility assay // Biophys J. - 1996. - V. 70, № 4. - P.1881-1892.

93. Tanaka H., Ishijima A., Honda M., Saito K., Yanagida T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament // Biophys J. - 1998. - V. 75, № 4. - P. 1886-1894.

94. Svoboda K., Block S. M. Biological applications of optical forces // Annu Rev Biophys Biomol Struct. - 1994. - V. 23. - P. 247-285.

95. Veigel C., Bartoo M. L., White D. C., Sparrow J. C., Molloy J. E. The stiffness of rabbit skeletal actomyosin cross-bridges determined with an optical tweezers transducer // Biophys J. - 1998. - V. 75, № 3. - P.1424-1438.

96. Capitanio M., Canepari M., Cacciafesta P., Lombardi V., Cicchi R., Maffei M.,

Pavone F. S., Bottinelli R. Two independent mechanical events in the

120

interaction cycle of skeletal muscle myosin with actin // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2006. - V. 103, № 1. - P. 87-92.

97. Lombardi V., Piazzesi G. The contractile response during steady lengthening of stimulated frog muscle fibres // J Physiol. - 1990. - V. 431. - P. 141-171.

98. Bickham D. C., West T. G., Webb M. R., Woledge R. C., Curtin N. A., Ferenczi M. A. Millisecond-scale biochemical response to change in strain // Biophys J. - 2011. - V. 101, № 10. - P.2445-2454.

99. Linari M., Woledge R. C., Curtin N. A. Energy storage during stretch of active single fibres from frog skeletal muscle // J Physiol. - 2003. - V. 548 (Pt 2). - P. 461-474.

100. Ferenczi M. A., Bershitsky S. Y., Koubassova N. A., Kopylova G. V., Fernandez M., Narayanan T., Tsaturyan A. K. Why muscle is an efficient shock absorber // PLoS One. - 2014. - V. 9, № 1. - P. e85739.

101. Brunello E., Reconditi M., Elangovan R., Linari M., Sun Y. B., Narayanan T., Panine P., Piazzesi G., Irving M., Lombardi V. Skeletal muscle resists stretch by rapid binding of the second motor domain of myosin to actin // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. - V. 104, № 50. - P. 20114-20119.

102. Colombini B., Bagni M.A., Romano G., Cecchi G. Characterization of actomyosin bond properties in intact skeletal muscle by force spectroscopy // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. - V. 104, № 22. - P. 9284-9289.

103. Bell G.I. Models for the specific adhesion of cells to cells // Science. - 1978. -V. 200, № 4342. - P.618-627.

104. Matyushenko A. M., Artemova N. V., Sluchanko N. N., Levitsky D. I. Effects of two stabilizing substitutions, D137L and G126R, in the middle part of a-tropomyosin on the domain structure of its molecule // Biophys Chem. - 2015. - V. 196. - P. 77-85.

105. Shchepkin D. V., Matyushenko A. M., Kopylova G. V., Artemova N. V.,

Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K., Levitsky D. I. Stabilization of the Central

121

Part of Tropomyosin Molecule Alters the Ca2+-sensitivity of Actin-Myosin Interaction // Acta Naturae. - 2013ro - V. 5, № 3. - P. 126-129.

106. Li X. E., Suphamungmee W., Janco M., Geeves M. A., Marston S. B., Fischer S., Lehman W. The flexibility of two tropomyosin mutants, D175N and E180G, that cause hypertrophic cardiomyopathy // Biochem Biophys Res Commun. -2012. - V. 424, № 3. - P. 493-496.

107. Metalnikova N. A., Tsaturyan A. K. A mechanistic model of Ca regulation of thin filaments in cardiac muscle // Biophys J. - 2013. - V. 105, № 4. - P. 941950.

108. Loong C. K., Badr M. A., Chase P. B. Tropomyosin flexural rigidity and single Ca2+ regulatory unit dynamics: implications for cooperative regulation of cardiac muscle contraction and cardiomyocyte hypertrophy // Front Physiol. -2012. - V. 3. - P. 80.

109. Potter J. D. Preparation of troponin and its subunits // Methods Enzymol. -1982. - V. 85, Pt B. - P. 241-263.

110. Gordon A. M., LaMadrid M. A., Chen Y., Luo Z., Chase P. B. Calcium regulation of skeletal muscle thin filament motility in vitro // Biophys J. - 1997. - V. 72, № 3. - P. 1295-1307.

111. Monteiro P. B., Lataro R. C., Ferro J. A., Reinach Fde C. Functional alpha-tropomyosin produced in Escherichia coli. A dipeptide extension can substitute the amino-terminal acetyl group // J Biol Chem. - 1994. - V. 269, № 14. - P. 10461-10466.

112. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227, № 5259. - P. 680-685.

113. Ashkin A. Forces of a single-beam gradient laser trap on a dielectric sphere in the ray optics regime // Biophys J. - 1992. - V. 61, № 2. - P 569-582.

114. Reihani S. N., Oddershede L. B. Optimizing immersion media refractive index improves optical trapping by compensating spherical aberrations // Opt Lett. -2007. - V. 32, № 14. - P. 1998-2000.

115. Simmons R. M., Finer J. T., Chu S., Spudich J. A. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap // Biophys J. - 1996. - V. 70, № 4. - P 1813-1822.

116. Reif F. Fundamentals of Statistical and Thermal Physics // 1965. - McGraw-Hill Science. — 651 P.

117. Gittes F., Schmidt C. F. Signals and noise in micromechanical measurements // Methods Cell Biol. - 1998. -V. 55. - P. 129-156.

118. Mashanov G. I., Molloy J. E. Automatic detection of single fluorophores in live cells // Biophys J. - 2007. - V. 92, № 6. - P. 2199-2211.

119. Haeberle J. R. Calponin decreases the rate of cross-bridge cycling and increases maximum force production by smooth muscle myosin in an in vitro motility assay // J Biol Chem. - 1994. - V. 269 № 17. - P. 12424-12431.

120. Brunet N. M., Chase P. B., Mihajlovic G., Schoffstall B. Ca2+-regulatory function of the inhibitory peptide region of cardiac troponin I is aided by the C-terminus of cardiac troponin T: Effects of familial hypertrophic cardiomyopathy mutations cTnI R145G and cTnT R278C, alone and in combination, on filament sliding // Arch Biochem Biophys. - 2014. - V. 552553. - P. 11-20.

121. Veigel C., Molloy J. E., Schmitz S., Kendrick-Jones J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers // Nat Cell Biol. - 2003. - V. 5, № 11. - P. 980-986.

122. Greenberg M. J., Lin T., Goldman Y.E., Shuman H., Ostap E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2012. - V. 109, № 37. - P. E2433-E2440.

123. Capitanio M., Canepari M., Maffei M., Beneventi D., Monico C., Vanzi F., Bottinelli R., Pavone F.S. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke // Nat Methods. -2012. - V. 9 № 10. - P. 1013-1019.

124. Nishizaka T., Miyata H., Yoshikawa H., Ishiwata S., Kinosita K. Jr. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers // Nature. - 1995. - V. 377, № 6546. - P. 251-254.

125. Piazzesi G., Reconditi M., Linari M., Lucii L., Bianco P., Brunello E., Decostre V., Stewart A., Gore D. B., Irving T. C., Irving M., Lombardi V. Skeletal muscle performance determined by modulation of number of myosin motors rather than motor force or stroke size // Cell. - 2007. - V. 131 № 4. - P. 784795.

126. Linari M., Caremani M., Piperio C., Brandt P., Lombardi V. Stiffness and fraction of Myosin motors responsible for active force in permeabilized muscle fibers from rabbit psoas // Biophys J. - 2007. - V. 92, № 7. - P. 2476-2490.

127. Tsaturyan A. K., Bershitsky S. Y., Koubassova N. A., Fernandez M., Narayanan T., Ferenczi M. A. The fraction of myosin motors that participate in isometric contraction of rabbit muscle fibers at near-physiological temperature // Biophys J. - 2011. - V. 101, № 2. - P. 404-410.

128. Piazzesi G., Lucii L., Lombardi V. The size and the speed of the working stroke of muscle myosin and its dependence on the force // J Physiol. - 2002. - V. 545, № 1. - P. 145-151.

129. Thirlwell H., Corrie J. E., Reid G. P., Trentham D. R., Ferenczi M. A. Kinetics of relaxation from rigor of permeabilized fast-twitch skeletal fibers from the rabbit using a novel caged ATP and apyrase // Biophys J. - 1994. - V. 67, № 6. - P. 2436-2447.

130. Cavagna G. A., Citterio G. Effect of stretching on the elastic characteristics and the contractile component of frog striated muscle // J Physiol. - 1974. - V. 239, № 1. - P. 1-14.

131. Dupuis D. E., Guilford W. H., Wu J., Warshaw D. M. Actin filament mechanics in the laser trap // J Muscle Res Cell Motil. - 1997. - V. 18, № 1. -P. 17-30.

132. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Теория упругости. Издание 5-е, стереотипное. // 2007. - Физматлит. - Москва. - 259 с. - (Теоретическая физика, т. VII).

133. Fujime S., Ishiwata S. Dynamic study of F-actin by quasielastic scattering of laser light // J Mol Biol. - 1971. - V. 62, № 1. - P. 251-265.

134. Ishiwata S., Fujime S. Effect of calcium ions on the flexibility of reconstituted thin filaments of muscle studied by quasielastic scattering of laser light // J Mol Biol. - 1972. - V. 68, № 3. - P. 511-522.

135. Gittes F., Mickey B., Nettleton J., Howard J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape // J Cell Biol. -1993. - V. 120, № 4. - P. 923-934.

136. Ott A., Magnasco M., Simon A., Libchaber A. Measurement of the persistence length of polymerized actin using fluorescence microscopy // Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. - 1993. - V. 48, № 3. - P. R1642-R1645.

137. Yanagida T., Nakase M., Nishiyama K., Oosawa F. Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin // Nature. - 1984. - V. 307, № 5946. - P. 58-60.

138. Isambert H., Venier P., Maggs A. C., Fattoum A., Kassab R., Pantaloni D., Carlier M. F. Flexibility of actin filaments derived from thermal fluctuations. Effect of bound nucleotide, phalloidin, and muscle regulatory proteins // J Biol Chem. - 1995. - V. 270, № 19. - P. 11437-11444.

139. Greenberg M. J., Wang C. L., Lehman W., Moore J. R. Modulation of actin mechanics by caldesmon and tropomyosin // Cell Motil Cytoskeleton. - 2008. -V. 65, № 2. - P. 156-164.

140. Goldmann W. H. Binding of tropomyosin-troponin to actin increases filament bending stiffness // Biochem Biophys Res Commun. - 2000. - V. 276, № 3. - P 1225-1228.

141. Nevzorov I. A., Nikolaeva O. P., Kainov Y. A., Redwood C. S., Levitsky D. I. Conserved noncanonical residue Gly-126 confers instability to the middle part of the tropomyosin molecule // J Biol Chem. - 2011. - V. 286, № 18. - P. 15766-15772.

142. Nabiev S. R., Ovsyannikov D. A., Kopylova G. V., Shchepkin D. V., Matyushenko A. M., Koubassova N. A., Levitsky D. I., Tsaturyan A. K., Bershitsky S. Y. Stabilizing the central part of tropomyosin increases the bending stiffness of the thin filament // Biophys J. - 2015. - V. 109, № 2. - P. 373-379.

143. Tyska M. J., Warshaw D. M. The myosin power stroke // Cell Motil Cytoskeleton. - 2002. - V. 51, № 1. - P. 1-15.

144. VanBuren P., Palmiter K. A., Warshaw D. M. Tropomyosin directly modulates actomyosin mechanical performance at the level of a single actin filament // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1999. - V. 96, № 22. -P. 12488-12493.

145. Behrmann E., Müller M., Penczek P. A., Mannherz H. G., Manstein D. J., Raunser S. Structure of the rigor actin-tropomyosin-myosin complex // Cell. -2012. - V. 150, № 2. -P. 327-338.

146. Geeves M. A., Lehrer S. S. Dynamics of the muscle thin filament regulatory switch: the size of the cooperative unit // Biophys J. - 1994. - V. 67, № 1. - P. 273-282.

147. Desai R., Geeves M. A., Kad N. M. Using fluorescent myosin to directly visualize cooperative activation of thin filaments // J Biol Chem. - 2015. - V. 290, № 4. - P. 1915-1925.

148. Kad N. M., Kim S., Warshaw D. M., VanBuren P., Baker J. E. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2005. - V.102, № 47. - P. 16990-16995.

149. Williams D. L. Jr., Greene L. E. Comparison of the effects of tropomyosin and troponin-tropomyosin on the binding of myosin subfragment 1 to actin // Biochemistry. - 1983. - V. 22, № 11. - P. 2770-2774.

150. Smith D. A., Geeves M. A. Cooperative regulation of myosin-actin interactions by a continuous flexible chain II: actin-tropomyosin-troponin and regulation by calcium // Biophys J. - 2003. - V. 84, № 5. - P. 3168-3180.

151. Smith D. A., Maytum R., Geeves M. A. Cooperative regulation of myosin-actin interactions by a continuous flexible chain I: actin-tropomyosin systems // Biophys J. - 2003. - V. 84, № 5. - P. 3155-3167.

Список сокращений

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АДФ - аденозиндифосфорная кислота ДТТ - дитиотреитол

EGTA - этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-Ы,К,К,К-тетрауксусная кислота

F-актин - фибриллярный актин

S1 - субфрагмент 1 миозина

SDS - додецилсульфат натрия

ТММ - тяжёлый меромиозин

ЛММ - лёгкий меромиозин

ИПС - искусственная подвижная система

HIS - высокая ионная сила (high ionic strength)

AB - буферный раствор (assay buffer)

ГОК - глюкоза-оксидаза-каталаза

NEM - N-этилмалеимид

TRIS - трис(гидроксиметил)аминометан

ИК - инфракрасный

ПИД - пропорциональный интегральный дифференциальный