Эпидемиологическая значимость вируса Кемерово на территории Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.02.02, кандидат наук Дедков Владимир Георгиевич

• Дедков Владимир Георгиевич
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Дедков Владимир Георгиевич

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Экология орбивирусов и их значение в инфекционной патологии человека

1.2. Молекулярно-генетическая характеристика рода Orbivirus

1.3. Отношение вируса Кемерово к группе вируса Грэйт-Айленд (GIV)

1.4. Общие сведения о вирусе Кемерово

1.5. Эпидемиология лихорадки Кемерово

1.6. Методические подходы, используемые при расшифровке геномов реовирусов de novo

1.7. Метод ПЦР в реальном времени как «золотой стандарт» молекулярной диагностики инфекционных заболеваний

1.8. Заключение 31 Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Общая характеристика организации, материалов и методов исследования

2.2. Расшифровка полного генома вируса Кемерово

2.3. Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово на основе ОТ-ПЦР в реальном времени

2.4. Молекулярно-генетическая оценка взаимоотношений вируса Кемерово с другими вирусами группы Грейт-Айленд

2.5. Изучение циркуляции вируса Кемерово на территории Российской Федерации

2.5.1. Определение видовой принадлежности клещей

2.5.2. Исследование зараженности иксодовых клещей вирусом Кемерово

2.5.3. Получение протяженного фрагмента первичной нуклеотидной последовательности вируса Кемерово

2.5.4. Оценка наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями,

возникшими после присасывания клеща

2

Глава 3. Особенности ситуации по инфекциям, передаваемым клещами на территории Российской Федерации

3.1. Заболеваемость населения ИПК и ее структура на отдельных территориях Российской Федерации

3.2. Диагностика ИПК как основа эпидемиологического надзора

3.2.1. Мониторинг численности, видовой структуры и зараженности переносчиков

3.2.2. Диагностика ИПК среди населения 67 Глава 4. Разработка методики выявления РНК вируса Кемерово методом ОТ-ПЦР в реальном времени на основе расшифровки генома штамма 21/10

4.1. Результаты расшифровки полного генома вируса Кемерово

4.2.Характеристика методики выявления РНК вируса Кемерово на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени

4.3.Аналитические свойства диагностической системы 72 Глава 5. Молекулярно-генетическая оценка взаимоотношений вируса Кемерово с другими вирусами группы Грейт-Айленд

5.1. Сравнительное описание основных характеристик генома вируса Кемерово, штамм 21/10

5.2. Результаты филогенетического анализа 82 Глава 6. Изучение циркуляции вируса Кемерово на территории Российской Федерации

6.1. Результаты исследования зараженности иксодовых клещей

6.2. Валидизация полученных результатов 91 6.3.Оценка наличия сероконверсии у лиц с лихорадочными состояниями, возникшими после присасывания клеща 95 Заключение 98 Выводы 101 Практические рекомендации 102 Список сокращений

Список литературы

Приложение 1. Методика секвенирования вируса Кемерово de novo

Приложение 2. Структура олигонуклеотидных праймеров для

амплификации фрагментов генома вирусов Кемерово

Приложение 3. Синтез положительного контрольного образца

Приложение 4. Структура олигонуклеотидных праймеров для

амплификации фрагментов генома штаммов вируса Трибеч Тг35 и Тг19

Приложение 5. Обогащение и неспецифическая амплификация вирусной

кДНК

Приложение 6. Проведение реакции нейтрализации вируса Кемерово

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эпидемиологическая значимость вируса Кемерово на территории Российской Федерации»

Введение

Проблема инфекций, переносимых клещами (ИПК), является чрезвычайно актуальной для большинства регионов Российской Федерации. Расширение ареалов переносчиков, а также обнаружение новых возбудителей, способных существовать совместно в одном клеще, вызывая смешанную инфекцию, заставляют обратить пристальное внимание на данную проблему [9]. Так в 2014 г обращаемость населения по поводу присасывания клеща составила 429636 случаев. Максимальные показатели обращаемости населения зарегистрированы в Томской (1413,90 на 100 тыс. населения), Тюменской (1150,29 на 100 тыс.) областях, Удмуртской Республике (1002 на 100 тыс.) и др. [5].

По данным Д.К.Львова на территории Российской Федерации

циркулирует более 50 видов арбовирусов [10]. Кроме того, на территории

Российской Федерации расположены ареалы обитания представителей

различных родов клещей, таких как Ixodes, Dermacentor, Hyalomma,

Haemophysalis, Rhipicephalus, выступающих переносчиками многих

патогенных агентов вирусной и бактериальной природы, а так же и

простейших микроорганизмов [8, 17]. Совокупность данных фактов создает

предпосылки к поддержанию высокого уровня заболеваемости ИПК,

особенно среди населения из групп риска, в т.ч. тех, чья хозяйственная

деятельность так или иначе связана с сельской и лесной местностью. Между

тем в настоящее время регистрируется заболеваемость только по шести

наиболее актуальным нозологиям, к которым относятся клещевой вирусный

энцефалит (КВЭ), иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), гранулоцитарный

анаплазмоз человека (ГАЧ), моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ),

лихорадка Крым-Конго (КГЛ) и клещевые риккетсиозы. Совокупная

заболеваемость этих нозологий составляет чуть менее 2% от количества

обращений по поводу присасывания клещей. Очевидно, не всякое

присасывание приводит к заболеванию. С другой стороны реальное

количество присасываний должно быть существенно больше

5

регистрируемого, особенно в удаленных от крупных городов районах. Таким образом, остается неизвестным вклад в структуру инфекционной патологии прочих инфекционных агентов (рис.1).

Рисунок 1. Доля регистрируемых клещевых нозологий в общем количестве случаев присасывания клещей (по данным Роспотребнадзора. 2014г).

Одним из агентов, эпидемиологическое значение которого изучено

недостаточно, является представитель рода орбивирус - вирус Кемерово.

В 1962 г во время комплексной Советско-Чехословацкой экспедиции

под руководством академика АМН СССР проф. М.П. Чумакова из клещей

вида Ixodes persulcatus и от больного человека впервые был выделен вирус

Кемерово [42]. В последующие годы родственные вирусу Кемерово

арбовирусы были выделены в других районах СССР, а также в Чехословакии,

Венгрии, Румынии, Египте, Индии, Канаде, Австралии, Перу, США и ряде

других стран из различных видов иксодовых и аргасовых клещей, крови

6

млекопитающих и птиц. Вновь сформированная группа вирусов получила название «группа вируса Кемерово». [36, 41]. В последующее десятилетие было проведено изучение физико-химических, биологических и антигенных свойств, как вируса Кемерово, так и родственных ему вирусов. Вместе с тем не были в достаточной степени изучены экологические аспекты циркуляции вирусов группы Кемерово и их роль в патологии человека. Это обстоятельство было обусловлено отсутствием в то время быстрых, доступных и чувствительных методов исследования. Проведение же широкомасштабных работ с применением традиционных вирусологических методов было экономически неоправданно. Постепенно интерес исследователей к данной проблематике падал, и вирусы группы Кемерово перешли в разряд «забытых» инфекций. Таким образом, на территории РФ циркулирует инфекционный агент, отнесенный ко II группе патогенности, базовые экологические и эпидемиологические характеристики которого не определены [24].

Диссертационное исследование выполнено на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора в рамках ФЦП «Химбиобезопасность 2009-2012»

Исследование носило комплексный характер, этапы которого были направлены на последовательное решение поставленных задач. Основными методами, использованными в работе, являлись эпидемиологический, эпизоотологический, вирусологический, молекулярно-генетический, статистический методы.

Целью исследования явилось изучение эпидемического потенциала вируса Кемерово и его генетических особенностей на территории Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать методику выявления РНК вируса Кемерово методом ОТ-ПЦР в реальном времени на основе расшифровки генома штамма 21/10.

2. Представить молекулярно-генетическую характеристику вируса Кемерово и его взаимоотношений с другими родственными вирусами.

3. Изучить инфицированность иксодовых клещей - потенциальных переносчиков вируса Кемерово на различных территориях Российской Федерации.

4. Оценить этиологическую связь вируса Кемерово с лихорадочными состояниями, возникающими после присасывания клеща у лиц, проживающих на эндемичных территориях.

Научная новизна:

1. Применение впервые разработанной методики определения РНК вируса Кемерово на основе расшифровки генома штамма 21/10 позволило выявить инфицированность переносчиков возбудителя на территории 10 регионов Российской Федерации, в том числе в ее Европейской части.

2. Впервые доказана возможность передачи вируса Кемерово посредством клещей вида ОвгтасвМог твИсиШш.

3. На основании впервые расшифрованных полных геномов вируса Кемерово, изолированного в России, и двух штаммов вируса Трибеч проведено филогенетическое сравнение вируса Кемерово с другими представителями группы вирусов Грейт Айленд, что позволило подтвердить их близкое родство и общность происхождения.

4. Впервые показано явление реассортации среди вирусов, относящихся к

группе Грейт Айленд, что свидетельствует об их способности к

спонтанной изменчивости и способности образовывать гибриды с

8

трудно прогнозируемыми базовыми эпидемиологическими характеристиками.

Практическая значимость:

1. Разработанная на основе высокочувствительной и специфичной технологии ОТ-ПЦР в реальном времени методика определения РНК вируса Кемерово явилась основой создания диагностического набора реагентов, предназначенного для использования в рамках мониторинга природных очагов арбовирусных инфекций.

2. В результате работы общее количество генетической информации о вирусах, образующих группу Грейт Айленд, существенно возросло, что создало необходимую базу для проведения исследовательских работ по созданию новых диагностических наборов, предназначенных как для выявления РНК и антигенов, так и для выявления антител против вирусов группы Грейт Айленд в целях осуществления эпидемиологической диагностики.

3. Полученные данные должны быть использованы для оптимизации эпидемиологического надзора за возбудителями арбовирусных инфекций.

Личный вклад

Автором в полном объёме самостоятельно были выполнены все запланированные виды эпидемиологических и молекулярно-биологических исследований, включая их организацию, сбор первичных данных, обобщение, статистическую обработку и анализ с последующей оценкой полученных данных. При личном участии автора разработан дизайн исследования, разработаны методики секвенирования вируса Кемерово de novo и секвенирования вируса Трибеч. Кроме того, автором лично разработана методика выявления РНК вируса Кемерово в биологических

образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени. По выполненной работе подготовлены публикации.

Часть исследований, посвященных изучению циркуляции вируса Кемерово, выполнена совместно с научными сотрудниками лаборатории эпидемиологи природно-очаговых инфекций ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Л.С. Карань и К.А. Гридневой при участии сотрудников ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»: д.б.н. Г.Г. Каргановой, к.б.н. А.П. Гмыль, к.б.н. Л.И. Козловской, к.б.н. Л.Ю. Романовой.

Апробация и публикация материалов исследования

Основные положения диссертации обсуждены на следующих конференциях:

• Международная научная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами», посвященная 75-летию открытия вируса клещевого энцефалита, пос. Листвянка ИО, 2012

• Международная научная конференция «Актуальные проблемы клещевого энцефалита». Москва, 2013

• 9th Louis Pasteur Conference «Emerging Infectious Diseases», Paris, 2014

• 7th Annual Global Virus Network Meeting, China, 2015

Публикации по теме диссертации:

1. Дедков В.Г., Маркелов М.Л, Войцеховская Я.А., Карганова Г.Г., Гмыль А.П., Козловская Л.И., Пиванова Г.П., Шипулин Г.А. Разработка тест-системы для определения РНК вируса Кемерово в формате ПЦР в реальном времени. Эпидемиология и инфекционные болезни. Акт. Вопросы, 2012, №3, 38-41

2. Дедков В.Г., Девяткин А.А., Бекова М.В., Маркелов М.Л., Бесхлебова О.В., Гранитов В.М., Шпынов С.Н., Гмыль А.П., Шипулин Г.А..

Обнаружение вируса Кемерово в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Алтайском крае. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 6(79), 2014, 46-50.

3. Dedkov V.G., Markelov M.L., Gridneva K.A., Bekova M.V., Gmyl A.P., Kozlovskaya L.I., Karganova G.G., Romanova L.Iu., Pogodina V.V., Yakimenko V.V., Shipulin G.A. Prevalence of Kemerovo virus in ixodid ticks from the Russian Federation. Ticks Tick Borne Dis. 2014. Jul 26

4. Dedkov V.G., Dubina D.A., Yurchenko O.A., Bekova M.V., Valdokhina A.V., Shipulin G.A, Characterization of two strains of Tribec virus isolated in Ukraine. Vector borne and zoonotic diseases, 11/2014; 14(11):808-16.

Структура и объем

Диссертация представлена на 129 страницах, включает 39 рисунков, 16 таблиц, список литературы и 6 приложений. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных результатов, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 25 отечественных и 57 зарубежных источников

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Экология орбивирусов и их значение в инфекционной патологии человека

Таксономически род Orbivirus принадлежит к семейству Reoviridae, включающему в себя следующие рода: Cardoreovirus, Mimoreovirus, Orbivirus, Phytoreovirus, Rotavirus, Seadornavirus. В настоящее время описано около 160 представителей рода Orbivirus являющихся патогенами беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе и человека [57]. Прототипным представителем орбивирусов считается вирус Синего языка овец (Bluetongue virus, BTV). Представители рода Orbivirus встречаются на всех континентах [13,38]. Переносчиками орбивирусов служат кровососущие насекомые (мокрецы, москиты, комары) и клещи. Наиболее значимыми с точки зрения экономических потерь для сельского хозяйства являются вирусы Синего языка овец (BTV), Африканской болезни лошадей (AHSV) и Эпизоотической геморрагической болезни (EHDV) [57]. Некоторые передающиеся клещами орбивирусы, такие как Чангвинола (Changuinola), Коррипарта (Corriparta), Лебомбо (Lebombo), Орунго (Orungo) и вирусы серогруппы Грейт-Айленд (Great Island, GIV) способны инфицировать человека, вызывая у него лихорадочные состояния различной степени тяжести [34].

Традиционно интерес к изучению орбивирусов был не слишком велик вследствие их невысокой значимости как патогенов (исключая BTV, AHSV и EHDV). Однако в последние пять лет с развитием молекулярных методов интерес к изучению орбивирусов постепенно растет, что приводит к появлению работ, посвященных генетической характеристике как вновь открытых, так и открытых ранее, но не охарактеризованных орбивирусов [31,32,44,45,55].

В основу типирования орбивирусов положена общность антигенных свойств различных представителей рода, образующих 22 различных

серокомплекса. Выделяют серокомплексы групп вирусов Африканской болезни лошадей (9 серотипов), Синего языка овец (26 серотипов), Чангвинола (12 серотипов), Ченуда (7 серотипов), Хобар-Горг (2 серотипа), Коррипарта (6 серотипов), Эпизоотической геморрагической болезни (10 серотипов), Энцефаллоза лошадей (7 серотипов), Эубенанджи (4 серотипа), Иери (3 серотипа), Грейт-Айленд (36 серотипов), Лебомбо (1 серотип), Пируанской болезни лошадей (1 серотип), Вонгорр (8 серотипов), Сент-Круа-Ривер (1 серотип), Уматилла (4 серотипа), Вад-Медани (2 серотипа), Валлал (3 серотипа), Варрего (3 серотипа), Орунго (4 серотипа), Палиам (13 серотипов), а также ряд видов, групповая принадлежность которых еще не определена окончательно [11].

На рис.2 представлено филогенетическое дерево рода Orbivirus, построенное на основании выравнивания 123 фрагментов первичных нуклеотидных последовательностей гена полимеразы (VP1) различных орбивирусов [72]. В качестве статистической модели использована модель Кимуры. Построение филогенетического дерева проведено методом присоединения соседей [77]. Статистическая достоверность топологии дерева подтверждена 1000 бутстреп - повторов. Для построения использована программа MEGA 4.0. Красным цветом обозначены неохарактеризованные вирусы, голубым - референсные штаммы, зеленым - вирусы, первичные нуклеотидные последовательности которых депонированы в международной базе NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Рис 2. Филогенетическое дерево рода Orbivirus. Построение проведено на основании частичных последовательностей гена полимеразы (нуклеотидный уровень).

1.2. Молекулярно-генетическая характеристика рода Orbivirus

Геном орбивирусов составляет около 20000 пар оснований и представлен 10 сегментами двухнитевой РНК, упакованной в двухслойный белковый кэпсид. Протяженность сегментов варьирует от 4000 до 600 пар оснований. Сегменты генома содержат гены, кодирующие 7 структурных белков (VP1 - VP7) и 4 неструктурных белка (NS1, NS2, NS3, NS3a) [57]. В большинстве случаев каждый сегмент генома кодирует лишь один белок, имея одну открытую рамку считывания. Исключение составляют сегменты 9 и 10, каждый из которых кодирует по 2 близко родственных белка (VP6 и VP6a (NS4) в сегменте 9 и NS3, NS3a в сегменте 10, соответственно) [33].

Икосаэдрическая коровая часть вириона состоит из двух концентрических белковых капсул - субкорового слоя, состоящего из белка VP3 (T2), и поверхностного слоя, состоящего из белка VP7 (T13). Белки VP1, VP4 и VP6 являются ферментами (рис.3).

i

VP4

VP7

^ VP3(T2) VP6 (хеликаза) УР1(полимераза)

VP5

Сегменты дцРНК

VP2

50 нм

Рис.3. Строение вирусной частицы орбивирусов (по данным [57])

Внешний слой вирусной частицы представлен белками УР2 и УР5, обеспечивающими прикрепление и проникновение вируса в клетку хозяина. Эти белки более вариабильны чем коровые и большинство неструктурных белков, поэтому специфичность их реакции с нейтрализующими антителами лежит в основе серотипирования орбивирусов [33,52]. Белок N81 представляет собой тубуллярный белок, участвующий в транслокации провирусных частиц к клеточной мембране [53, 71]. Белок N82, будучи фосфорилированным клеточными киназами, превращается в матриксный белок вирусных гранулярных телец включения (У1Б). Неструктурные белки N83 и №3а представляют собой гликопротеины, которые в больших количествах экспрессируются в клетках насекомых, и отсутствуют в клетках млекопитающих. Эти белки участвуют в сборке дочерних вирусных частиц [52]. У некоторых орбивирусов белки N83 и №3а чрезвычайно вариабельны. Существует предположение о том, что эти белки играют детерминирующую роль в процессе адаптации вируса к переносчику [70]. Описание функций белков и их локализация представлены в Таблице 1

Таблица 1. Белки орбивирусов и их функции

Сегмент Белок Локализация Функции

генома

( пар

оснований)

1, УР1 (Ро1) Внутри РНК зависимая РНК

(3954) субкорового полимераза

слоя

2 УР2 Наружный Серотип специфический

(2926) кэпсидный антиген, определяющий

слой вирулентность. Участвует в

прикреплении вируса к

клеточной мембране.

3 УР3 (Т2) Субкоровый Структурный белок,

(2770) слой кэпсида формирующий субкоровый

слой кэпсида

4 VP4 Внутри Кэпирующий фермент,

(1981) (Cap) субкорового трансметилаза.

слоя

5 NS1 цитоплазма Белок, формирующий тубулы

(1769) (TuP) в цитоплазме клетки.

Характерен для репликации

орбивирусов.

6 VP5 Наружный Формирует наружный капсид].

(1638) кэпсид

7 VP7 Внешний Формирует внешний коровый

(1156) (T13) коровый слой слой, серогруппо-

специфический антиген

8 NS2 цитоплазма Матриксный белок вирусных

(1124) (ViP) телец включения (УГБ).

9 VP6 Внутри оцРНК и дцРНК- связывающая

(1046) (Hel) субкорового хеликаза

слоя

10 NS3 Клеточные Гликопротеины,

(822) NS3a мембраны обеспечивающие выход

вирусных частиц из клетки

хозяина.

-—;—;-

http://www.reoviridae.org

1.3 Отношение вируса Кемерово к группе вируса Грэйт-Айленд (GIV)

Вирус Кемерово (KEMV) выделен в 1962 г. от больных людей и из клещей вида I. persulcatus. [42]. Вскоре в Чехословакии из клещей вида Ixodes ricinus были выделены вирусы Липовник (LIPV) и Трибеч (TRBV), по биологическим и антигенным свойствам оказавшиеся близкими к вирусу Кемерово [50, 62, 63]. Антигенное родство этих видов послужило основанием для объединения их в новую классификационную группу под названием серогруппа Кемерово [38].

В последующие годы на разных континентах из различных природных источников, главным образом из клещей, были выделены вирусы, антигенно родственные вирусу Кемерово. Основные сведения о месте и источнике выделения представлены в таблице, составленной по данным И. С.Михайловой [12]:

Таблица 2. Сведения об основных штаммах вирусов серогруппы Кемерово

Название вируса Объект Место Год Литературн

или штамма обследования выделения изоляции ый источник

1. Кемерово I. Persulcatus СССР, 19б2 М.П. Чумаков

и человек Кемеровская область и соавторы, 1963

2. Липовник I. Ricinus Чехословакия 19бЗ H. Libicova и

(Lipovnik) Мелкие млекопитающие козы соавт., 1964,1965

3. Трибеч I. Ricinus Чехословакия 19бЗ,19б5 M.Gresikova и

Tribec Мелкие соавт.,1965

млекопитающие 19бб E.Ernek и

козы соавт.,

1966

4. Вад-Медани Rhipicephalus Судан 1952 R.M. Taylor и

Wad-Medani sanguineus соавт., 1966

(Ar-495)

5. Ченуда Ar. reflexus Египет 1954 R.M. Taylor и

Chenuda соавт., 1966

6. Вад-Медани Hyalomma sp. Индия 1954 R.M. Taylor и

(Ic-673) соавт., 1968

7. Селетар Boophilus Сингапур 19б4 Yaru, 1965

Seletar (rud SM-214 microplus

8. Вад-Медани (Ic-664) Mix Hyalomma anatolicum, Boophilus Западный Пакистан 1961 F.Begum и соавт., 1970

9. Ченуда (Ar-3441) Argas peringueyi ДоЬапеппеБЬиг ё 19бб R.M. Taylor и соавт., 1966

10. Вад-Медани Ambliomma Ямайка - R.M. Taylor и

(T-N2) cajennense соавт., 1968

11. Трибеч (S-83) Haemaphysal is punctata Румыния 1966 V.Topciu и соавт., 1966

12. Моно Лейк Argas cooleyi США, 1966 Yaru, 1968

Mono Lake (Ar-861 Калифорния

13. Гуачо Huachí Ornithodoros Перу 1961 Yaru, 1968

(Ar-883) amblus

14. Трибеч (S-4) I. Ricinus Румыния 1961 V.Topciu и

соавт., 1970

15. Кемерово I. Persulcatus СССР, 1963-1966 Л.Н.

Новосибирска я обл. Тарасевич и соавт., 1970

16. Вад Медани Boophilus Колумбия 1910 Yaru, 1910

(calli-4990) microplus

17. Баку Ornithodoros СССР, 1970 Д.К. Львов и

coniceps Азербайджан соавт., 1971

18. Кемерово (Eg Ar-1169) горихвостка Египет 1961 J.R. Schmidt, R.E. Shope, 1971

19. Грейт Айленд I. uriae Канада 1971 Main, 1971

Great Island

20. Болайн I. uriae Канада 1971 Main, 1971

Bauline

21. Трибеч I. ricinus СССР, 1971 П.Г.

(Харагыш) Молдавия Скоферца и

соавт., 1972

22. Сиксган Сит Argas cooleyi США, Техас I 1969-1970 C.E. Yunker и

Sixgun City Колорадо соавт., 1972

23. Охотский I. puctus СССР, 1969-1970 Д.К. Львов и

Дальний соавт., 1973

Восток

24. Aus (MI- I. uriae Австралия - A. Main, 1972

14850)

25. Иакина Хэд I. uriae США 1970 C.E. Yunker и

(Yaquina Head) соавт., 1973

26. Баку Ornithodoros coniceps СССЗ, Западная 1972 В.П. Андреев и соавт., 1973

Туркмения

27. Йакина I. uriae США, Аляска 1971 C.E. Yunker и

Хэд (Alaska-71) соавт., 1973

28. Кемерово I. persulcatus СССР, Алтайский 1973 И.С. Михайлова,.

край 1974г

29. Кемерово I. persulcatus СССР, 1974 И.С.

Вологодская Михайлова

область 1974

В настоящее время в отношении таксономического названия группы не существует единообразия. В ряде современных публикаций авторы придерживаются исторического названия группы - «группа вируса Кемерово» [34, 50]. Другая часть авторов придерживается определения «группа вируса Грейт-Айленд» [35, 68]. Такой же классификационный подход использован международным комитетом по таксономии вирусов (The

19

International Committee on Taxonomy of Viruses) [57]. К сожалению, в силу ряда обстоятельств, до нашего времени сохранилось лишь небольшое число штаммов выше упомянутых вирусов. Некоторые вирусы после более детального изучения были исключены из группы. В настоящее время считается, что группа Грейт-Айленд включает 6 видов вирусов: Грейт-Айленд (GIV), Наггет (NUGV), Броадхэвен (BRDV), Кемерово (KEMV), Липовник (LIPV), Трибеч (TRBV) и Охотский (OKHV). Все они, за исключением вируса Наггет, секвенированы и депонированы в международном банке GenBank NCBI.

Филогенитическое отношение группы Грейт-Айленд к прочим орбивирусам представлено на рис 4. Основанием для построения дерева послужило сравнение аминокислотных последовательностей Т2-протеинов (основных компонентов субкорового слоя вирусной частицы) различных представителей рода [33].

Рис.4. Филогенетическое дерево рода Orbivirus. Построение проведено на основании аминокислотных последовательностей T2. (Из статьи Belhouchet M. с соавт. [33]).

Дальнейшее развитие биоинформатических методик позволило более тонко проанализировать филогенетические отношения между различными представителями группы Грейт-Айленд. Это привело к тенденции выделять внутри группы вирусов Грейт-Айленд две самостоятельне серогруппы -Кемерово и Грейт-Айленд [48].

Как видно из рис. 5., орбивирусы образуют два больших кластера. В первый входят представители рода, переносчиками которых являются мокрецы. Их Т2-протеины кодируются в третьем сегменте. Во второй

Рис.5. Филогенетические отношение группы вируса Грейт-Айленд и остальных орбивирусов. Построение проведено на основании

аминокислотных последовательностей VT2. (Из статьи Cowled C. И соавт. [45]).

кластер входят представители рода, переносчиками которых являются клещи и москиты. Их Т2-протеины кодируются во втором сегменте. Серогруппы Грейт-Айленд и Кемерово являются близкородственными (происходят из одного узла). В серогруппу Грейт-Айленд входят виды Грейт-Айленд, Броадхэвэн и Охотский, а в серогруппу Кемерово входят виды Кемерово, Трибеч и Липовник. При этом вирус Липовник, фактически, является разновидностью вируса Трибеч.

1.4. Общие сведения о вирусе Кемерово

Несмотря на более чем 50 лет с момента открытия вируса Кемерово, информация о нем скудна и зачастую противоречива. Впервые вирус был изолирован в 1962 г академиком АМН СССР М.П. Чумаковым во время совместной Советско-Чехословацкой экспедиции по изучению очагов вируса клещевого энцефалита в Кемеровской области [26]. В процессе изучения вируса было установлено его отличие от вируса клещевого энцефалита, в напряженном очаге которого был обнаружен новый инфекционный агент. Затем была доказана его антигенная самостоятельность и принадлежность к роду Orbiviruses семейства Reoviridae. Основанием отнесения вируса Кемерово к роду Orbiviruses послужила его относительная стабильность в жирорастворителях, лабильность при рН 3,0 и отсутствие антигенных взаимосвязей с основными серологическими группами арбовирусов [36]. По предложению М. П. Чумакова новый вирус был назван вирусом Кемерово [25].

Размер вирусных частиц, определенный путем фильтрации вируса

через фильтры Millipore с диаметрами 450, 220, 100 и 50 мкм был менее

50мкм [41]. Метод высокоскоростного центрифугирования показал сходство

размеров вируса Кемерово и вируса клещевого энцефалита, диаметр

которого составляет 30 мкм [78]. Электронно-микроскопические

22

исследования ультратонких срезов культуры куриного эмбриона (ККЭ) после заражения вирусом Кемерово позволило установить локализацию вирусных частиц в клетке, определить их форму и показать изменения ультратонкой структуры зараженных клеток [82]. По данным исследователей вирусы имели округлую, либо овальную форму и диаметр около 40 мкм, что согласуется с данными ультрацентрифугирования. Установлено, также, наличие оболочки и капсида икосаэдрического типа.

Вирус Кемерово размножается во многих тканевых культурах различного происхождения (эпителиальных, соединительно-тканных, полученных от позвоночных и членистоногих). Цитопатическое действие вируса наблюдали в перевиваемых клетках куриного эмбриона (ККЭ), перевиваемых клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ), культуре клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21), культуре клеток почки зеленой мартышки (Vero), карциномы шейки матки (Hela) и др. [53]. И. В. Семашко при сравнительном изучении культивирования вируса Кемерово в культурах ККЭ, ВНК-21, Vero и СПЭВ-44 не выявила доказуемых преимуществ какой-либо из этих культур [18]. Установлено, что для вируса Кемерово характерно раннее (1 -2 сутки) проявление цитопатического эффекта с четкой деструкцией клеток и накоплением вируса в культуральной среде [12]. Показано, что наиболее интенсивно репродукция вируса происходит при температуре 37°С.

Как и у прочих орбивирусов, геном вируса Кемерово представлен двухнитевой РНК, состоящей из 10 сегментов размером от 707 до 3896 пар оснований. Общий размер генома составляет около 20000 пар оснований [11]. Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами, либо к возникновению нового вида вируса в случае реассортации с другими представителями группы Грейт-Айленд.

1.5. Эпидемиология лихорадки Кемерово

По существующим представлениям вирус является возбудителем природно-очагового зооноза с трансмиссивным механизмом передачи и относится ко II группе патогенности [24]. Однако роль вируса в патологии человека до сих пор не выяснена окончательно. Попытка ответить на этот вопрос была предпринята И.С. Михайловой в ее диссертационной работе [12]. Для этого в период с 1966 по 1972 годы в Кемеровской области было обследовано 694 пациента с лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, возникшими после присасывания клещей. Для обнаружения специфических АТ к вирусу Кемерово использовались реакция нейтрализации (РН) и реакция связывания комплемента (РСК), как наиболее чувствительные в то время методы. По данным автора лишь 1,1% случаев этиологически связаны с вирусом Кемерово. Попытка изоляции вируса из 61 образца крови и 21 образца ликвора к успеху не привела. При обследовании здорового населения с помощью РН в районах выделения вируса Кемерово из клещей, у 10,6% были выявлены специфические вируснейтрализующие антитела.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дедков Владимир Георгиевич, 2016 год

Список литературы.

1. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований. Клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций. Подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов., под ред. Д.К. Львова. Итоги науки и техники.-Сер. «Вирусология». 1991 - Т.25, М., ВИНИТИ

2. Громашевский В.Л., Львов Д.К., Циркин Ю.М., Сидорова Г.А., Аристова В.А., Гостинщикова Г.В., Андреев В.П. Новые очаги арбовирусов, экологически связанных с птицами в юго-восточном Азербайджане. Итоги IV симпозиума по изучению вирусов. этиологически связанных с птицами. М., 1972г.: 118-121.

3. Дедков В.Г., Маркелов М.Л., Войцеховская Я.А., Карганова Г.Г., Гмыль А.П., Козловская Л.И., Пиванова Г.П., Шипулин Г.А.. Разработка тест-системы для определения РНК вируса Кемерово в формате ПЦР в реальном времени. Эпидемиология и инфекционные болезни. Акт. Вопросы, 2012, №3, 38-41.

4. Дедков В.Г., Девяткин А.А., Бекова М.В., Маркелов М.Л., Бесхлебова О.В., Гранитов В.М., Шпынов С.Н., Гмыль А.П., Шипулин Г.А.. Обнаружение вируса Кемерово в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Алтайском крае. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 6(79), 2014, 46-50.

5. Государственный доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2014 году» http://rospotrebnadzor.ru/documents/details.php7ELEMENT ID=3692 (обращение 07.08.2015г)

6. Государственный доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Алтайском крае в 2011 году» ТУ Роспотребнадзора по Алтайскому краю. Барнаул, 2012

7. Иммуноферментный анализ. /Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. 1988, М., с. 172-242.

8. Иксодовые клещи: полевые исследования и дифференциальная диагностика. Омск, 2011

9. Коренберг Э.И., Помелова В.Г., Осин Н.С.. Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами. Москва, 213

10. Львов Д. К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусные инфекции. М., Медицина, 1989г.

11. Медицинская вирусология. /Под редакцией Д.К. Львова, МИА, Москва, 2008г.

12. Михайлова И. С. Материалы изучения природных очагов вируса Кемерово и его роли в патологии человека. Дисс. канд. мед. наук, М., 1974.

13. Медицинская вирусология. Под редакцией Д.К. Львова, МИА, Москва, 2008г.

14. Организация эколого-эпидемического мониторинга территории Российской Федерации: Методические рекомендации. Под ред. Львова Д.К. 1995, М., МЗ РФ.

15. ПЦР в реальном времени. Изд. 2-е, исправленное. Под ред. Д.В. Ребрикова. 2009, М., Бином. Лаборатория знаний.

16. Ревякин В.С., Пушкарев В.М. География Алтайского края., Барнаул, Алт.кн. изд.-во, 1989

17. Рудаков Н.В., Шпынов С.А., Самойленко И.Е., Ястребов В.К., Оберт А.С.. Курепина Н.Ю., риккетсии и риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки в Сибири., Омск, 2012

18. Семашко И. В. Сравнительное изучение вирусов группы Кемерово. Дисс. канд. мед. наук, М., 1974.

19. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат, 1991.

20. Тапулере В.О., Либикова Е. С., Майер Е., Ржегачек Р., Кожух О., Эрнек Э. Изоляция в Западной Сибири из клещей I. Регви1са1ш и от больных людей вируса, отличающегося от возбудителя клещевого энцефалита. «Клещевой энцефалит и др. арбовирусные инфекции». Москва-Минск, 1962г, стр.5-7.

21. Тарасевич Л.Н., Чудинов П.И., Богданов И.И., Мелентьева Л.А. К вопросу о распространенности цитопатогенного вируса в популяции клещей I. persulcatus в Новосибирской области. Вопросы инф. патологии, Омск, 1970г, вып.2, стр.45-47.

22. Тарасевич Л.Н. Изучение свойств цитопатогенных вирусов, выделенных в природном очаге клещевого энцефалита в Новосибирской области. Вопросы инф. патологии, Омск, 1970г., вып.2, стр.220-221.

23. Филиппова Н.А. Фауна СССР. Т. IV, выпуск 4. Паукообразные. Ленинград, «Наука», 1977.

24. Черкасский Б.Л. Особо опасные инфекции, Москва, «Медицина», 1996г

25. Чумаков М. П., Карпович Л.Г., Сарманова Е.С., Сергеева Г.И., Бычкова М.В.,

26. Чумаков М. П., Карпович Л.Г., Сарманова Е.С., Либикова Е. С., Майер Е. и др. Выделение в Западной Сибири из клещей Ixodes persulcatus и от больных людей вируса, отличающегося от возбудителя клещевого энцефалита. Воп. Вирусол., 1963, I, 98.

27. Шкарин В.В., Ковалишина О.В., Новые инфекции: систематизация, проблемы, перспективы

28. Ackermann R, Rehse-Kupper B. (1979) Die Zentraleuropaische Enzephalitis in der Bundesrepublik Deutschland. Fortschr Neurol Psychiatr 47:103-122

29. Allander T., Emerson S.U., Engle R.E., Purcell R.H., Bukh J.A., virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species., Proc Natl Acad Sci U S A., 2001, 98(20):11609-14.

30. Ambrose H.E., Clewley J.P., Virus discovery by sequence-independent genome amplification. Rev. Med. Virol. 2006, (16):365-383.

31. Belaganahalli M.N., Maan S., Maan N.S., Tesh R., Attoui H., Mertens P.C. Umatilla Virus Genome Sequencing and Phylogenetic Analysis: Identification of Stretch Lagoon Orbivirus as a New Member of the Umatilla virus Species. PLoS ONE, 2011, 6(8): e23605

32. Belaganahalli M.N, Maan S., Maan N.S, Nomikou K., Pritchard I., Ross Lunt, Kirkland P.D., Attoui H., Brownlie J., Mertens P.P. Full Genome Sequencing and Genetic Characterization of Eubenangee Viruses Identify Pata Virus as a Distinct Species within the Genus Orbivirus., PLoS ONE, 2012, 7(3): e31911.

33. Belhouchet M., Jaafar F.M., Firth A.E, Grimes J.M., Mertens P.P., Attoui H. Detection of a Fourth Orbivirus Non-Structural Protein. PLoS ONE, 2011, (6):pp1-16.

34. Belhouchet M., Mohd F., Jaafar, Tesh J.R., Grimes J., Maan S., Mertens P.P., Attoui H., Complete sequence of Great Island virus and comparison with the T2 and outer-capsid proteins of Kemerovo, Lipovnik and Tribec viruses (genus Orbivirus, family Reoviridae). Journal of General Virology (2010), 91, 2985-2993.

35. Bell-Sakyi, L., Zweygarth, E., Blouin, E.F., Gould, E.A. and Jongejan, F. Tick cell lines: tools for tick and tick-borne disease research. Trends in Parasitology 2007, 23:450-457.

36. Borden E.C., Shope R.E., Murphy F.A., Physicochemical and morphological relationship of some arthropod-borne viruses to Blue-tongue virus. A new taxonomic group. Physicochimical and serologic studies. J. Gen. Virol., 1971,13,2,261

37. Breitbart M, Rohwer F., Method for discovering novel DNA viruses in blood using viral particle selection and shotgun sequencing. Biotechniques, 2005, 39(5):729-36.

38. Casals J. Identification of viral strains. Yale arbovirus Res. Unit, 1965, ann. Rep., 1-27

39. Casals J., Identification of viral strains from Argentina, Carribean, Egypt, Pakistan, France, Czechoslovakia. Yale Arbovirus Res. Unit, ann. rep. 1967

40. Casals J., Antigenic characterization of tickborne arboviruses not belonging in group B. Japan J. of Med. Sci. and Biol., 1967, (20): 119-129

41. Casals J. Tick-borne viruses unrelated to group B. Eight Inter. Congr. Trop. Med a., Malaria. Tegeran, 1968:692-693.

42. Chumakov, M.P., Ernek, E., Kozuch, O., Sarmanov, E., Sergeeva, G.I., Tapupere, V.O., Bychkova, M.B., Karpovich, L.G., Libikova, H., Rehacek, J., Mayer, V. Report on Isolation from Ixodes persulcatus ticks and from patients in Western Siberia of a virus differing from agent of tick-borne encephalitis. Acta Virol., 1963, 7 (1):82—83.

43. Chumakov M.P., Zeitlenok N.A. (1939) Tick-borne spring-summer encephalitis in the wider Ural area. Arch Biol Nauk 56:11-17

44. Cooper E., Anbalagan S., Klumper P., Scherba G., Simonson R.R., Hause B.M. Mobuck virus genome sequence and phylogenetic analysis: identification of a novel Orbivirus isolated from a white-tailed deer in Missouri, USA, Journal of General Virology, 2014, (95):110-116

45. Cowled C., Palacios G., Melville L., Weir R., Walsh S., Davis S., Gubala A., Lipkin I.W., Briese T., Boyle D. Genetic and epidemiological characterization of Stretch Lagoon orbivirus, a novel orbivirus isolated from Culex and Aedes mosquitoes in northern Australia, Journal of General Virology, 2009, (90): 14331439

46. Dedkov V.G., Markelov M.L., Gridneva K.A., Bekova M.V., Gmyl A.P., Kozlovskaya L.I., Karganova G.G., Romanova L.Iu., Pogodina V.V., Yakimenko V.V., Shipulin G.A. Prevalence of Kemerovo virus in ixodid ticks from the Russian Federation. Ticks Tick Borne Dis. 2014. 5(6), 651-655.

47. Dedkov V.G., Dubina D.A., Yurchenko O.A., Bekova M.V., Valdokhina A.V., Shipulin G.A, Characterization of two strains of Tribec virus isolated in Ukraine. Vector borne and zoonotic diseases, 11/2014; 14(11):808-16.

48. Dilcher M., Hasib L., Lechner M., Wieseke N., Middendorf M., Marz M., Koch A., Spiegel M., Dobler G., Hufert F.T., Weidmann M., Genetic characterization of Tribec virus and Kemerovo virus, two tick-transmitted human-pathogenic Orbiviruses. Virology, 2012, (423):68-76.

49. Glanz S.A. Primer of Biostatistics, 5-th edition., McCraw-Hill, NY 2002, p.130

50. Gorman B.M., Taylor J., Morton H.C., Melzer A.J., Young P.R. Characterization of nugget virus, a serotype of the Kemerovo group of Orbiviruses. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 1984, (62):101—115.

51. Gresikova M., Nosek J., Kozuch O., Ernek E., Lichard M., Study on ecology of Tribec virus. Acta Virol., 1965, 9(1):83-88.

52. Huismans, H., Erasmus B.J., Identification of the serotype specific and group-specific antigens of bluetongue virus. Onderstepoort J. Vet. Res., 1981, (48):51-58.

53. Huismans H, Els H.J., Characterization of the tubules associated with the replication of three different orbiviruses. Virology, 1979, (92): 397-406.

54. Hyatt A.D., Zhao Y., Roy P., Release of bluetongue virus-like particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3A. Virology, 1993, (193):592-603.

55. Kapoor A., Tesh R.B., Duraisamy R., Popov V.L., Travassos da Rosa A, Lipkin I.W., A novel mosquito-borne Orbivirus species found in South-east Asia., Journal of General Virology, 2013, (94):1051-1057.

56. Karamisheva V., Shestopalova N., Tihonova T., Karpovich L., Chumakov M. Acta virologica, 1967, 11(2).

57. King A., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 2012

58. Klasse H.J., Sattentau Q.J. Occupancy and mechanism in antibody-mediated neutralization of animal viruses, J. Gen. Virol., 2002, V(83):2091-2108.

59. Kolman J.M., Kopecky K., Wokounova D. (1973) Serological examination of population from an endemic area of TBE and Uukuniemi viruses (in Czech). Ceskosl Epidemiol Mikrobiol Imunol 22:153- 159

60. Kubo Y.M., Furuuchi S., Molecular analysis of the genome of Chuzan virus, a member of the Palyam serogroup viruses, and its phylogenetic relationships to other orbiviruses. J. Gen. Virol., 1999, (80):937-941.

61. Kunz C. (ed.) (1981) Tick-borne encephalitis. Facultas-Verlag, Wien, p 286

110

62. Libikova H., Rehacek J., Ernek E., Gresikov M., Somogyio J., Kozuch O., 1964. Cytopathic viruses isolated from Ixodes ricinus ticks in Czechoslovakia. Acta Virol., 1964, 8(1):96-106.

63. Libikova H., Rehacek J., Somogyio J., Viruses related to Kemerovo virus in Ixodes ricinus ticks in Czechoslovakia. Acta Virol., 1965, 9 (1):76-82.

64. Malkova D., Holubova J, Kolman J.M., Marhoul Z., Hanzal F., Kulkova H., Markvart K., Simkova L. (1980) Antibodies against some arboviruses in persons with various neuropathies. Acta Virol 24:298

65. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2003, Cold Spring Harbor Laboratory.

66. Matz, M., Shagin, D., Bogdanova, E., Britanova, O., Lukyanov, S., Diatchenko, L. and Chenchik, A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Research, 1999, (27):1558-1560.

67. Mertens P.C., Brown F., Sangar D.V., Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode. Virology, 1984, (135):207-217.

68. Moss S.R., Nuttall P.A. Comparison of the non-structural protein, NS1, of tick-borne and insect-borne orbiviruses. Virus Research, 1995, (36):287-292.

69. Nomikou K., Dovas C.I., Maan S., Anthony S.J., Samuel A.R., Papanastassopoulou M., Maan N.S., Mangana O., Mertens P.P., Evolution and Phylogenetic Analysis of Full-Length VP3 Genes of Eastern Mediterranean Bluetongue Virus Isolates. PloS One, 2009, (4).

70. O'Hara R.S., Meyer A.J., Burroughs J.N., Pullen L., Martin L.A., Development of a mouse model system, coding assignments and identification of the genome segments controlling virulence of African horse sickness virus serotypes 3 and 8. Arch Virol Suppl., 1998, (14): 259-279.

71. Owens RJ, Limn C, Roy P., Role of an arbovirus nonstructural protein in cellular pathogenesis and virus release. J Virol, 2004, (78): 6649-6656.

72. Palacios G., Cowled C., Bussetti A.V., Savji N., Weir R., Wick I., Travassos

da Rosa A., Calisher C.H., Tesh R.B., Boyle D., Lipkin I.W., Rapid Molecular

111

Strategy for Orbivirus Detection and Characterization. Journal of Clinical Microbiology, 2011, (49):2314-2317.

73. Reyes G.R., Kim J.P., Sequence-independent, single primer amplification (SISPA) of complex DNA populations. Mol Cell Probes, 1991, (5):473-481.

74. Rumer L., Sheshukova O., Dautel H., Mantke O.D., Niedrig M. Differentiation of medically important Euro-Asian tick species ixodes ricinus, ixodes persulcatus, ixodes hexagonus, and dermacentor reticulatus by polymerase chain reaction., Vector-Borne and Zoonotic Diseases 2011, 11 (7): 899-905

75. Schmidt J.R., Shope R.E., Kemerovo virus from a migrating common redstart of Eurasia. (Phoenicurus ochruros, Ar1169), Acta Virol. 1971, 15(1):112.

76. Stenos J., Graves S.R., Unsworth N.B., A highly sensitive and specific realtime PCR assay for the detection of spotted fever and typhus group rickettsiae. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2005, 73(6): 1083-1085.

77. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res., 1994, 11; 22(22):4673-80.

78. Tihomirova T.I. Localization and morphology of Kemerovo virus in tissue culture cells of continuous strain of human embryo skin muscle. Proc. 3-rd Europ. Reg. Cong. On Electron. Microscop. Prague, 1964:335.

79. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol., 1996. (14):303-308.

80. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification., 2008, Springer.

81. Yuryev A. Ed. PCR Primer Design. Methods Mol. Biol., 2007, v. 402, Humana Press Inc.,Totowa, NJ.

82. Zemla J. Discussion In.: H. Libikova. Biology of viruses of the tick-borne encephalitis complex. Prague. 1962:117.

Приложение 1. Методика секвенирования вируса Кемерово de novo

Через 72 ч после начала инфекции, содержащую вирус культуральную жидкость освобождали от клеточного дебриса центрифугированием при 10000 об/мин и 4°С в течение 20 мин в роторе SW-28. Надосадочную жидкость переносили в новые пробирки для ротора SW-28 по 32 мл в каждую. На дно пробирок подслаивали 3 мл 30 %-ной (по массе) сахарозы, приготовленной на буфере, содержащем 1M NaCl (Sigma Aldrich), 0.02 M Tris-HCl (pH 7.4, Sigma Aldrich) и центрифугировали при 25000 об/мин 4 ч при 4° С. Супернатант тщательно удаляли, вирусные бляшки ресуспендировали в 1 мл 1х буфера для ДНКазы RQ (Fermentas) и добавляли 100 ед. ДНКазы RQ (Fermentas) и до 5 мг/мл РНКазы А (Fermentas). Инкубация проводилась в течение 30 мин при 37° С. Добавили 10 % (вес / объем) СДС до 1% и экстрагировали нуклеиновую кислоту 1 раз фенолом и смесью фенол/хлороформ (1:1 по объему). К водной фазе добавляли 5М ацетат аммония (Sigma Aldrich) до конечной концентрации 1М и три объема РНК собрали центрифугированием. Осадок отмывали 80% этанолом, высушили и растворили в H2O. РНК хранили при -80°С.

дцРНК извлекали методом преципитации в 2M LiCl (Helicon) при 4° С в течение 16 часов. Затем центрифугировали 30 мин при 16000 g. дцРНК выделяли из супернатанта, используя Gel Extraction kit (Qiagen), согласно рекомендованному производителем протоколу.

Подобно тому, как описано в [67], в качестве адаптеров использовали анкор-праймеры:

-Reo-Sp-Loop(5'p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC_Sp9_TCCAGTTTAGAATCC-3') и

-AntiREO-T7loop_Sp(5'p-CATATCTGCAGAGCTCCGTAATACGACTCACTATATT_Sp9_TTTATAGT GAGTCGTATTA-3').

К 10 мкл дцРНК добавили 2 мкл 10-х лигазного буфера для Т4-РНК лигазы (Fermentas), 25 пмоль анкор-праймера, полиэтиленгликоль (PEG,

113

Fermentas) до конечной концентрации 10%, 1 мкл Т4-РНК лигазы (Fermentas) и довели Н2О milliQ до конечного объема 20 мкл. Инкубировали ночь при комнатной температуре.

Полученный лигат очищали при помощи колонок Qiagen по протоколу, рекомендованному производителем. Очищенный лигат (50мкл) упарили при помощи системы SpeedVac (Labconco) досуха, а, затем растворили сухой остаток в 10 мкл деионизированной воды (milliQ).

К 5 мкл полученного после растворения образца добавили 3 мкл ДМСО (Amresco). Плавили образец под слоем минерального масла 2 мин. при 90° C, затем резко помещали в лед. После остывания в течение 2 мин. добавили 12 мкл смеси для обратной транскрипции, содержащей 4 мкл 5-х буфера (250 mM Tris-HCl (pH8.5 при 25°C), 40мМ MgCl2, 150мМ KCl, 5мМ ДТТ)-Fermentas, дНТФ до конечной концентрации 0,5мМ, 1 мкл AMV-ревертазы (Promega). Инкубировали 30 мин при 37°C, затем 30 мин при 42°C. AMV-ревертазу инактивировали прогреванием 5 мин при 85°C. Полученную кДНК обработали РНКазой H (Fermentas) 20 мин при 37°C, затем инактивировали 10 мин. при 65 °C.

Полученную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами pReo (5'p-GTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3') и Sh-reo-pr (5'p-CGCAGCTCTGCAGATATG-3'), комплементарными участкам адаптеров Reo-Sp-Loop и T7loop_Sp, соответственно. ПЦР проводили в объеме 25 мкл. В реакцию брали 2 мкл кДНК, 10 пмоль соответствующего праймера, 2,5 мкл дНТФ 1,76 мМ (ФБУН ЦНИИЭ), 10 мкл смеси для ПЦР blue2 (ФБУН ЦНИИЭ). Смесь довели деионизированной водой (milliQ) до конечного объема 25 мкл.

Для амплификации использовали двухстадийный режим.

1стадия:

94°^2мин

94°C -20сек

72°C - 15 мин, n = 2 цикла.

На этой стадии происходила достройки второй цепи кДНК 2 стадия: 94°С - 20 сек 50°С - 20 сек

72°С - 1 мин, n=45 циклов 72°С - 5 мин

На этой стадии происходило увеличение концентрации матрицы.

Реакцию проводили на приборе «Терцик» (ДНК-технология). Результаты реакции оценивались электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (рис.35).

Рис.35. Электрофореграмма продуктов амплификации кДНК вируса Кемерово

1- библиотека с адаптером Reo_Sp-loop

2- библиотека с адаптером Anti-reoT7-loop-Sp

Полученные библиотеки клонировали в вектор pGem-T (Promega). Для этого наносили по 10 мкл каждой библиотеки на 0,8 % агарозный гель (LMP Agarose ) с добавлением бромистого этидия) и после электрофоретического

разделения в ТЕ буфере (18 мин, 250В) вырезали отдельные полосы, соответствующие 1500, 1000, 800 и 600 пар оснований, соответственно.

Для экстракции соответствующих фрагментов ДНК из агарозы добавляли к каждому фрагменту геля деионизированную воду (milliQ) из расчета 1:1 по массе, плавили при температуре 72°С до полного расплавления агарозы и помещали на 10 мин в морозильную камеру (-70°С). Затем размораживали образцы в термостате при 37°С и избавлялись от агарозы ультрацентрифугированием на микроцентрифуге mini spin (Eppendorf) 12 тыс. об./мин в течение 5мин.

Полученные отжимы реамплифицировали с праймерами pReo и Sh-reo-pr. Состав реакционной смеси: 10 мкл отжима, 1 мкл соответствующего праймера (10 пмоль/мкл), 2,5 мкл 1,76мМ ДНТФ(Т) (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии), 10 мкл ПЦР-смесь Blue-2 (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии), 9,5 мкл milliQ. Реакцию проводили под маслом с использованием горячего старта. Термоциклирование проводили на приборе «Терцик» (ДНК-технология) в следующем режиме:. 94°С - 60сек 94°С - 20сек 50°С - 20сек

72°С - 60сек, п=15циклов 72°С - 5мин 4°С - хранение

Результат реакции оценивали электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (Рис. 36).

ReoSpLoop/pReo

AntiReoT7Loop_Sp/Sh-reopr

4000 п.о.

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1000 п.о.

800 п.О

Рис. 36. Электрофореграмма продуктов реамплификации отдельных фрагментов библиотек

Для лигирования использовали по 3 мкл ПЦР-продуктов, содержащих ДНК фрагментов соответствующих библиотек.

Лигирование проводили с помощью набора pGem-T (Promega) по протоколу, рекомендуемому производителем. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки. Отбор колоний со вставками осуществляли методом «бело-голубой» селекции на твердой среде LB с добавлением ампициллина, X-Gal и IPTG.

С каждой чашки пересеивали по 100 колоний, содержащих вставки. После подращивания на твердой среде LB с добавлением ампицилина амплифицировали полученные клоны при помощи ПЦР in situ.

Полученные ПЦР-фрагменты (289 шт.) были отсеквенированы с помощью системы автоматического секвенирования GA 3100 (Applied Biosystems). Приготовление среды LB (Luria-Bertani) проводили согласно протоколу [65]: Сиквенсы собирали в контиги и анализировали с помощью пакетов программ Lasergen 7.0 (DNA-Star) и VectorNTI 9.0 (Invitrogen).

При сборке контигов в качестве референсных использовали последовательности VP1, VP2,VP6 вируса Кемерово (HM543481, HM543482, HM543483) и полный геном вируса Грейт-Айленд (HM543467).

Для дополнения недостающими фрагментами и верификации спорных участков генома были выбраны олигонуклеотидные праймеры (прилож. 1 ) со сходными термодинамическими параметрами что, в последствие позволило проводить ПЦР по универсальной программе.

Для определения структуры 5'-концевого фрагмента сегмента 5 (250 bp) использован подход, сходный с методикой RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) [66].

Исходную библиотеку кДНК вируса Кемерово с адаптером Anti-reo_T7loop_Sp разбавили деионизованной водой (milliQ) в 100 раз и взяли в реакцию 10 мкл.

Реакцию проводили в объеме 25 мкл с использованием горячего старта. Состав нижней смеси включал: 1 мкл праймера PAN_Sh-reo (1пмоль/мкл), 1 мкл праймера PAN (10пмоль/мкл), 1мкл праймера Vp2-rc123 (10пмоль/мкл), 2,5 мкл 1,76 мМ дНТФ(Т) (ФБУН ЦНИИЭ), 0,5 мкл Н2О (milliQ) - под воском. Структура праймеров Vp2-rc1;2;3 представлена в приложении 1.

В качестве верхней смеси использовали 10 мкл смеси для ПЦР blue-2 (ФБУН ЦНИИЭ).

Амплификация проводилась с помощью термоциклера «Терцик» (ДНК-технология) под слоем минерального масла в режиме: 94 °C - 2 мин 94 °C - 20 сек 60 °C - 20сек

72 °C - 1 мин, n=35 циклов 72 °C - 5 мин 4 °C - хранение.

Результаты ПЦР оценивали электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (рис.37).

Рис. 37. Электрофореграмма фрагментов 5'-концевого фрагмента Vp2 (Seg. 4) с тремя вариантами обратного праймера.

Где Rc1, Rc2 и Rc3 - ампликоны, полученные в результате амплификации с помощью праймеров VP2-Rc1, VP2-Rc2, VP2-Rc3 и праймера PAN_Sh-reo

Полученные фрагменты были выделены из геля и клонированы в вектор pGem-T (Promega) по стандартному протоколу.

Отбор колоний со вставками осуществляли методом «бело-голубой» селекции на твердой среде LB с добавлением ампициллина, X-Gal и IPTG.

С каждой чашки пересеивали по 10 колоний, содержащих вставки. После подращивания на твердой среде LB с добавлением ампицилина амплифицировали полученные клоны при помощи ПЦР in situ. Результаты ПЦР оценивали электрофоретическим методом в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (рис.38).

гс-1

гс-2

гс-3

К-

Рис.38. Электрофореграмма продуктов амплификации полученных клонов при помощи ПЦР in situ.

Где rc-1, rc-2, rc-3 - клонированные ампликоны, полученные в результате амплификации фрагментов исходной библиотеки Reo_Sp-loop помощью праймеров VP2-Rc1, VP2-Rc2, VP2-Rc3 и праймера PAN_Sh-reo

Полученные ПЦР-фрагменты секвенировались с помощью системы автоматического секвенирования GA 3100 (Applied Biosystems). Обработка хроматограмм и сборка контигов осуществлялась при помощи пакетов программ Lasergen 7.0 (DNA Star) и VectorNTI 9.0 (Invitrogen). Выравнивание полученных сиквенсов представлено на рис. 39.

(104) 104 110 120 130 140 150 160 170

rc1 rc (84) CTCATGTACAGCGCGAATACGACGAATTCGACATTGTGCTGACACCACATACCCACGACTCACGCGGGCCGTACAA rc2 rc (82) CTCATGTACAGCGCGAATACGACGAATTCGACATTGTGCTGACACCACATACCCACGACTCACGCGGGCCGTACAA rc3 rc (104) CTCATGTACAGCGCGAATACGACGAATTCGACATTGTGCTGACACCACATACCCACGACTCACGCGGGCCGTACAA Consensus(104) CTCATGTACAGCGCGAATACGACGAATTCGACATTGTGCTGACACCACATACCCACGACTCACGCGGGCCGTACAA

Рис. 39. Фрагмент выравнивания контигов 5'-концевого фрагмента Vp2(Seg4)

На рисунке показаны контиги, полученные помощью праймеров VP2-Rc1, VP2-Rc2, VP2-Rc3 и праймера PAN_Sh-reo

Приложение 2. Структура олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генома вирусов Кемерово

№ название фрагмент Длина, 5'-3'-последовательность

п.о.

1 Vp1-1f VP1(seg1) 23 atgtcatggctgtagtggagcag

2 Vp1-1r VP1(seg1) 25 cgccacctatggaacgttatgtct

3 Vp1-2f VP1(seg1) 22 tgtatggagcgcttcatcgacg

4 Vp1-2r VP1(seg1) 25 tgatagcatgtaggagtcgtatagg

5 Vp1-3f VP1(seg1) 25 atatgggcgtgcttggatcgtaaac

6 Vp1-3r VP1(seg1) 26 gacgcgtgatcccgtagcttcgagat

7 Vp1-4f VP1(seg1) 25 aaataggcggaaagattataatcgg

8 Vp1-4r VP1(seg1) 23 gatgccgcgtctgcacttcatct

9 Vp1-5f VP1(seg1) 26 agttgcgaactcattacacaacatgg

10 Vp1-5r VP1(seg1) 23 tcgagtctagatgcgtctcacag

11 Vp1-6f VP1(seg1) 26 aggacggttacacattgtgccgactg

12 Vp1-6r VP1(seg1) 24 tctaaagacattgtaaactcgtccc

13 Vp1-7f VP1(seg1) 25 ctgaatctagacagacgtgtcgcgc

14 Vp1-7r VP1(seg1) 25 gtatccttatgtcgagcggacggct

15 Vp3-1f VP3(seg2) 23 aacttccggaagcaatggccaac

16 Vp3-1r VP3(seg2) 24 tcccatgaggtattcccaatgcgg

17 Vp3-2f VP3(seg2) 24 agagcctgttttcaacgtgcatcg

18 Vp3-2r VP3(seg2) 20 gcctcgcacaagcggtcgtg

19 Vp3-3f VP3(seg2) 24 atgttatcgacgaaaggttctgcg

20 Vp3-3r VP3(seg2) 21 aacgcgcgcagtacactctcc

21 Vp3-4f VP3(seg2) 25 attgttctgagcatacaccatggac

22 Vp3-4r VP3(seg2) 21 ctccgggccgacgcccacgct

23 Vp4-1f VP4(seg3) 25 taaaatgttcggatcgcacacggtg

24 Vp4-1r VP4(seg3) 24 cgcgaattgaaggcgaggaaagat

25 Vp4-2f VP4(seg3) 24 atggaacgaccttgcttttatggg

26 Vp4-2r VP4(seg3) 26 tccagcataagcaataacacgaaacc

27 Vp4-3f VP4(seg3) 22 agatcatgttgcgctgctccag

28 Vp4-3r VP4(seg3) 22 agttatgtccgcgccatcgctc

29 Vp2-1f VP2(seg4) 23 acagaagaagatcaacaggcttg

30 Vp2-1r VP2(seg4) 22 cctaaccggcctcacgttctca

31 Vp2-2f VP2(seg4) 24 tttcaggacacggttatccctctc

32 Vp2-2r VP2(seg4) 23 cgcctccaaccggccgagcagga

33 Vp2-3f VP2(seg4) 23 atgagaataaacccgcactgccc

34 Vp2-3r VP2(seg4) 21 tatcttggtcttgcccgcggg

35 Vp2-rc-1r VP2(seg4) 28 ttcctgctctgcctcaagcctgttgatc

36 Vp2-rc-2r VP2(seg4) 26 tctgcgttagcgagttcctgctctgc

37 Vp2-rc-3r VP2(seg4) 26 atccgtcggacgccacgccatccaac

38 NS1-1f NS1(seg5) 26 agctcgtgatgtgggtcgcgtacttc

39 NS1-1r NS1(seg5) 26 taccctccgatgggcggtgtgtgcag

40 Vp5-1f VP5(seg6) 22 acggagagtgaggagcagaatg

41 Vp5-1r VP5(seg6) 21 cggaccgttccgcctctacat

42 VP5-2f VP5(seg6) 20 tctgcgcagcagaggacatg

43 VP5-2r VP5(seg6) 20 acgcagaggattaaagatac

44 NS2-1f NS2(seg7) 20 aattttcctcatttcgagcg

45 NS2-1r NS2(seg7) 20 tggccgtagagtggtaagtt

46 NS2-2f NS2(seg7) 20 aatatcctggaagcgctgcg

47 NS2-2r NS2(seg7) 21 cgcgctagcgttcccgcacta

48 Vp6-1f VP6(seg9) 22 aaattctctcgtcagtacggca

49 Vp6-1r VP6(seg9) 21 ctttctgcgcagctccctcat

50 Vp6-2f VP6(seg9) 20 gcgattacgcgaggctctgc

51 Vp6-2r VP6(seg9) 20 tctgcgtactgtcaccctct

Приложение 3. Синтез положительного контрольного образца

В качестве вектора для клонирования использован вектор с ампициллиновой устойчивостью, содержащий гены двух упаковочных белков MS2 фага, сигнальную последовательность, необходимую для упаковки, а также фрагмент гена gag ВИЧ.

Клонирование ампликона проводили с использованием рестриктазы XcmI, которая в данном векторе вырезает небольшой фрагмент, в результате чего на обоих его концах образуются выступающие нуклеотидные остатки тимина (T). Так как ампликоны, полученные с помощью Taq полимеразы, содержат на концах выступающие нуклеотидные остатки аденозина (А), они могут быть легко клонированы в полученный вектор.

Линеаризованный вектор и ампликон лигировали в течение 10 часов при температуре +4°С. Полученную лигазную смесь вводили в клетки E.coli (штамм DH10b) методом кальциевой трансформации. Клетки высевали на среду, содержащую ампициллин, и растили в течение 10-12 часов при температуре 37°С.

Выросшие ампициллинустойчивые колонии E.coli проверяли с помощью ПЦР на наличие целевого фрагмента ДНК, а также на прямую ориентацию этого фрагмента. Для этого в качестве прямого праймера выбрали праймер, отжигающийся на начало целевого фрагмента, а в качестве обратного праймера использовали праймер на край вектора, примыкающий к концу целевого фрагмента. В результате были отобраны клоны, содержащие целевую вставку в прямой ориентации.

Из выбранных в результате скрининга клонов были выделены соответствующие плазмиды, которые затем вводились в клетки E.coli (штамм BL21) для экспрессии генов MS2 фагов и упаковки целевых РНК в фаговые частицы внутри клеток. Для этого колонии с чашек собирали в жидкую среду, наращивали до оптической плотности, равной 1, добавляли ИПТГ и растили еще 4 часа при температуре 37°С. Затем клеточную культуру

центрифугировали, добавляли 1 мл буфера для МБ2 фага и проводили лизис с помощью лизоцима (конечная концентрация 1 мг/мл), а также с помощью замораживания-оттаивания.

Полученные лизаты обрабатывали ДНКазой и РНКазой для уничтожения всех нуклеиновых кислот, не включенных в фаговую оболочку. Затем проводили центрифугирование и отбирали супернатант, содержащий фаговые частицы. Наличие упакованной РНК в супернатанте контролировали с помощью электрофореза в агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Для получения более качественных и свободных от возможных примесей контролей проводили очистку упакованных РНК в хлориде цезия. Для этого полученные препараты смешивали с раствором хлорида цезия, переносили в запаивающиеся ценрифужные пробирки и проводили ультрацентрифугирование при скорости 65000 об/мин. на протяжении 20 часов (ультраценрифуга Беекшап). В результате разные составляющие исходного препарата распределялись по длине пробирки, которую затем прокалывали и собирали содержимое, разделяя его на 7 фракций. Из них определяли наиболее чистую и концентрированную пробу, которую в дальнейшем разводили и использовали в качестве положительного контрольного образца.

Приложение 4. Структура олигонуклеотидных праймеров для

амплификации фрагментов генома штаммов вируса Трибеч Тг35 и Тг19

праймер последовательность (5'-3') сегмент положение ориентация

1-^ тддддтетсдтссстетдетссдсс 1 2-26 прямой

1-1г дсссттссстдтссстттссдсс 1 855-877 обратный

1-2f тсдсссстдсстдттсдтсстттстс 1 741-766 прямой

1-2г тсттссссссссддсдсстттдс 1 1544-1566 обратный

1-3f дстдтдссдссссссддтсстдс 1 1461-1483 прямой

1-3г дсссстдсдтдстссдсдстстс 1 2261-2283 обратный

1-4f тссдссдссссссддссттсс 1 2211-2231 прямой

1-4г тсдтсстдсдссдсдстстстсс 1 3019-3041 обратный

1-5f тсдсдсдссстсдсстдсстсс 1 2961-2982 прямой

1-5г тдтссттдтстсссссссдссттс 1 3868-3891 обратный

2-1f дсттссссддссддтссссддтс 2 6-28 прямой

2-1г дсссстсддсссстсдтссдс 2 673-693 обратный

2-2f тсддссддсдтсддсдссдтстдстс 2 605-630 прямой

2-2г дтсстссстстстсдтсдсттсс 2 1252-1274 обратный

2-3f дсдсссссдсстссстдсдтс 2 1205-1255 прямой

2-3г дсссддсстстссссдттссс 2 1897-1917 обратный

2-4f ттдтсдсссддттстссддтссстс 2 1812-1836 прямой

2-4г дтссттдстссссссссдтсс 2 2771-2791 обратный

3-1f тддддтсттсссдтсссдсдссдтдс 3 2-27 прямой

3-1г тдтссстдсстдсстсссдсд 3 755-795 обратный

3-2f дтсдсддсстддтссттсссдссс 3 691-614 прямой

3-2г ддсдссдтсссдтддттсссссс 3 1437-1459 обратный

3-3f тсстсстсттсстсдтсстсттдс 3 1375-1398 прямой

3-3г дтсттдтсттсссстсдсдссдсс 3 1910-1933 обратный

4-1f дтттссттсттссттсстсстссс 4 7-30 прямой

4-1г ттссссстсдссстсдтдтдсс 4 573-594 обратный

4-2f тсдсдтддттсдстсддтсссддтссс 4 501-527 прямой

4-2г дсссстстсдсссддссддтсс 4 1103-1124 обратный

4-3f дсдтсссдстсдтсстдтсссс 4 1012-1033 прямой

4-3г дсдддтстдссссдссдтсстсдс 4 1687-1710 обратный

5-И ТДДДДТСТТСТТССССДТССДСС 5 2-24 прямой

5-1г ТСТДСТТССДСТДССДСССС 5 711-730 обратный

5-2f ДССТСДСДСДДДДСДСССДСДС 5 541-562 прямой

5-2г ТСССТССДТСССДСДТТДСС 5 1305-1324 обратный

5^ ТТСДДССДССДСССССТТТС 5 1252-1271 прямой

5-3г ТДТСТТДСТСТТСССССССС 5 1710-1729 обратный

6-1f ТДДДДДСТСТСДСССДДСДССС 6 2-23 прямой

6-1г ТССДТСТСТТТСДСДТСДССТС 6 958-979 обратный

6-2f ДСССССТССССДДДДССДТСС 6 808-828 прямой

6-2г ТДТССТДДССССДТСССДССС 6 1647-1667 обратный

7-1f ДДДТССТСДТТТСССДССДССДСС 7 6-29 прямой

7-1г ТТСССДДТСССССТСДСССТС 7 760-780 обратный

7-2f ДСДДТССДСССДДТСДСДДДТДССС 7 632-656 прямой

7-2г ТСТТДСДДТССССССТССССС 7 1173-1193 обратный

8-1f ТДДДДТТСТТСДСССДСДТССДСССС 8 2-27 прямой

8-2г ДТСТССССТТССДТССДДТСДТДСДС 8 799-824 обратный

8-2f ТСССССДСТТСДСДТСССДДСС 8 572-593 прямой

8-2г ТСТТСДДСДССССССТДДСССДС 8 1128-1150 обратный

9-1f ДДТТСССТССТСДСТДССССДС 9 6-27 прямой

9-2г СССТСССТДСТСТСДСССТДТ 9 1002-1022 обратный

10-1f ТДДДДДТТТСССДДСДДТССТДССДС 10 2-27 прямой

10-1г ТДТСТТДДТТССССССССДСДС 10 683-704 обратный

Приложение 5. Обогащение и неспецифическая амплификация вирусной кДНК.

100 мкл осветленных клещевых суспензий обработали 25 ед. бензоназы (81§ша-АМпсЬ) 30 мин. при 37°С в присутствии М§С12, для удаления хозяйских нуклеиновых кислот. Далее суспензию обработали протеиназой К (до к/к 200 мкг/мл, 81§ша-АШпсЬ) в присутствии 0,5% БОБ, 25мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 50мМ Тпб-ИО (рН8,0) 90 мин. при 56 °С для инактивации бензоназы. Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции с помощью набора Рибо-золь В (АшрИБеш). Полученный осадок РНК растворили в 40 мкл Н2О шйНр (АшрИБеш). Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью вырожденного гексонуклеотидного праймера КТБ-гпёб, содержащего на 5'-конце «довесок» в виде искусственной последовательности нуклеотидов (5'-а§а1^^а1аа§а§аса§(К)6 -3').

Перед добавлением смеси для обратной транскрипции осуществляли отжиг праймера КТБ-гпёб. Для этого к 12 мкл, содержащим вирусную дцРНК, добавляли 2 мкл КТБ-гпёб (48 пмоль /мкл), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, 81§ша-АМпсЬ) под слоем минерального масла и прогревали 2 мин. при 90°С, затем резко помещали в лед. К полученному раствору добавляли 20 мкл ЯТ-ш1х (АшрИБеш), 4 мкл дитиотреита (ДТТ, 10 мМ), 1 мкл ревертазы ММЬУ (АшрИБеш). Реакцию обратной транскрипции проводили на приборе Терцик (ДНК-Технологии) в следующем режиме: 24°С - 10мин, 37°С - 30 мин, 50°С - 15 мин. Полученную кДНК обработали РНКазой Н (Бегше^ав) 15 мин. при 37°С для удаления РНК, после чего инактивировали РНКазу Н прогреванием в течении 2 мин. при 95°С.

Для синтеза второй цепи кДНК к полученной смеси добавили 2 мкл 10х О-буфера (Бегшейав), 12 мкл дНТФ 1,76 мМ (АшрИБеш), 5 мкл Н2О шИ^ (АшрИБеш), 1 мкл фрагмент Кленова Ехо(-) (Бегшейав). Реакцию проводили 15 мин. при 24°С, далее 20 мин. при 37°С. Полученный продукт очистили с

помощью набора QIAquick PCR kit (Qiagen). Очищенную кДНК элюировали в 50 мкл и хранили при -70 °С.

Реакцию неспецифической амплификации проводили с помощью праймеров NTS1 (5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3') и NTS2 (5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3'), содержащих в своей 3'-области последовательность, идентичную «довеску» праймера NTS-rnd6 и в присутствии интеркалирующего красителя. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала по 5 пмоль каждого праймера, 5 мкл дНТФ 1,76 мМ (AmpliSens) под воском, 14 мкл пцр-смеси Flu2 (AmpliSens), 20 мкл кДНК и 3 мкл EvaGreen Dye 20x (Biotium Inc.). Реакцию проводили с помощью прибора для ПЦР в реальном времени Rotor-Gene 6000 в режиме: 95 °С -2мин; 95 °С - 20сек, 50 °С - 40сек, 72 °С - 60сек, n=4; 95 °С - 20сек, 65 °С -20сек, 72 °С - 60сек (детекция). При достижении кривой флуоресценции порога насыщения реакцию останавливали. Полученный продукт использовали для ПЦР со специфическими праймерами на вирус Кемерово

[4].

Приложение 6. Проведение реакции нейтрализации вируса Кемерово

В качестве чувствительной биологической модели использовали культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) из лабораторной коллекции. Клетки выращивали при 37°С на среде 199 (ПИПВЭ, Россия) с добавлением 5% фетальной бычей сыворотки (БББ, 01Ьео).

Вирус Кемерово, штамм 21/10, хранился в виде культуральной жидкости заражённых клеток в замороженном виде при -70°С.

Реакцию нейтрализации бляшек проводили в культуре клеток СПЭВ на пластиковых 6-луночных панелях через 72 часа после посадки клеток.

Разведения исследуемой сыворотки готовили в среде 199 на растворе Эрла с 2% FBS, с шагом 2, начиная с 1:10 до 1:320. К исследуемым разведениям сыворотки добавляли вирус в 199 среде на растворе Эрла с 2% FBS с известным титром (25-30 бляшек на дозу) в соотношении (1:1). Проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С в СО2-инкубаторе, затем вносили по 200 мкл в лунку 6-луночной панели и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в СО2-инкубаторе.

Затем добавляли 4,5 мл 1% агарового покрытия, содержащего из расчета на одну панель: 3 мл 10*раствора Эрла; 20,7 мл воды для инъекций; 0,15 мл смеси антибиотиков; 0,45 мл 0,1% нейтрального красного; 2,25 мл FBS; 0,9 мл 7,5 % бикарбоната натрия; 0,3 г агара (<^Асо»).

На 6 сутки проводили учет бляшек.

За титр сыворотки принимали максимальное разведение сыворотки, подавляющее образования 50% бляшек по сравнению с отрицательным контролем вируса. Расчет проводили по методу Рида и Менча [14].

Достоверность каждого опыта подтверждали проведением отрицательных контрольных реакций между неинфицированной культурой клеток и отрицательной сывороткой, а также инфицированной вирусом культуры клеток и отрицательной сывороткой.